針對磷脂酶a2的抗體及其應用的制作方法
                            
            
                            
            文檔序號：3554254閱讀：592來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：針對磷脂酶a2的抗體及其應用的制作方法
            
發明
            
背景技術：
             領域本發明涉及針對抗原磷脂酶A2(PLA2)的抗體以及所述抗體的應用。尤其是，根據本發明的某些實施方案，提供針對抗原PLA2的完全人源單克隆抗體。本發明提供編碼以下序列的核苷酸序列和含有以下序列的氨基酸序列，所述序列為免疫球蛋白分子的重鏈和輕鏈，特別是對應于跨骨架區和/或互補決定區(CDR)的連續重鏈和輕鏈序列的序列，具體從FR1到FR4或從CDR1到CDR3。本發明還提供表達這些免疫球蛋白分子和單克隆抗體的雜交瘤或其他細胞系。
            
背景技術：
             分泌型磷脂酶A2(PLA2)酶是由小的、含二硫化物的鈣依賴酶組成的一類普遍存在的家族，該酶可催化水解磷脂sn-2酯鍵，釋放溶血磷脂和游離脂肪酸產物。見E.A.Dennis，TBE Enzymes，第16卷，Academic Press，New York(1983).PLA2的核苷酸和氨基酸序列分別在SEQ ID NO1和2中表明。兩個保守性殘基的側鏈，組氨酸和天冬氨酸，參與催化部位。
            
具體地說，PLA2水解L-1，2-二酰基磷脂的2-酰基，生成游離脂肪酸，例如花生四烯酸和溶血磷脂。溶血磷脂能夠破壞細胞和膜，在與疼痛、發燒和炎癥有關的四大類花生酸(前列腺素，前列環素，血栓烷和白三烯)的生物合成中，由膜磷脂合成花生四烯酸是限速步驟。花生四烯酸通過兩種酶途徑代謝，隨后轉化為促炎物質，包括白三烯(通過脂氧化酶活性)、血栓烷和前列腺素(兩者均通過環加氧酶活性)。這些化學介質募集免疫系統和補體級聯反應中的細胞，產生放大的炎癥反應。此外，已知白三烯-B4以反饋環形式作用，進一步提高PLA2活性(Wijkander，J.等(1995)J.Biol.Chem.27026543-26549)。
            
超過80種PLA2酶已經進行了結構鑒定，顯示高度的序列同源性。J.Chang等，Biochem.Pharm.362429-2436，(1987)；F.F.Davidson和E.A.Dennis，J.of Molecular Evolution 31228-238(1990).PLA2酶中鑒定最充分的種類是分泌型，此類酶被釋放到細胞外環境中，以幫助消化生物物質。分泌型的分子量約為12～15kDa(Davidson和Dennis，同上)。
            
在哺乳動物細胞中，至少鑒定出四組不同的PLA2，包括組I(胰腺的)，組IIA，組IIC(炎癥的)和組V(在心臟中表達)。組I中PLA2酶作用在于消化食物中的脂質，并且有人提出其在細胞增殖、平滑肌收縮和急性肺損傷中具有一定作用。組II中PLA2酶是炎性過程的有效介質，在炎性病變(inflammatory disorder)患者的血清和滑液中大量表達。這些酶在檢測的多種人細胞類型中均有發現，并在多種病理過程例如敗血癥休克、腸癌、類風濕性關節炎和表皮增生中表達。組V中的一種PLA2酶已從腦組織中克隆，在心臟組織中強烈表達。其他的PLA2酶已經從多種人體組織和細胞系中克隆，表明PLA2酶的高多樣性。最近從胎兒肺中克隆了一種人PLA2酶，根據其結構特征，該酶似乎是被稱之為組X的哺乳動物PLA2酶中新一組的第一個成員。(Chen J.等(1994)J.Biol.Chem.2692365-2368；Kennedy，B.P.等(1995)J.Biol.Chem.27022378-22385；Komada，M.等(1990)Biochem.Biophys.Res.Commun.1681059-1065；和Cupillard，L.等(1997)J.Biol.Chem.27215745-15752)。
            

            發明內容
            
本發明的實施方案涉及針對PLA2的抗體。針對抗原PLA2的抗體可用作降脂質劑(lipid lowering agent)，例如在治療動脈粥樣硬化和再狹窄中。所述抗體也用于診斷、預防和治療炎性病變。炎性病變和退行性病變(degenerative disorder)可解釋絕大多數的衰弱疾病(debilitatingdisease)。炎癥狀態(state)，例如動脈粥樣硬化、關節炎、牛皮癬和哮喘，均源于關節、皮膚和血管處的炎癥反應。此外，最近的研究還表明，阿爾察默病(Alzheimer′s disease)病理的主要部分(component)是慢性炎癥，給藥非類固醇抗炎藥物似乎可以減慢阿爾察默病的病情發展。Schnabel，Science 2601719-1720(1993)。
            
減弱或消除炎癥反應是治療這些疾病的關鍵。因此，本文所述抗體用作PLA2的抑制劑，以阻止從膜磷脂釋放花生四烯酸，停止全部花生四烯酸級聯反應，從而中止由炎性過程引發的損傷。
            
本發明的實施方案還包括與PLA2結合并影響PLA2功能的單克隆抗體。因此，本發明的實施方案提供具有診斷和治療所需性質的人源抗PLA2抗體和抗PLA2抗體的制品。具體地說，本發明的一個實施方案提供的抗PLA2抗體具有治療上可利用的特征，包括，例如，但不限于，與PLA2的強結合親和力、體外中和PLA2功能的能力和體內長時間中和PLA2功能的能力。
            
本發明的一個實施方案是與PLA2結合的完全人源單克隆抗體，并具有選自SEQ ID NO3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，30和31的重鏈氨基酸序列。在一個實施方案中，所述抗體進一步包括選自SEQ IDNO4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26和28的輕鏈氨基酸序列。
            
本發明另一實施方案是與PLA2結合的完全人源抗體，并包括具有如表3和4所示的CDR序列的重鏈氨基酸序列。已知CDR的測定可由本領域普通技術人員容易地完成。一般地，本發明中所述的CDR如Kabat等在Sequences of Proteins of Immunological Interest，1-3卷(第五版，NIHPublication 91-3242，Bethesda MD 1991)所定義。
            
而本發明另一實施方案是與PLA2結合的完全人源抗體，并包括具有如表5和6所示的CDR序列的輕鏈氨基酸序列。
            
本發明的再一實施方案是與PLA2結合的完全人源抗體，并且該抗體包括具有包括如表3和4所示序列的CDR的重鏈氨基酸序列，和具有包括如表5和6所示序列的CDR的輕鏈氨基酸序列。
            
本發明的再一實施方案是與本發明的完全人源抗體交叉競爭結合PLA2的抗體。在本發明另一實施方案中，完全人源抗體是抗PLA2單抗2.12或抗PLA2單抗2.25。
            
所述本發明的實施方案基于與PLA2特異性結合的分離抗體的產生和識別。如上所討論，PLA2在炎癥疾病和相關病癥(condition)中表達水平提高。因此，抑制PLA2的生物活性可延緩由此類疾病和病癥引發的綜合癥的發展。所述疾病或病癥可以是，例如，源于關節、皮膚和血管處炎癥反應的炎性病變和退行性病變，包括但不限于，關節炎、牛皮癬、哮喘和阿爾察默病，但最優選動脈粥樣硬化和再狹窄。
            
因此，所述本發明的一個實施方案提供與PLA2結合的分離抗體或其片段。如本領域所公知，抗體優選為，例如，單克隆、嵌合和/或人源抗體。所述本發明的實施方案還提供產生這些抗體的細胞。
            
應該領會的是，本發明的實施方案不限于任何特定的抗PLA2抗體，或抗體的任何具體形式。例如，抗PLA2抗體可以是全長抗體(例如具有完整的人Fc區)或抗體片段(例如Fab，Fab′或F(ab′)2)。此外，抗體可以由分泌該抗體的雜交瘤制備，或者由編碼該抗體的單個基因或多個基因轉化或轉染的重組產生的細胞制備。
            
在一個優選的實施方案中，本發明包括治療人類的炎癥病癥和相關疾病，包括但不限于，源于關節、皮膚和血管處炎癥反應的炎性病變和退行性病變，包括但不限于，關節炎、牛皮癬、哮喘和阿爾察默病，但最優選動脈粥樣硬化和再狹窄。
            
在一個實施方案中，抗PLA2抗體形成一種藥用組合物，包括有效量的所述抗體或其片段，連同藥學上可接受的載體或稀釋劑。在另一實施方案中，抗PLA2抗體或其片段與治療劑相配合(conjugate)。所述治療劑可以是毒素或放射性同位素。這些抗體可優選用于治療疾病，例如，源于關節、皮膚和血管處炎癥反應的炎性病變和退行性病變，包括但不限于，關節炎、牛皮癬、哮喘和阿爾察默病，但最優選動脈粥樣硬化和再狹窄。
            
在另一實施方案中，本發明包括一種治療與患者的PLA2表達有關的疾病或病癥的方法，所述方法通過給該患者給藥有效量的抗PLA2抗體實現。患者為哺乳動物患者，優選為人類患者。這些疾病或病癥可以是，例如，源于關節、皮膚和血管處炎癥反應的炎性病變和退行性病變，包括但不限于，關節炎、牛皮癬、哮喘和阿爾察默病，但最優選動脈粥樣硬化和再狹窄。另外的實施方案包括通過下列步驟為哺乳動物治療與PLA2的表達有關的疾病或病癥的方法識別需要進行炎癥病癥治療的哺乳動物，給所述哺乳動物給藥治療有效量的抗PLA2抗體。
            
或者，可以給哺乳動物給藥抗PLA2抗體以防止其感染上與PLA2的表達有關的疾病或病癥，包括但不限于，炎癥病癥或相關疾病。抗PLA2抗體優選為完全人源抗體。所述疾病或病癥可以是，例如，但不限于，基于關節、皮膚和血管處炎癥反應的炎性病變和退行性病變，包括但不限于，關節炎、牛皮癬、哮喘和阿爾察默病，并且最優選動脈粥樣硬化和再狹窄。
            
在另一實施方案中，本發明為一個包括一容器、和一包裝說明書或標簽的制成品，所述容器具有包含抗PLA2抗體的組合物，所述包裝說明書或標簽表明該組合物可用于治療以PLA2的表達為特征的病癥。優選哺乳動物，更優選人類接受抗PLA2抗體。在一個優選的實施方案中，治療人類炎癥病癥和相關疾病。
            
另一實施方案為一種識別一種疾病的危險因素、診斷一種疾病和判斷一種疾病病期的方法，該方法包括使用抗PLA2抗體識別PLA2的存在。
            
在一個實施方案中，本發明包括一種診斷與細胞中PLA2的表達有關的病癥的方法，所述方法通過將該細胞與抗PLA2抗體接觸并檢測PLA2的存在實現。
            
在另一實施方案中，本發明包括一種檢測哺乳動物組織或細胞中的PLA2以篩選出人類的炎癥病癥和相關疾病的檢測試劑盒。所述試劑盒包括一種與PLA2結合的抗體，和一種顯示該抗體與PLA2(如果存在)反應的工具。該抗體優選為單克隆抗體。在一個實施方案中，與PLA2結合的抗體被標記。抗體優選使用選自下列的標記物標記熒光染料、酶、放射性核素和不透射線物質。在另一實施方案中，抗體為未標記的一次抗體，顯示反應的工具為一種標記的抗免疫球蛋白抗體。
            
而另一實施方案為一種抗PLA2抗體在制備治療炎癥病癥和相關疾病的藥物中的應用。在一個實施方案中，所述疾病選自基于關節、皮膚和血管處炎癥反應的炎性病變和退行性病變，包括但不限于，關節炎、牛皮癬、哮喘和阿爾察默病，但最優選動脈粥樣硬化和再狹窄。
            

            

            
圖1A為柱狀圖，顯示滴定量的與0.5單位PLA2酶溫育的底物的劑量-反應曲線。
            
圖1B為柱狀圖，顯示KLH對檢測的影響最小。
            
圖2A為柱狀圖，顯示與400nM Bis-BODIPY底物溫育、并由Fxa裂解細菌表達的滴定量的酶。
            
圖2B為柱狀圖，顯示被20μl/孔從G2和G4的KLH廢棄(exhaust)上清液輕微抑制、并由細菌表達的PLA2的酶活性。
            
圖3為線形圖，顯示每種抗體所測試的最高劑量的抑制百分率。
            
圖4為單抗2.12的特異性結合物(binder)的肽共有序列的比對結果。
            
具體實施例方式
            
本發明的一個實施方案涉及針對抗原PLA2的抗體以及此抗體的應用。例如，針對PLA2的抗體可用于對炎癥病癥和相關疾病進行有效預防、治療、診斷和/或判斷病期的方法。所述病癥包括，例如，關節、皮膚和血管處的炎癥反應，動脈粥樣硬化，關節炎，牛皮癬，哮喘，再狹窄和阿爾察默病。在一個具體的實施方案中，給藥治療有效量的抗PLA2抗體以治療炎癥病癥和相關疾病。在優選的實施方案中，抗體為針對抗原PLA2的完全人源單克隆抗體。
            
本發明的其他實施方案涉及可導致體內炎癥減輕的其他化合物。從而，降低PLA2水平的化合物可用于治療炎癥病癥。PLA2核酸、多肽、抗體、促效劑(agonist)、拮抗劑(antagonist)和其他有關化合物的用途會在下文更完全地公開。
            
