磷酸化肽的標記方法及選擇吸附方法，使用于該方法的配位化合物、該配位化合物的制造...的制作方法

專利名稱：磷酸化肽的標記方法及選擇吸附方法，使用于該方法的配位化合物、該配位化合物的制造 ...的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種磷酸化肽的標記方法及選擇吸附方法，可使用于該方法的配位化合物、該配位化合物的制造方法及可用作該制造方法的原料化合物。
背景技術：
有種生物體內的酶，在以其活性中心或變構部位為代表的特定部位上具有絲氨酸及蘇氨酸、酪氨酸殘基，它們的羥基由被稱為激酶的酶磷酸化或脫磷酸化調節其酶活性。或者，有的酶通過賴氨酸、精氨酸、組氨酸的氨基或亞氨基及天冬氨酸、谷氨酸的羧基被磷酸化(或脫磷酸化)來調節其酶活性。
作為上述磷酸化—脫磷酸化調節酶活性的代謝系統，熟知的是糖原合成的抑制及其分解系統。該代謝系統主要由磷酸化—脫磷酸化進行階式控制及其酶活性的調節。
近年來，人們明白，上述磷酸化—脫磷酸化在有關疾病的代謝系統中具有重要的作用。
例如，對于細胞的癌變，磷酸化—脫磷酸化的異常被認為是一個原因。即，細胞周期的進行及停止由酶(蛋白質)的磷酸化(或脫磷酸化)控制，上述磷酸化(或脫磷酸化)與周期素及其依賴的激酶(CDK)有關。但如果上述功能受到損傷，則磷酸化(或脫磷酸化)發生紊亂，其結果引發細胞的增殖異常。
另外，人們明白，蛋白激酶C關系到作為特應性皮炎(atopic dermatitis)及花粉癥(pollen allergy)等過敏性疾病原因的組胺的脫顆粒(degranulation)，及發生于阿耳茨海默病患者的腦中的神經原纖維變化(neurofibrillary tangle)也源于磷酸化的T型蛋白質(tau protein)。
因此，把握蛋白質的磷酸化—脫磷酸化的狀況，不僅有利于生物體組織細胞的基因的發現探索，或酶活性的評價，也可有利于疾病的診斷、治療。
可是，以往使用的磷酸化蛋白質(或脫磷酸化蛋白質)的檢定(鑒定)方法存在各種缺陷。
例如，酶免疫法雖然具有這樣的優點即使作為對象的蛋白質試樣微量也可進行分析，但要獲得足夠量的必要抗體卻有困難。另外，對象蛋白質在幾個kDa以下時，無法配制結合于蛋白質中的磷酸化部位的抗體。
又，有人考慮使用由放射性同位素32P所標記的磷酸來檢測對蛋白質的特異結合的方法，但放射性同位素的處理必須注意，對其廢液的管理、處理等也有要求。
再有，磷酸化蛋白質和脫磷酸化蛋白質的電荷不同，因此，也有人考慮應用二維電泳法。然而，在對生物體試樣進行分析的場合，試樣中含有多種類的蛋白質，由此，也使得在二維凝膠上的檢定非常困難。而且，為了在該凝膠上進行檢定而使用放射性同位素，則會發生如上所述的問題。
另外，下列非專利文獻1中記載了鋅的配位化合物。該鋅配位化合物中的兩個鋅離子具有作用于二核苷酸中的磷酸根(磷酸二酯基)，并切斷該酸根的功能。然而，非專利文獻1中的該配位化合物的功能主要是用作催化劑的，有關與磷酸根的配位結合功能，未作任何記載。實際上，根據本發明人的試驗，該配位化合物和兩個核苷之間的磷酸根(磷酸二酯基)的離解常數非常大。即，該配位化合物對磷酸二酯基的配位結合功能很低。
另外，下列非專利文獻2中也記載了具有類似于上述鋅配位化合物結構的鐵的配位化合物。但是，所述鐵的配位化合物是作為氧分子的傳輸蛋白質的蚯蚓血紅蛋白(hemerythrin)的模型合成的。有關該鐵配位化合物與磷酸單酯基的配位結合功能，未作任何記載，也未作任何啟示，這一點如同所述非專利文獻1。
非專利文獻1Yashiro Morio等，″Preparation and Study of Dinuclear Zinc(II)complex forthe Efficient Hydrolysis of the Phosphodiester Linkage in a Diribonucleotide″.《Journal of the chemical Socicty，Chemical communications》，P.1793-1794(1995年)非專利文獻2Hidekazu Arii等，″A novel diiron coplex as a functional Model for hemerythrin″.《Journal of Inorganic Biochemistry》，第82卷，P.153-162(2000年)發明內容在上述狀況下，本發明欲解決的課題在于提供一種容易檢測磷酸化肽(蛋白質)，并對其進行標記的方法，及為精制等處理提供一種磷酸化肽的可選擇吸附方法。
本發明的目的還在于提供一種對于磷酸化肽具有優異的配位結合功能并且可使用上述方法的化合物、該化合物的制造方法及其原料化合物。
本發明人為解決上述課題，就可配位于結合在蛋白質上的磷酸根(磷酸單酯基)的金屬配位化合物作了刻意研究，發現本發明的化合物對于磷酸離子或磷酸單酯中的二個羥基具有極高的配位結合功能，其結果，可強力配位于結合在肽上的磷酸根(磷酸單酯基)，即使是含有多肽的混合試樣也能對磷酸化肽作特異結合，形成復合物，另外，由于本發明的化合物具有標記基團，因此，容易對上述復合物進行檢定。由此，完成了本發明。
即，本發明方法的特征在于由式(I)表示的配位化合物對磷酸化肽進行標記，或有選擇地吸附磷酸化肽。
[式中，X表示結合基，Y表示標記(示蹤)基團。]因此，由于可對磷酸化肽作特異結合，形成復合物，且具有標記基團，由此，使得用上述(I)表示的配位化合物對該復合物檢定容易，特別在生化研究及疾病的診斷治療方面非常有用。
又，在上述方法中，作為上述配位化合物，較好的是使用標記基團為生物素的化合物。因其處理容易，且可應用各種顯色反應，使用方便，可容易檢定磷酸化肽。
上述式(I)表示的配位化合物可由其特征在于包括如下反應式1的方法而容易地制得。
(式中，R1和R2表示用于形成結合基X的反應性基團，Y表示標記基團。)另外，式(II)表示的化合物作為可使用于上述反應式1的化合物，即，制造上述式(I)表示的配位化合物的原料化合物。
(式中，R1表示反應性基團，但，氨甲基、羥甲基、氨基及羧基除外。)根據本發明的磷酸化肽的標記方法，可容易地檢定磷酸化肽(蛋白質)。因此，本發明的方法適用于生物體試樣等，是非常有用的用于疾病的診斷等的標記方法。
再有，本發明的化合物(I)顯示了以往沒有的、對于磷酸化肽的配位結合性，因此，可用作上述方法中所使用的化合物。而且本發明的化合物(I)具有特異吸附在磷酸化肽的特征，可用作精制或濃縮磷酸化肽以及收集磷酸化肽的化學信息。


圖1為本發明的鋅配位化合物的MALDI-TOF質譜。
圖2為對電泳后的凝膠使用本發明的鋅配位化合物進行了染色的結果(A)以及由以往的染色方法再繼續進行了染色的結果(B)。該圖顯示以往的染色方法會染色所有的肽，而本發明方法只染色被磷酸化的肽。
圖3為本發明的鋅配位化合物的MALDI-TOF質譜以及其部分擴大質譜。
圖4為本發明的鋅配位化合物的MALDI-TOF質譜以及其部分擴大質譜。
圖5為在本發明的鋅配位化合物的制造用原料化合物之中，具有生物素用作標記基團的化合物的MALDI-TOF質譜以及其部分擴大質譜。
圖6為在本發明的鋅配位化合物的制造用原料化合物之中，具有生物素用作標記基團的化合物的MALDI-TOF質譜以及其部分擴大質譜。
圖7為本發明的鋅配位化合物的MALDI-TOF質譜以及其部分擴大質譜。
圖8為本發明的鋅配位化合物的MALDI-TOF質譜。
圖9為對電泳后的凝膠使用本發明的鋅配位化合物進行了染色的結果(A)以及由以往的染色方法再繼續進行了染色的結果(B)。該圖顯示以往的染色方法會染色所有的肽，而本發明方法只染色被磷酸化的肽。
具體實施例方式
本發明方法的最大特征在于使具有標記基團的式(I)的配位化合物與磷酸化肽作特異結合，形成復合物，由此，可容易檢定磷酸化肽。
即，以往，已知可與磷酸根結合的金屬配位化合物有各種，但沒有類似于式(I)的化合物、且具有標記基團的配位化合物。本發明人發現使用式(I)的配位化合物，在含有多肽的生物體試樣中，也能極為容易地檢定出磷酸化肽，由此完成了本發明。
以下，舉例說明本發明的標記磷酸化肽的標記方法。
首先，從作為對象的組織細胞配制含有構成該細胞的實質上所有肽的試樣。該配制用生化領域中通常所使用的方法進行。
其次，分離出包含于該試樣中的肽。所述分離方法并無特別的限定，可以使用通常使用的分離方法，例如，使用電泳法。
在使用電泳法時，將泳動后的凝膠浸漬于式(I)表示的配位化合物的溶液中，對磷酸化肽進行標記，根據標記基團的種類選用不同的檢測方法，由此，可檢定磷酸化肽。
