專利名稱：楓楊醌及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及楓楊醌(英文名Pterocaryquinone)及其制備方法和用途。更具體地，本發明涉及從東京楓楊Pterocarya tonkinesis(Franch.)Dode.中提取的全新化學骨架結構類型的醌類化合物、該類化合物的制備方法，以及這類物質作為細胞凋亡誘導劑、腫瘤細胞殺傷劑、腫瘤細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑的用途。
背景技術：
醌類化合物主要有苯醌、萘醌、蒽醌和菲醌四種類型，而且迄今已知的醌類化合物也為數甚多(參見文獻姚新生主編，天然藥物化學(第三版)，人民衛生出版社，2002年)。關于醌類化合物的生物活性也有很多報道，如有文獻(宮寶安等，丹參醌化合物結構特征與抗氧化活性，生物物理學報，2001，17(2)，383-388)曾報道丹參醌具有抗氧化活性，還有文獻(蔣英麗等，新疆紫草素誘導人大腸癌細胞的凋亡，癌癥，2001，20(12)，1355-1358)曾報道新疆紫草素具有誘導人大腸癌細胞的凋亡作用。但以上這些文獻所報道的所有醌類化合物的化學結構與本發明的楓楊醌類化合物完全不同，尤其是骨架結構截然不同。關于本發明的楓楊醌類化合物尤其是關于該類化合物的化學骨架結構迄今尚未見任何報道。
天然醌類化合物可從很多植物中分離得到，但尚未見從東京楓楊中分離得到天然醌類化合物的文獻報道。
發明內容
本發明首次發現東京楓楊的粗提物具有很好的細胞凋亡誘導、細胞周期抑制以及對癌細胞的增殖抑制等抗腫瘤活性，于是對其活性成分進行了研究，發現了具有全新骨架結構的楓楊醌類化合物具有抗腫瘤活性。
因此，本發明第一方面涉及具有下式通式I所示結構的楓楊醌類化合物或其藥學上可接受的鹽類 式I其中，R1、R2、R3為羥基或氫；R4為羥基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、氨基或氫。
本發明的另一個方面涉及具有通式I結構的楓楊醌類化合物的提取方法，該方法包括用醇或含水醇提取東京楓楊的干燥莖皮，得到粗浸膏，然后從粗浸膏中分離純化而得到通式I化合物。
本發明的另一方面涉及一種藥物組合物，其含有作為活性成分的本發明楓楊醌化合物或其藥學上可接受的鹽類及一種或多種藥用載體或賦形劑。
經實驗證實，本發明的上述楓楊醌類化合物對腫瘤細胞具有誘發凋亡以及抑制增殖等作用，因此本發明的另一方面涉及楓楊醌化合物用于制備細胞凋亡誘導劑、腫瘤細胞殺傷劑或腫瘤增殖抑制劑的用途。
具體來說，在本發明的一個實施方案中，本發明的楓楊醌或其藥學上可接受的鹽具有下列通式I
式I其中，R1、R2、R3為羥基或氫；R4為羥基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、氨基或氫。
在本發明的一個優選實施方案中，本發明的楓楊醌化合物或其藥學上可接受的鹽類具有下列結構式 式I其中，R1、R3、R4為羥基，R2為氫。
本發明的楓楊醌類化合物可按如下方法提取和純化，用醇或含水醇提取東京楓楊的干燥莖皮，得到粗浸膏，然后從粗浸膏中分離純化上述楓物醌類化合物。
在上述方法中，所述醇是甲醇、乙醇；所述含水醇是60～70％的含水乙醇；所述分離純化包括利用本領域技術人員熟知的天然產物分離純化的常規方法，如液-液萃取、柱層析、薄層層析、重結晶或其任意組合，其中柱層析和重結晶精制可反復進行多次。
根據需要，本發明的楓楊醌化合物還可以與藥學上可接受的酸形成酸加成鹽。所述的“藥學上可接受的酸”是本領域技術人員熟知的，包括與無機酸形成藥用鹽，例如硫酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽；及與有機酸形成藥用鹽，例如乙酸鹽、草酸鹽、檸檬酸鹽、葡萄糖酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、對甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽等。
根據本發明，經分離純化得到的本發明楓楊醌化合物的純品可單獨或以藥物組合物形式使用。當以藥物組合物形式使用時，本發明楓楊醌化合物可與一種或多種本領域內熟知的載體或賦形劑一起，制成多種適合的給藥劑型，例如片劑、膠囊、注射劑等。
本發明采用流式細胞術結合顯微鏡下檢測細胞形態特征的方法，測試了楓楊醌類化合物對小鼠乳腺癌tsFT210細胞的細胞周期抑制和細胞凋亡誘導以及對該細胞的增殖抑制等活性。
本發明的楓楊醌類化合物對腫瘤細胞的生物學作用特征是在不同濃度或不同作用時間的條件下，對癌細胞可通過誘發癌細胞發生顯著凋亡來顯示其抑制腫瘤細胞增殖的生物學活性，從而發揮其抗腫瘤作用。
