專利名稱：一種提取、純化牛初乳中的IgG的方法
技術領域：
本發明涉及一種提取、純化牛初乳中的IgG的方法，具體是利用制備色譜技術提取、純化牛初乳中的IgG。
背景技術：
免疫球蛋白(Immunoglobulin，簡稱Ig)是牛初乳和常乳中最引人注目的免疫因子，初乳中富含的多種免疫球蛋白(IgG、IgM等)能夠形成抗體，與病源微生物及毒素等抗原結合，在哺乳動物新生幼仔自身免疫系統發育成熟、正常運作之前，可以保護其免受病源體的侵襲。牛初乳中免疫球蛋白(Immunoglobulin，簡稱Ig)有IgG、IgA、IgM、IGD和IgE等種類，而且對于每一類還可以有更細致的分類。因此如果要從Ig中分離出IgG而且要達到很高的濃度(效價)，單純依靠一般效率的分離手段是很難完成的，目前已有一些提取牛初乳中的IgG的方法，但這些方法存在著提取、純化出的IgG含量低、工藝復雜等不足。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種工藝簡單、提取純化出的IgG含量高的一種提取、純化牛初乳中的IgG的方法。本發明的技術方案是本發明的提取、純化方法步驟如下1、將收集到的牛初乳過濾，利用離心機在30℃-50℃離心脫脂，將脫脂后的牛初乳在60℃-65℃巴氏消毒；2、加鹽析物質沉淀去除酪蛋白及無抗體活性蛋白；3、乳清脫鹽、除糖，鹽析、透析將去除酪蛋白及無抗體活性蛋白的上清液經強酸型樹脂(Catex，Na+型)處理，去除過量的鹽析物質；在乳清中加入分析純硫酸銨，使其飽和度達到35％，4℃靜置12-13h，在4℃下離心25-35min，保留沉淀，用原乳清液體積5％的PBS(磷酸鹽緩沖液，pH6.8，0.01mol/L)溶解沉淀，將沉淀置入透析袋中，在4℃下對PBS透析至透析液中無NH+4存在(或用5000道爾頓的中空纖維膜超濾至無NH+4存在)，然后凍干，得到IgG初步分離濃縮產物；4、離子交換柱層析分離純化；5、凝膠過濾層析純化，純化后即可得含量達90％以上的IgG。
本發明由于選擇合適的離子交換填料和凝膠過濾填料(選擇以SepharoseFF為基架的離子交換介質DEAE Sepharose F.F選擇凝膠過濾填料Sephacry/s-200HR)，利用制備色譜技術提取、純化牛初乳中的IgG.，并選擇二甲基十二烷基芐基溴化銨作為鹽析物質，沉淀去除不具備抗體活性的初乳蛋白，簡化了生產工藝，使提取、純化出的牛初乳中的IgG.含量可達90％以上。
具體實施例方式1、將收集到的牛初乳在4-10℃過濾，利用4000r/min離心機，30℃-50℃離心脫脂，將脫脂后的牛初乳在60℃-65℃巴氏消毒25-35min之后冷凍保藏；2、將冷凍的脫脂牛初乳室溫解凍并升溫至20℃-30℃，攪拌下緩慢加入等體積的2％ DMLDAB(二甲基十二烷基芐基溴化胺)水溶液，調節pH7.9-pH8.1，沉淀酪蛋白及各種無抗體活性的的初乳蛋白組分，將渾濁混合物加熱至43℃-45℃，冷卻至室溫，沉淀15-20小時，離心18-25min除去沉淀，保留上清液；3、上清液經強酸型樹脂(Catex，Na+型)處理，去除過量的DMLDAB；在乳清中加入分析純硫酸銨，使其飽和度達到35％，4℃靜置12-13小時，在4℃下離心25-35min，保留沉淀；用原乳清液體積5％的PBS(磷酸鹽緩沖液，pH6.8，0.01mol/L)溶解沉淀，將沉淀置入透析袋中，在4℃下對PBS透析至透析液中無NH+4存在(或者用5000道爾頓的中空纖維膜超濾至無NH+4存在)。然后凍干，得到IgG初步分離濃縮產物；4、離子交換柱層析分離純化(1)離子交換柱填充及連接填料采用DEAE Sepharose F.F(安法瑪西亞，amersham pharmacia biotech)，將柱填料分別用蒸餾水、0.5mol/L NaOH溶液處理，然后用pH7.4，0.01mol/L的PBS平衡，在0.3MPa下填充到規格為45mmi.d.×200mm的離子交換柱管中，制成DEAE Sepharose F.F離子交換柱。將離子交換柱管部分安裝到用生化培養箱改制的冷阱柱箱中(溫控范圍2℃-50℃)，將梯度轉換接頭與P2000高效液相色譜泵連接(將泵的最小壓力設置為“0”MPa)。用UV200紫外檢測器檢測，402色譜工作站記錄繪圖；(2)、樣品準備及上樣洗脫取2.0g IgG初步分離的樣品，用pH7.4，0.01mol/L的PBS30mL溶解，置于透析袋中，然后在4℃下對2500mL的pH7.4，0.01mol/L的PBS透析24h后上樣，上樣后分別采用3種洗脫液進行分段洗脫(用TSP高效液相色譜系統的P2000二元梯度泵代替普通的梯度混合器)，第一階段采用pH7.4，0.01mol/L的PBS洗脫；第1個峰流出后，再采用pH5.4，0.02mol/L的PBS進行第二階段洗脫；第2個峰流出后，改用pH5.4，0.08mol/L的PBS洗脫至第3個峰流出，洗脫體積流速為300mL/h，分離過程中控制柱溫為4℃；5、凝膠過濾層析純化采用Sephacryl S-200 HR凝膠過濾填料(安法瑪西亞，amersham pharmacia biotech)進行凝膠過濾層析，將填料在0.2MPa下填充到16mmi.d.×800mm凝膠過濾柱管中。填充后，用pH7.6，0.005mol/LPBS在4℃下平衡12h，體積流速為36mL/h。將DEAESepharose F.F分離得到的3個峰分別用pH7.6，0.005mol/L的PBS溶解并上樣，洗脫液為pH7.6，0.005mol/L的PBS，洗脫體積流速為36mL/h。分離過程中控制柱溫為4℃，根據組分的保留時間，用BS-100A型自動餾分收集器將3個峰收集并凍干。即獲IgG純品，IgG含量為90％以上。