可用于式(I)的配位化合物溶液的溶劑，只要是不阻礙磷酸化肽的檢測的即可，并無特別的限定。例如，可使用水(包括緩沖液及其它鹽溶液)；甲醇、乙醇等的醇類；及其混合溶劑等。較好的是，使用水系溶劑。要點是，不使肽改性。
其次，就被用于上述方法的化合物(I)作一說明。

(式中，X表示結合基，Y表示標記基團。)在上述式(I)中，配位金屬選用Zn的理由是，其磷酸化蛋白質的磷酸根(磷酸單酯基)的配位功能極大。
所謂“結合基”，在上述式(I)的化合物中，是將主骨架和標記基團結合的基團，從而具有使得化合物(I)的制造容易，或使標記基團不至于阻礙化合物(I)和結合于肽的磷酸根的配位的作用。因此，在式(I)化合物的制造過程中，容易獲得其標記基團直接結合于主骨架上的原料化合物。在標記基團較小、不阻礙對磷酸根的配位的場合，“結合基”也可以是直接連接主骨架和標記基團的共價鍵。
作為“結合基”，只要是具有上述作用的即可，并無特別的限定。例如，所述“結合基”可舉出C1-C6的亞烷基，氨基(-NH-)，醚基(-O-)，硫醚基，(-S-)，羰基(-C(＝O)-)，亞硫酰基(-C(＝S)-)，酯基，酰胺基，脲基(-NHC(＝O)NH-)，硫脲基(-NHC(＝S)NH-)；其中一端具有選自氨基、醚基、硫醚基、羰基、亞硫酰基、酯基、酰胺基、脲基、硫脲基的C1-C6的亞烷基；其兩端具有同一、或不同的選自氨基、醚基、硫醚基、羰基、亞硫酰基、酯基、酰胺基、脲基、硫脲基的C1-C6的亞烷基；以及選自氨基、醚基、硫醚基、羰基、亞硫酰基、酯基、酰胺基、脲基、硫脲基及C1-C6亞烷基的兩個或者兩個以上的基團成直線狀結合的基團。
這里，“C1-C6的亞烷基”指碳原子數為1至6的直鏈狀或枝鏈狀的二價脂肪族烴基，例如，可舉出亞甲基、亞乙基、亞丙基、四亞甲基、六亞甲基、甲基亞乙基、甲基亞丙基、二甲基亞丙基等。較好的是C1-C4的亞烷基，更好的是C1-C2的亞烷基。
本發明中的“標記基團”只要是在生化領域內通常使用的即可，并無特別的限定。從處理方面來說，含有放射性同位素的標記基團是不理想。所述的“標記基團”可舉出例如熒光顯色基、含有硝基氧化物自由基的基團、生物素等。
“熒光顯色基”指穩定地放出較長波長的熒光的取代基，不考慮水溶性、脂溶性與否，只要是生化領域通常使用的即可，并無特別的限定。作為這樣的“熒光顯色基”，可舉出例如，氨甲基香豆素(aminomethylcoumarin)及其衍生物、聚三氟氯乙烯(fluoroscein)及其衍生物、四甲基若丹明(tetramethylrhodamine)及其衍生物、鄰氨基苯甲酰(anthraniloyl)及其衍生物、硝基苯并惡二唑(nitrobenzoxadiazole)及其衍生物、二甲基氨基萘(dimethylaminonaphthalene)及其衍生物。
“含有硝基氧化物自由基的基團”為具有穩定的自由基的基團，可由電子自旋共振(ESR)檢測磷酸化肽。即，生物體分子通常不具有不成對電子，顯示不出電子自旋共振，但具有“含有硝基氧化物自由基的基團”的化合物(I)配位的肽顯示電子自旋共振，所以，能檢定磷酸化肽。
“生物素”對于來源于卵白的卵白素和來源于放線菌的鏈霉卵白素具有特異且強力的親和性。因此，使卵白素或鏈霉卵白素結合于具有生物素作為標記基團的本化合物(I)，再使生物素化的酶作用，即可通過生物素及卵白素等使本發明的配位化合物和酶作特異結合。而且，作為該酶，如使用堿性磷酸(酯)酶、過氧化物酶、熒光素酶等，使與各種酶對應的顯色劑作用，可以檢定磷酸化肽。例如，使本發明的配位化合物結合在磷酸化肽上，再使堿性磷酸(酯)酶作為酶介于鏈霉卵白素結合在該配位化合物上，顯色劑使用氮藍四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸，反應數小時。由于磷酸化肽顯示紫色，可由此檢定。又，若丹明等的熒光色素標記的鏈霉卵白素市場有售。使用該鏈霉卵白素，可由通常的熒光圖像解析法檢定磷酸化肽。
以下，舉例說明本發明的磷酸化肽的選擇吸附方法。
此時，作為上述標記基團，使用可與特定化合物作特異結合的生物素等。例如，市場有售的結合了鏈霉卵白素的瓊脂糖凝膠，對此使具有生物素的本發明的配位化合物作為標記基團作用其上，則可生成結合有本發明的配位化合物的瓊脂糖凝膠。使試樣混合物作用于該瓊脂糖凝膠上，則可選擇地吸附磷酸化肽。然后，在可脫附磷酸緩沖液等所述可脫附配位化合物和磷酸化肽的條件下，可以僅得到磷酸化肽。即，使用這樣的瓊脂糖凝膠，即使不通過電泳法，也可對磷酸化肽進行提純或濃縮。同樣，結合了鏈霉卵白素的磁性珠在市場上也有售。使用該磁性珠可對磷酸化肽進行提純或濃縮。再有，作為表面胞質團共振(SPR)測定用的平板，可使用市售的結合了鏈霉卵白素的平板。將此作為標記基團，使具有生物素的本發明的配位化合物作用，成為結合了本發明的配位化合物的表面胞質團共振(SPR)的測定用平板。使用該平板測定未知試樣的表面胞質團共振(SPR)，由此，可檢定未知試樣中有無磷酸化肽。
還有，根據化合物(I)，作為具有如同本發明的作用效果的化合物，也可將甲基等導入吡啶環，這樣的等價化合物(即作用效果相同)也包含于本發明的范圍內。
另外，在本發明的化合物中，對(-X-Y)基團的位置并無特別的限定，也可存在于下述化合物(I’)所示的位置。
該化合物(I’)與化合物(I)是在二者的立體結構有差異之外，其他性質完全相同(等價)，通過合成為哪一種化合物并不清楚，實際上，可認為是上述二者的混合物。當然，化合物(I’)也在本發明的范圍內。
上述式(I)表示的配位化合物可由其特征在于包括如下反應式1的方法而容易地制得。
(式中，X、Y定義如同前述。R1和R2表示用于形成結合基X的反應性基團。)在上述反應式中，首先，使反應性基團R1和R2反應，通過結合基X，使標記基團Y導入主骨架上。
因此，R1和R2的種類、溶劑、反應溫度、其它試劑、精制方法等，主要由X的種類決定。例如，通過氨基(仲氨基或叔氨基)導入標記基團時，作為R1和R2的組合，可以舉出在末端具有氨基(伯氨基或仲氨基)的基團和鹵原子等脫離基(elimination group)的組合。此時，一般的反應條件可以舉出在溶劑中堿的存在下，使二化合物縮合的方法。另外，如果R1為活性基團，則標記基團的導入非常容易。
其次，可由在化合物(IV)的溶液中添加金屬鹽得到化合物(I)。例如，可由硝酸鋅(II)和乙酸鋅(II)的添加得到。在添加乙酸鋅(II)的場合，可得到一次配位乙酸的下述化合物。
該化合物比化合物(I)更穩定，便于儲存，但與化合物(I)等價(即作用相同)，可如同化合物(I)進行使用。即，在肽混合物中，由于加入上述化合物，磷酸單酯基可與乙酸進行交換配位，因此可以檢測磷酸化肽。
化合物(I)的原料化合物，即化合物(II)，可由以下反應式2合成。
(式中，R1與前面的定義相同。“Hal”表示鹵原子，較好的是溴原子。)作為原料化合物的化合物(VI)的(1，3-二氨基-2-丙醇)可使用市售產品。又，化合物(VII)和化合物(IX)的結構較為簡單，即可以使用市售產品，也可以由本領域技術人員用熟知方法合成制得。
在反應式2中，首先，在催化劑的存在下，使化合物(VI)和(VII)進行縮合反應，從而得到化合物(VIII)。所述反應可分步導入化合物(VII)，也可通過使用3當量(等效量)或者3當量以上的化合物(VII)用一步反應得到化合物(VIII)。
在反應式2中，作為縮合反應進行還原性氨基化反應。此時，所使用的溶劑，可實質性溶解化合物(VI)和化合物(VII)，只要是不妨礙反應的溶劑皆可，并無特別的限定。例如，可以使用如甲醇、乙醇、異丙醇等醇類；如二乙醚、四氫呋喃、二惡烷等的醚類；水；或其混合溶劑。
在還原性氨基化反應中，首先使化合物(VI)和化合物(VII)在有作為催化劑的濃鹽酸下縮合，然后，由通常的還原劑還原。
反應溫度和反應時間可根據原料化合物的種類等采用適當的條件，例如，可以在20-80℃時反應12-100小時。
反應完畢后，減壓蒸餾去除溶劑等，加水，萃取出非水溶性溶劑，用無水硫酸鎂等干燥油層之后，減壓蒸餾去除溶劑。殘余物以硅膠柱色譜法等公知方法提純，得到化合物(VIII)。
化合物(VIII)的制備方法并不限于反應式2所示的方法，例如，可從化合物(VI)和鹵化物合成化合物(VIII)。
其次，由化合物(IX)的反應，可制得化合物(II)。該反應可采用常規的叔胺合成反應。例如，使之在溶劑中存在堿的條件下縮合。在該步驟中，根據R1的不同，也可導入適當的保護基并進行脫保護。或者，取代化合物(IX)中的R1，使用具有惰性取代基(inactive substituent group)的化合物。進行上述步驟之后，由官能基團的變換，將上述惰性取代基變換為R1，由此，也可合成化合物(II)。例如，上述惰性取代基使用含有硝基的化合物，在進行所述步驟之后，將硝基變換為反應性基團的氨基。