另外，本發明的核酸及其片段和變體，可用于(以非限制性舉例方式)，(a)指導相應的編碼蛋白、多肽、片段和變體作為重組或異源基因產物的生物合成，(b)用作檢測和定量本文所公開的核酸的探針，(c)用作制備反義分子的序列模板，等用途。這些用途將在以下公開內容中更完整地敘述。
            
另外，本發明的蛋白和多肽，及其片段和變體，可應用的方式包括(a)用作免疫原以激發產生抗PLA2抗體，(b)在此抗體的免疫原性檢測中用作捕捉抗原(c)用作篩選與本發明的PLA2多肽結合的物質的目標，和(d)用作PLA2特異性抗體的靶，以致使用所述抗體的治療可抑制炎癥反應。PLA2核酸、多肽、抗體、促效劑、拮抗劑和其他相關化合物的上述用途和其他用途會在下文更完全地公開。由于其調節炎癥的效果很強，增強PLA2多肽的表達或活性可用于促進炎癥。相反，減弱PLA2多肽的表達可用于減輕炎癥。
            
序列表序列表中提供了典型的人源抗PLA2抗體的重鏈和輕鏈可變區核苷酸和氨基酸序列，其內容在表1中總結如下。
            
表1  
            
     
            
     
            
除非另有定義，本文所使用的科技術語的含義與本領域的普通技術人員通常理解的含義相同。另外，除非上下文另有要求，單數形式的術語包括其復數，復數形式的術語也包括其單數。一般地，本文所述細胞和組織培養、分子生物學、蛋白質和寡核苷酸或多核苷酸化學，以及雜交有關的術語和技術，都是本技術領域公知的和通常使用的。重組DNA、寡核苷酸合成、組織培養和轉化(例如電穿孔、脂轉染(lipofection))均使用標準技術。酶促反應和純化技術根據制造商的說明書或本領域常規方法或本文所述的進行操作。上述技術和方法一般按照本領域所公知的，以及本說明書通篇引用和討論的多篇一般和具體文獻中記載的常規方法進行操作。參見例如Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual(第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))。本文記載的分析化學、有機合成化學、藥物化學和制藥化學有關的術語、實驗室方法和技術均為本領域公知的和通常使用的。化學合成、化學分析、藥品的制備、配方和遞送以及患者治療均使用標準技術。
            
根據所提供的實施方案中使用的下列術語，除非另有說明，按照以下意思理解本文使用的術語“分離多核苷酸”是指基因組、cDNA或合成源的多核苷酸，或其某種組合，依據其來源，“分離多核苷酸”(1)與“分離多核苷酸”天然存在于其中的另一個多核苷酸的全部或部分沒有關聯，(2)有效連接到與其無天然連接的另一多核苷酸，或者(3)不作為較大序列的一部分天然存在。
            
本文使用的術語“分離蛋白質”是指cDNA、重組RNA或合成來源的，或其某種形式的組合的蛋白質，依據其來源或起源，“分離蛋白質”(1)不與自然界中發現的蛋白質有關聯，(2)不含有相同來源的其他蛋白質，如不含有鼠蛋白(murine protein)，(3)在另一不同物種的細胞中表達，或(4)在自然界中不存在。
            
本文使用的“多肽”作為一個通用術語，是指天然蛋白、片段或多肽序列的類似物。所以，天然蛋白、片段和類似物是多肽屬的幾種。根據本發明，優選的多肽包括人源重鏈免疫球蛋白分子和人源κ輕鏈免疫球蛋白分子，以及由包括重鏈免疫球蛋白分子，輕鏈免疫球蛋白分子，如κ輕鏈免疫球蛋白分子(反之亦然)，以及其片段和類似物相結合形成的抗體分子。
            
本文提到某對象時使用的術語“天然存在”是指該對象可以在自然界中發現的事實。例如，一段多肽或多核苷酸序列，存在于生物有機體(包括病毒)中，可以從天然源中分離，并且沒有在實驗室中經過人類或某他途徑有意地修飾，這樣的多肽或多核苷酸序列就是天然存在的。
            
本文使用的術語“有效連接”是指所述各元件的位置關系，可使它們以預期方式發揮功能。一段控制序列“有效連接”到一段編碼序列，其連接方式可以在與控制序列相容的條件下實現編碼序列的表達。
            
本文使用的術語“控制序列”是指影響與之相連的編碼序列的表達和加工所必須的多核苷酸序列。控制序列的性質因宿主有機體的不同而不同；原核生物中，控制序列一般包括啟動子、核糖體結合位點和轉錄終止序列；真核生物中，控制序列一般包括啟動子和轉錄終止序列。術語“控制序列”旨在至少包括其存在對表達和加工起重要作用的所有元件，并且還可以包括其存在是有益的附加元件，例如，前導序列和融合配偶體序列(fusionpartner sequence)。
            
本文使用的術語“多核苷酸”是指長度為至少10個堿基的多聚體形式的核苷酸，它可以是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或修飾形式的所述兩種核苷酸中的任一種。該術語包括單鏈和雙鏈形式的DNA。
            
本文使用的術語“寡核苷酸”包括由天然存在的和非天然存在的寡核苷酸鍵連接起來的天然存在的和經過修飾的核苷酸。寡核苷酸是多核苷酸的亞組(subset)，通常包括不超過200個堿基的長度。寡核苷酸優選為10到60個堿基長度，最優選12、13、14、15、16、17、18、19、或20到40個堿基長度。寡核苷酸通常為單鏈，如用于探針；但寡核苷酸也可以為雙鏈，如用于構建基因突變體。本發明的寡核苷酸可以為正義或反義寡核苷酸。
            
本文使用的術語“天然存在的核苷酸”包括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文使用的術語“經過修飾的核苷酸”包括具有修飾或替代的糖基的核苷酸等。本文使用的術語“寡核苷酸鍵”包括如下寡核苷酸鍵，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoraniladate、磷酰胺酯(phosphoroamidate)等。參見例如，LaPlanche等Nucl.Acids Res.149081(1986)；Stec等，J.Am.Chem.Soc.1066077(1984)；Stein等Nucl.Acids Res.163209(1988)；Zon等Anti-Cancer Drug Design 6539(1991)；Zon等Oligonucleotides andAnaloguesA Practical Approach，87-108頁(F.Eckstein編輯，OxfordUniversity Press，英國牛津市(1991))；Stec等的美國專利5,151,510；Uhlmann和Peyman Chemical Reviews 90543(1990)。如果需要，寡核苷酸可以包括檢測標記。
            
本文使用的術語“選擇性雜交”是指可檢測到的特異性結合。本發明的多核苷酸、寡核苷酸和其片段與核酸鏈選擇性雜交，其雜交和洗滌的條件應使可檢測到的與非特異性核酸結合的可測量的量達到最小。如本領域所公知和本文所討論的，可使用非常嚴格的條件獲得選擇性雜交的條件。一般地，本發明的多核苷酸、寡核苷酸及片段和所研究的核酸序列之間的核酸序列的同源性(homology)為至少80％，更一般地，優選將同源性提高到至少85％，90％，95％，99％和100％。如果兩段氨基酸序列部分或完全相同，那么它們是同源的。例如85％同源性表示當兩段序列以最大匹配的方式比對時，有85％的氨基酸是相同的。最大匹配時允許存在間隔(匹配的兩段序列中任一段上)；間隔長度優選5或更小，更優選2或更小。另一種優選情形，兩條蛋白序列(或來源于蛋白的至少30氨基酸長度的多肽序列)使用帶有突變數據矩陣、間隔罰分設置值等于或大于6的程序ALIGN時，如果它們的比對分數大于5(標準差單元)，本文中稱之為同源。參見M.O.Dayhoff，Atlas of Protein Sequence and Structure，101-110頁(第5卷，National Biomedical Research Foundation(1972))和該卷的增補本2，1-10頁。當使用ALIGN程序對兩段序列或其部分進行最優比對時，如果它們的氨基酸有多于或等于50％相同時，它們即為更優選的同源。本文使用的術語“相應的”表示一段多核苷酸序列與基準多核苷酸序列的全部或部分同源(即相同，但沒有嚴格的進化關系)，或者一段多肽序列與基準多肽序列相同。與之不同的是，本文使用術語“互補的”表示其互補序列與基準多核苷酸序列的全部或部分同源。舉例說明，核苷酸序列“TATAC”與基準序列“TATAC”相應，與“GTATA”互補。
            
下列術語用于描述兩條或多條多核苷酸或氨基酸序列之間的序列關系“基準序列”“對比窗(comparison window)”“序列相同(sequenceidentity)”“序列相同百分率(percentage of sequence identity)”和“基本相同(substantial identity)”。“基準序列”是用作序列比較基礎的規定序列。基準序列可以是較長序列的亞組，比如序列表中所示全長cDNA或基因序列的片段，或者可以包括完整的cDNA或基因序列。一般地，基準序列至少在18核苷酸或6氨基酸長度，經常至少24核苷酸或8氨基酸長度，更經常至少48核苷酸或16氨基酸長度。既然兩段多核苷酸或氨基酸序列中的各段都可以(1)包括一段在所述兩分子之間相似的序列(即完整多核苷酸或氨基酸序列的一部分)，并且(2)還包括一段在兩段多核苷酸或氨基酸序列之間不同的序列，兩(或多)個分子之間的序列比較一般通過在“對比窗”內比較所述兩個分子的序列進行，以便識別和比較部分區域的序列相似性。本文使用的“對比窗”是指至少18個連續的核苷酸或6個氨基酸這一概念上的片段，其中多核苷酸序列或氨基酸序列與基準序列上的至少大約18個連續的核苷酸或6個氨基酸序列相比較，并且其中與基準序列(它不包括插入或缺失)比較，多核苷酸序列在對比窗中的部分可以包括20％或更少的插入、缺失、替換等(如間隔)以使兩段序列最優比對。用于與對比窗比對的序列的最優比對可以使用以下算法進行局部同源算法(local homology algorithm)，Smith和Waterman Adv.Appl.Math.2482(1981)，同源比對算法(homology alignment algorithm)，Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48443(1970)，尋求相似性方法(searchfor similarity method)，Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.(美國)852444(1988)，這些算法的計算機實現(Wisconsin Genetics軟件包版本7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，(Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)，Geneworks，或MacVector軟件包)，或者人工比對(by inspection)，然后選擇通過以上方法產生的最優比對(即在對比窗中產生最高同源百分率)。
            
術語“序列相同”是指兩段多核苷酸或氨基酸序列在對比窗內相同(即基于單個核苷酸或單個氨基酸殘基順次比較)。術語“序列相同百分率”按照如下方法計算在對比窗內比較兩段最優比對的序列，確定兩段序列中出現相同的核酸堿基(如A、T、C、G、U或I)或殘基的位置的數量，得出匹配位置數，匹配位置數除以對比窗的總位置數(即對比窗的大小)，結果再乘以100即得到序列相同百分率。本文使用的術語“基本相同”表示多核苷酸或氨基酸序列的一種特性，其中多核苷酸或氨基酸包括一段至少85％序列相同的序列，優選至少90～95％序列相同，更優選至少99％序列相同，以上結果是在對比窗內至少18個核苷酸(6氨基酸)位置上，更經常至少24～48個核苷酸(8～16氨基酸)位置上與基準序列比較得出的，其中序列相同百分率是通過在對比窗內比較基準序列與某一序列計算得到的，該序列可以包括總計為基準序列的20％或以下的缺失或插入。基準序列可以是更長序列的亞組。
            
本文引用的20種常規氨基酸及其縮寫遵循常規使用方式。參見Immunology--A Synthesis(第二版，E.S.Golub和D.R.Gren編輯，SinauerAssociates，Sunderland，Mass.(1991))。20種常規氨基酸的立體異構體(如D-氨基酸)，非天然氨基酸如α-，α-雙取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸，以及其他非常規氨基酸也可以是本發明的多肽的適宜組分。非常規氨基酸的例子包括4-羥基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基賴氨酸、ε-N-乙酰賴氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、σ-N-甲基精氨酸，以及其他類似氨基酸和亞氨基酸(如4-羥基脯氨酸)。本文所用的多肽表示方法中，左手方向為氨基末端方向，右手方向為羧基末端方向，與標準用法和慣例一致。
            
類似地，除非另有說明，單鏈多核苷酸序列的左手端為5′端；雙鏈多核苷酸序列的左手方向為5′方向。新生RNA轉錄物5′到3′延伸的方向為轉錄方向；DNA鏈上序列和RNA相同，且在RNA轉錄物5′端5′的序列區稱作“上游序列”；DNA鏈上序列和RNA相同的，且在RNA轉錄物3′端3′的序列區稱作“下游序列”。
            
當涉及多肽時，術語“基本相同”是指兩段多肽序列，當它們最優比對時，比如使用GAP或BESTFIT程序以默認間隔權重比對時，共有至少80％的序列相同，優選至少90％的序列相同，更優選至少95％的序列相同，最優選至少99％的序列相同。優選地，不相同的殘基位置是由于保守性氨基酸替換引起的。保守性氨基酸替換是指側鏈相似的殘基之間的可替換性。例如，具有脂肪族側鏈的一組氨基酸為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族-羥基側鏈的一組氨基酸為絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側鏈的一組氨基酸為天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香側鏈的一組氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側鏈的一組氨基酸為賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含硫側鏈的一組氨基酸為半胱氨酸和蛋氨酸。優選的保守性氨基酸替換組為纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
            
