專利名稱：混合酸酐法合成胸腺五肽的方法
技術領域：
本發明涉及一種合成活性多肽原料藥的方法，尤其是涉及一種混合酸酐法液相合成胸腺五肽的方法。
背景技術：
胸腺五肽簡稱TP5，其英文名為Thymopentin，多肽化學組成為N-精氨酰-賴氨酰-天門冬氨酰-酪氨酸，是非常重要的免疫促進類活性多肽藥物，能夠顯著提高人的免疫力，幫助人類有效的抵抗多種疾病，同時對多種疾病都有顯著而確切的療效，市場前景廣闊，具有很好的經濟和社會效益。但由于在合成技術上的限制，其生產成本很高，產品數量有限，導致市售藥物價格居高不下，難以真正發揮其效益。傳統的胸腺五肽合成均由固相合成法完成，成本高，難于規模化生產，產物純化難度很大，有時甚至用高壓液相色譜法也難于達到所希望的純度。
(1)胸腺五肽(TP-5)的化學合成，國內外絕大多數采用固相法。有少數研究單位和制藥企業采用液相法，但都是以DCC(二環己基碳二亞胺)為縮合劑，而該法的缺點是產物純化較困難，規模化生產難度大，而且由于DCC容易導致生產人員過敏，也不是一個好的綠色的合成方法。
(2)固相法合成胸腺五肽技術存在的主要問題是合成成本非常高、規模小、粗產品純化困難，大量使用對人體有害的DCC作為接肽縮合試劑等。
(3)與本發明相近的技術是CN1442428A《一鍋法液相合成胸腺五肽的工藝》。一鍋法液相合成胸腺五肽。該方法以Boc或Fmoc保護的氨基酸衍生物為原料，經過二肽——三肽——四肽——五肽合成——粗肽純化，合成過程中間產物不需要過多的純化。所說的粗產品純化是用弱酸性和強酸性陽離子交換樹脂純化TP-5粗肽；所說的肽合成是用的縮合劑BOP和HOBt；所說的合成方法未明確指明能夠用于規模化生產TP-5；所說的純化純度為95％。
發明內容
本發明的目的在于解決目前胸腺五肽生產中存在的不能大規模合成胸腺五肽的技術問題。
本發明混合酸酐法合成胸腺五肽的方法，過程有二肽合成—三肽合成—四肽合成—五肽合成—粗品生成；它是以N-甲基嗎啉為催化劑，采用氯甲酸烷基酯為活化劑，活化被保護的氨基酸形成高反應活性的混合酸酐，與氨基端裸露的氨基酸或肽反應來合成胸腺五肽；各肽合成中均采用N-甲基嗎啉為催化劑，氯甲酸烷基酯為活化劑，氯甲酸烷基酯(ClCO2R1，R1＝Et、Pr、iPr、n-Bu、iBu)選用氯甲酸乙酯、氯甲酸丙酯、氯甲酸異丙酯、氯甲酸丁酯、氯甲酸異丁酯，其中優選氯甲酸乙酯。各肽合成過程包括混合酸酐的生成—過濾—減壓濃縮—酸堿洗滌—干燥除水—各肽生成—脫保護基的過程，合成五肽后，脫掉保護基團，生成粗品胸腺五肽，再純化；所述被保護的氨基酸按各肽合成順序是酪氨酸酯與纈氨酸的混合酸酐反應得到二肽、天門冬氨酸的混合酸酐與二肽反應得到三肽、賴氨酸的混合酸酐與三肽反應得到四肽、精氨酸的混合酸酐與四肽反應得到五肽粗品，所用氨基酸的2-氨基都采用叔丁氧甲酰基(Boc)保護，精氨酸的2-氨基由叔丁氧甲酰基(Boc)或芐氧甲酰基(Cbz)保護，天門冬氨酸的側鏈羧基采用芐酯保護，賴氨酸的側鏈氨基用2-氯芐氧甲酰基保護，精氨酸的側鏈胍基用硝基保護，酪氨酸的酚羥基用芐基保護，羧基用酯基保護；酪氨酸酯為酪氨酸甲酯、乙酯、芐酯或芐醚酪氨酸甲酯、乙酯、芐酯。混合酸酐的生成過程中的反應溫度為-10～-18℃；減壓濃縮—酸堿洗滌—干燥除水過程為減壓濃縮后加入乙酸乙酯，分別用稀鹽酸、碳酸氫鈉和飽和食鹽水洗滌，用無水硫酸鈉干燥；各肽合成過程中的反應溫度為-18～0℃。