專利名稱：用于毛細管電泳DNA片段分離的低pH篩分溶液體系的制作方法
技術領域：
本發明提供了一種用于毛細管電泳分離DNA片段的低pH篩分溶液體系。其特征在于基體緩沖溶液的pH值在7.0左右。該篩分體系可用于毛細管電泳在紫外檢測條件下分離相差一個堿基的DNA片段。
背景技術：
毛細管無膠篩分電泳的DNA分析在分子生物學基礎研究中有重要的應用價值。其技術關鍵在于使用具有高分辨率的篩分介質。目前用于毛細管無膠電泳的高分子篩分介質是水溶性高分子溶液。目前公開報道的DNA分離介質對DNA片段的分離都是在pH值較高的TBE(Tris-borate-EDTA，即89mmol/L三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)，89mmol/L硼酸(boric acid)，2mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，pH＝8.3)，TTE(Tris-TAPS-EDTA，即50mmol/L三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)，50mmol/L TAPS(N-tris(hydroxymethyl)methyl-3-amino-propanesulfonic acid)，2.0mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，pH＝8.2)，TAPS-NaOH(100mmol/Lol/L N-tris(hydroxymethyl)methyl-3-amino-propanesulfonicacid，用NaOH調pH值到8.0)等緩沖液中進行的，而且采用的是熒光試劑和激光誘導熒光檢測手段的條件下獲得的。用于紫外檢測條件則分離效果很差。較高pH值的緩沖溶液還有可能使如丙烯酰胺類的DNA篩分介質發生水解，從而影響分離效果。一般使用的熒光試劑價格昂貴，毒性大，如溴化乙錠(EtBr)。激光誘導熒光檢測器的價格又使其不易推廣。而在紫外檢測條件下，毛細管電泳單堿基分離DNA片段還比較困難。
關于聚丙烯酰胺(LPA)、聚N，N-二甲基丙烯酰胺(PDMA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，以及它們的混合溶液體系作為DNA分離介質的情況已有諸多報道。
1990年，已有聚丙烯酰胺(LPA)作為DNA分離介質的報道。多年來的研究結果顯示，聚丙烯酰胺(LPA)的黏度大，操作不便，不能在空柱中使用，在堿性條件下容易水解，等等。
關于聚N，N-二甲基丙烯酰胺(PDMA)作為DNA分離介質，文獻(MadabhushiR S，Electrophoresis，1998，19224-230)認為其粘度小，具有動態涂層能力分離能力較強。用TAPS-NaOH(pH8.0)緩沖溶液稀釋的6.5％PDMA(Mw98,000)用作四色熒光測序介質在42℃時，空柱條件下，其單堿基分辨率可達600堿基左右，但是其中還是有一些沒有分開的片段。
關于聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作為DNA分離介質，文獻(Gao Q F，Yeung ES，Anal.Chem.，1998，701382-1388；Song J M，Yeung E S，Electrophoresis，2001，22748-754)報道，其水溶性好，粘度小，有自動涂層能力，單色測序時，用TBE緩沖溶液稀釋的7％商品化的PVP(Mw1,000,000)能分離350bp的DNA片段。而在四色測序中，發現染料標記的DNA片段的遷移率要比普通條件下更大，需加入10M尿素才能減少這種遷移差異。但是這種特殊條件下使用的含有極高濃度尿素的介質溶液并不易于常規使用。
文獻(Song L，Liu T，Liang D，et al，Electrophoresis，2001，223688-3698)提供的一種新的DNA分離介質，即聚丙烯酰胺和聚乙烯吡咯烷酮的互穿網絡(interpenetrating networks of polyacrylamide and polyvinylpyrrlidone，LPA/PVP)體系。這種體系的粘度小，具有動態涂層能力，分離效率高，分離的重現性好。用TBE緩沖溶液稀釋的2％PVP(Mw1,000,000)和1％LPA(Mw400，000)的混合物溶液可以將DNA標準樣品pBR322/HaeIII中的22個片段很好地分開，而且123/124bp達到了單堿基分離。但是其中使用了熒光試劑溴化乙錠(EtBr)，它具有很強的基因透變性，對人體和環境都有很大的毒性。