如本文所討論，抗體或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中微小變異被認為包含在本發明之內，只要氨基酸序列的變異保持至少75％，更優選至少80％、90％、95％，最優選99％。特別地，考慮保守性氨基酸替換。保守性替換是發生在具有相關側鏈的同一氨基酸家族內的替換。正常編碼的氨基酸一般分為以下幾個家族(1)酸性＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性＝賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)無極性＝丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；以及(4)無電荷極性＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。更優選的家族為絲氨酸與蘇氨酸為脂肪族-羥基家族；天冬酰胺和谷氨酰胺為含酰胺家族；丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸為脂肪家族；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸為芳香家族。例如有理由相信，亮氨酸同異亮氨酸或纈氨酸、天冬氨酸同谷氨酸、蘇氨酸同絲氨酸的單獨替換，或者氨基酸同其結構相近的氨基酸的類似替換不會對所生成分子的結合或性質有較大影響，特別是替換沒有涉及到框架位點內的氨基酸時。氨基酸改變是否產生功能性肽，可易于通過測試多肽衍生物的特異活性檢測。本文對檢測方法作詳細描述。抗體或免疫球蛋白分子的片段或類似物可易于由本領域的普通技術人員制備。優選地，片段或類似物的氨基和羧基末端位于功能區的近邊界處。可以通過比較公共或專有序列數據庫中的核苷酸和/或氨基酸序列數據來識別結構和功能區域。優選地，使用計算機比較法來識別存在于結構和/或功能已知的其他蛋白中的序列基序(sequence motif)或預測的蛋白構象區域。識別出折疊成已知三維結構的蛋白序列的方法已經公知。Bowie等Science 253164(1991)。所以，以上例子說明，本領域技術人員可以識別用于確定與本發明一致的結構和功能區域的序列基序和結構構象。
            
優選的氨基酸替換是能夠(1)降低蛋白分解敏感性，(2)降低氧化敏感性，(3)改變形成蛋白復合物的結合親和力，(4)改變結合親和力，以及(4)賦予或改變其類似物其他物理化學或功能性質的替換。類似物可以包括序列不同于天然存在的肽序列的各種突變蛋白質。例如，單個或多個氨基酸替換(優選保守性氨基酸替換)可以發生于天然存在的序列(優選在形成分子間接觸的區域之外的多肽部分)中。保守性氨基酸替換應該基本不改變親代序列(parent sequence)的結構特性(例如，替換氨基酸應該不會破壞親代序列中存在的螺旋，或破壞親代序列特征性的其他類型的二級結構)。本領域已識別的多肽二級和三級結構的例子記載在Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton編輯，W.H.Freeman and Company，紐約(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze編輯，Garland Publishing，紐約州紐約市(1991))；和Thornton等Nature 354105(1991)。
            
本文使用的術語“多肽片段”是指一段多肽，其氨基末端和/或羧基末端缺失，但其余氨基酸序列同起源于，例如，全長cDNA序列的天然存在的序列中的相應位置相同。片段通常有至少5、6、8或10氨基酸長度，優選至少14氨基酸長度，更優選至少20氨基酸長度，通常至少50氨基酸長度，以及更優選至少70氨基酸長度。本文使用的術語“類似物”是指包括至少25個氨基酸片段的多肽，其與導出(deduced)的氨基酸序列的一部分基本相同，并且至少具備下列性質之一(1)在適宜的結合條件下，與PLA2特異結合，(2)阻止與PLA2正確結合的能力，或(3)體外或體內抑制表達PLA2的細胞生長的能力。通常，相對于天然存在的序列，多肽類似物包含保守性氨基酸替換(或插入或缺失)。類似物通常為至少20氨基酸長度，優選至少50氨基酸長度或更長，并且經常可與全長的天然存在的多肽長度相等。
            
肽類似物通常作為與其模板肽有相似性質的非肽藥物在制藥工業上使用。這些類型的非肽化合物被稱為“肽模仿劑(peptide mimetics)”或“擬肽物(peptidomimetics)”。Fauchere，J.Adv.Drug Res.1529(1986)；Veber和Freidinger TINS 392頁(1985)；和Evans等J.Med.Chem.301229(1987)。這些化合物通常借助計算機化的分子模型開發。與治療有效的肽結構相似的肽模仿劑可用于產生等效的治療或預防效果。一般地，擬肽物在結構上與范例多肽(paradigm polypeptide，即具有生化性質或藥理活性的多肽)，例如人源抗體相似，但其一個或多個肽鍵可任選地由下列鍵替換，所述鍵選自--CH2NH--、--CH2S--、--CH2-CH2--、--CH＝CH--(順式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和-CH2SO--，使用的方法已為本領域所公知。可以使用同型D-氨基酸系統地替換共同序列中一個或多個氨基酸(如D-賴氨酸代替L-賴氨酸)以生產更穩定的肽。另外，包含共同序列或基本相同的共同序列變異體的約束肽(constrained peptide)也可用本領域公知方法合成(Rizo和Gierasch Ann.Rev.Biochem.61387(1992))；例如，加入內半胱氨酸殘基能夠形成分子內二硫橋鍵，可使肽環化。
            
“抗體”或“抗體肽”是指完整的抗體，或與完整的抗體競爭特異結合的其結合片段。結合片段通過重組DNA技術，或通過酶或化學方法切割完整的抗體產生。結合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和單鏈抗體。除了“雙特異性”或“雙功能”抗體外的抗體可理解為其各結合位點相同。過量的抗體使與反受體結合的受體數量減少至少大約20％、40％、60％或80％，更經常地在85％以上(根據體外競爭結合測試所得數據)時，抗體顯著地抑制受體與反受體的結合。
            
術語“表位(epitope)”包括任何可與免疫球蛋白或T細胞受體特異結合的蛋白決定簇。表位決定簇通常由具有化學活性的分子表面基團組成，如氨基酸或糖基側鏈，并且通常具有特異的三維結構特性，以及特異的電荷特性。當離解常數≤1μM，優選≤100nM，最優選≤10nM時，就可以說，抗體與抗原特異結合。
            
本文使用的術語“試劑”是指化學化合物、化學化合物的混合物、生物大分子、或生物材料制成的提取物。
            
就本發明而言，所使用的″活性的″或″活性″是指保持天然的或自然存在的PLA2多肽的生物和/或免疫活性的PLA2多肽形式，其中″生物″活性是指由天然或自然存在的PLA2多肽引起的生物功能(抑制或激發)，而不是指誘導產生針對天然或自然存在的PLA2多肽所具有的抗原表位的抗體的能力，″免疫″活性是指誘導產生針對天然或自然存在的PLA2多肽所具有的抗原表位的抗體的能力。
            
″治療″是指治療(therapeutic treatment)和預防措施，其目標是防止或減緩(減輕)目標病理情況或異常。需要治療者包括已經具有所述異常者，以及易于患上所述異常者或試圖預防所述異常者。
            
″哺乳動物″是指任何可分類為哺乳動物的動物，包括人，其他靈長類，例如猴子、黑猩猩和大猩猩，家畜和農畜，以及動物園飼養的動物、體育競技動物、實驗室用動物或玩賞動物，例如狗、貓、牛、馬、綿羊、豬、山羊、兔、嚙齒動物等等。對治療來說，哺乳動物優選為人類。
            
本文使用的″載體″包括在使用的劑量和濃度下對細胞或哺乳動物沒有毒性的藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑。通常生理上可接受的載體為含水pH緩沖溶液。生理上可接受的載體的實例包括緩沖液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(小于約10個殘基)多肽；蛋白，例如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖，及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨糖醇；鹽形式平衡離子，例如鈉；和/或非離子型表面活性劑，例如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
            
木瓜蛋白酶消化抗體可產生兩個相同的稱為“Fab”片段的抗原結合片段和一個殘余的“Fc”片段，前者每個片段帶有單個抗原結合部位；后者的名稱反映了其能夠容易地結晶。胃蛋白酶處理生成一個″F(ab′)2″片段，該片段具有兩個抗原結合部位，并且仍然能夠交聯抗原。
            
″Fv″是包含抗體的完整的抗原識別和結合部位的最小抗體片段。這一部分由一個重鏈可變區和一個輕鏈可變區通過緊密的非共價鍵結合的二聚物組成。在此結構中，每個可變區的三個CDR相互作用以確定VH-VL二聚物表面的抗原結合部位。這六個CDR共同賦予此抗體以抗原結合特異性。然而，例如，即使單個可變區(如，Fv二聚物的VH或VL部分，或只包括三個特異性針對抗原的CDR的半個Fv)也可能具有識別和結合抗原的能力，盡管其親和力比完整結合部位要低。
            
Fab片段也包含輕鏈恒定區和重鏈第一恒定區(CH1)。Fab片段與Fab′片段的不同之處在于，前者在重鏈CH1區的羧基末端增加了幾個殘基，所述重鏈CH1區包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸。F(ab′)2抗體片段最初作為一對其間具有鉸鏈半胱氨酸的Fab′片段而產生。抗體片段的其他化學耦合方式也為公知。
            
″固相″是指一種本文所述抗體可附著于其上的非水性基質。本文所涵蓋的固相的例子包括，部分或全部由玻璃形成的物質(如可控孔度玻璃(controlled pore glass))，多糖(如瓊脂糖)，聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，聚乙烯醇和硅酮。在某些實施方案中，根據上下文，固相可以包括檢測板的孔；在其他實施方案中，固相為純化柱(如親合層析柱)。本術語還包括離散微粒的非連續固相，例如美國專利No.4,275,149中所述。
            
本文使用的術語″脂質體″表示一種由各種類型的脂質、磷脂和/或表面活性劑組成的小泡，所述表面活性劑可用于將藥物(如PLA2多肽或其抗體)運送至哺乳動物。脂質體成分通常排列成雙分子層的形式，類似于生物膜的脂質排列。
            
本文使用的術語″小分子″描述一種分子量小于約500道爾頓的分子。
            
本文使用的術語″標記″或″標記的″是指加入可檢測標記物，例如，通過加入放射性標記的氨基酸，或者通過附著于可由標記的親和素(例如，含有熒光標記物或可由光學方法或比色法檢測的酶活性的鏈親和素)檢測的生物素基部分的多肽。在某些情況下，標記或標記物也可有治療作用。標記多肽和糖蛋白的多種方法在本領域中是公知的且可以使用。標記多肽的實例包括但不限于以下內容放射性同位素或放射性核素(如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)，熒光標記(如FITC、羅丹明、鑭系磷光體)，酶標記(如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶)，化學發光，生物素基，可被二次報道分子識別的預先確定的多肽表位(如，亮氨酸拉鏈對序列，二次抗體結合部位，金屬結合區域，表位標記)。在一些實施方案中，通過不同長度的間隔臂附著標記物以減少可能存在的空間位阻。
            
本文使用的術語“治療藥劑或藥物”是指正確給藥至患者時產生所需治療效果的化學化合物或組合物。本文使用的其他化學術語與本領域的常規用法一致，示例可以參見The McGraw-Hill Dictionary of ChemicalTerms(Parker，S.編輯，McGraw-Hill，圣弗朗西斯科(1985))。
            
本文使用的“基本純凈”是指目標種類為存在的主要種類(即，以摩爾數計，它在組合物中的含量比其他任何一種都多)，優選地，基本純化的組分是指其中目標種類占所存在的全部大分子種類的至少約50％(以摩爾數計)的組合物。一般地，基本純凈的組合物應占組合物中所存在的全部大分子種類的約80％以上，更優選85％、90％、95％、以及99％以上。最優選地，目標種類純化到基本同質的程度(使用常規檢測方法在組合物中檢測不到雜質類)，此時組合物主要由單一大分子種類組成。
            
術語“患者”包括人類和獸類個體。
            
抗PLA2抗體抗體，或其部分、片段、模仿物(mimetics)或衍生物，可以是識別PLA2的任何類型的抗體或部分。在某些實施方案中，抗體或其部分優選可以中和PLA2。在另一些實施方案中，抗體或其部分優選可以減輕與炎癥病癥相關的綜合癥，包括但不限于炎癥、體液潴留、組織腫脹、疼痛、浮腫、高血壓和腦腫脹。
            
抗體結構已知基本的抗體結構單元包括一個四聚體。各四聚體由兩對相同的多肽鏈組成，每對具有一條“輕”鏈(大約25kDa)和一條“重”鏈(大約50-70kDa)。各鏈的氨基末端部分包括由大約100到110或更多氨基酸組成的可變區，主要負責抗體識別。各鏈的羧基末端部分形成恒定區，主要負責效應物功能。來自人類的輕鏈可分為κ和λ輕鏈。重鏈可分為μ、δ、γ、α或ε，分別定義抗體的同種型IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈內部，可變區和恒定區由約12或更多氨基酸組成的“J”區連接，重鏈還包括約10或更多氨基酸組成的“D”區。大體參見，FundamentalImmunology第7章(Paul，W.編輯，第2版.Raven Press，紐約(1989)).各輕/重鏈對的可變區形成抗體的結合位點。所以，完整的抗體具有兩個結合位點。除了在雙功能或雙特異性抗體中之外，這兩個結合位點是相同的。
            
所有鏈均顯示出大體相同的結構，即相對保守的骨架區(FR)連接三個高變區，后者也被稱為互補決定區或CDR。各對兩條鏈上的CDR沿骨架區排列，使之可與特異表位結合。從N-末端到C-末端，輕鏈和重鏈都包括區域FR1，CDRl，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。氨基酸在各區域上的分配與下列文獻中的定義一致Kabat Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health，馬里蘭州貝賽斯達(1987 and 1991))，或Chothia & Lesk J.Mol.Biol.196901-917(1987)；Chothia等Nature 342878-883(1989)。
            