脫保護基過程為，加入三氟乙酸脫除叔丁氧甲酰基(Boc)保護基團，減壓濃縮后加入有機溶劑溶解，有機溶劑可以是二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯，用冷的氫氧化鈉洗滌有機溶劑，再用飽和食鹽水洗滌，用無水硫酸鈉干燥后濃縮，再用四氫呋喃或N，N-二甲基甲酰胺溶劑溶解并冷藏備用，其中溶劑優選四氫呋喃；所述粗品生成是指合成五肽后，用氟化氫切割—皂化或用催化氫化—三氟乙酸化—皂化脫掉所有保護基團。
粗品生成過程中所用氟化氫切割—皂化法脫掉所有保護基團的過程為，對于合成的五肽化合物N-叔丁氧甲酰基-(N-硝基)-精氨酰-(2-氯芐氧甲酰基)-賴氨酰-(芐酯)天門冬氨酰-纈氨酰-(芐醚)酪氨酸酯或N-芐氧甲酰基-(N-硝基)-精氨酰-(2-氯芐氧甲酰基)-賴氨酰-(芐酯)-天門冬氨酰-纈氨酰-(芐醚)酪氨酸酯{R3-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-Cbz)-Asp(OBn)-Val-Tyr(OBn)OR2，R2＝甲基(Me)、乙基(Et)、芐基(Bn)，R3＝叔丁氧甲酰基(Boc)、芐氧甲酰基(Cbz)}，當R2＝Bn基時，經氟化氫切割直接得到胸腺五肽的粗品；當R2＝Me、Et時，經氟化氫切割后，脫掉除甲酯與乙酯以外的所有保護基團；再用氫氧化鈉的甲醇水溶液皂化1-2小時，脫掉酪氨酸殘基上的甲基或乙基保護基，得到粗的胸腺五肽化合物。
粗品生成過程中所用催化氫化—三氟乙酸化—皂化脫掉所有保護基團的過程為，對于合成的五肽化合物N-叔丁氧甲酰基-(N-硝基)-精氨酰-(2-氯芐氧甲酰基)-賴氨酰-(芐酯)天門冬氨酰-纈氨酰-(芐醚)酪氨酸酯或N-芐氧甲酰基-(N-硝基)-精氨酰-(2-氯芐氧甲酰基)-賴氨酰-(芐酯)-天門冬氨酰-纈氨酰-(芐醚)酪氨酸酯{R3-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-Cbz)-Asp(OBn)-Val-Tyr(OBn)OR2，R2＝Me、Et、Bn，R3＝Boc、Cbz}，當R3＝Cbz，R2＝Bn時，采用催化氫化脫掉芐基(Bn)、硝基、芐氧甲酰基(Cbz)、2—氯芐氧甲酰基(2-Cl-z)保護基團，可以直接得到粗肽產品；當R3＝叔丁氧甲酰基(Boc)時，催化氫化后再用三氟乙酸脫掉叔丁氧甲酰基(Boc)；在R2＝Me、Et時，經過氫化或三氟乙酸化脫掉其他的保護基團之后，最后用甲醇—氫氧化鈉皂化1-2小時，脫掉酪氨酸殘基的甲基或乙基保護基，得到五肽的粗肽化合物。催化氫化過程中，催化劑用量為粗肽的10～30％的鈀/碳(Pd/C)，所用的鈀/碳中金屬鈀的重量百分含量為10～20％，氫氣壓力為10到100個大氣壓力。
在粗品生成后的純化過程為，用制備性高壓液相色譜純化，得到純度大于98％的胸腺五肽水溶液，然后用冷凍干燥機冷凍干燥得到白色凍干粉狀物固體，純度可以達到98％以上。
所用的各種保護氨基酸均能很容易從商家購得。