文獻(Wang Y.，Hao J.，Liang D.，et al，Electrophoresis.，2002，231460-1466)也提供了一種新的DNA分離介質，聚N，N-二甲基取代聚丙烯酰胺和聚乙烯吡咯烷酮的互穿網絡(interpenetrating networks of(poly(N，N-dimethylacrylamide)and polyvinylpyrrlidone)。在以TBE緩沖溶液為背景電解質的PVP溶液中聚合N，N-二甲基取代丙烯酰胺，得到的高分子混合溶液不經純化，直接用于dsDNA的分離。在優化條件下，DNA標準樣品pBR322/HaeIIIDNA中的22個片段在15分鐘內成功分離，并且123/124bp的分離度達到了1.0(激光誘導熒光檢測)。但是同樣也使用了熒光試劑溴化乙錠(EtBr)。
發明內容
本發明的目的在于提供一種用于毛細管電泳分離DNA片段的低pH(pH7.0左右)篩分溶液體系，這種分離體系在紫外檢測條件下就可以達到對DNA片段的單堿基分辨。
本發明提供了一種可用于DNA分離的篩分溶液體系，該篩分溶液體系的pH為6.5-7.5之間，優選pH值為7.0。
該篩分溶液體系由篩分介質和基體緩沖溶液組成。優選的基體緩沖溶液可以為NaH2PO4-Na2HPO4磷酸鹽溶液，KH2PO4-K2HPO4磷酸鹽溶液，(NH4)H2PO4-(NH4)2HPO4磷酸鹽溶液，N，N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)-NaOH緩沖溶液，等等。優選緩沖液摩爾濃度在5-50mmol/L之間，進一步優選20mmol/L。進一步優選的基體緩沖溶液為NaH2PO4-Na2HPO4磷酸鹽溶液，其磷酸鹽濃度優選為20mmol/L，pH值為7.0。優選的NaH2PO4是至少是分析純的。優選的Na2HPO4的至少是分析純的。
所述的篩分介質為水溶性高分子，優選的水溶性高分子介質可以是LPA，PDMA，LPA/PVP，PDMA/PVP。優選的DMA單體是購于日本東京工業化成株式會社。其優選質量濃度范圍在1～20％(質量百分比)，進一步優選在1～10％，最優選是6％。優選的PVP系進口分裝(購于中國醫藥(集團)上海化學試劑公司)。其優選質量濃度范圍在1～20％(質量百分比)，進一步優選在1～10％，最優選是6％。PVP的K值優選為10～110，更優選在20～50，最優選為30。預定質量的DMA單體與預定質量的PVP之比在1∶1～6∶1之間。優選在1∶1～3∶1。最優選為1∶1。優選的AM單體是購于日本東京工業化成株式會社。其優選質量濃度范圍在1～20％(質量百分比)，進一步優選在1～10％，最優選是6％。上述高分子介質的制備可以采用水溶液中的自由基聚合法。例如，先將預定質量的PVP(K值為30)粉末溶解在預定體積的基體緩沖液磷酸鹽溶液中，然后加入至少分析純的預定質量的DMA單體。混勻，除氧，在惰性氣體氛圍下加入引發劑。該反應可以在室溫，常壓下進行，兩個小時內聚合反應可以完成。或者例如，將預定質量的至少分析純AM單體溶解在預定體積的基體緩沖液磷酸鹽溶液中。混勻，除氧，在惰性氣體氛圍下加入引發劑。該反應可以在室溫，常壓下進行，兩個小時內聚合反應可以完成。能生成自由基的引發劑可以是過硫酸銨(APS和N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)；過硫酸銨和3-二甲胺丙腈(3-dimethylaminopropionitrile，DMAPN)；過硫酸銨和3-二甲胺丙腈亞硫酸鹽；過氧化氫和硫酸亞鐵-抗壞血酸；過硫酸銨和亞硫酸氫鈉等。優選過硫酸銨(APS，98％)和N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED，99％)(均為電泳純，進口分裝)。引發劑體系推薦使用量(按聚合前基體緩沖液的體積10ml計)APS溶液的濃度優選為10～40％(質量體積百分比)，最優選為10％；用量優選為10～50ul，更優選為20～30ul。TEMED溶液的濃度優選為10～40％(體積百分比)，最優選為10％；用量優選為20～100ul，更優選為40～60ul。引發劑加入順序例如先加TEMED溶液，在待聚合溶液充分除氧后，在惰性氣體氛圍下迅速向反應體系中加入APS溶液。本發明提供的制備反應可以在10～40℃之間進行，優選20～30℃。