雙特異性或雙功能抗體是人工雜化的抗體，具有兩不同的重/輕鏈對和兩個不同的結合位點。雙特異性抗體可通過多種方法制備，包括雜交瘤細胞的融合或Fab’片段的連接。參見，例如，Songsivilai & Lachmann Clin.Exp.Immunol.79315-321(1990)，Kostelny等J.Immunol.1481547-1553(1992)。相對于制備常規抗體，制備雙特異性抗體的勞動強度更大，并且產量和純度一般較低。只有單一結合位點的片段形式(如Fab，Fab’和Fv)中不存在雙特異性抗體。
            
應該領會，此類雙功能抗體或雙特異性抗體均已被本發明考慮并涵蓋于本發明之中。
            
人源抗體和抗體的人源化所述本發明的實施方案還考慮和涵蓋了人源抗體。為人類治療時，人源抗體避免了與具有鼠或大鼠可變區和/或恒定區的抗體有關的某些問題。存在此類鼠或大鼠來源的蛋白可以導致該抗體的快速清除，或者可以導致患者產生針對該抗體的免疫應答。為了避免使用鼠或大鼠來源的抗體，已設想可通過將人源抗體功能引入嚙齒動物使得嚙齒動物產生完全人源抗體的方法來開發人源化抗體或產生完全人源抗體。
            
人源抗體產生完全人源抗體的一種方法是通過使用基因工程改造的XenoMouse品系的小鼠，在其基因組中含有人源重鏈和輕鏈基因。例如，Green等，Nature Genetics 713-21(1994)中描述了一種XenoMouse小鼠，所述小鼠包含人源重鏈基因座(locus)和κ輕鏈基因座的245kb和190kb大小的種系結構片段。通過分別使用人源重鏈基因座和κ輕鏈基因座的兆堿基大小的種系結構YAC片段，將Green等的工作延伸至引入全部人源抗體的超過約80％。見Mendez等，Nature Genetics 15146-56(1997)和美國專利申請系列號08/759,620，申請日1996年12月3日。而且，已經產生包含全部λ輕鏈基因座的XenoMouse小鼠(美國專利申請系列號60/334,508，申請日2001年11月30日)。并且可產生多種同種型的XenoMouse小鼠也已經產生(見，例如WO 00/76310)。XenoMouse品系可從Abgenix，Inc.(Fremont，CA)購得。
            
XENOMOUSE的生產在以下文獻中有進一步的討論和描述以下美國專利申請系列號，包括1990年1月12日提交的No.07/466,008、1990年11月8日提交的No.07/610,515、1992年7月24日提交的No.07/919,297、1992年7月30日提交的No.07/922,649、1993年3月15日提交的No.08/031,801、1993年8月27日提交的No.08/112,848、1994年4月28日提交的No.08/234,145、1995年1月20日提交的No.08/376,279、1995年4月27日提交的No.08/430,938、1995年6月5日提交的No.08/464,584、1995年6月5日提交的No.08/464,582、1995年6月5日提交的No.08/463,191、1995年6月5日提交的No.08/462,837、1995年6月5日提交的No.08/486,853、1995年6月5日提交的No.08/486,857、1995年6月5日提交的No.08/486,859、1995年6月5日提交的No.08/462,513、1996年10月2日提交的No.08/724,752和1996年12月3日提交的No.08/759,620以及美國專利包括No.6,162,963、No.6,150,584、No.6,114,598、No.6,075,181和No.5,939,598和日本專利No.3 068 180 B2、No.3 068 506B2和No.3 068 507 B2。參見Mendez等Nature Genetics 15146-156(1997)和Green和Jakobovits J.Exp.Med.188483-495(1998)。另外參見1996年6月12日授權公開的歐洲專利EP 0 463 151 B1、1994年2月3日公開的國際專利申請WO 94/02602、1996年10月31日公開的國際專利申請WO 96/34096、1998年6月11日公開的WO 98/24893、2000年12月21日公開的WO 00/76310。
            
在另一種方法中，其他人，包括GenPharm International，Inc.使用“微基因座(minilocus)”方法。在微基因座方法中，模擬外源Ig基因座是通過包含來自Ig基因座的片段(單個基因)實現的。這樣，一個或多個VH基因、一個或多個DH基因、一個或多個JH基因、一個μ恒定區、以及第二個恒定區(優選γ恒定區)形成一個構建體以插入動物體內。這種方法記載在頒給Surani等的美國專利5,545,807和頒給Lonberg和Kay的美國專利5,545,806、No.5,625,825、No.5,625,126、No.5,633,425、No.5,661,016、No.5,770,429、No.5,789,650、No.5,814,318、No.5,877,397、No.5,874,299和6,255,458，頒給Krimpenfort和Berns的美國專利5,591,669和6,023.010、頒給Berns等的美國專利5,612,205、No.5,721,367和No.5,789,215和頒給Choi和Dunn的美國專利5,643,763和GenPharmInternational的美國專利申請系列號，包括1990年8月29日提交的No.07/574,748、1990年8月31日提交的No.07/575,962、1991年12月17日提交的No.07/810,279、1992年3月18日提交的No.07/853,408、1992年6月23日提交的No.07/904,068、1992年12月16日提交的No.07/990,860、1993年4月26日提交的No.08/053,131、1993年7月22日提交的No.08/096,762、1993年11月18日提交的No.08/155,301、1993年12月3日提交的No.08/161,739、1993年12月10日提交的No.08/165,699、1994年3月9日提交的No.08/209,741。另外參見歐洲專利546 073 B1、國際專利申請WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884和美國專利5,981,175。進一步參見Taylor等，1992，Chen等，1993，Tuaillon等，1993，Choi等，1993，Lonberg等，(1994)，Taylor等，(1994)，和Tuaillon等，(1995)，Fishwild等，(1996)。
            
Kirin也驗證了從小鼠中產生人源抗體的方法，通過微細胞融合，大片段染色體或整條染色體被導入小鼠中。見歐洲專利申請No.773 288和No.843 961.  
            
Lidak Pharmaceuticals(現在的Xenorex)也已證實，通過向SCID小鼠注射來自于人類供體的非惡性成熟外周白血球以進行處理(modify)，可以產生人源抗體。處理后的小鼠顯示了人類供體受到免疫原刺激時出現的特征性免疫應答，所述免疫應答即產生人源抗體。見美國專利No.5,476,996和5,698,767。
            
人抗鼠抗體(HAMA)應答使業界開發出嵌合的或者其他形式的人源化的抗體。雖然嵌合抗體具有人源恒定區和鼠源可變區，但預期可觀察到某種人抗嵌合抗體(HACA)應答，特別是在長期或多倍劑量使用抗體的情形下。所以，期望提供針對PLA2的完全人源抗體，以消除HAMA或HACA應答的影響和/或效果。
            
人源化和呈現(display)技術正如以上所討論的與人源抗體的產生有關的問題，產生免疫原性減弱的抗體具有許多優勢。某種程度上，這可以通過選用適當的文庫將人源化技術和呈現技術相結合以實現。應該領會，鼠源抗體或來自于其他物種的抗體可以使用本領域公知的技術人源化或靈長類源化。見，例如，Winter和Harris，Immunol Today 1443-46(1993)和Wright等，Crit，Reviews inImmunol.12125-168(1992)。所研究抗體可通過重組DNA技術改造，使用相應的人源序列替換CH1，CH2，CH3，鉸鏈區和/或骨架區(見WO92/02190和美國專利No.5,530,101，5,585,089，5,693,761，5,693,792，5,714,350和5,777,085)。將Ig的cDNA用于構建嵌合免疫球蛋白基因也已為本領域所公知(Liu等，P.N.A.S.843439(1987)和J.Immunol.1393521(1987))。從產生抗體的雜交瘤或其他細胞中分離mRNA并用于產生cDNA。所研究cDNA可選用特異性引物通過聚合酶鏈反應擴增(美國專利No.4,683,195和4,683,202)。另外，可建立和篩選文庫以分離所研究序列。然后將編碼抗體可變區的DNA序列與人源恒定區序列融合。人源恒定區基因序列可在以下文獻中找到Kabat等，″Sequences of Proteinsof Immunological Interest，″N.I.H.publication no.91-3242(1991)。人源C區基因可從已知克隆中容易地獲得。同種型的選擇要根據所需效應物功能，例如補體固定或抗體依賴細胞的細胞毒性活性。優選的同種型為IgG1，IgG3和IgG4。可以使用任一種人源輕鏈恒定區，即κ或λ。然后用常規方法表達嵌合的人源化的抗體。
            
抗體片段，例如Fv、F(ab′)2和Fab，可通過裂解完整的蛋白來制備，例如通過蛋白酶或化學方法裂解。另一方法為設計一種截短型基因(truncated gene)。例如，編碼部分F(ab′)2片段的嵌合基因包括編碼H鏈的CH1區和鉸鏈區的DNA序列，然后是翻譯終止密碼子，以產生截短型分子。
            
重鏈和輕鏈J區的共有序列可用來設計寡核苷酸，所述寡核苷酸可用作引物以將有用的限制位點引入J區，以便隨后將V區節段(segment)與人源C區節段連接。C區cDNA可通過定向誘變修飾，以在人源序列的類似位置放置限制位點。
            
表達載體包括質粒、反轉錄病毒、YAC、EBV來源的附加體等等。方便的載體是可編碼功能完備的人源CH或CL免疫球蛋白序列的載體，其中合適的限制位點通過基因改造以使任何VH或VL序列可以容易地插入和表達。在這樣的載體中，剪接通常發生在插入的J區中的剪接供體位點和人源C區之前的剪接受體位點之間，并且還發生在人源CH外顯子中的剪接區。聚腺苷酸化和轉錄終止發生在編碼區下游的天然染色體位點處。產生的嵌合抗體可以連接于任何強(strong)啟動子，包括反轉錄病毒LTR，如SV-40早期(early)啟動子(Okayama等，Mol.Cell.Bio.3280(1983))、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)LTR(Gorman等，P.N.A.S.796777(1982))和莫洛尼氏小鼠白血病毒(moloney murine leukemia virus)LTR(Grosschedl等，Cell 41885(1985))。應該領會，還可以使用天然Ig啟動子等。
            
而且，人源抗體或其他物種來源的抗體可以使用本領域公知的技術通過呈現類技術產生，包括但不限于噬菌體呈現、反轉錄病毒呈現、核糖體呈現及其他技術，得到的分子可進行進一步的成熟，例如親合力成熟，這些技術已為本領域所公知。Wright和Harris，同上，Hanes和Plucthau，PNAS USA 944937-4942(1997)(核糖體呈現)，Parmley和Smith，Gene73305-318(1988)(噬菌體呈現)，Scott，TIBS 17241-245(1992)，Cwirla等，PNAS USA 876378-6382(1990)，Russel等，Nucl.Acids Res.211081-1085(1993)，Hoganboom等，Immunol.Reviews 13043-68(1992)，Chiswell和McCafferty，TIBTECH 1080-84(1992)，和美國專利No.5,733,743。如果呈現技術用于產生非人源抗體，則這些抗體可以如上所述進行人源化。
            
使用這些技術，可以產生針對表達PLA2的細胞、針對PLA2本身、針對PLA2的各種形式、針對其表位或肽和針對其表達文庫的抗體(見例如美國專利No.5,703,057)，所述表達文庫可隨后用來按上述方式篩選上述活性。
            
抗體制備通過使用XenoMouse技術，制備出PLA2特異性的完全人源單克隆抗體。主要過程為，使用PLA2或其片段免疫XenoMouse小鼠品系，從表達抗體的小鼠中回收淋巴細胞(如B細胞)，回收的細胞與骨髓型細胞系融合以制備永生雜交瘤細胞系，對這些雜交瘤細胞系進行篩選和選擇以識別出可產生PLA2特異性抗體的雜交瘤細胞系。此外，本文還敘述了這些細胞系所產生的抗體的鑒定，包括這些抗體的重鏈和輕鏈的核苷酸和氨基酸序列分析。
            
或者，如果不與骨髓瘤細胞融合產生雜交瘤細胞，那么，從經過免疫的小鼠XENOMOUSE品系分離出的回收細胞，進一步篩選其針對初始抗原的反應性，初始抗原優選為PLA2蛋白。此篩選包括使用PLA2-His蛋白進行酶聯免疫吸附分析(ELISA)，用與目標抗原結合的已知抗體進行競爭實驗，和在體外結合表達全長PLA2的瞬時轉染的CHO細胞。然后使用PLA2特異性溶血蝕斑試驗分離出分泌目標抗體的單個B細胞(Babcook等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，i937843-7848(1996))。用于裂解的靶細胞優選為包被有PLA2抗原的綿羊紅細胞(SRBC)。在可分泌目標免疫球蛋白的B細胞培養物和補體存在的條件下，蝕斑的形成表明靶細胞有特異性的、PLA2介導的裂解。蝕斑中央可分離出單個抗原特異性漿細胞，并且從單個漿細胞中可分離出編碼抗體特異性的遺傳信息。使用逆轉錄酶PCR，可克隆出編碼所分泌抗體的可變區的DNA。此克隆DNA可進一步插入合適的表達載體，優選載體盒(vector cassette)如pcDNA，更優選含有免疫球蛋白重鏈和輕鏈恒定區的pcDNA載體。然后將生成的載體轉染到宿主細胞中，優選CHO細胞中，并在常規營養基中培養，營養基可改良為適于誘導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼目標序列的基因。然后分離出編碼抗PLA2的抗體特異性的遺傳物質，將其導入合適的表達載體，并將載體轉染至宿主細胞中。
            