混合酸酐法合成胸腺五肽的的具體步驟為A、使Boc-纈氨酸與氯甲酸烷基酯在N-甲基嗎啉催化的條件下，以四氫呋喃或N，N-二甲基甲酰胺為溶劑，在-10～-18℃反應生成Boc-纈氨酸與氯甲酸烷基酯的混合酸酐，使該混合酸酐與酪氨酸酯在-18～0℃反應，用高壓液相色譜檢測反應結果(酪氨酸酯峰消失)，濾出N-甲基嗎啉鹽酸鹽，有機溶劑用酸、堿洗滌后，用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮除去有機溶劑，可以得到粗產率大于100％的二肽化合物，其純度大于92％(最高可達98％)。該二肽化合物不必進一步純化，直接用于下面的反應。
B、將二肽化合物直接與三氟乙酸反應，脫掉Boc保護基，減壓濃縮抽干三氟乙酸后，加入二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯有機溶劑溶解，洗滌、干燥、濃縮，用四氫呋喃等溶劑溶解后冷卻備用。
天門冬氨酸同樣地用N-甲基嗎啉催化，與氯甲酸乙酯反應就可以得到混合酸酐，該混合酸酐與上述脫除保護基的預冷的二肽化合物反應可以得到三肽化合物3，不經過純化就可以直接用于合成下面的四肽化合物。
C、四肽化合物4和五肽化合物5的合成可以用合成三肽化合物3的同樣方法獲得。即用同樣的辦法可以依次地接上氨基酸賴氨酸和精氨酸。
本發明用混合酸酐法液相合成胸腺五肽，高壓液相純化五肽粗品，簡單快捷，同時，該方法由于避免了使用傳統的DCC法縮合合成胸腺五肽，反應速度相應的比DCC法快且產率高，該法合成過程中幾乎所有溶劑都能回收再使用，大大降低對環境的污染，從而實現生產過程的綠色環保化(DCC對人的皮膚有強烈的致敏性和副產物難于純化等缺點)，是一個高效的、綠色的胸腺五肽的可大規模化合成的方法。提高合成產率和產品純度，從而降低生產成本和產品價格，中間產物純度高，不需復雜的純化過程可直接用于下一步的合成，原材料廉價易得，能大大簡化純化過程，兼具液相與固相合成法的中間產物最小程度純化和易形成規模化生產的優點。
本發明與已有的發明和生產技術線比較，本發明合成過程不需要復雜的純化，肽合成用混合酸酐法，而避免使用任何昂貴的接肽縮合試劑；純化是用高壓液相色譜法，最終產物的純度高，終產物的粗肽經過制備性高壓液相色譜純化、冷凍干燥機冷凍干燥后，純度可以達到98％以上，符合藥檢要求的白色凍干粉狀胸腺五肽產品。
圖1是本發明的工藝流程圖。
具體實施例方式
下面的實施例可以使本專業技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
說明書中用到的縮略詞Asp天門冬氨酸Arg精氨酸Bn 芐基Boc叔丁氧甲酰基n-Bu 正丁基
iBu 異丁基C 碳Cbz芐氧甲酰基2-Cl-z 2-氯芐氧甲酰基ClCOOR1氯甲酸酯DMFN，N-二甲基甲酰氨Et 乙基HF 氟化氫H+3O 酸水HPLC 高壓液相色譜Lys賴氨酸Me 甲基NaOH 氫氧化鈉NMMN-甲基嗎啉NO2硝基Pd 鈀Pr 丙基iPr 異丙基TFA三氟乙酸TLC薄板層析TP5胸腺五肽Tyr酪氨酸Val纈氨酸附圖中的附圖標記為1Boc-纈氨酸，2二肽化合物，3三肽化合物，4四肽化合物，5五肽化合物。