本發明的楓楊醌類化合物可還通過加入藥物或試劑可接受的輔料或溶劑制成抗腫瘤劑或細胞凋亡誘導劑，用于生命科學研究。在生命科學研究中作為誘發細胞凋亡的低分子生物探針加以利用時，本發明的化合物可溶于甲醇、含水甲醇或水中使用，也可以溶于二甲基亞砜的含水溶液中進行使用。
圖1是化合物I在甲醇中的紫外吸收光譜；圖2是化合物I的紅外吸收光譜(KBr)；圖3是化合物I在氘代吡啶中的1H核磁共振光譜；圖4是化合物I在氘代吡啶中的13C核磁共振光譜；圖5是用每毫升50微克的化合物I處理17小時后在倒置顯微鏡下拍照的小鼠乳腺癌tsFT210細胞的照片，左圖為空白對照，右圖為化合物I處理組。
具體實施例方式實施例1.化合物I的提取、分離和純化 化合物I取東京楓楊的干燥莖皮(3.5公斤)粉碎，用10升60％的乙醇室溫浸泡6天，濾取含水乙醇溶液，同樣的提取重復進行8次。合并提取液，減壓濃縮至不含乙醇(約2升)，用等體積的氯仿萃取4次，合并氯仿萃取液，濃縮干燥，得到氯仿萃取物10.4克。
取氯仿萃取物10.4克，用適量氯仿溶解后加10克薄層層析硅膠G拌樣，用194克硅膠H干法上減壓柱，用氯仿→甲醇梯度(100∶0→1∶1)洗脫層析分離，得到34個餾份。對各餾份進行薄層檢查及在每毫升50微克濃度下的活性測試，并根據結果合并相關餾份，得到活性組份Fr-5(2.1克，氯仿洗脫部分)。將Fr-5全部上Sephadex-LH20柱，用氯仿∶甲醇＝1∶1洗脫層析，共得到130個餾份，經合并相關流分，得活性組分Fr-5-4共1.6克。用適量氯仿溶解組份Fr-5-4(1.6克)，并加入5克薄層層析硅膠G拌樣，用35克硅膠H上減壓柱，石油醚-氯仿梯度洗脫層析，從石油醚-氯仿(65∶35)洗脫餾份中得到活性組份Fr-5-4-10(50毫克)。該組份Fr-5-4-10再經制備硅膠薄層層析(石油醚∶丙酮＝2∶1展開)分離，刮取黃色條帶，用氯仿洗脫并經氯仿-甲醇(1∶1)混合溶劑中重結晶精制，得化合物I純品5.8毫克，其為黃色針晶，熔點267-268℃，FeCl3試劑顯棕色，[α]D24-0.4(c1.0，CHCl3)，分子式C20H12O6，TOF-MS m/z348[M]+，349[M+H]+；Positive HR-TOF-MS m/z實測值348.0637[M]+，計算值348.0639(C20H12O6[M]+)；實測值349.0707[M+H]+，計算值349.0704(C20H13O6[M+H]+)。
UVλmaxnm(logε)于甲醇中431(2.86)，325.5(2.84)，287(3.08)，259(3.33)，207.5(3.79，末端吸收)。
IRνmaxcm-1(KBr)3526(游離OH)，3442(氫鍵合的OH)，2956，2926，2854(亞甲基和次甲基質子)，1670，1638(酮羰基)，1610，1579，1451(芳環)，1313，1273，1243(C-O)，1220，1178，1140，755，722。1H及13C NMR數據見表1。
表1 化合物I在氘代氯仿中的600MHz1H和150MHz13C NMR數據a)HMBCd)位置標號δm(J，Hz)1H-1H COSYb) NOEsc) δc2JC3JCH1 -- 198.13s 20 192 -- 115.26s 3-OH，6，43 -- 162.05s 4 3-OH，54 7.24dd(7.4，1.4)5，6 125.20d 3-OH，65 7.63t(7.4) 4，6 137.30d6 7.65dd(7.4，1.4)5，4 120.38d 47 -- 132.62s 58 -- 180.47s 69 -- 148.67s 20 1910 -- 154.39s 18-OH，19，2011 -- 188.82s12 -- 110.53s 13-OH，16，1413 -- 163.50s 13-OH，1514 6.93dd(7.8，0.9)15，16 119.35d 13-OH，1615 7.48t(7.8) 16，14 136.75d16 7.14dd(7.8 0.9) 15，14 113.32d 1417 -- 146.26s 19，1518 -- 82.00s 20 18-OH，20，1619 3.07dd(10.6，4.0) 20，19(δ3.05)19(δ3.05)，20 54.05t20 18-OH3.06dd(10.6，0.7) 20，19(δ3.07)18-OH20 4.22br d(4,0) 1919(δ3.07) 52.60d193-OH11.52s --13-OH11.50s --18-OH4.79s 16，19(δ3.05) --