一般地，由以上提到的細胞系產生的抗體具有帶有人源κ輕鏈的完全人源IgG2重鏈或帶有人源κ輕鏈的完全人源IgG4重鏈。抗體具有高親和力，當在固相和溶液相中測量時，其Kd值通常在約10-6到約10-11M之間。
            
鑒于親和力在抗PLA2抗體治療用途中的重要性，應該理解，可以通過例如組合方法制備抗PLA2抗體，并且可以測定這些抗體的結合親和力。可以使用的一個方法為，從以上述方法制備并且發現對PLA2具有強親和力的抗體中獲取重鏈cDNA，從以上述方法制備并且同樣發現對PLA2具有強親和力的第二抗體中獲取輕鏈cDNA，將兩者結合產生第三抗體。得到的第三抗體的親和力可以用本文所述的方法測量，并分離和鑒定具有期望離解常數的抗體。另一種方法是，上述任何抗體的輕鏈可用作幫助生成重鏈的工具，當所述重鏈與此輕鏈配對時，會顯示對PLA2的高親和力，或者，反之亦然。文庫中重鏈可變區可以從天然動物中分離，從超免疫動物中分離，從包含CDR區不同的可變重鏈序列的文庫中人工產生，或者通過可在任何重鏈可變區基因的CDR區產生多樣性的任何其他方法產生(如隨機誘變或定向誘變)。這些CDR區，特別是CDR3，和最初與原始抗體配對的重鏈在長度或序列相同性上的差異顯著。生成的文庫隨后可用于篩選與PLA2結合的高親和力抗體，以生成與治療有關的抗體分子，所述抗體分子與原始抗體具有類似的性質(高親和力和中和作用(neutralization))。一種使用重鏈或重鏈可變區的類似方法可用于生成具有獨特輕鏈可變區的與治療有關的抗體分子。此外，此新重鏈可變區或輕鏈可變區，可隨后以如上所述的類似方式用于識別另一個新輕鏈可變區或重鏈可變區，進而可產生新抗體分子。
            
可使用的另一種組合方法為，在種系重鏈和/或輕鏈上施行誘變，該方法被證實可用于所述根據本發明的抗體，特別是互補決定區(CDR)。得到的抗體的親和力可以用本文所述的方法測量，并分離和鑒定具有期望離解常數的抗體。一旦選擇出優選的結合者，編碼相同結合者的序列可用于產生如上所述的重組抗體。在寡核苷酸上施行誘變的適當的方法為本領域技術人員所公知，包括化學誘變(如使用亞硫酸氫鈉)、酶錯參(enzymaticmisincorporation)以及暴露于輻射下。應該領會，所述本發明涵蓋與本文明確闡明的抗體基本相同(如本文定義)的抗體，不管通過誘變或任何其他方法產生。此外，本文明確闡明的抗體中發生保守性或非保守性氨基酸替換(如本文定義)生成的抗體，包括在所述本發明的實施方案之中。
            
可使用的另一種組合方法為，將如上所述抗體的CDR區，特別是CDR3，在衍生自其他可變區基因的骨架區環境(context)中表達。例如，一種抗PLA2抗體的重鏈的CDR1、CDR2和CDR3可在其他重鏈可變基因的骨架區環境中表達。同樣地，一種抗PLA2抗體的輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3可在其他輕鏈可變基因的骨架區環境中表達。另外，所述CDR區的種系序列可在其他重鏈或輕鏈可變區基因的環境中表達。可檢測得到的抗體的特異性和親和力，并可產生新抗體分子。
            
應該注意的是，根據本發明實施方案的抗體可以在除雜交瘤細胞系以外的其他細胞系中表達。編碼特定抗體的序列可用于轉化合適的哺乳動物宿主細胞。轉化可以使用將多核苷酸導入宿主細胞的任何已知方法進行，包括例如，將多核苷酸包入病毒(或病毒載體)再用病毒(或載體)轉導宿主細胞，或者使用本領域公知的轉染方法，如以下文獻中所示美國專利4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455。使用的轉化方法取決于待轉化的宿主。將異源多核苷酸導入哺乳動物細胞的方法已為本領域所公知，包括葡聚糖(dextran)介導的轉染、磷酸鈣沉淀、聚凝胺(polybrene)介導的轉染、原生質體融合、電穿孔、在脂質體中封裝多核苷酸、以及將DNA直接微注射至核中。
            
可作為表達宿主使用的哺乳動物細胞系已為本領域所公知，包括可由美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)獲得的許多永生細胞系，包括但不限于中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞、人宮頸癌傳代細胞(HeLa cell)、幼倉鼠腎細胞(baby hamsterkidney，BHK)、猴腎細胞(monkey kidney cells，COS)、人肝細胞癌細胞(human hepatocellular carcinoma cell，如Hep G2)，以及很多其他細胞系。通過確定哪株細胞系表達水平高并且產生的抗體具有基本的PLA2結合性質，來選擇特別優選的細胞系。
            
根據本發明實施方案的抗體能夠結合PLA2。此外，本發明的抗體還可用于檢測患者樣品中的PLA2，從而可用作診斷劑，如下文所述。另外，基于已知的PLA2與炎癥的關系，可以預期所述抗體會在治療炎癥中起到治療效果。
            
抗體治療的附加規范(criteria)如本文所述，PLA2抗體的功能對其至少一部分作用模式來說顯得非常重要。所謂功能，意思是，舉例說明，PLA2抗體與PLA2作用時的活性。因此，就某方面來講，有關產生抗體作為針對PLA2的治療候選物就很期望抗體能夠具有效應物功能，包括補體依賴的細胞毒性(CDC)和抗體依賴細胞的細胞毒性(ADCC)。有多種功能相同的同種型抗體，包括但不限于鼠源IgM，鼠源IgG2a，鼠源IgG2b，鼠源IgG3，人源IgM，人源IgG1，人源IgG3和人源IgG4。應該注意的是，產生的抗體無需在一開始就具有某種同種型，而是抗體產生時可具有任何同種型，并于其后使用本領域公知的常規技術轉換同種型。這些技術包括使用直接重組技術(direct recombinant technique，參見例如美國專利4,816,397)，細胞間融合技術(cell-cell fusion technique，參見例如美國專利5,916,771和No.6,207,418)，以及其他技術。
            
在細胞間融合技術中，制備具有任一所需同種型重鏈的一株骨髓瘤或其他細胞系并制備具有輕鏈的另一株骨髓瘤或其他細胞系。然后使這些細胞融合，便可分離出表達完整抗體的細胞系。
            
舉例來說，本文討論的一種PLA2抗體為人源抗PLA2IgG2抗體。如果此抗體具有所需的同PLA2分子的結合能力，它就可以容易地轉換同種型，生成人源IgM，人源IgG1，人源IgG3或人源IgG4同種型，同時仍然具有相同的可變區(它限定了抗體的特異性和部分親和力)。這些分子即可固定補體，參與CDC。
            
因此，由于產生的候選抗體具有如上所討論的所需“結構”屬性，經過同種型轉換，它們通常可具有至少某種目標“功能”屬性。
            
表位繪制免疫印跡分析法本文所述抗體與PLA2的結合可用多種方法測定。例如，PLA2可進行SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)和通過免疫印跡法分析。SDS-PAGE可在還原劑存在或不存在的條件下進行。這樣的化學修飾可以導致半胱氨酸殘基的甲基化。因此，可以測定本文所述PLA2抗體是否與PLA2的線性表位結合。
            
表面增強的激光解吸/電離所述PLA2抗體表位的表位繪制還可以使用SELDI(蛋白指紋圖譜技術)進行。SELDI ProteinChip陣列用于確定蛋白-蛋白交互作用位點。抗原被特異性地捕捉到抗體上，所述抗體通過初始的溫育和洗滌以共價形式固定于Protein Chip陣列表面。結合抗原可以通過激光誘導的解吸程序檢測，并直接分析測定其質量。這樣的結合抗原的片段被稱為蛋白的″表位″。
            
SELDI程序可直接檢測復合分子組合物中單個組分，并定量繪制所述單個組分相對于其他組分的量，且快速、靈敏度高、可調整規模(scalable)。SELDI使用多種表面化學物質的陣列捕捉和呈現(present)絕大多數的單個蛋白分子，以通過激光誘導的解吸程序檢測。SELDI程序的成功部分歸因于在表面(″芯片″)上多種功能的微型化和集成化，兩者分別依賴于不同的技術。SELDI BioChip(生物芯片)和其他種類的SELDI探針為表面″增強的″，從而可主動參與待評估的單個目標分子(如蛋白)或分子種群(population)的捕捉、純化(分離)、呈現、檢測和鑒定。
            
只裝載有原始樣品的單個SELDI蛋白BioChip可以讀數幾千次。來自LumiCyte的SELDI蛋白BioChip上每1平方厘米可容納多達10,000個可尋址蛋白接合(docking)位置。每個位置可顯示幾十種蛋白的存在。當比較各位置的蛋白組成信息并將獨特的信息集結合起來時，得到的組合圖譜可顯示特征集(set)圖像，共同應用于確定特殊圖案或分子″指紋″。不同的指紋可關聯于健康狀況的不同的階段，疾病發作或與施用適當治療方法相關的疾病衰退。
            
SELDI程序可分為四部分更加詳細地敘述。首先，一種或多種所研究的蛋白以直接來源于原始物質、而未經過樣品制備及樣品標記的形式捕捉或″接合″于ProteinChip陣列上。第二步，通過減小化學和生物分子″噪音″來提高″信噪″比。減小″噪音″是通過洗去不需要的物質而在芯片上選擇性保留目標物來實現的。然后，捕捉的一種或多種目標蛋白通過快速、靈敏的激光誘導程序(SELDI)讀數，提供目標物的直接信息(分子量)。最后，通過在芯片上進行一種或多種結合反應或修飾反應鑒定蛋白結構和功能，從而可以對陣列中任何一個或多個位置的目標蛋白進行原位鑒定。
            
噬菌體呈現本文所述PLA2抗體的表位可通過將ProteinChip陣列暴露于呈現在絲狀噬菌體(Filamentous phage)的12聚體隨機肽組合文庫(New EnglandBiolabs)來確定。
            
噬菌體呈現是一種選擇技術，其中，一段肽通過與噬菌體的外殼蛋白融合來表達，導致融合的蛋白在病毒粒子的表面呈現。淘選按照下列步驟進行將噬菌體呈現肽文庫在以目標物包被的板或管中溫育，洗去未結合的噬菌體，洗脫特異性結合的噬菌體。然后將洗脫的噬菌體擴增，并經過另外的結合和擴增循環，以富集結合序列庫。三或四個循環之后，通過在抗體包被的孔中進行噬菌體ELISA法來進一步檢測單個克隆結合的結合情況，并使用陽性克隆的特異性DNA測序來鑒定。
            
針對本文所述PLA2抗體的淘選進行多個循環之后，可將結合的噬菌體洗脫，并進行進一步研究以識別和鑒定結合的肽。
            
PLA2促效劑和拮抗劑所述本發明的實施方案還涉及PLA2蛋白的變體，所述變體既可用作PLA2促效劑(模仿劑)也可用作PLA2拮抗劑。PLA2蛋白變體可通過誘變產生，例如，單點突變(discrete point mutation)或截短PLA2蛋白。一種PLA2蛋白促效劑可以與自然存在的PLA2蛋白形式的生物活性基本一致，或保留其中一組活性。一種PLA2蛋白拮抗劑可以抑制自然存在的PLA2蛋白形式的一種或多種活性，例如通過與包括PLA2蛋白的細胞信號級聯的下游或上游成員競爭性結合。因此，用限制功能的變體處理可得到特殊的生物學效果。在一個實施方案中，使用具有自然存在的蛋白形式的一組生物活性的變體處理受試者，相對于使用自然存在的PLA2蛋白形式處理，受試者的副作用更小。
            
可用作PLA2促效劑(模仿劑)或PLA2拮抗劑的PLA2蛋白變體，可通過篩選PLA2蛋白突變株，如截短型突變株組合文庫尋找具有促效劑或拮抗劑活性的蛋白來識別。在一個實施方案中，PLA2變體多樣化文庫通過在核酸水平上的組合突變產生，并由多樣化基因文庫編碼。一個PLA2變體多樣化文庫可以通過，例如將合成的寡核苷酸混合物通過酶連接入基因序列的方法生成，這樣一組簡并的潛在PLA2序列可作為單個多肽表達，或者用另一種方法，作為包含所述PLA2序列組的更大的融合蛋白表達(如噬菌體呈現)。多種方法可用于從簡并寡核苷酸序列生成潛在PLA2變體文庫。可以在自動DNA合成儀上化學合成簡并基因序列，然后將合成基因連接入適當的表達載體中。使用一組簡并基因可在一組混合物中提供編碼一組所需的潛在PLA2變體序列的所有序列。合成簡并寡核苷酸的方法已為本領域所公知(見，例如，Narang，Tetrahedron 393(1983)；Itakura等，Annu.Rev.Biochem.53323(1984)；Itakura等，Science 1981056(1984)；Ike等，Nucl.Acid Res.11477(1983))。
            
設計和生成其他療法而且，基于生成的和鑒定的與PLA2有關的抗體的活性，設計除抗體部分以外的其他治療方式也比較容易。所述方式包括但不限于，高級抗體療法，如雙特異性抗體、免疫毒素和放射性同位素標記療法，生成多肽療法和基因療法，特別是內抗體(intrabody)、反義療法和小分子。
            