基體緩沖液選用磷酸鹽溶液時，為了消除體系中金屬或其它雜質的影響，除了使用高純度的反應試劑外，還可以向體系中加入螯合劑EDTA。例如在10ml，20mmol/L的NaH2PO4-Na2HPO4溶液中加入100ul，1mmol/L EDTA。還可以向體系中加入DNA變性劑尿素或者甲酰胺，體系中尿素的含量優選為3.5-8mol/L；或者體系中甲酰胺的含量優選為10％-50％，濃度單位為v/v。
用做DNA分離介質的高分子的分子量可以根據被分離DNA的大小在很寬范圍內變化。例如，高分子可達100,000～10,000,000。優選500,000～5,000,000。更優選500,000～1,000,000。可以用多角度激光光散射與分子排阻色譜聯用技術(MALLS-SEC法)來測定高分子的分子量及其分布。
本發明提供的低pH(pH7.0左右)篩分溶液體系在紫外檢測條件下就可以達到對DNA片段的單堿基分辨。
1，圖1是2％PDMA/PVP溶液(含15％v/v甲酰胺)對DNA標準樣品pBR322/HaeIII Markers的毛細管電泳分離譜圖。
2，圖2是圖1中123/124片段的局部放大圖。
3，圖3是2％LPA溶液(含7M尿素)對DNA標準樣品pBR322/HaeIII Markers毛細管電泳分離譜圖。
4，圖4是圖3中123/124片段的局部放大圖。
5，圖5是2％LPA溶液(含7M尿素)對DNA標準樣品pBR322/Msp I Markers和φχ174/HaeIII Markers的1∶1混合溶液的毛細管電泳分離譜圖。
6，圖6是圖5中309/310片段的局部放大圖。
具體實施例方式實施例一篩分介質PDMA/PVP(去活條件)的制備和配制取一只干燥潔凈的25ml的三頸瓶，向其中加入0.6g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.619ml N，N-二甲基丙烯酰胺(DMA)，10ml NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(20mmol/L，pH7.0)，將兩者充分混勻。再加入100μl的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(1mmol/L)溶液，100μl的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)(10％v/v)溶液。混勻，抽氣，除氧(惰性氣體保護)，加入50μl的過硫酸銨(APS)(10％w/v)溶液。混勻，靜置。反應結束后，可不經純化，直接將聚合產物裝入塑料瓶中，置于冰箱中冷藏保存。使用時將制得的PDMA/PVP高分子用NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(20mmol/L，pH7.0)溶解并稀釋到2％(高分子溶液濃度單位為w/v)。再分別取2％(w/v)的高分子體系PDMA/PVP溶液和甲酰胺按85∶15的體積比混勻，作為DNA篩分介質。
毛細管電泳實驗的條件如下
使用紫外260nm檢測。恒壓操作模式，電壓為4kV(-→+)。電動進樣，-4kV×3s。轉盤、柱溫設定為25℃。數據由工作站收集并處理。實驗時，先將聚丙烯酰胺涂層毛細管柱用水沖洗180秒，之后用篩分介質溶液沖洗180秒。在進樣前，最好將毛細管柱的進樣端在蒸餾水中浸一次以清洗毛細管柱的外壁，以免污染DNA樣品。
高分子體系2％(w/v)PDMA/PVP用作篩分介質所得到的DNA分離譜圖，如圖1所示。其中123/124組分的峰分離函數p＝0.39，Rs＝0.75。
實施例二篩分介質LPA(去活條件)的制備和配制取一只干燥潔凈的25ml的三頸瓶，向其中加入0.6g丙烯酰胺(AM)，10mlNaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(20mmol/L，pH7.0)，將兩者充分混勻。再加入100μl的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(1mmol/L)溶液，100μl的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)(10％v/v)溶液。