作為本發明的方法中使用的化合物，也可取代化合物(I)，使用以下的化合物(X)。
(式中，X、Y的定義與前述相同。R3-R5表示吡啶環的4或6位上的供電子取代基。)在本發明的方法中使用的化合物(X)，藉由導入適當取代位置上的供電子取代基，其供電子功能富集吡啶氮。由此，使其具有對于鋅的優異的配位性能，其結果，制造容易，且具有穩定性。
有關化合物(X)的使用方法、制造方法、原料化合物，也可參照化合物(I)使用。
下面舉制造例及試驗例，更詳細地說明本發明內容。但本發明的范圍并不限定于此。下述實施例是根據上述必要條件選擇的例子，根據上述記載適當地改變結構也可以得到本發明效果。因此本發明當然不受下述實施例的限制，在能夠適合上述·下述宗旨的范圍進行適當變更也可以實施，它們均包含在本發明的技術范圍內。
實施例制造例1-1 6-溴甲基煙酸甲酯 對6-甲基煙酸甲酯50g(331mmol)的四氯化碳(625mL)溶液，添加N-溴丁二酰亞胺59g(331mmol)再添加過氧化苯甲酰1.0g。然后，在用射光器進行光照射的同時在40-50℃反應24小時。
反應液冷卻后，過濾析出的結晶，過濾液用碳酸氫鈉水溶液洗凈后，濃縮。得到的殘余物用硅膠柱色譜法提純，得到37g的目的產物。NMR檢測結果如下1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ3.96(3H，s，OCH3)，4.58(2H，s，CH2Br)，7.54(1H，d，Py)，8.30(1H，dd，Py)，9.17(1H，d，Py)。
制造例1-2 N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-1，3-二氨基丙烷-2-醇 對1，3-二氨基丙烷-2-醇32.6g(362mmol)的甲醇(2400mL)溶液，添加濃鹽酸60mL，再滴下2-吡啶醛116.3g(1.09mol)。然后，添加氰基三氫硼酸鈉50.16g(798mmol)。添加完畢后，在室溫下反應3天。
反應液中加入濃硫酸，調節pH至6后，濃縮到-定程度，加入0.1N的氫氧化鈉水溶液，調節pH至7，用氯仿萃取。收集該氯仿層，干燥后濃縮。得到的殘余物以硅膠柱色譜法提純，得到34g的目的產物。NMR檢測結果如下1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ2.59-2.83(4H，m，CH2)，3.86-4.01(7H，m，NCH2Py，CH)，7.15(3H，dd，Py)，7.23-7.32(3H，m，Py)，7.56-7.65(3H，m，Py)，8.53(3H，dd，Py)。
制造例1-3 N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-(5-甲氧基羰基-2-吡啶甲基)-1，3-二氨基丙烷-2-醇 對實施例1-2制得的N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-1，3-二氨基丙烷-2-醇18.2g(50mmol)的干燥二甲基甲酰胺(150mL)溶液，添加碳酸鉀13.8g(100mmol)，滴入實施例1-1制得的6-溴甲基煙酸甲酯11.5g(50mmol)的干燥二甲基甲酰胺(75mL)溶液。滴下后，于50℃反應1小時。
反應后，冷卻溶液，然后，投入750mL水中，用1N的鹽酸調節pH至8。用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯層，用水、飽和食鹽水洗凈后，濃縮。得到的殘余物以硅膠柱色譜法提純，得到21.5g的目的產物。NMR檢測結果如下1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ2.58-2.73(4H，m，CH2)，3.83-3.95(12H，m，OCH3，NCH2Py，CH)，7.10-7.14(3H，m，Py)，7.34(3H，d，Py)，7.50-4.60(4H，m，Py)，8.17(1H，dd，Py)，8.50(3H，d，Py)，9.09(1H，d，Py)。
制造例1-4 N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[5-N″-(2-氨基乙基)氨基甲酰-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇 對實施例1-3制得的N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-(5-甲氧基羰基-2-吡啶甲基)-1，3-二氨基丙烷-2-醇9.7g(18.9mmol)的甲醇(100mL)溶液，滴下乙二胺22.7g(378mmol)，滴下后，在室溫下反應3天。反應后，濃縮溶液，得到的殘余物以硅膠柱色譜法提純，得到9.72g的目的產物。NMR檢測結果如下1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ2.54-2.71(4H，m，CH2)，2.94(2H，t，CH2N)，3.49(2H，dt，CH2N)，3.80-3.99(9H，m，NCH2Py，CH)，7.12(3H，ddd，Py)，7.35(3H，d，Py)，7.45(1H，d，Py)，7.58(3H，ddd，Py)，8.02(1H，dd，Py)，8.49(3H，ddd，Py)，8.89(1H，d，Py)。
制造例1-5 N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[5-N″-(7-硝基-2，1，3-苯并惡二唑-4-基氨基乙基)氨基甲酰-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇 對在實施例1-4制得的N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[5-N″-(2-氨基乙基)氨基甲酰-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇200mg(0.37mmol)的乙腈(20mL)溶液中，先后添加碳酸氫鈉336mg(4.0mmol)及4-氯-7-硝基-2，1，3-苯并惡二唑73.8g(0.37mmol)，在室溫下反應2小時。
反應后，濃縮溶液，加入二氯甲烷50mL和水50mL，進行分液。二氯甲烷層用無水硫酸鈉干燥后，所得到的殘余物以硅膠柱色譜法提純，得到71.2g的目的產物。NMR檢測結果如下1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ2.46-2.69(4H，m，CH2)，3.65-3.95(13H，m，NCH2CH2N，NCH2Py，CH)，6.06(1H，d，Ar)，7.08-7.13(3H，m，Py)，7.32(3H，d，Py)，7.42(1H，d，Py)，7.56(3H，ddd，Py)，7.96(1H，dd，Py)，8.44-8.48(3H，m，Py)，8.19(1H，d，Ar)，8.83(1H，d，Py)。
制造例1-6本發明的鋅配位化合物溶液 將上述制造例1-5合成的化合物作成濃度為50μM的水溶液，加入2倍摩爾的硝酸鋅，配制本發明的鋅配位化合物溶液。
又，用下述方法確認鋅配位化合物的存在。即，將在上述制造例1-5制得的化合物溶解于磷酸緩沖液(pH＝6.86)，作成濃度為50μM的溶液，加入2倍摩爾的硝酸鋅。在該溶液中，本發明的鋅配位化合物具有下述結構，由MALDI-TOF質譜確認。質譜檢測條件如下基質(Matrix) 2’，4’，6’-三羥基乙酰苯(THAP)檢測方式(Mode)反射方式(reflector)加速電壓(Accelerating Voltage)20000V極電壓(Grid Voltage) 57.500％激光強度(Laser) 2500檢測次數(Scans Averaged) 128真空度(Pressure) 5.05e-07 C36H37N11O9PZn2Mol.Wt.929.49Exact Mass926.11由MALDI-TOF質譜確認的結果示于圖1。圖1中，分子離子峰被觀察到為926.2(exactmass926.11)，910.24峰值可認為是惡二唑基的氧脫離后的峰值。