隨著以補體固定為所需屬性的高級抗體療法的產生，通過使用例如雙特異性抗體、免疫毒素，或放射性同位素標記藥物，或許可以回避細胞殺傷對補體的依賴。
            
例如，生成的雙特異性抗體可以包括(i)連接在一起的兩個抗體，一個對PLA2有特異性，另一個對第二種分子有特異性，(ii)單個抗體，其中一條鏈對PLA2有特異性，另有第二條鏈對第二種分子有特異性，(iii)單鏈抗體，同時對PLA2和另一種分子有特異性。這些雙特異性抗體可以使用公知的技術制備；例如，有關(i)和(ii)，參見例如Fanger等ImmunolMethods 472-81(1994)以及Wright和Harris，supra.，有關(iii)，參見例如Traunecker等Int.J.Cancer(增補本)751-52(1992)。各情況下，使第二特異性針對重鏈活化受體，包括但不限于，CD16或CD64(參見例如Deo等18127(1997))或CD89(參見例如Valerius等Blood 904485-4492(1997))。依據上述方法制備的雙特異性抗體極有可能殺死表達PLA2的細胞，特別是本發明的PLA2抗體在其中起作用的細胞。
            
關于免疫毒素，可以使用本領域公知的技術修飾抗體，使之用作免疫毒素。參見例如Vitetta Immunol Today 14252(1993)。另外參見美國專利5,194,594。有關放射性同位素標記的抗體的制備，也可使用本領域公知的技術容易地制備出此種經過修飾的抗體。參見例如Junghans等CancerChemotherapy and Biotherapy 655-686(第二版，Chafner和Longo編輯，Lippincott Raven(1996))。另外參見美國專利4,681,581、No.4,735,210、No.5,101,827、No.5,102,990(RE 35,500)、No.5,648,471和No.5,697,902.各免疫毒素和放射性同位素標記的分子都有可能殺死表達PLA2的細胞，特別是本發明的抗體在其中起作用的細胞。
            
在生成治療肽方面，通過利用與PLA2及其抗體，例如本文所述抗體有關的結構信息(如以下有關小分子的討論)，或者通過篩選肽文庫，可生成針對PLA2的治療肽。肽治療劑的設計和篩選在下列相關文獻中討論Houghten等，Biotechniques 13412-421(1992)，Houghten，PNAS USA825131-5135(1985)，Pinalla等，Biotechniques 13901-905(1992)，Blake和Litzi-Davis，BioConjugate Chem.3510-513(1992)。還可以類似方式制備與肽部分相關的免疫毒素和放射性標記的分子，如以上有關抗體的討論。
            
假如PLA2分子(或某種形式，如剪接變體或替換形式)在疾病過程中是功能活性的，則還可以通過常規技術設計基因和反義治療劑。這些形式(modality)可用于調節PLA2的功能。有關抗體，如本文所述，可幫助設計和使用與之相關的功能檢測。反義治療劑的設計和方案在國際專利申請No.WO 94/29444中詳細討論。基因療法的設計和方案已為公知。然而，特別地，使用涉及內抗體(intrabody)的基因治療技術經證明特別具有優越性。見，例如，Chen等，Human Gene Therapy 5595-601(1994)和Marasco，Gene Therapy 411-15(1997)。基因治療劑的總體設計和相關注意事項還在國際專利申請No.WO 97/38137中討論。
            
還可以預想小分子治療劑。如本文所述，可以設計藥物調節PLA2的活性。從PLA2分子結構及其與其他分子，如本文所述的抗體的相互作用等方面收集的知識，如本文所述，可用于合理設計附加的治療形式。在這點上，合理的藥物設計技術，例如X射線晶體衍射、計算機輔助(或協助)分子建模(CAMM)、定量或定性結構活性關系(QSAR)及類似技術可用于集中藥物發現研究。合理設計使得可以預測蛋白或合成結構，所述結構可與此分子或其用于修飾或調節PLA2活性的特殊形式相互作用。這些結構可以化學合成或用生物系統表達。此方法在Capsey等，GeneticallyEngineered Human Therapeutic Drugs(Stockton Press，NY(1988))中已有研究。此外，還可以設計和合成組合文庫，并用于篩選程序，例如高通量篩選研究。
            
治療劑給藥和制劑包括但不限于抗體及其片段的抗PLA2化合物適合于摻入治療有機體的藥物中，所述有機體需要一種可調節PLA2的化合物。這些藥理學活性的化合物可以按照制劑學的常規方法加工制成藥劑給藥于有機體，例如動物和包括人類在內的哺乳動物。在某些實施方案中，活性成分可經過或不經過修飾加入到藥用產品中。更多的實施方案包括通過幾種途徑制備本文所述的傳遞藥理學活性化合物的藥物或治療劑。例如但不限于，具有編碼抗體或其片段的序列的DNA、RNA和病毒載體可用于某些實施方案中。另外，編碼抗體或其片段的核酸可以單獨給藥或與其他活性成分共同施用。
            
應該知道，本文所述的治療實體可以與適當的載體、賦形劑、穩定劑及其他可以摻入制劑用以改善轉移、遞送、耐受等性能的試劑混合施用。藥學上可接受的載體包括適合于胃腸外、腸內(如口服)或局部使用并且不與本發明的藥理學活性成分發生有害反應的有機或無機載體物質。適當的藥學上可接受的載體包括但不限于水，鹽溶液，醇，阿拉伯膠，植物油，苯甲醇，聚乙二醇，明膠，碳水化合物例如乳糖、直鏈淀粉或淀粉，硬脂酸鎂，滑石，硅酸，粘性石蠟，芳香油，脂肪酸甘油單酯和甘油二酯，季戊四醇脂肪酸酯，羥基甲基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮等等。更多的載體、賦形劑和穩定劑包括緩沖劑如TRIS HCL、磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽和其他有機酸鹽；抗氧化劑如抗壞血酸；小分子量(小于約10個殘基)肽如聚精氨酸，蛋白如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物包括纖維素及其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；平衡離子如鈉和/或非離子表面活性劑如TWEEN、PLURONICS或聚乙二醇。更多適當的載體記載在Remmington＇s Pharmaceutical Sciences，15版，EastonMack PublishingCompany，1405-1412頁和1461-1487頁(1975)和The National FormularyXIV，14版，Washington，American Pharmaceutical Association(1975)。
            
抗體給藥途徑可根據已知方法，包括，例如但不限于，局部、透皮、胃腸外、胃腸內、經氣管(transbronchial)和透過肺泡(transalveolar)。胃腸外給藥途徑包括但不限于，電注射或直接注射或輸注，例如直接注射入中心靜脈導管、靜脈內、腦內、肌內、腹膜內、皮內、動脈內、鞘內或損傷區(intralesional)途徑。抗體優選通過輸注、彈丸注射(bolus injection)或如下說明的持久釋放系統連續給藥。在一個優選的實施方案中，給藥途徑可以為皮下注射。在另一實施方案中，通過腎動脈給藥抗體。胃腸內給藥途徑包括但不限于口服和直腸。經氣管和透過肺泡給藥途徑包括但不限于吸入(不管通過口還是鼻內)。
            
當用來體內給藥時，抗體制劑優選為無菌。這可以通過在凍干和再生之前或之后，使用過濾除菌膜過濾來容易地實現。抗體通常以凍干形式保存或保存于溶液中。另外，治療組合物可無熱原，并存在于具有適當pH值、等滲性和穩定性的胃腸外可接受的溶液中。治療抗體組合物通常放入具有無菌存取孔的容器內，例如靜脈注射溶液袋或具有塞子的小瓶，塞子可被皮下注射針頭穿過。
            
注射用無菌組合物可以按照常規制藥慣例配制，如Remington＇sPharmaceutical Sciences(18版，Mack Publishing Company，Easton，PA(1990))中所述。藥物制品可滅菌處理，如果必要可與助劑混合，例如潤滑劑，防腐劑，穩定劑，潤濕劑，乳化劑，影響滲透壓的鹽類，緩沖液，抗氧化劑，著色劑、調味劑和/或香料等等，所述助劑不與活性化合物發生有害反應。例如，可能需要將活性化合物溶解或懸浮于載體中，例如水或自然存在的植物油，如芝麻油、花生油或棉籽油，或者合成脂肪載體如油酸乙酯等等。
            
具有本發明的藥理學活性化合物、適于胃腸外給藥的合適組合物包括但不限于，藥學上可接受的無菌等滲溶液。所述溶液包括但不限于，可注射入中心靜脈導管、靜脈內、肌內、腹膜內、皮內或皮下注射的鹽溶液和磷酸鹽緩沖鹽溶液。
            
具有本發明的藥理學活性化合物、適于胃腸內給藥的合適組合物包括但不限于，藥學上可接受的口服散劑、丸劑或液體，以及直腸給藥的栓劑。
            
適宜的緩釋制品的例子包括含有所述多肽的固體疏水聚合物的半透性基質，其中所述基質是成型品(shaped article)、涂膜(film)或微膠囊形式的。緩釋基質的例子包括聚酯、水凝膠(如聚(甲基丙烯酸-2-羥乙基酯)記載于Langer等，J.Biomed Mater.Res.，(1981)15167-277和Langer，Chem.Tech.，(1982)1298-105，或聚乙烯醇、聚交酯(美國專利3,773,919，EP 58,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等，Biopolymers，(1983)22547-556)、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯(Langer等，supra)，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球)以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)。
            
聚合物例如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能夠釋放分子長達100天以上，而一些水凝膠釋放蛋白質的周期較短。當封裝的蛋白質長時間停留在體內時，它們可能會因為在37℃下暴露在水分中而變性或聚集，導致失去生物活性和可能改變免疫原性。根據所涉及的機制，可以設計合理的策略以保持蛋白質的穩定性。例如，如果發現聚集機制是通過二硫化物的互換(disulfide interchange)而形成分子間S-S鍵，那么可以通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍干、控制含水量、使用適當的添加劑、以及開發特殊的聚合物基質組合物實現穩定。
            
緩釋組合物還包括脂質體包裹的本發明的抗體。包含這種抗體的脂質體使用公知方法制備美國專利DE 3,218,121；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1985)823688-3692；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1980)774030-4034；歐洲專利EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；142,641；日本專利申請83-118008；美國專利4,485,045和4,544,545；以及歐洲專利EP 102,324。
            
治療用的抗體的有效量取決于，例如，治療目標、給藥途徑和患者的狀況。抗體的劑量將由主治醫師考慮已知影響藥物作用的各種因素進行確定，所述因素包括疾病的嚴重程度和類型，患者的體重、性別、飲食、給藥時間和途徑，以及其它藥物治療和其它有關的臨床因素。因此，治療學家須滴定劑量并按需改進給藥途徑以獲得最佳的治療效果。通常，臨床醫師將給藥抗體直至達到實現所需效果的劑量。治療有效劑量可由體外或體內方法確定。所述治療的進程易于通過常規方法或本發明所述的方法監控。
            
所述化合物的治療功效和毒性可通過在細胞培養物或實驗動物中用標準藥學方法確定，例如，ED50(群體中50％治療有效的劑量)。由治療動物模型或替代模型所得的數據可用于用公式表示(formulate)包括人類在內的其它有機體的劑量使用范圍。所述化合物的劑量優選落在包括ED50而無毒性的循環濃度(circulating concentration)范圍內。該范圍內劑量的變化取決于evectin(含pleckstrin(C激酶主要底物)同源區的蛋白家族B)、雜合體、結合伙伴(binding partner)或其片段的類型、所采用的劑型、有機體的敏感度以及給藥途徑。
            
多種抗體或其片段的標準劑量濃度可在約0.1～100mg/kg。所需劑量濃度包括，例如0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg，、3.0mg/kg、3.5mg/kg、4.0mg/kg、4.5mg/kg、5.0mg/kg、5.5mg/kg、6.0mg/kg、6.5mg/kg、7.0mg/kg、7.5mg/kg、8.0mg/kg、8.5mg/kg、9.0mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg和100mg/kg或更高。一個優選劑量為1～10mg/kg。
            
在一些實施方案中，抗體或其片段的劑量使組織或血液濃度或上述兩者為約0.1μM～500mM，優選為約1～800μM，并且更優選大于約10uM～約500μM。優選劑量為，例如需使組織濃度或血液濃度或上述兩者達到10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM、55μM、60μM、65μM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、95μM、100μM、110μM、120μM、130μM、140μM、145μM、150μM、160μM、170μM、180μM、190μM、200μM、220μM、240μM、250μM、260μM、280μM、300μM、320μM、340μM、360μM、380μM、400μM、420μM、440μM、460μM、480μM和500μM。在替代實施方案中，可采用使組織濃度大于800μM的劑量。還可持續輸注抗體、雜合體、結合伙伴或其片段以在組織中維持穩定的濃度，該濃度由血液水平測量。
            
可調整劑量和給藥以提供足夠水平的活性部分或維持所需效果。本發明實施方案包括短效和長效藥用組合物。因此，實施方案包括如下方案，其中藥用組合物約每1、2、3、4、5、6天、或每周給藥、或者每2周、每3周、每4周、每5周、每6周、每7周或每8周給藥一次。根據具體制劑的半衰期和清除速度，本發明的藥用組合物可給藥每天約1、2、3、4、5、6、7、8、9和10次或更多次。
            
其它治療劑可在給藥抗PLA2抗體之前、同時或之后給藥。所述治療劑可用于治療疾病癥狀或可減少抗PLA2抗體的副作用。上述治療劑還可用于提高抗PLA2抗體的活性。可使用任何類型的治療劑，包括但不限于，例如，抗生素、利尿劑、麻醉劑、止痛劑、抗炎劑和胰島素。通常用于治療炎癥并可與抗體結合使用的治療劑的實例包括諸如可的松等甾類抗炎劑和非甾類抗炎藥物，例如對乙酰氨基酚、阿司匹林、布洛芬和萘普生等。
            