權利要求
1.一種提取、純化牛初乳中的IgG的方法，其特征在于其步驟為(1)、將收集到的牛初乳過濾，利用離心機在30℃-50℃離心脫脂，將脫脂后的牛初乳在60℃-65℃巴氏消毒；(2)、加鹽析物質沉淀去除酪蛋白及無抗體活性蛋白；(3)、乳清脫鹽、除糖、鹽析、透析將去除酪蛋白及無抗體活性蛋白的上清液經Catex，Na+型強酸型樹脂處理，去除過量的鹽析物質；在乳清中加入分析純硫酸銨，使其飽和度達到35％，4℃靜置12-13h，在4℃下離心25-35min，保留沉淀，用原乳清液體積5％的pH6.8，0.01mol/L磷酸鹽緩沖液PBS溶解沉淀，將沉淀置入透析袋中，在4℃下對PBS透析至透析液中無NH+4存在，或用5000道爾頓的中空纖維膜超濾至無NH+4存在，凍干后得到IgG初步分離濃縮產物；(4)、用離子交換柱層析分離純化；(5)、凝膠過濾層析純化，即可得IgG純品。
2.如權利要求1所述的一種提取、純化牛初乳中的IgG的方法，其特征在于所述的去除酪蛋白及無抗體活性蛋白的方法中所用的鹽析物質是二甲基十二烷基芐基溴化胺水溶液，其方法的步驟是將脫脂消毒后的牛初乳在20℃-30℃下，攪拌緩慢加入等體積的2％的二甲基十二烷基芐基溴化胺水溶液，調節pH7.9-pH8.1，沉淀各種無抗體活性的的初乳蛋白組分，將渾濁混合物加熱至43℃-45℃，冷卻至室溫，沉淀15-20小時，離心18-25min除去沉淀，保留上清液。
3.如權利要求1所述的一種提取純化、牛初乳中的IgG的方法，其特征在于所述的離子交換柱層析分離純化的方法的步驟是(1)離子交換柱填充及連接填料采用DEAE Sepharose F.F(安法瑪西亞，amersham pharmacia biotech)，將柱填料分別用蒸餾水、0.5mol/LNaOH溶液處理，然后用pH7.4，0.01mol/L的PBS平衡，在0.3MPa下填充到規格為45mm i.d.×200mm的離子交換柱管中，制成DEAESepharose F.F離子交換柱。將離子交換柱管部分安裝到用生化培養箱改制的冷阱柱箱中，溫控范圍2℃-50℃，將梯度轉換接頭與P2000高效液相色譜泵連接，將泵的最小壓力設置為“0”MPa，用UV200紫外檢測器檢測，402色譜工作站記錄繪圖；(2)、樣品準備及上樣洗脫取2.0g IgG初步分離的樣品，用pH7.4，0.01mol/L的PBS30mL溶解，置于透析袋中，然后在4℃下對2500mL的pH7.4，0.01mol/L的PBS透析24h后上樣，上樣后分別采用3種洗脫液進行分段洗脫，第一階段采用pH7.4，0.01mol/L的PB洗脫；第1個峰流出后，再采用pH5.4，0.02mol/L的PBS進行第二階段洗脫；第2個峰流出后，改用pH5.4，0.08mol/L的PBS洗脫至第3個峰流出，洗脫體積流速為300mL/h，分離過程中控制柱溫為4℃。
4.如權利要求1所述的一種提取純化牛初乳中的IgG的方法，其特征在于所述的凝膠過濾層析純化的方法的步驟是用SephacrylS-200 HR凝膠過濾填料(安法瑪西亞，amersham pharmacia biotech)進行凝膠過濾層析，將填料在0.2MPa下填充到16mm i.d.×800mm凝膠過濾柱管中，填充后，用pH7.6，0.005mol/L PBS在4℃下平衡12h，體積流速為36mL/h，將DEAE Sepharose F.F分離得到的3個峰分別用pH7.6，0.005mol/L的PBS溶解并上樣，洗脫液為pH7.6，0.005mol/L的PBS，洗脫體積流速為36mL/h，分離過程中控制柱溫為4℃，根據組分的保留時間，用BS-100A型自動餾分收集器將3個峰收集并凍干即可得IgG純品。
全文摘要
一種提取純化牛初乳中的IgG的方法，步驟如下將收集到的牛初乳過濾，離心脫脂，將脫脂后的牛初乳巴氏消毒；加鹽析物質去除酪蛋白及無抗體活性蛋白；乳清脫鹽、除糖鹽析、透析；用離子交換柱層析法分離純化；凝膠過濾層析純化，即可得IgG。本發明利用制備色譜技術提取、純化牛初乳中的IgG.，簡化了生產工藝，使提取、純化出的牛初乳中的IgG.含量可達90％以上。
文檔編號C07K16/04GK1660905SQ20041001358
公開日2005年8月31日 申請日期2004年2月27日 優先權日2004年2月27日
發明者張瀟宇, 鄭永杰, 王曉工, 薄金嶺, 諸曉強, 楊秀茹, 遲濤, 王雪蓮 申請人:黑龍江省乳品工業技術開發中心