實施例1 肽化合物2{Boe-Val-Tyr(OBn)OR2，R2＝Me}的合成把1.69克的Boc-Val溶解于20毫升的四氫呋喃中，加入1.0毫升的N-甲基嗎啉，在-10～-15℃條件下向其中加入0.75毫升的氯甲酸乙酯，加樣完畢后，使反應在同樣溫度下反應5～6分鐘之后，將1.93克酪氨酸芐醚甲酯鹽酸鹽的DMF溶液5毫升在-15～0℃加入反應瓶內，再向其中加入1.0毫升的N-甲基嗎啉，加樣完畢后，反應自然恢復至室溫，并繼續反應6小時，至反應完全。抽濾，濾出N-甲基嗎啉鹽酸鹽，將濾液減壓濃縮后，乙酸乙酯溶解，依次用5％稀鹽酸、5％的碳酸氫鈉和飽和食鹽水洗滌，用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮至干。粗產率大于100％，HPLC分析純度大于90％。該二肽化合物2不必純化可直接用于三肽的合成。
實施例2 二肽化合物2{Boc-Val-Tyr(OBn)OR2，R2＝Bn}的合成把1.69克的Boc-Val溶解于15毫升的四氫呋喃中，加入1.0毫升的N-甲基嗎啉，在-10～15℃條件下向其中加入0.75毫升的氯甲酸乙酯，加樣完畢后，使反應在同樣溫度下反應5～6分鐘之后，將3.28克酪氨酸芐醚芐酯對甲基苯磺酸鹽的DMF溶液5毫升在-10～0℃反應條件下加入反應瓶內，再向其中加入1.0毫升的N-甲基嗎啉，加樣完畢后，反應自然恢復至室溫，并繼續反應6小時，至反應完全。抽濾，將濾液減壓濃縮后，乙酸乙酯溶解，依次用5％鹽酸、5％碳酸氫鈉、飽和食鹽水洗滌，用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮至干。粗產率大于100％，HPLC分析純度大于90％。該二肽化合物2不必純化可直接用于三肽的合成。
實施例3 三肽化合物3{Boc-Asp(OBn)-Val-Tyr(OBn)OR2，R2＝Me}的合成。
將實施例1中合成的二肽化合物1.45克溶解于15毫升純三氟乙酸內，室溫反應15分鐘后，減壓濃縮至干，用二氯甲烷溶解，用冷的10％氫氧化鈉稀釋至PH為9.0，飽和食鹽水洗滌后，用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮至干，用四氫呋喃溶解后，放置冰箱備用。
將1.16克Boc-Asp溶解于四氫呋喃中，向其中加入0.4毫升N-甲基嗎啉，反應瓶用冰鹽浴冷卻后，加入0.34毫升的氯甲酸乙酯，反應10分鐘左右，再向反應瓶內加入上述預冷的脫Boc-保護后的二肽的四氫呋喃溶液，將反應自然恢復至室溫，并繼續攪拌6小時左右，用TLC和HPLC檢測反應至完全結束后萃滅反應。布氏漏斗抽濾、減壓濃縮并回收四氫呋喃，用乙酸乙酯溶解，依次用5％鹽酸、冷的5％氫氧化鈉和飽和食鹽水洗滌有機相，用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮至干(粗產率大于100％)，HPLC分析純度大于90％。不經過純化就可以直接用于合成四肽化合物。
實施例4 四肽化合物4{Boc-Lys(2-Cl-Cbz)-Asp(OBn)-Val-Tyr(OBn)OR2，R2＝Me}的全合成。
將1.4克三肽化合物與15毫升三氟乙酸反應脫去Boc保護基，用10％冷的氫氧化鈉洗滌有機溶劑至PH值為9.0，再用飽和食鹽水洗滌，用無水硫酸鈉干燥后濃縮，再用四氫呋喃溶解并冷藏備用；使0.92克Boc-(2-氯芐氧甲酰基)-賴氨酸在N-甲基嗎啉0.24毫升催化下與0.21毫升氯甲酸乙酯-10～-15℃反應合成混合酸酐，該混合酸酐與上述脫去Boc保護基的三肽化合物于-15～0℃反應，經過常規化的后處理即得四肽化合物N-Boc-(2-氯芐氧甲酰基)-賴氨酰-(芐酯)天門冬氨酰-纈氨酰-(芐醚)酪氨酸酯；粗產率大于100％。該化合物無需進一步純化即可直接用于合成后面的五肽化合物。