診斷用途本發明的實施方案還可用于檢測，特別是體外診斷檢測，例如，用于確定患者樣品中PLA2的水平。所述檢測可用于診斷與PLA2的過度表達相關的疾病。在某些實施方案中，疾病為炎癥病癥。患者樣品可為，例如，體液，優選血液，更優選血清、關節液、組織溶胞產物和由疾病組織制備的提取物。本發明其它的實施方案可用于診斷炎性病癥和相關疾病，并確定其階段。監控PLA2的水平可用作患者對治療應答的替代測量方法并可用作監控患者疾病嚴重程度的方法。與其它可溶性標志物相比，PLA2的水平升高表明有炎癥存在。患者樣品中所存在的PLA2抗原的濃度可使用專門測定存在的抗原量的方法測定。所述方法包括ELISA法，其中，例如，本發明的抗體可方便地固定在不溶性基質上，如聚合物基質上。或者，可采用使用抗PLA2抗體的免疫組織化學染色法測定樣品中PLA2的水平。使用可為疾病發展或治療的各階段提供統計顯著結果的一群(population)樣品，可指出可看作是疾病各階段特征的抗原濃度范圍。
            
在一例實施方案中，從受試者處采得血液樣品并測定樣品中PLA2抗原的濃度以評估所研究對象中疾病的階段，或鑒定受試者對療程的應答。由此得到的濃度用于鑒定該值落入的濃度范圍。上述鑒定的范圍與多群診斷對象中鑒定的疾病發展階段或治療階段相關聯，從而提供研究對象所處的階段。
            
可在樣品中直接測量基因擴增和/或表達，例如，根據本發明提供的序列，使用適宜標記的探針通過常規的DNA印跡法(Southern blotting)和RNA印跡法(Northern blotting)以定量mRNA的轉錄(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，775201-5205(1980))，或者通過點漬法(DNA分析)或原位雜交。或者，可采用識別特異性雙鏈體的抗體，所述雙鏈體包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體和DNA-RNA雜合雙鏈體或DNA蛋白雙鏈體。可依次標記抗體并進行檢測，其中雙鏈體結合到表面上，使得在表面上形成雙鏈體后，可探測到與雙鏈體結合的抗體的存在。
            
例如，包括抗體片段在內的抗體可用于定性或定量探測PLA2蛋白的表達。如上所述，抗體優選具有可探測的，例如熒光標記，并且可通過光學顯微鏡、流式細胞計、熒光計或其它本領域已知的技術監控結合作用。如果擴增的基因編碼細胞表面蛋白，如生長因子，上述技術將是特別適用的。所述結合檢測根據本領域已知的進行。
            
對與PLA2蛋白結合的抗體進行原位探測可通過，例如，免疫熒光或免疫電子顯微鏡進行。就此目的而言，從患者身上采集組織樣品，并加入標記抗體，優選使抗體覆蓋生物樣品。該方法還可測定標志基因產物在所檢查組織中的分布。本領域的普通技術人員將領會多種組織學方法可易于進行原位探測。
            
測定差異基因表達數量的最靈敏和最靈活的方法之一是RT-PCR，該方法可用于在不同樣品群中比較正常組織和經過或未經過藥物治療的腫瘤組織中mRNA的水平，以鑒定基因表達的模式，區分密切相關的mRNA并分析RNA的結構。
            
第一步是從靶樣品中分離mRNA。原材料通常是分別從疾病組織中和相應的正常組織中分離的全部RNA。因此，mRNA可取自，例如，疾病組織冷凍或存檔的并由石蠟包埋和固定(例如，福爾馬林固定)的樣品，以與同類型的正常組織比較。mRNA的提取方法已為本領域所公知，并且公開在分子生物學的標準教科書上，包括Ausubel等，Current Protocols ofMolecular Biology，John Wiley和Sons(1997)。從石蠟包埋的組織中提取RNA的方法公開在，例如Rupp和Locker，Lab Invest.，56A67(1987)，以及De Andrés等，Bio Techniques，1842044(1995)。具體而言，RNA的分離可使用從，例如Qiagen等商業制造商購得的純化試劑盒、緩沖裝置和蛋白酶，按照制造商的說明書進行。例如，取自培養細胞的全部RNA可使用Qiagen RNeasy的微柱進行分離。取自組織樣品的全部RNA可使用RNAStat-60(Tel-Test)進行分離。
            
由于RNA不能用作PCR的模板，因此使用RT-PCR分析差異基因表達的第一步是將RNA模板逆轉錄為cDNA，然后在PCR反應中對其進行指數擴增。兩種最常用的逆轉錄酶是禽成髓細胞瘤病毒逆轉錄酶(AMV-RT)和鼠白血病病毒逆轉錄酶(MMLV-RT)。逆轉錄步驟通常使用特異性引物、隨機六聚體或寡脫氧胸苷酸引物引導，這取決于表達概況(expression profiling)的條件和目標。例如，提取的RNA可根據制造商的說明書使用GeneAmp RNA PCR試劑盒(Perkin Elmer，CA，USA)進行逆轉錄。然后可在隨后的PCR反應中，將得到的cDNA用作模板。
            
雖然PCR步驟可使用多種熱穩定的DNA依賴的DNA聚合酶，但通常采用Taq DNA聚合酶，所述聚合酶具有5’-3’核酸酶活性，但缺乏3’-5’內切核酸酶活性。因此，TaqMan PCR通常使用Taq或Tth聚合酶的5’-核酸酶活性，以水解與其靶擴增子相結合的雜合探針，但是也可使用具有相當的5’核酸酶活性的任何酶。兩種寡核苷酸引物用于生成PCR反應特有的擴增子。第三寡核苷酸或探針設計成探測位于兩PCR引物之間的核苷酸序列。探針不能由Taq DNA聚合酶延長，并用報道(reporter)熒光染料和淬滅劑熒光染料標記。當兩種染料在探針上的位置非常接近時，任何報道染料的激光誘導發射光譜通過淬滅染料淬滅。在擴增反應過程中，TaqDNA聚合酶以依賴于模板的方式切割探針。得到的探針片段在溶液中分離，并且釋放的報道染料發出的信號不受第二熒光團淬滅效應的影響。對于每個新合成的分子均釋放一個報道染料分子，并且探測未淬滅報道染料可為數據的定量解釋提供基礎。
            
可使用市售裝置進行TaqMan RT-PCR，例如，ABI PRIZM 7700TMSequence Detection SystemTM(Perkin-Elmer-Applied Biosystems，FosterCity，CA，USA)或Lightcycler(Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，Germany)。在一個優選實施方案中，5’核酸酶方法是在實時定量PCR設備上進行的，如ABI PRIZM 7700TM Sequence Detection SystemTM。系統由熱循環器、激光、電荷耦合設備(CCD)、照相機和計算機組成。系統在熱循環器上的96孔板式中擴增樣品。在擴增過程中，通過纖維光纜對全部96個孔實時采集激光誘導的熒光信號，并在CCD上檢測。系統包括運行儀器的軟件和分析數據的軟件。
            
5’-核酸酶的檢測數據最初表示為Ct或閾值周期(threshold cycle)。如上所述，每個周期內記錄熒光值，該值代表在擴增反應中擴增至所述點的產品的量。當首次記錄統計顯著的熒光信號時，該點即為周期閾值(Ct)。當比較疾病組織細胞中和正常細胞中的RNA的表達時，ΔCt的值用作核酸樣品中特定靶序列的起始拷貝相對數量的定量度量。
            
為將誤差和樣品對樣品變異產生的影響降到最低，通常使用內部(internal)標準進行RT-PCR。理想的內部標準在不同組織之間以恒定水平表達，并且不受實驗治療的影響。標準化基因表達模式最常用的RNA為有持家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和β-肌動蛋白的mRNA。
            
還可使用微陣技術識別或確認差異基因表達。在該方法中，將所研究的核苷酸序列種植或排列在微芯片底物上。然后用取自所研究細胞或組織的特異性DNA探針對排列的序列進行雜交。
            
在微陣技術的一個具體實施方案中，在密陣中，將cDNA克隆的經PCR擴增的插入片段加入底物。優選將至少10,000核苷酸序列加入底物。以每芯片10,000元件固化在芯片上的微排列基因，適用于苛刻條件下的雜交。可通過逆轉錄提取自所研究組織的RNA來引入熒光核苷酸，從而產生熒光標記的cDNA探針。應用于芯片的標記cDNA探針在陣列上與各DNA點選擇性雜交。芯片經嚴格清洗以除去非特異性結合的探針后，用共焦激光顯微鏡掃描。定量各排列元件的雜交使得可以評估相應的mRNA豐度(abundance)。通過雙色熒光，由兩RNA源產生并分別標記的cDNA探針成對雜交至陣列。從而同時測定對應于各指定基因的，取自兩源的轉錄物的相對豐度。對多數基因，微型化規模的雜交可對其表達模式提供方便快速的評估。所述方法已顯示出探測微量轉錄物所需的敏感性，所述轉錄物在每個細胞的少數拷貝上表達，并且該方法顯示以至少約2倍不同的表達水平再現探測(Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93(20)L106-49)。核酸雜交的方法論以及微陣列技術已為本領域所公知。
            
單克隆抗體的鑒定單克隆抗體可在多種檢測方法中用作高度特異性探針，以關聯功能特性與特異性結構決定簇(determinant)，使得mAb成為驗證藥物靶的重要工具。在蛋白質印跡法、流式細胞計和免疫組織化學中使用抗體試劑鑒定蛋白表達模式是一種標準慣例。mAb良好的特異性使得能夠區分密切相關的分子，并已由下列方法證明細菌和病毒株的血清分型，(Bash，M.C.等，“Genetic and immunologic characterization of a novel serotype 4，15strain of Neisseria meningitidis”FEMS Immunol Med Microbiol 29，169-176(2000)；Jensen，T.H.等，“Probing the structure of HIV-1 Rev byprotein footprinting of multiple monoclonal antibody-binding sites”FEBSLett 414，50-54(1997))，蛋白特異性翻譯后變體的探測(Martegani，等，“A.Structural variability of CD44v molecules and reliability ofimmunodetection of CD44 isoforms using mAbs specific for CD44 variantexon products”Am J Pathol 154，291-300(1999))，以及具有改變構象的蛋白的區分(Drbal等，“A novel anti-CD18 mAb recognizes anactivation-related epitope and induces a high-affinity conformation inleukocyte integrins”Immunobiology 203，687-698(2001))。表位結合的多樣性可進一步表示為兩種不同的mAb，所述mAb針對介導完全不同的功能活性的相同靶，例如，一種mAb可以是拮抗劑，而另一種沒有活性。Sattentau等，“Epitopes of the CD4 antigen and HIV infection”Science 234，1120-1123(1986)；Pierres等，“Clonal analysis of B-and T-cell responses toIa antigens.I.Topology of epitope regions on I-Ak and I-Ek moleculesanalyzed with 35 monoclonal alloantibodies”Immunogenetics 14，481-495(1981)。重要的是，不僅作為試劑，而且作為人類疾病的治療劑，mAb的實用性不斷增加。Spigel等，“HER2 overexpressing metastatic breastcancer”Curr Treat Options Oncol 3，163-174(2002)；Sandborn，等，“Biologic therapy of inflammatory bowel disease”Gastroenterology 122，1592-1608(2002)。
            
現有產生mAb的方法很多。應用于嚙齒動物，通常為實驗室小鼠的標準株系的標準雜交瘤技術，產生數十組到數百組嚙齒動物氨基酸序列的mAb。雖然嚙齒動物源的mAb可用作試劑，但通常生產的治療劑對人類的效果較差，因為其可能有免疫原性。通過嵌合或人源化的抗體工程產生的抗體，雖然人源含量較高，并且在人類中引起免疫應答的可能性較低，但通常以犧牲效能或起效速度為代價。產生適用于人類治療劑的一種更有利的途徑是產生完全人源的抗原特異性mAb。重要的是，所述完全人源的mAb可用作靶證實的試劑和治療引導的候選物。產生完全人源抗體最普遍的兩種技術是噬菌體呈現法和轉基因小鼠法。使用多種呈現技術表達的幼稚(naive)人源抗體文庫可為抗原特異性抗體片段的來源，盡管該片段通常需要隨后進行體外工程以符合治療性mAb所要求的活性標準。Watkins等，“Introduction to antibody engineering and phage display”Vox Sang 78，72-79(2000)。通過對產生完全人源抗體的轉基因小鼠進行基因工程，可使用雜交瘤技術直接回收適宜用作試劑和治療劑的親和力成熟的抗原特異性mAb。Mendez等，“Functional transplant of megabase humanimmunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice”NatGenet 15，146-156(1997)；LaRochelle.等，“Platelet-derived growth factor Dtumorigenicity in mice and dysregulated expression in human cancer”Cancer Res 62，2468-2473(2002)；Ishida等，“Production of HumanMonoclonal and Polyclonal Antibodies in TransChromo Animals”CloningStem Cells 4，91-102(2002)；Davis等，“Transgenic mice as a source of fullyhuman antibodies for the treatment of cancer”Cancer Metastasis Rev 18，421-425(1999)。
            
不管采取何種途徑產生最初的抗體庫，結合特異性的數量是有限的。不管是否將整組抗體用于高通過量的功能篩選，還是其容量限制是否限定了可在功能實驗中接受篩選的抗體數量，鑒定并隨后降低抗體庫中結合特異性的豐度可能是有利的。并且，有效選擇具有獨特的結合特異性抗體的方法可用于根據結合競爭性將功能活性繪制成箱(bin)。
            