制造例2-1N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[5-N″-(2-D-生物素氨乙基)氨基甲酰-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇 對D-生物素137mg(0.56mmol)的二甲基甲酰胺(10mL)溶液，先添加1，1’-羰基二咪唑116mg(0.72mmol)，在室溫下反應12小時。其后，冰冷反應液，將在制造例1-4制得的N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[5-N″-(2-氨基乙基)氨基甲酰-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇260mg(0.48mmol)的二甲基甲酰胺(3mL)溶液滴下，移出冷卻浴，在室溫下反應2小時。
反應完畢后，反應液倒入水50mL中，用氯仿50mL萃取二次。濃縮氯仿層后得到的粗制品用硅膠柱色譜法提純，得到265mg的目的產物。NMR檢測結果如下1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ1.27-1.47(2H，m，CH2)，1.50-1.75(4H，m，CH2)，2.13-2.26(2H，m，COCH2)，2.52-2.74(5H，m，NCH2，SCH2)，2.79-2.88(1H，m，SCH2)，3.01-3.12(1H，m，SCH)，3.43-3.65(4H，m，NCH2CH2N)，3.80-4.02(9H，m，NCH2Py，CHO)，4.22-4.28(1H，m，NCH)，4.42-4.49(1H，m，NCH)，5.83(1H，bs，NHCO)，6.60(1H，bs，NHCO)，7.07-7.18(3H，m，Py)，7.31-7.38(3H，m，Py)，7.44(1H，d，Py)，7.59(3H，ddd，Py)，8.03(1H，dd，Py)，8.15(1H，bs，NHCO)，8.42-8.58(3H，m，Py)，8.94(1H，d，Py)。
制造例2-2本發明的鋅配位化合物溶液 將在上述制造例2-1合成的化合物溶解于磷酸緩沖液(pH＝6.86)，作成濃度3mM的溶液，加入2倍摩爾的硝酸鋅。
在該溶液中，本發明的鋅配位化合物具有下述結構，由MALDI-TOF質譜(基質為2’，4’，6’-三羥基乙酰苯)確認。
C40H50N10O8PSZn2Mol.Wt.992.69Exact Mass989.19出MALDI-TOF質譜確認的結果示于圖3。圖3中，分子離子峰被觀察到為989.6(exactmass989.17)。
試驗例1 10％的Native聚丙烯酰胺電泳凝膠首先，在下述條件下，配制電泳凝膠、電泳用pH緩沖液和試樣溶解用色素液。
濃縮凝膠125mM三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)-鹽酸緩沖液(pH6.8)4.5％(w/v)聚丙烯酰胺(丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺＝30∶1)分離凝膠375mM三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH8.8)10％(w/v)聚丙烯酰胺(丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺＝30∶1)電泳用pH緩沖液(pH8.3)25mM三(羥甲基)氨基甲烷190mM甘氨酸試樣溶解用色素液(3倍濃縮液)195mM三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH6.8)10％(w/v)丙三醇0.1％(w/v)BPB(溴酚藍為泳動色素標記物)其次，分別將1牛血清白蛋白、2β-酪蛋白(磷酸化型)、3β-酪蛋白(脫磷酸化型)各2μg溶解于試樣溶解用色素液。作為試樣，將其標繪于配制成的電泳用凝膠后，進行4mA的恒電流電泳，直至泳動色素標記流出。
將得到的凝膠浸漬于上述制造例1-6中配制的本發明的鋅配位化合物溶液(50μM)中約30分鐘。然后，從溶液中取出，在由UV燈照射紫外線之下攝影拍照。然后，用科麥西艷藍進行常規染色、攝影拍照。在由本發明的鋅配位化合物溶液染色后的凝膠作為A，接著將科麥西艷藍染色后的凝膠作為B，如圖2所示。
如圖2所示，根據本發明的方法，只能檢定結合了磷酸的β-酪蛋白(2)。由此可以明白，根據本發明的方法，可從生物體試樣只檢定出磷酸化肽。
制造例3-1N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[5-N″-2-(6-D-生物素酰胺六羧基酰胺基乙基)氨基甲酰-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇
對實施例1-4制得的N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[5-N″-(2-氨基乙基)氨基甲酰-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇113mg(0.21mmol)的乙腈(10mL)溶液，滴下5-(N-丁二酰亞胺基氧代羰基)戊基D-生物素酰胺95mg(0.21mmol)的二甲基亞砜(2mL)溶液。
在室溫反應6小時后，濃縮溶液，所得到的粗制品以硅膠柱色譜法提純，得到136mg的目的產物(產率為76％)。NMR檢測結果如下1H-NMR(CDCl3，500MHz)δ1.25-1.32(2H，m，CH2)，1.38-1.47(4H，m，CH2)，1.56-1.67(5H，m，CH2)，1.68-1.77(1H，m，CH2)，2.11-2.22(4H，m，COCH2)，2.58(2H，dd，J＝8.0 and 13.3Hz，NCH)，2.66(1H，dd，J＝3.9 and 13.3Hz，NCH)，2.68(1H，dd，J＝3.9and 13.3Hz，NCH)，2.71(1H，dd，J＝3.0 and 13.3Hz，SCH)，2.88(1H，dd，J＝5.2 and 13.0Hz，SCH)，3.07-3.21(3H，m，NCH，SCH)，3.45-3.59(4H，m，NCH2)，3.82-3.91(8H，m，NCH2Py)，3.94(1H，tt，J＝3.9 and 8.0Hz，OCH)，4.28-4.32(1H，m，NCH)，4.46-4.50(1H，m，NCH)，5.62(1H，bs，NHCO)，6.40(1H，bs，NHCO)，6.62(1H，t，J＝5.7Hz，NHCO)，7.10-7.14(3H，m，Py)，7.23(1H，t，J＝6.0Hz，NHCO)，7.32-7.36(3H，m，Py)，7.43(1H，d，J＝8.2Hz，Py)，7.56-7.61(3H，m，Py)，8.06(1H，dd，J＝2.3 and 8.2Hz，Py)，8.17(1H，t，J＝5.0Hz，NHCO)，8.46-8.50(3H，m，Py)，8.96(1H，d，J＝2.3Hz，Py)。
13C NMR(CDCL3，125MHz)δ25.0(CH2)，25.5(CH2)，26.2(CH2)，27.7(CH2)，27.8(CH2)，29.0(CH2)，35.6(CH2CO)，36.1(CH2CO)，39.0(CH2NH)，39.3(CH2NH)，40.7(CH2S)，41.0(CH2NH)，55.6(CH2S)，59.2(CH2N)，60.2(CHNH)，60.7(CH2Py)，60.8(CH2Py)，61.0(CH2Py)，61.8(CHNH)，67.4(CHOH)，122.1(Py)，122.8(Py)，123.2(Py)，128.5(Py)，135.6(Py)，136.5(Py)，148.0(Py)，149.0(Py)，159.3(Py)，159.4(Py)，162.6(Py)，163.9(NCON)，166.3(CONH)，173.4(CONH)，174.9(CONH)。
制造例3-2本發明的鋅配位化合物溶液
C46H61N11O9PSZn2Mol.Wt.1105.85Exact Mass1102.27將在上述制造例3-1合成的化合物(200nmol)溶解于磷酸緩沖液(pH＝6.86)，作成濃度3mM的溶液，加入2倍摩爾的硝酸鋅。
該溶液由MALDI-TOF質譜(基質為2’，4’，6’-三羥基乙酰苯)分析確認上述鋅配位化合物的存在。MALDI-TOF質譜的確認結果示于圖4。圖4中，分子離子峰被觀察到為1102.3(exact mass1102.27)。