實施例5五肽化合物5{R3-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-Cbz)-Asp(OBn)-Val-Tyr-(OBn)OR2，R2＝Me，R3＝Boc}的合成。
將1.98克四肽化合物與15毫升三氟乙酸反應脫去Boc保護基，用10％冷的氫氧化鈉洗滌有機溶劑至PH值為9，再用飽和食鹽水洗滌，用無水硫酸鈉干燥后濃縮，再用四氫呋喃溶解并冷藏備用；使0.7克Boc-(N-硝基)-精氨酸在0.26毫升N-甲基嗎啉催化下與0.21毫升氯甲酸乙酯反應合成混合酸酐，該混合酸酐與前述脫去Boc保護基的四肽化合物反應，經過常規化的后處理即得五肽化合物N-Boc-(N-硝基)-精氨酰-(2-氯芐氧甲酰基)-賴氨酰-(芐酯)-天門冬氨酰-纈氨酰-(芐醚)酪氨酸酯，粗產率大于100％。實施例6胸腺五肽TP5粗肽的合成與純化。
把1.2克五肽化合物5{R3-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-Cbz)-Asp(OBn)-Val-Tyr(OBn)OR2，R2＝Me，R3＝Boc}溶解于20毫升甲醇中，通入預冷的HF氣體(于HF氣體切割裝置中進行)約2小時，用氮氣流吹走并減壓抽除剩余的HF氣體將反應物裝入100毫升的圓底燒瓶中，向其中于0℃條件下加入2M的氫氧化鈉2ml，恢復至室溫反應1小時，HPLC檢測皂化反應完全后，用5％稀鹽酸調PH值為6.0左右，用乙醚50毫升萃取兩次，除去脂溶性雜質后，堿壓濃縮除去部分甲醇，制備性高壓液相色譜純化(C18柱，乙腈/水梯度洗脫)。冷凍干燥機冷凍干燥得TP5為白色凍干粉狀固體588毫克。1H NMR(300MHz，DCCl3)δ(ppm)0.635～0.657(m，6H，C(CH3)2)，1.241(m，2H，CH2)，1.446～1.583(m，6H，3CH2)，1.727～1.782(m，4H，2CH2)，2.608～2.652(m，2H，NCH2)，2.763～2.815(m，2H，NCH2)，2.969～3.037(m，3H，NCH，PhCH2)，3.863(t，2H，NCH，J＝9Hz)，4.161(t，1H，NCH，J＝6.6Hz)，4.402～4.585(m，3H，CH2，NCH)，4.689～4.726(m，1H，NCH)，6.642(d，2H，PhH，J＝8.4Hz)，6.955(d，2H，PhH，J＝8.4Hz)。FAB-MS(M+1)＝680，ESI-MS679。
實施例7 胸腺五肽TP5粗肽的合成與純化。
把1.2克五肽化合物5{R3-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-Cbz)-Asp(OBn)-Val-Tyr-(OBn)OR2，R2＝Bn，R3＝Boc}溶解于20毫升甲醇中，通入預冷的HF氣體(于HF氣體切割裝置中進行)約2小時，用氮氣流吹走并減壓抽除剩余的HF氣體將反應物裝入100毫升的圓底燒瓶中，用20毫升水溶解，用乙醚15毫升萃取兩次，除去脂溶性雜質后，制備性高壓液相色譜純化(C18柱，乙腈/水梯度洗脫)。