混勻，抽氣，除氧(惰性氣體保護)，加入50μl的過硫酸銨(APS)(10％w/v)溶液。混勻，靜置。反應結束后，可不經純化，直接將聚合產物裝入塑料瓶中，置于冰箱中冷藏保存。使用時將制得的LPA高分子用NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(20mmol/L，pH7.0)溶解并稀釋到2％(高分子溶液濃度單位為w/v)。實驗時將的2％LPA高分子用含有7mol/L尿素的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(20mmol/L，pH7.0)溶解，并稀釋到2％(高分子溶液濃度單位為w/v)。
毛細管電泳實驗的條件如下使用紫外260nm檢測。恒壓操作模式，電壓為4kV(-→+)。電動進樣，-5kV×5s。轉盤、柱溫設定為25℃。數據由工作站收集并處理。實驗時，先將聚丙烯酰胺涂層毛細管柱用水沖洗180秒，之后用篩分介質溶液沖洗180秒。在進樣前，最好將毛細管柱的進樣端在蒸餾水中浸一次以清洗毛細管柱的外壁，以免污染DNA樣品。
2％的高分子體系LPA用作篩分介質所得到的DNA分離譜圖，如圖2所示。其中123/124組分的峰分離函數p＝0.66，Rs＝0.79。
實施例三篩分介質LPA(去活條件)的制備和配制篩分介質LPA(去活條件)的制備和配制同實施例二。
毛細管電泳實驗的條件同實施例二。
2％高分子體系LPA用作篩分介質所得到的DNA分離譜圖，如圖5所示。其中309/310組分的峰分離函數p＝0.93，Rs＝0.67。
權利要求
1.一種用于毛細管電泳分離DNA片段的篩分溶液體系，其特征是該篩分溶液體系的pH為6.5-7.5之間。
2.根據權利要求1所述的篩分溶液體系，其特征在于該篩分溶液體系的pH為7.0。
3.根據權利要求1所述的篩分溶液體系，其特征在于所述的篩分溶液體系由篩分介質和基體緩沖溶液組成，所述的篩分介質為水溶性高分子，所述的基體緩沖溶液可以為NaH2PO4-Na2HPO4磷酸鹽溶液，KH2PO4-K2HPO4磷酸鹽溶液，(NH4)H2PO4-(NH4)2HPO4磷酸鹽溶液或N，N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)-NaOH緩沖溶液。
4.根據權利要求3所述的篩分溶液體系，其特征在于所述的基體緩沖溶液為NaH2PO4-Na2HPO4磷酸鹽溶液。
5.根據權利要求3所述的篩分溶液體系，其特征在于所述的緩沖液摩爾濃度在5-50mmol/L之間。
6.根據權利要求3所述的篩分溶液體系，其特征在于所述的緩沖液摩爾濃度在20mmol/L。
7.根據權利要求3所述的篩分溶液體系，其特征在于所述的水溶性高分子可以是線性聚丙烯酰胺(LPA)；線性聚N，N-二甲基丙烯酰胺(PDMA)；線性聚丙烯酰胺與聚乙烯吡咯烷酮的混合物(LPA/PVP)；或者線性聚N，N-二甲基丙烯酰胺與聚乙烯吡咯烷酮的混合物(PDMA/PVP)。
8.根據權利要求3所述的篩分溶液體系，其特征在于所述的水溶性高分子的含量為0.5-4％，其中高分子溶液濃度單位為w/v。
9.根據權利要求3所述的篩分溶液體系，其特征在于所述的水溶性高分子的含量為2％，其中高分子溶液濃度單位為w/v。
10.根據權利要求3所述的篩分溶液體系，其特征在于體系中加入螯合劑EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)。
11.根據權利要求10所述的篩分溶液體系，其特征在于體系中螯合劑EDTA的含量在0-2mmol/L。
12.根據權利要求3所述的篩分溶液體系，其特征在于體系中加入DNA變性劑尿素或甲酰胺。
13.根據權利要求12所述的篩分溶液，其特征在于體系中尿素的含量為3.5-8mol/L；或者甲酰胺的含量為10％-50％，濃度單位為v/v。
14.權利要求1～15中任意一項所述的篩分溶液體系用于毛細管電泳在紫外檢測條件下分離相差一個堿基的DNA片段的用途。
全文摘要
本發明提供了一種用于毛細管電泳分離DNA片段的低pH篩分溶液體系。其基體緩沖溶液的pH值在6.5～7.5左右，優選為7.0左右。該篩分體系可用于毛細管電泳在紫外檢測條件下分離相差一個堿基的DNA片段。
文檔編號C07H1/06GK1560067SQ200410016929
公開日2005年1月5日 申請日期2004年3月12日 優先權日2004年3月12日
發明者許旭, 王前, 戴立信, 許 旭 申請人:中國科學院上海有機化學研究所