試驗例2鏈霉酶卵白素瓊脂糖(結合生物素的部位的量為60-120nmol/mL)和緩沖液的懸浮液0.3mL(西格馬公司Sigma-Aldrich Co.制)填充于離心式過濾組件(容量0.5mL，濾芯孔徑0.22μm)，置于離心分離機中進行15秒離心分離(離心加速度為2000×g)，過濾緩沖液。接著，將5.0mM的三(羥甲基)氨基甲烷乙酸鹽(Tris-acetate)緩沖液(pH＝7.4，0.30mL)載持于過濾組件上，置于離心分離機，離心加速度為2000×g作15秒離心過濾操作5次。
將溶解了制造例3-1中合成的化合物(120nmol/mL)和乙酸鋅(500nmol/mL)的5.0mM的三(羥甲基)氨基甲烷乙酸鹽緩沖液(pH＝7.4，0.30mL)載持于上述過濾組件上，平衡化5分鐘之后，置于離心分離機，離心加速度為2000×g作15秒離心過濾。接著，將5.0mM的三(羥甲基)氨基甲烷乙酸鹽緩沖液(pH＝7.4，0.30mL)載持于過濾組件上，置于離心分離機，離心加速度為2000×g作15秒離心過濾操作5次。再將溶解了10nmol/mL乙酸鋅的5.0mM的三(羥甲基)氨基甲烷乙酸鹽緩沖液(pH＝7.4，0.30mL)載持于過濾組件上，置于離心分離機，離心加速度為2000×g作15秒離心過濾操作5次。
其次，將溶解了作為試樣的非磷酸化肽p60c(p60c-srcpeptide 521-533，14nmol/mL)及磷酸化肽P-p60c(O-phosphoryl p60c-srcpeptide 521-533，12nmol/mL)的5.0mM的三(羥甲基)氨基甲烷乙酸鹽緩沖液(pH＝7.4，0.30mL)載持于上述過濾組件上，平衡化5分鐘之后，置于離心分離機，離心加速度為2000×g作15秒離心過濾。該濾液作為組份1。
其次，將5.0mM的三(羥甲基)氨基甲烷乙酸鹽緩沖液(pH＝7.4，0.50M NaNO3，0.30mL)載持于過濾組件上，置于離心分離機，離心加速度為2000×g作15秒離心過濾操作3次。所得濾液分別作為組份2，3，4。
再將1.0mM的磷酸-氫氧化鈉緩沖液(pH＝7.4，0.50M NaNO3，0.30mL)載持于過濾組件上，置于離心分離機，離心加速度為2000×g作15秒離心過濾操作2次。所得濾液分別作為組份5，6。
用高效液相色譜儀(HPLC)定量上述各個組份的肽含量。所得到的分離回收率結果示于表1。
表1

HPLC分析條件柱Capcell Pak C18 type UG 80，4.6mmφ×150mm移動相乙腈/水＝14/86(v/v)，0.1％(v/v)三氟乙酸流速1mL/min柱溫度40℃檢測方法UV 266nm保持時間P-p60c 5.3分鐘，p60c 13.4分鐘根據上述結果證實，如使用本發明的配位化合物，可從磷酸化肽和非磷酸化肽的混合試樣有選擇地分離出磷酸化肽。
比較例1將鏈霉酶卵白素瓊脂糖(結合生物素的部位的量為60-120nmol/mL)和緩沖液的懸浮液0.3mL(西格馬公司制)填充于離心式過濾組件(容量0.5mL，濾芯孔徑0.22μm)，置于離心分離機中進行15秒離心分離(離心加速度為2000×g)，過濾緩沖液。接著，將5.0mM的三(羥甲基)氨基甲烷乙酸鹽緩沖液(pH＝7.4，0.30mL)載持于過濾組件上，置于離心分離機，離心加速度為2000×g作15秒離心過濾操作5次。
對于所得到的過濾組件(無本發明的配位化合物)，使用的試樣如同上述試驗例2的試樣，并進行同樣的處理，得到組份7-12。
就上述得到的組份7-12在如同上述試驗例2的條件下進行HPLC分析。其結果示于表2。
表2

根據上述結果可見，如不使用本發明的配位化合物，則即使進行同樣的處理也無法分離磷酸化肽和非磷酸化肽。
制造例4-1 2-乙酰氧基甲基-4-硝基吡啶

將乙酸酐200mL加熱至100℃，緩慢添加2-甲基-4-硝基吡啶N-氧化物25.0g(162mmol)。添加之后，慢慢升溫，在130℃反應20分鐘。反應液冷卻至80℃，滴下乙醇200mL，使反應停止。濃縮后，將反應液倒入500mL水中，用碳酸氫鈉調節pH至9。用乙酸乙酯(500mL和200mL)萃取之后，用水(200mL)、飽和食鹽水(200mL)洗凈有機層。對濃縮有機層得到的粗制品用硅膠柱色譜法提純，得到7.68g目的產物。NMR檢測結果如下1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ2.23(3H，s，COCH3)，3.36(2H，s，CH2Py)，7.97(1H，dd，Py)，8.07(1H，d，Py)，8.90(1H，d，Py)。
制造例4-2 2-羥甲基-4-硝基吡啶

在上述制造例4-1合成的2-乙酰氧基甲基-4-硝基吡啶7.68g(39.2mmol)中加入10％鹽酸30mL，于50℃反應30分鐘。反應液冷卻后，倒入水200mL中，用碳酸氫鈉調節pH至9。用乙酸乙酯萃取(100mL×3)后，濃縮有機層，得到的殘余物用硅膠柱色譜法提純，得到4.70g目的產物。NMR檢測結果如下1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ3.36(1H，t，OH)，4.94(2H，d，CH2Py)，7.95(1H，ddt，Py)，8.09(1H，dt，Py)，8.86(1H，d，Py)。
制造例4-3 2-溴甲基-4-硝基吡啶 在上述制造例4-2合成的2-羥甲基-4-硝基吡啶1.00g(6.49mmol)的干燥乙醚(40mL)懸浮液中，于0℃時滴下三溴化磷0.88g(3.24mmol)。滴下完畢后在0℃反應2小時，其后在20℃反應64小時。反應液倒入冰水250mL中，用碳酸氫鈉調節pH至8。分離乙醚層和水層之后，用乙酸乙酯萃取水層(100mL×2)，收集有機層，用無水硫酸鈉干燥。蒸餾除去溶劑，得到的粗制品用硅膠柱色譜法提純，得到0.80g目的產物。NMR檢測結果如下1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ4.66(2H，s，CH2Py)，7.96(1H，dd，Py)，8.19(1H，dd，Py)，8.88(1H，dd，Py)。
制造例4-4N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[4-硝基-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇 對上述制造例1-2合成的N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-1，3-二氨基丙烷-2-醇2.65g(7.28mmol)的干燥二甲基甲酰胺(40mL)溶液，添加無水碳酸鉀2.02g(14.6mmol)，升溫至55℃。將上述制造例4-3合成的2-溴甲基-4-硝基吡啶1.58g(7.28mmol)的干燥二甲基甲酰胺(20mL)溶液在同樣溫度時滴下。在55℃反應5小時之后冷卻。將反應液倒入200mL水中，用1N的鹽酸調節pH至8。用乙酸乙酯萃取(400mL×3)，有機層用飽和食鹽水(250mL)洗凈，并用無水硫酸鎂干燥后，濃縮。蒸餾除去溶劑，得到的粗制品用硅膠柱色譜法提純，得到3.30g目的產物。NMR檢測結果如下1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ2.60-2.78(4H，m，NCH2)，3.84-3.96(6H，m，CH2Py)，3.96-4.03(1H，m，OCH)，4.07(2H，s，CH2Py)，7.09-7.14(3H，m，Py)，7.34(3H，t，Py)，7.55-7.62(3H，m，Py)，7.80(1H，dd，Py)，8.22(1H，d，Py)，8.49-8.52(3H，m，Py)，8.76(1H，dd，Py)。