冷凍干燥機冷凍干燥得TP5為白色凍干粉狀固體592毫克。1H NMR(300MHz，DCCl3)δ(ppm)0.635～0.657(m，6H，C(CH3)2)，1.241(m，2H，CH2)，1.446～1.583(m，6H，3CH2)，1.727～1.782(m，4H，2CH2)，2.608～2.652(m，2H，NCH2)，2.763～2.815(m，2H，NCH2)，2.969～3.037(m，3H，NCH，PhCH2)，3.863(t，2H，NCH，J＝9Hz)，4.161(t，1H，NCH，J＝6.6Hz)，4.402～4.585(m，3H，CH2，NCH)，4.689～4.726(m，1H，NCH)，6.642(d，2H，PhH，J＝8.4Hz)，6.955(d，2H，PhH，J＝8.4Hz)。FAB-MS(M+1)＝680，ESI-MS679。
實施例8 胸腺五肽TP5粗肽的合成與純化。
在高壓反應釜中，把1.22克五肽化合物5{R3-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-Cbz)-Asp(OBn)-Val-Tyr(OBn)OR2，R2＝Me，R3＝Cbz}溶解于20毫升甲醇中，加入10％的Pd/C 120毫克，通入氫氣使壓力為40個大氣壓，在室溫下反應10個小時后濾掉Pd/C，減壓濃縮干甲醇，溶解于水中，將反應物裝入100毫升的圓底燒瓶中，向其中于0℃條件下加入2M的氫氧化鈉2ml，恢復至室溫反應1小時，HPLC檢測皂化反應完全后，用5％稀鹽酸調PH值為6.0左右，用乙醚50毫升萃取兩次，除去脂溶性雜質后，堿壓濃縮除去部分甲醇，制備性高壓液相色譜純化(C18柱，乙腈/水梯度洗脫)。冷凍干燥機冷凍干燥得TP5為白色凍干粉狀固體610毫克。1H NMR(300MHz，DCCl3)δ(ppm)0.635～0.657(m，6H，C(CH3)2)，1.241(m，2H，CH2)，1.446～1.583(m，6H，3CH2)，1.727～1.782(m，4H，2CH2)，2.608～2.652(m，2H，NCH2)，2.763～2.815(m，2H，NCH2)，2.969～3.037(m，3H，NCH，PhCH2)，3.863(t，2H，NCH，J＝9Hz)，4.161(t，1H，NCH，J＝6.6Hz)，4.402～4.585(m，3H，CH2，NCH)，4.689～4.726(m，1H，NCH)，6.642(d，2H，PhH，J＝8.4Hz)，6.955(d，2H，PhH，J＝8.4Hz)。FAB-MS(M+1)＝680，ESI-MS679。
實施例9 胸腺五肽TP5粗肽的合成與純化。
在高壓反應釜中，把1.22克五肽化合物5{R3-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-Cbz)-Asp(OBn)-Val-Tyr(OBn)OR2，R2＝Bn，R3＝Cbz}溶解于20毫升甲醇中，加入10％的Pd/C 120毫克，通入氫氣使壓力為40個大氣壓，在室溫下反應10個小時后濾掉Pd/C，減壓濃縮干甲醇，溶解于20毫升水中，用乙醚15毫升萃取兩次，除去脂溶性雜質后，制備性高壓液相色譜純化(C18柱，乙腈/水梯度洗脫)。冷凍干燥機冷凍干燥得TP5為白色凍干粉狀固體604毫克。