a)本表信號歸屬基于DEPT、PFG1H-1H COSY、PFG HMQC及PFG HMBC圖譜解析結果。碳信號的多重度利用DEPT方法確定并分別用s(單重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)表示。
b)此欄中的數字和代號分別代表在PFG1H-1H COSY譜中與相應行中的1H給出偶合相關信號的1H核。
c)此欄中的數字代表在照射相應行1H信號的NOE差光譜中給NOE相關信號的1H核。
d)此欄中的數字代表在PFG HMBC(1JCH＝8Hz)譜中與相應行中的碳信號給出相隔兩根(2JCH)或三根(3JCH)化學鍵的遠程雜核相關(HMBC)信號的1H核。
采用與實施例1相類似的方法，收集其它餾分，可以得到其中R1，R2，R3和R4具有其它含義的楓楊醌類化合物。
實施例2.化合物I的生物活性測試實驗樣品及實驗方法被測樣品溶液的配制取上述實施例1中分離精制的純品化合物I，精密稱取適量，用甲醇配制成10mg/ml的濃縮液，并根據需要進行適當稀釋，供活性測試。
細胞系及細胞培養活性測試采用小鼠乳腺癌tsFT210細胞系，細胞用含10％FBS的RPMI-1640培養基，在32℃于通入5％二氧化碳的培養箱中繼代培養。
流式細胞術測試方法取對數生長期的tsFT210細胞，用新鮮的RPMI-1640培養基配制成密度為每毫升2×105個細胞的細胞懸液，按每孔0.5毫升接種于24孔板中，每孔加入5微升不同濃度的樣品溶液，32℃下培養17小時。取藥物作用下培養后的細胞，首先在光學顯微鏡下觀察藥物處理引起的形態學變化，判斷有無細胞周期抑制，細胞凋亡或細胞壞死的形態學特征，必要時進行拍照。繼而將細胞分別從24孔板轉移至1.5毫升Eppendorf離心管中，4℃下3000轉/分離心3分鐘，吸去上清液，加0.5毫升磷酸緩沖溶液(PBS)震蕩洗滌一次，相同條件下離心收集細胞，加150微升碘化丙啶(PI)水溶液(在100毫升水中含5毫克PI、100毫克檸檬酸鈉和200毫克NP-40)，4℃下染色30分鐘后，加入150微升PBS稀釋，用流式細胞儀分析測定細胞中DNA的含量分布。細胞在細胞周期各時相中的分布利用庫爾特公司產計算機軟件WinCycle進行分析計算。
實驗結果形態學檢測結果在光學倒置顯微鏡下觀察到，tsFT210細胞當用每毫升1.56微克的化合物I處理時就開始出現凋亡細胞的形態特征，當用每毫升12.5微克以上的化合物I處理時，視野中絕大多數呈現典型的凋亡細胞的形態即雪花瓣狀細胞或膜裹著細胞碎片。
流式細胞術分析結果tsFT210細胞經0.78微克/毫升以上的化合物I處理后，經流式細胞術分析均在sub-G0/G1區檢測到凋亡峰，且隨著濃度增高，凋亡峰增強，與形態學檢測結果基本吻合。
實驗結論上述實驗結果表明，化合物I主要通過誘發癌細胞發生凋亡來發揮其抑制癌細胞增殖的抗腫瘤作用。因此，本發明的楓楊醌類化合物可作為抗腫瘤劑用于腫瘤的治療，也可作為誘發細胞凋亡的低分子生物探針用于探索生命現象本質的生命科學實驗研究中。
權利要求
1.式I化合物或其藥學上可接受的鹽類 式I其中，R1、R2、R3為羥基或氫；R4為羥基、C1-C6烷基、C1-C6烷氨基、氨基或氫。
2.權利要求1的化合物，其中，R1、R3、R4為羥基，R2為氫。
3.藥物組合物，其包含作為活性成分的權利要求1中的式I楓楊醌類化合物或其藥學上可接受的鹽類以及一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑。
4.式I化合物的制備方法， 式I其中，R1、R2、R3為羥基或氫；R4為羥基、C1-C6烷基、C1-C6烷氨基、氨基或氫，該方法包括用醇或含水醇提取東京楓楊的干燥莖皮，得到粗浸膏，然后對粗浸膏進行分離和純化。
5.權利要求4所述的方法，所述醇是甲醇、乙醇；所述含水醇是60～70％的含水乙醇。
6.權利要求4所述的方法，其中的分離和純化包括選自液-液萃取、柱層析、薄層層析或重結晶的步驟或其任意組合。
7.權利要求1所述的式I化合物用于制備細胞凋亡誘導劑和腫瘤細胞殺傷劑的用途。
8.權利要求1所述的式I化合物用于制備腫瘤細胞增殖抑制劑的用途。
9.權利要求1所述的式I化合物用于制備抗腫瘤藥物的用途。
全文摘要
本發明涉及楓楊醌類化合物及其制備方法。所述化合物對腫瘤細胞具有誘發調亡及抑制增殖等作用，因此，可作為細胞凋亡誘導劑、細胞增殖抑制劑和抗腫瘤劑。
文檔編號C07C46/10GK1569793SQ20041000605
公開日2005年1月26日 申請日期2004年2月27日 優先權日2004年2月27日
發明者崔承彬, 劉紅兵, 蔡兵, 顧謙群, 趙慶春, 管華詩 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院毒物藥物研究所