制造例4-5N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[4-迭氮基-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇 對實施例4-4合成的N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[4-硝基-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇1.01g(2.00mmol)溶解于干燥四氫呋喃(17mL)，室溫下滴入迭氮化鈉156mg(2.40mmol)的水(3.3mL)溶液，將反應液升溫至50℃。在該溫度下反應17小時。冷卻后用氯仿(10mL×2)萃取水層，濃縮有機層，得到的粗制品用硅膠柱色譜法提純，得到980mg目的產物。NMR檢測結果如下1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ2.58-2.74(4H，m，NCH2)，3.83-3.92(8H，m，CH2Py)，3.92-4.01(1H，m，OCH)，6.74(1H，dd，Py)，7.09-7.14(3H，m，Py)，7.20(1H，d，Py)，7.32-7.36(3H，m，Py)，7.55-7.60(3H，m，Py)，8.39(1H，d，Py)，8.49-8.52(3H，m，Py)。
制造例4-6N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[4-氨基-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇
對實施例4-5合成的N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[4-迭氮基-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇980mg(1.98mmol)的乙醇溶液(20mL)，添加氧化鉑100mg。在氫氣壓30kPa下反應2小時。過濾除去催化劑，濃縮濾液，得到的粗制品用硅膠柱色譜法提純，得到690mg目的產物。NMR檢測結果如下1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ2.43-2.71(4H，m，NCH2)，3.66-3.92(8H，m，CH2Py)，3.92-4.01(1H，m，OCH)，6.35(1H，dd，Py)，6.63(1H，d，Py)，7.08-7.14(3H，m，Py)，7.27-7.39(3H，m，Py)，7.54-7.62(3H，m，Py)，8.10(1H，d，Py)，8.49-8.50(3H，m，Py)。
制造例4-7N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[4-D-生物素氨基-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇 在室溫下，將D-生物素62.4mg(0.26mmol)懸浮于二氯甲烷(5mL)，加入4-二甲基氨基吡啶5.2mg(0.04mmol)、三乙胺35.8μL(0.26mmol)。對此，于室溫下滴入在實施例4-6合成的N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[4-氨基-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇100mg(0.21mmol)的二氯甲烷(2mL)溶液，室溫下，添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽49.0mg(0.26mmol)。加熱反應液，回流下反應5小時。對該反應液追加D-生物素6.0mg(0.02mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽10.0mg(0.05mmol)、二氯甲烷(2mL)，再在回流下反應6小時。反應液冷卻后投入水中(40mL)，用氯仿萃取(30mL×3)。有機層用水(30mL×2)、飽和食鹽水(30mL)洗凈，用無水硫酸鎂干燥后，濃縮得到粗制品。該粗制品用HPLC分離提純，得到62.5mg目的產物。NMR檢測結果如下1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ1.37-1.45(2H，m，CH2)，1.53-1.71(4H，m，CH2)，2.19-2.25(2H，m，COCH2)，2.62-2.75(5H，m，NCH2，SCH2)，2.87-2.93(1H，dd，SCH2)，3.09-3.15(1H，m，SCH)，3.67-3.80(9H，m，OCH，NCH2Py)，4.28-4.32(1H，m，NCH)，4.48-4.52(1H，m，NCH)，5.15-5.40(2H，m，NHCO)5.89(1H，bs，NHCO)6.48-6.50(1H，m，Py)，6.72-6.76(1H，m，Py)，7.13-7.17(3H，m，Py)，7.27-7.29(1H，m，Py)，7.37(2H，d，Py)，7.56-7.66(3H，m，Py)，8.00(1H，dd，Py)，8.49-8.50(3H，m，Py)。
該化合物以CHCA(α-氰基-4-羥基肉桂酸)為基質，測定MALDI-TOF質譜。其結果示于圖5。根據圖5，作為質子加成物(proton adduct ion)[M++1]的分子離子峰，觀察到696.3。
制造例5-1 6-氨基己酸甲酯鹽酸鹽 對6-氨基己酸10.0mg(76.2mmol)的甲醇(300mL)懸浮液，加入濃硫酸5.51g。將該懸浮液加熱升溫，蒸餾除去在酯化反應過程中生成的水以及甲醇。在該蒸餾除去過程中，分4次適時加入甲醇(每次60mL)，進行8小時的反應。反應液冷卻后，用28％的甲醇鈉甲醇溶液調節pH至6.2。蒸餾除去溶劑，殘余物投入水500mL中。用碳酸鈉調節pH至10.3。用二氯甲烷萃取(350mL×3)，用無水硫酸鎂干燥。蒸餾除去溶劑。得到的6-氨基己酸甲酯溶解于二惡烷(40mL)，加入4N-鹽酸/二惡烷溶液7.1mL。在室溫下攪拌30分鐘后，蒸餾除去溶劑。殘余物中加入乙醚析出結晶，濾取結晶，減壓干燥，得到3.3g目的產物。NMR檢測結果如下1H-NMR(DMSO-d6，300MHz)δ1.26-1.36(2H，m，CH2)，1.48-1.61(4H，m，CH2)，2.31(2H，t，CH2CO)，2.73(2H，t，CH2N)，3.59(3H，s，CH3)，8.1(3H，bs，NH3)。
制造例5-2 5-碳甲氧基戊基-D-生物素酰胺
對上述制造例5-1制得的6-氨基己酸甲酯鹽酸鹽1.00g(5.50mmol)的DMF(40mL)溶液，加入三乙胺1.20mg(11.8mmol)、4-二甲氨基吡啶137mg(1.1mmol)。再加入D-生物素1.34mg(5.50mmol)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽1.42g(7.42mmol)，在35-45℃時反應23小時。將反應液投入水300mL中。用氯仿萃取(150mL×5)，用無水硫酸鎂干燥。蒸餾除去溶劑。得到的粗制品用硅膠柱色譜法提純，得到1.04g目的產物。NMR檢測結果如下1H-NMR(DMSO-d6，300MHz)δ1.18-1.65(12H，m，CH2)，2.04(2H，t，CH2CO)，2.28(2H，t，CH2CO)，2.57(1H，d，CH2S)，2.82(1H，dd，CH2S)，3.00(1H，dt，NHCO)，3.06-3.12(1H，m，CH2S)，3.58(3H，s，OCH3)，4.09-4.15(1H，m，CHN)，4.28-4.32(1H，m，CHN)，6.35(1H，bs，NHCO)，6.41(1H，bs，NHCO)，7.72(1H，t，NHCO)。
制造例5-3 5-羧基戊基-D-生物素酰胺 對上述制造例5-2合成的5-碳甲氧基戊基-D-生物素酰胺800mg(2.15mmol)溶解于四氫呋喃(25mL)和甲醇(25mL)，在室溫下滴入氫氧化鈉2.33g(58.3mmol)的水(12.5mL)溶液。滴下完畢后，升溫至40℃，反應2小時。冷卻后，濃縮反應液，加水(60mL)。加入1N的鹽酸，調節pH至2.0。濾取析出的結晶，對結晶水洗，真空干燥，得到724mg目的產物。NMR檢測結果如下1H-NMR(DMSO-d6，300MHz)δ1.17-1.67(12H，m，CH2)，2.04(2H，t，CH2CO)，2.19(2H，t，CH2CO)，2.57(1H，d，CH2S)，2.82(1H，dd，CH2S)，3.00(1H，dt，NHCO)，3.06-3.12(1H，m，CH2S)，4.13(1H，t，CHN)，4.30(1H，t，CHN)，6.36(1H，bs，NHCO)，6.43(1H，bs，NHCO)，7.74(1H，t，NHCO)，11.95(1H，bs，CO2H)。