1HNMR(300MHz，DCCl3)δ(ppm)0.635～0.657(m，6H，C(CH3)2)，1.241(m，2H，CH2)，1.446～1.583(m，6H，3CH2)，1.727～1.782(m，4H，2CH2)，2.608～2.652(m，2H，NCH2)，2.763～2.815(m，2H，NCH2)，2.969～3.037(m，3H，NCH，PhCH2)，3.863(t，2H，NCH，J＝9Hz)，4.161(t，1H，NCH，J＝6.6Hz)，4.402～4.585(m，3H，CH2，NCH)，4.689～4.726(m，1H，NCH)，6.642(d，2H，PhH，J＝8.4Hz)，6.955(d，2H，PhH，J＝8.4Hz)。FAB-MS(M+1)＝680，ESI-MS679。
權利要求
1.一種混合酸酐法合成胸腺五肽的方法，過程有二肽合成—三肽合成—四肽合成—五肽合成—粗品生成；其特征在于以N-甲基嗎啉為催化劑，采用氯甲酸烷基酯為活化劑，活化被保護的氨基酸形成高反應活性的混合酸酐，與氨基端裸露的氨基酸或肽反應來合成胸腺五肽；各肽合成中均采用N-甲基嗎啉為催化劑，氯甲酸烷基酯為活化劑，各肽合成過程包括混合酸酐的生成—過濾—減壓濃縮—酸堿洗滌—干燥除水—各肽生成—脫保護基的過程，合成五肽后，脫掉保護基團，生成粗品胸腺五肽，再純化；所述被保護的氨基酸按各肽合成順序是酪氨酸酯與纈氨酸的混合酸酐反應得到二肽、天門冬氨酸的混合酸酐與二肽反應得到三肽、賴氨酸的混合酸酐與三肽反應得到四肽、精氨酸的混合酸酐與四肽反應得到五肽粗品，所用氨基酸的2-氨基都采用叔丁氧甲酰基(Boc)保護，精氨酸的2-氨基由叔丁氧甲酰基(Boc)或芐氧甲酰基(Cbz)保護，天門冬氨酸的側鏈羧基采用芐酯保護，賴氨酸的側鏈氨基用2-氯芐氧甲酰基保護，精氨酸的側鏈胍基用硝基保護，酪氨酸的酚羥基用芐基保護，羧基用酯基保護；減壓濃縮—酸堿洗滌—干燥除水過程為減壓濃縮干后加入乙酸乙酯，分別用稀鹽酸、碳酸氫鈉和飽和食鹽水洗滌，用無水硫酸鈉干燥；脫保護基過程為，加入三氟乙酸脫除叔丁氧甲酰基(Boc)保護基團，減壓濃縮后加入有機溶劑溶解，有機溶劑可以是二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯，用冷的氫氧化鈉洗滌有機溶劑，再用飽和食鹽水洗滌，用無水硫酸鈉干燥后濃縮，再用四氫呋喃或N，N-二甲基甲酰胺溶劑溶解并冷藏備用，其中溶劑優選四氫呋喃；所述粗品生成是指合成五肽后，用氟化氫切割—皂化或用催化氫化—三氟乙酸化—皂化脫掉所有保護基團。在粗品生成后的純化過程為，用制備性高壓液相色譜純化，得到胸腺五肽水溶液，然后冷凍干燥。
2.按照權利要求1所述的混合酸酐法合成胸腺五肽的方法，其特征在于所述氯甲酸烷基酯(ClCO2R1，R1＝Et、Pr、iPr、n-Bu、iBu)選用氯甲酸乙酯、氯甲酸丙酯、氯甲酸異丙酯、氯甲酸丁酯、氯甲酸異丁酯，其中優選氯甲酸乙酯；所述酪氨酸酯為酪氨酸甲酯、乙酯、芐酯或芐醚酪氨酸甲酯、乙酯、芐酯。
3.按照權利要求1或2所述的混合酸酐法合成胸腺五肽的方法，其特征在于所述混合酸酐的生成過程中的反應溫度為-10～-18℃；各肽合成過程中的反應溫度為-18～0℃。