制造例5-4N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[4-(6-D-生物素酰胺基六羧基酰胺基)-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇 對上述制造例5-3合成的5-羧基戊基-D-生物素酰胺99.0mg(0.27mmol)的干燥二甲基甲酰胺溶液，添加三乙胺38.1μL(0.27mmol)和4-二甲基氨基吡啶5.7mg(0.04mmol)。再滴入上述制造例4-6合成的N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[4-氨基-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇100mg(0.21mmol)的干燥二甲基甲酰胺溶液(1mL)。然后，加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽51.7mg(0.27mmol)，在40℃反應24小時。對該反應液追加三乙胺8.9μL(0.06mmol)、5-羧基戊基-D-生物素酰胺22.8mg(0.06mmol)、以及1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽12.2mg(0.06mmol)，于40℃反應6小時。
反應液冷卻后，投入水(150mL)中，加氯化鈉，使之飽和。用氯仿萃取(40mL×5)，有機層用水(150mL×2)、飽和食鹽水(150mL)洗凈。用無水硫酸鎂干燥。蒸餾除去溶劑。得到的粗制品用HPLC分離提純，得到37.5mg目的產物。NMR檢測結果如下1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ1.30-1.80(12H，m，CH2)，2.14-2.25(4H，m，COCH2)，2.60-2.76(5H，m，NCH2，CH2S)，2.87(1H，dd，CH2S)，3.10-3.25(3H，m，CH2NHCO，SCH)，3.68-3.82(9H，m，NCH2Py，OCH)，4.28-4.33(1H，m，NCH)，4.45-4.52(1H，m，NCH)，5.27(1H，bs，NHCO)，5.50(1H，bs，NHCO)，5.60(1H，bs，NHCO)6.22(1H，bs，NHCO)，6.52-6.57(1H，m，Py)，6.72-6.75(1H，m，Py)，7.16(3H，t，Py)，7.27-7.30(1H，m，Py)，7.37(2H，d，Py)，7.57-7.66(3H，m，Py)，7.99(1H，d，Py)，8.46-8.52(3H，m，Py)。
該化合物以CHCA為基質，測定MALDI-TOF質譜。其結果示于圖6。根據圖6，作為質子加成物[M++1]的分子離子峰，觀察到809.5。
制造例6-1 2-溴甲基-3-羥基吡啶 對25％溴化氫乙酸溶液12.8g(39.6mmol)，添加3-羥基2-羥甲基吡啶鹽酸鹽5.0g(54.7mmol)，于110℃反應1小時。再滴下25％溴化氫乙酸溶液4.90mL(15.1mmol)，反應2小時。反應液冷卻后，倒入水50mL中，用碳酸氫鈉溶液調節pH至8。用二氯甲烷萃取(50mL×4)，濃縮二氯甲烷層。得到的粗制品用硅膠柱色譜法提純，得到1.36g目的產物。NMR檢測結果如下1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ5.31(2H，s，CH2Br)，7.20-7.32(2H，m，Py)，8.18-8.21(1H，m，Py)，8.55(1H，bs，OH)。
制造例6-2N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[3-羥基-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇 將上述制造例1-2合成的N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-1，3-二氨基丙烷-2-醇1.00g(2.75mmol)和上述制造例6-1合成的2-溴甲基-3-羥基吡啶633mg(3.37mmol)溶解于二甲基甲酰胺(15mL)，添加碳酸鉀760mg(5.50mmol)。在50℃反應2小時之后冷卻。反應液倒入100mL水中，用1N的鹽酸調節pH至8。用乙酸乙酯萃取(400mL×3)，有機層用水(100mL)、飽和食鹽水(100mL)洗凈，用無水硫酸鈉干燥后，得到的粗制品用HPLC分離，得到660mg目的產物。NMR檢測結果如下1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ2.51-2.69(4H，m，NCH2)，3.71-4.08(9H，m，CH2Py，OCH)，7.05-7.14(4H，m，Py)，7.15-7.19(1H，t，Py)，7.23-7.28(3H，m，Py)，7.55(2H，dt，Py)，7.64(1H，dt，Py)，7.91(1H，dd，Py)，8.48-8.55(3H，m，Py)。
制造例6-3N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[3-D-生物素氧基-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇(N，N，N’-Tri(2-pyridylmethyl)-N’-(3-D-biotinyloxy-2-pyridylmethyl)-1，3-diaminopropane-2-ol) 對實施例6-2合成的N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[3-羥基-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇100mg(0.21mmol)的干燥二甲基甲酰胺(5mL)溶液，在3℃下添加氫氧化鈉(油性)9.0mg(0.23mmol)。返回到室溫，反應30分鐘后，繼續滴入N-丁二酰亞胺-D-生物素(N-succinimidyl D-biotinate)79.8mg(0.23mmol)的干燥二甲基亞砜(1mL)溶液。滴下后，室溫下反應3.5小時，倒入100mL水中。用氯仿萃取(300mL×3)，氯仿層用無水硫酸鈉干燥后，蒸餾去除溶劑。得到的粗制品用HPLC分離，得到63.6mg目的產物。NMR檢測結果如下1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ1.43-1.56(2H，m，CH2)，1.60-1.85(4H，m，CH2)，2.53(2H，t，COCH2)，2.58-2.68(4H，m，NCH2)，2.71-2.77(1H，m，SCH2)，2.91(1H，dd，SCH2)，3.13-3.19(1H，m，SCH)，3.76-3.99(9H，m，OCH，NCH2Py)，4.28-4.36(1H，m，NCH)，4.47-4.53(1H，m，NCH)，5.16(1H，bs，NHCO)5.93(1H，d，NHCO)7.08-7.14(3H，m，Py)，7.20(1H，dd，Py)，7.33-7.42(4H，m，Py)，7.52-7.62(3H，m，Py)，8.42(1H，dd，Py)，8.51(3H，m，Py)。
制造例6-4 本發明的鋅配位化合物溶液
C37H44N8O8PSZn2Mol Wt922.61Exact Mass919.13對實施例6-3合成的N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[3-D-生物素氧基-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇(200nmol)的乙腈溶液(66.7μL)，加入100mM的硝酸鋅水溶液40μL，再加入磷酸緩沖液(pH＝6.86)560μL。對該溶液由MALDI-TOF質譜(基質為2’，4’，6’-三羥基乙酰苯)分析確認上述鋅配位化合物的存在。MALDI-TOF質譜的確認結果示于圖7。圖7中，分子離子峰被觀察到為919.1(exact mass919.13)。
制造例7-1N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[5-N”-(2-丹酰氨基乙基)氨基甲酰基-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇 將上述制造例1-4合成的N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[5-N”-(2-氨基乙基)氨基甲酰基-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇1.1g(2.1mmol)溶解于干燥乙腈(9mL)，加入840mg(31mmol)的丹酰氯，50℃反應3小時。濃縮反應液的粗制品。粗制品用硅膠柱色譜法提純，得到1.30g目的產物。NMR檢測結果如下1H-NMR(CDCl3，500MHz)δ2.57(1H，dd，CH2)，2.60(1H，dd，CH2)，2.67(1H，dd，CH2)，2.69(1H，dd，CH2)，2.85(6H，s，NCH3)，3.17(2H，dd，NCH2CH2N)，3.50(2H，dd，NCH2CH2N)，3.88(8H，dd，NCH2Py)，3.83-3.92(1H，m，OCH)，6.31(1H，m，SO2NH)，7.11(1H，d，Ar)，7.13(3H，ddd，Py)，7.35(3H，d，Py)，7.36(1H，d，Py)，7.42(1H，m，CONH)，7.46(1H，dd，Ar)，7.49(1H，dd，Ar)，7.60(2H，dt，Py)，7.60(1H，dt，Py)，7.90(1H，dd，Py)，8.23(1H，dd，Ar)，8.27(1H，d，Ar)，8.49(2H，ddd，Py)，8.50(1H，ddd，Py)，8.51(1H，dd，Ar)，8.80(1H，d，Py)。
13C-NMR(CDCl3，125MHz)39.9(NCH2CH2N)，42.7(NCH2CH2N)，45.3(NCH3)，59.0(CH2)，59.1(CH2)，60.6(CH2Py)，60.7(CH2Py)，61.3(CH2Py)，67.1(CHO)，115.2(Ar)，118.6(Ar)，122.1(Py)，122.8(Py)，123.2(Ar)，123.2(Py)，128.1(Ar)，128.5(Ar)，129.5(Ar)，129.6(Ar)，129.9(Py)，130.6(Ar)，134.5(Ar)，135.4(Py)，136.5(Py)，136.6(Py)，147.6(Py)，148.9(Py)，149.0(Py)，152.0(Ar)，159.1(Py)，159.1(Py)，162.8(Py)，166.2(CONH)。
制造例7-2本發明的鋅配位化合物溶液 C42H47N9O8PSZn2Mol.Wt997.70Exact Mass996.16將上述制造例7-1中合成的N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[5-N”-(2-丹酰氨基乙基)氨基甲酰基-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇(200nmol)溶解于磷酸緩沖液(pH＝6.86)作成3mM溶液。加入2倍摩爾的硝酸鋅。對該溶液進行由THAP為基質的MALDI-TOF質譜分析，確認上述鋅配位化合物的存在。MALDI-TOF質譜的確認結果示于圖8。圖8中，分子離子峰被觀察到為996.2(exact mass919.16)。
制造例8-1N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[5-N”-(2-N-5-螢光素基硫脲素乙基)氨基甲酰基-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇
將上述制造例1-4合成的N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[5-N”-(2-氨基乙基)氨基甲酰基-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇950mg(1.76mmol)溶解于干燥二甲基甲酰胺(150mL)，添加干燥吡啶38mL。滴入螢光素5-異硫氰酸酯750mg(1.92mmol)的干燥二甲基甲酰胺(150mL)溶液，室溫下反應3小時。濃縮反應液，用硅膠柱色譜法提純，得到961mg目的產物。NMR檢測結果如下1H-NMR(DMSO-d6，300MHz)δ2.33-2.43(2H，m，CH2)，2.50-2.61(2H，m，CH2)，3.38-3.57(4H，m，NCH2CH2N)，3.67-3.92(9H，m，NCH2Py，CHO)，6.52-6.67(6H，m，Ar)，7.16-7.23(3H，m，Py)，7.17(1H，d，Ar)，7.34-7.41(3H，m，Py)，7.52(1H，d，Py)，7.69(3H，dt，Py)，7.68-7.77(1H，m，Ar)，8.14(1H，dd，Py)，8.24(1H，d，Ar)，8.41-8.46(3H，m，Py)，8.78(1H，m，NHCO)，8.92(1H，d，Py)。
試驗例310％的Native聚丙烯酰胺凝膠電泳首先，在如同上述試驗例1的條件下，配制電泳凝膠、電泳用pH緩沖液和試樣溶解用色素液。
其次，分別將1.牛血清白蛋白、2.人血清白蛋白、3.碳酸脫水酶、4.β-半乳糖苷酶、5.α-酪蛋白(磷酸化型)、6.α-酪蛋白(脫磷酸化型)、7.β-酪蛋白(磷酸化型)、8.β-酪蛋白(脫磷酸化型)、9.胃蛋白(磷酸化型)、10.胃蛋白(脫磷酸化型)各2μg溶解于試樣溶解用色素液中。作為試樣，將其標繪于配制成的電泳用凝膠后，進行40mA的恒電流電泳，直至泳動色素標記(物)流出。
將得到的凝膠浸漬于含有上述制造例8-1中配制的N，N，N’-三(2-吡啶甲基)-N’-[5-N”-(2-N-5-螢光素基硫脲基乙基)氨基甲酰基-2-吡啶甲基]-1，3-二氨基丙烷-2-醇1μM和乙酸鋅100μM的10mM三(羥甲基)氨基甲烷乙酸鹽pH緩沖液(pH＝7.4)中30分鐘。從溶液中取出后，該凝膠用10mM三(羥甲基)氨基甲烷乙酸鹽pH緩沖液(pH＝7.4)100mL 10分鐘洗凈2次后，使用氟影像分析儀(fluoro image analyzer)FLA-5000(富士照片膠卷株式會社制)，在激勵波長473nm、熒光檢測過濾510nm的條件下，作熒光圖像攝影。接著，用科麥西艷藍甲酰進行常規的染色，作照片攝影。由本發明的鋅配位化合物溶液染色后的凝膠作為A，接著將科麥西艷藍染色后的凝膠作為B，示于圖9。
如圖9所示可以明白，在進行常規染色的場合(B)，所有的肽都被染色，相比之下，在用本發明的鋅配位化合物溶液進行處理的場合，可僅僅檢定出結合了磷酸的(5)α-酪蛋白，(7)β-酪蛋白、(9)胃蛋白(2)。由此可以明白，根據本發明的方法，可從生物體試樣僅僅檢定出磷酸化肽。
權利要求
1.一種對磷酸化肽進行標記的方法，其特征在于，所述方法由式(I)表示的配位化合物對磷酸化肽進行標記 式中，X表示結合基，Y表示標記基團。
2.如權利要求1所述的對磷酸化肽進行標記的方法，其特征在于，作為所述配位化合物，使用所述標記基團為生物素的化合物。
3.一種對磷酸化肽進行標記的方法，其特征在于，所述方法由式(I)表示的配位化合物對磷酸化肽進行選擇性吸附 式中，X表示結合基，Y表示標記基團。
4.如權利要求3所述的對磷酸化肽進行標記的方法，其特征在于，作為所述配位化合物，使用所述標記基團為生物素的化合物。
5.一種式(I)表示的配位化合物 式中，X表示結合基，Y表示標記基團。
6.如權利要求5所述的配位化合物，其特征在于，所述標記基團為生物素。
7.一種式(I)表示的配位化合物的制造方法，其特征在于，所述方法包括下述反應式 式中，R1和R2表示用于形成結合基X的反應性基團，Y表示標記基團。
8.一種式(II)表示的化合物 式中，R1表示反應性基團，但，氨甲基、羥甲基、氨基及羧基除外。
全文摘要
本發明提供一種容易從生物體試樣等檢測磷酸化肽(蛋白質)的方法及選擇吸附方法，及因具有對于磷酸化肽的高配位結合功能、可用于所述方法的化合物。本發明揭示了式(I)表示的配位化合物(式中，X表示結合基，Y表示標記基團)。所述化合物因具有對于磷酸化肽的高配位結合功能、可容易從生物體試樣等檢測磷酸化肽。
文檔編號C07F9/6596GK1526724SQ20041000768
公開日2004年9月8日 申請日期2004年2月24日 優先權日2003年3月3日
發明者小池透, 川崎昭彥, 彥, 小橋達弘, 弘, 高萩誠 申請人:株式會社納德研究所