4.按照權利要求3所述的混合酸酐法合成胸腺五肽的方法，其特征在于所述粗品生成過程中所用氟化氫切割—皂化法脫掉所有保護基團的過程為，對于合成的五肽化合物N-叔丁氧甲酰基-(N-硝基)-精氨酰-(2-氯芐氧甲酰基)-賴氨酰-(芐酯)天門冬氨酰-纈氨酰-(芐醚)酪氨酸酯或N-芐氧甲酰基-(N-硝基)-精氨酰-(2-氯芐氧甲酰基)-賴氨酰-(芐酯)-天門冬氨酰-纈氨酰-(芐醚)酪氨酸酯{R3-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-Cbz)-Asp(OBn)-Val-Tyr(OBn)OR2，R2＝甲基(Me)、乙基(Et)、芐基(Bn)，R3＝叔丁氧甲酰基(Boc)、芐氧甲酰基(Cbz)}，當R2＝Bn基時，經氟化氫切割直接得到胸腺五肽的粗品；當R2＝Me、Et時，經氟化氫切割后，脫掉除甲酯或乙酯以外的所有保護基團，再用氫氧化鈉的甲醇水溶液皂化1-2小時，脫掉酪氨酸殘基上的甲基或乙基保護基，得到粗的胸腺五肽化合物。
5.按照權利要求3所述的混合酸酐法合成胸腺五肽的方法，其特征在于所述粗品生成過程中所用催化氫化—三氟乙酸化—皂化脫掉所有保護基團的過程為，對于合成的五肽化合物N-叔丁氧甲酰基-(N-硝基)-精氨酰-(2-氯芐氧甲酰基)-賴氨酰-(芐酯)天門冬氨酰-纈氨酰-(芐醚)酪氨酸酯或N-芐氧甲酰基-(N-硝基)-精氨酰-(2-氯芐氧甲酰基)-賴氨酰-(芐酯)-天門冬氨酰-纈氨酰-(芐醚)酪氨酸酯{R3-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-Cbz)-Asp(OBn)-Val-Tyr(OBn)OR2，R2＝Me、Et、Bn，R3＝Boc、Cbz)，當R3＝Cbz，R2＝Bn時，采用催化氫化脫掉芐基(Bn)、硝基、芐氧甲酰基(Cbz)、2-氯芐氧甲酰基(2-Cl-z)保護基團，可以直接得到粗肽產品；當R3＝叔丁氧甲酰基(Boc)時，催化氫化后再用三氟乙酸脫掉叔丁氧甲酰基(Boc)；在R2＝Me、Et時，經過氫化或三氟乙酸化脫掉其他的保護基團之后，最后可用甲醇—氫氧化鈉皂化1-2小時，脫掉酪氨酸殘基的甲基或乙基保護基，得到五肽的粗肽化合物。
6.按照權利要求5所述的混合酸酐法合成胸腺五肽的方法，其特征在于所述催化氫化過程中，催化劑用量為粗品重量的10～30％的鈀/碳(Pd/C)，所用的鈀/碳中金屬鈀的重量百分含量為10～20％；所用氫氣壓力為10到100個大氣壓力。
全文摘要
本發明公開了一種混合酸酐法液相合成胸腺五肽的方法，它解決了目前胸腺五肽生產中存在的不能大規模合成胸腺五肽的技術問題。其合成過程有二肽合成—三肽合成—四肽合成—五肽合成—粗品生成；它是以N－甲基嗎啉為催化劑，采用氯甲酸烷基酯為活化劑，活化被保護的氨基酸形成高反應活性的混合酸酐，與氨基端裸露的氨基酸或肽反應來合成胸腺五肽；各肽合成過程包括混合酸酐的生成—過濾—減壓濃縮—酸堿洗滌—干燥除水—各肽生成—脫保護基的過程，合成五肽后，脫掉保護基團，生成粗品胸腺五肽，再純化；本發明的合成過程，避免使用任何昂貴的接肽縮合試劑；最終產物純度高，兼具液相與固相合成法的中間產物最小程度純化和易形成規模化生產的優點。
文檔編號C07K7/06GK1640889SQ20041000260
公開日2005年7月20日 申請日期2004年1月13日 優先權日2004年1月13日
發明者達朝山, 劉大學 申請人:蘭州凱博生物化學技術有限公司