常規的鑒定抗體結合特異性的途徑是表位作圖法。Baerga-Ortiz等，“Epitope mapping of a monoclonal antibody against human thrombin byH/D-exchange mass spectrometry reveals selection of a diverse sequence ina highly conserved protein”Protein Sci 11，1300-1308(2002)；McCullough等，“Immune protection against foot-and-mouth disease virus studied usingvirus-neutralizing and non-neutralizing concentrations of monoclonalantibodies”Immunology 58，421-428(1986)。雖然該技術可以高分辯率識別各抗體與其抗原結合的位點，但有可能費時費力，并且處理量低。就歷史觀點而言，標記抗體和過量的未標記抗體之間與抗原基于ELISA的結合競爭已用于測定兩種抗體是否競爭。McCullough等，supra(1986)。雖然基于ELISA的競爭檢測法缺乏表位作圖法的精確性，但易于進行并且可在一天或兩天內完成。然而，當有大量樣品時，所述方法就變得很麻煩，并且需要大量純化的抗體。
            
為此，開發了一種高通過量的新方法，即多重競爭抗體箱(MultiplexedCompetitive Antibody Binning，MCAB)法，該方法僅使用少量抗體和抗原。MCAB法使得一組抗體根據其對抗原的結合競爭以高通過量裝箱，并且已成功用于常規的抗體篩選和鑒定。所述檢測方法基于靶分子上抗體競爭結合模式的相似性，并采用Luminex光譜編碼的玻珠和探測技術以進行高度多重性檢測。MCAB法靈敏度足夠高，可用于以高通過量的方式篩選和鑒定取自雜交瘤繁殖早期的抗體，其中抗體少量存在于上清液中。該方法通過使用呈現技術也可適用于所產生的重組抗體片段。
            
該方法能夠根據對抗原結合的交叉競爭將一大組復雜的單克隆抗體分類至不同的箱中。在一些實施方案中，MCAB法適用于在識別抗原陽性抗體后即刻進行，以提供信息用于促進(advance)抗體候選物進行進一步檢驗。或者，MCAB法可用于在篩選功能活性后，將抗體分類為結合組。
            
MCAB技術采用采自XenoMouseG2和G4小鼠的完全人源mAb，所述小鼠株系針對人源抗體基因座轉基因并分別生成完全人源IgG2κ和IgG4κ抗體。Mendez等，supra(1997)。用蛋白抗原使所述小鼠免疫并隨后產生雜交瘤的方法通常可產生100多種抗原特異性、高親和力的mAb。本發明所述的MCAB法引入多重化策略，即使用基于玻珠的技術以檢測由Luminex(Fulton等，supra(1997))開發的抗體(Ab)競爭和特異性捕捉以及探測劑。同時，將各mAb與選自100種市售玻珠的獨特光譜編碼的玻珠相結合，使得各mAb在單溶液相多重檢測中與多達99種其它的mAb競爭。該方法能使用未經純化的雜交瘤上清液并可較早引入抗體產生過程中。
            
當單克隆抗體本身用作證實企圖發現基因組或蛋白質組靶的工具時，MCAB法是特別有價值的。Quinn-Senger等，supra(2002)；Walke等，supra(2001)。在上述情況下，初次和二次結合篩選后可能沒有特定的功能檢測，能用于從數十種或數百種抗原特異性抗體中選擇出候選物。因為給定抗體的生物功能取決于其在靶分子上結合的表位，(Blanpain等，“Multiple active states and oligomerization of CCR5 revealed by functionalproperties of monoclonal antibodies”Mol Biol Cell 13，723-737(2002)；Corada等，“Monoclonal antibodies directed to different regions of vascularendothelial cadherin extracellular domain affect adhesion and clustering ofthe protein and modulate endothelial permeability”Blood 97，1679-1684(2001))，因此以下方法是有用的，即根據結合競爭性將抗體分組至不同的箱中，然后促進各箱的抗體亞類進行功能檢測。非競爭箱的確定也使得待測抗體針對協同活性結合。Kawashima.等，“The multi-epitope approachfor immunotherapy for canceridentification of several CTL epitopes fromvarious tumor-associated antigens expressed on solid epithelial tumors”Hum Immunol 59，1-14(1998)。
            
挑選出的抗體和方法的實施方案在以下實施例中說明實施例本文所提供的以下實施例，包括進行的實驗和獲得的結果，僅出于說明目的，不得解釋為對所述的本發明實施方式的限制。
            
實施例1PLA2抗原制備重組PLA2蛋白使用26kDa的標記物谷胱甘肽(Glutathionine)S轉移酶(GST)制備，通過使用含有谷胱甘肽的親和基質(affinity matrix)，GST與重組PLA2融合以幫助從大腸桿菌表達載體中純化。純化蛋白在本領域所公知的溫和、非變性條件下洗脫。進一步實驗檢測純化后是否仍保持酶活性，并總結如下。在標記物和重組PLA2之間插入一段內肽酶酶切位點序列，以除去標記物。
            
實施例2抗PLA2抗體主要與PLA2結合的單克隆抗體由以下步驟制備使用GST-PLA2融合蛋白免疫XenoMouse小鼠(Abgenix Inc，Fremont，CA)以激發免疫反應。兩品系小鼠，hIgG2品系(組1)和hIgG4品系(組2)，在爪墊處使用約0.6mg/ml不含內毒素的GST-PLA2免疫，所述GST-PLA2從大腸桿菌表達載體純化。兩組小鼠(每組10只)在30天時間共給予8次加強免疫，并在第15、22和30天采血。見表2。使用的佐劑為第一次加強免疫使用Titermax Gold佐劑(Catalog#T-2684，lot#12K1599，Sigma，50/50體積比)；第2到7次加強免疫使用磷酸鋁凝膠佐劑(Alum)(Catalog#1452-250，Batch 8919，Superfos Biosector，5μl/小鼠)和CpG(ODN 1826的D-PBS溶液，2mg/ml，10μg/小鼠)；最后一次加強免疫使用D-PBS。針對PLA2蛋白片段的單克隆抗體使用雜交瘤技術的標準方法由PLA2蛋白片段免疫的XenoMouse動物制備。
            
表2組1和組2的PLA2免疫時間表  
            
     
            
實施例3ELISA法實例為檢測抗PLA2效價，PLA2抗原首先經過生物素化，再包被于板上以備ELISA檢測。簡言之，15-500μg PLA2抗原稀釋于1mL pH值為8.6的PBS中。將10μL10mg/mL的硫代NHS-生物素(溶于DMSO的生物素原液)加至1mL PLA2抗原溶液中，室溫攪拌下溫育1小時。溫育后，加入100μL飽和Tris溶液終止反應，離心，至少洗滌4次以將游離生物素與生物素化的PLA2抗原分離。生物素化PLA2(1μg/mL)包被于Sigma鏈親和素板上，室溫放置1小時。對照鏈親和素板不進行包被，以用作對照。
            
用蒸餾水洗板五次。平行的兩組雜交瘤培養上清液使用以1∶100初始稀釋再以1∶2稀釋的2％牛乳/PBS滴定。最后一孔留空作為對照。用蒸餾水洗滌鏈親和素板五次。將與羊抗人IgG Fc特異性HRP綴合的抗體加入至終濃度為1μg/mL，室溫下放置1小時。用蒸餾水洗滌5次，然后加入TMB使鏈親和素板顯色30分鐘，加入1M磷酸終止ELISA反應。由450nm的光密度測定雜交瘤培養上清液的特定效價。
            
實施例4針對PLA2的完全人源抗體的二次篩選Luminex檢測為進一步確認能夠產生完全人源抗PLA2抗體，將PLA2抗原包被于Luminex微珠(MiraiBio，Inc.，Alameda，CA)表面，以進行多分析物生物測定檢驗。
            
簡言之，將綴合微珠混合物以50μl/孔加至過濾板上，抽濾(aspirate)。抽濾后，將樣品和對照以50μl/孔加至過濾板，在平板振蕩器(plate shaker)上暗處溫育20分鐘。溫育后，使用100mL/孔的洗滌緩沖液洗滌過濾板兩次。最后，加入801μl/孔的檢測抗體混合物，平板振蕩器上暗處溫育20分鐘。
            
包被的微珠由選自下列的標記抗體探測人γ、人κ、人λ、人IgM、鼠γ和鼠λ。輕柔的旋轉攪拌(vortex)微珠原液，使用下述公式計算所需的微珠混合物的體積(n+6)×50μl(其中n＝樣品數目)。然后，微珠稀釋于封閉緩沖液中至濃度為每孔2500珠或0.5×105/mL。過濾板中每孔加入200μl洗滌緩沖液以預先濕潤，抽濾。
            
溫育后，使用Luminex儀為板讀數，該儀器利用顯微流(microfluidics)使微珠單行排列，并用激光照射顯示微珠的內部顏色和表面顏色。選擇與微珠結合的完全人源抗體進行進一步分析。
            
實施例5抗PLA2抗體結構分析為分析與PLA2結合的完全人源抗體結構，從相應的雜交瘤中克隆出編碼形成抗體的重鏈和輕鏈片段的基因。基因克隆和測序按照以下步驟進行從來自免疫XenoMouse小鼠的約2×105個雜交瘤細胞中，使用Fast-Track試劑盒(Invitrogen)分離聚(腺苷酸+)mRNA。產生隨機引物cDNA后進行PCR實驗。人VH或人VK家族特異性可變區引物(Marks等，1991)或通用人VH引物，MG-30(CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG SEQ ID NO32)用于連接對人特異性的引物。
            
Cγ2恒定區(MG-40d；5′GCT GAG GGA GTA GAG TCC TGAGGA 3′SEQ ID NO33)；Cγ1恒定區(HG1；5′CAC ACC GCG GTC ACA TGG C 3’SEQ IDNO34)；或Cγ3恒定區(HG3；5′CTA CTC TAG GGC ACC TGT CC 3’SEQ IDNO35)；或人CK恒定區(hKP2；如Green等，1994先前所述)。雜交瘤中人源單克隆抗體來源的重鏈和κ鏈轉錄物序列，可通過對PCR產物直接測序得到，所述PCR產物使用上述引物由聚(腺苷酸+)RNA產生。還使用TA克隆試劑盒(Invitrogen)將PCR產物克隆進入質粒pCRII中。另外，兩種鏈均使用Prism染料-終止子(dye-terminator)測序試劑盒和ABI 377測序儀進行測序。全部序列使用MacVector和Geneworks軟件程序與″VBASE序列路徑(sequence directory)″(Tomlinson等，MRC Centre forProtein Engineering，劍橋，英國)比對分析。
            
抗體克隆和CDR區序列概括在下表3-7中。
            
表3抗PLA2單抗重鏈序列數據  
            
     
            
表3(續)抗PLA2單抗重鏈序列數據(續)  
            
     
            
表4抗PLA2單抗重鏈分類序列數據  
            
     
            
表4(續)抗PLA2單抗重鏈分類序列數據(續)  
            
     
            
     
            
表5抗PLA2單抗輕鏈序列數據  
            
     
            
表5(續)抗PLA2單抗輕鏈序列數據(續)  
            
     
            
     
            
表6抗PLA2單抗輕鏈分類序列數據  
            
     
            
表6(續)抗PLA2單抗輕鏈分類序列數據(續)  
            
     
            
表7抗PLA2單抗序列匯總  
            
     
            
實施例6篩選PLA2酶的功能性抑制劑為識別阻斷PLA2功能活性的抗體，將在96孔板中檢測酶活性的基本方案修改后用于在384孔板中篩選。對先前在ELISA方法中發現的可阻斷酶結合的五十八(58)種備選抗體作篩選。識別出幾種阻斷PLA2功能活性的抗體。
            
基本的酶檢測方法簡言之，下列三種組分混合于黑色384孔板中(1)20μl去離子水或KLH上清或實驗培養基；(2)20μl酶稀釋于去離子水；(3)20μlBis-BODIPY-FLC11-PC底物稀釋于3倍的分析緩沖液。將板蓋好，室溫下溫育特定時間。溫育后，可選擇性地加入20μl 40mM EDTA終止反應，將板置于α-Fusion(Packard)上使用FITC濾鏡、top read模式讀數(激發光波長＝485nm；發射光波長＝530nm)。
            
檢測方法的改進進行初始實驗確定底物的檢測極限和KLH廢棄上清液的影響。市售的豬PLA2用作測試底物的陽性對照品，圖1A顯示了與0.5單位酶溫育的滴定量的底物的劑量-反應曲線。為檢測KLH上清液的影響，每孔中溫育0.5單位酶，130nM底物和20μl(或沒有)KLH上清液。在多個時間點讀數，溫育30分鐘時的數據顯示于圖1B中。KLH上清液對檢測的影響最小。
            
細菌表達的PLA2。細菌表達的酶的活性在使用Fxa裂解后比裂解前高約四(4)倍(數據未顯示)。使用Fxa將GST標記從細菌表達的GST-酶融合蛋白上切割下來。簡言之，將GST-酶融合蛋白與1單位Fxa在1倍的Fxa緩沖液中室溫下溫育過夜。
            
滴定量的Fxa裂解的細菌表達的酶與400nM Bis-BODIPY底物溫育。在多個時間點讀數，溫育10分鐘時的數據顯示于圖2A中。為檢測KLH上清液的影響，每孔中溫育0.4μg Fxa裂解的酶，400nM底物和20μl(或沒有)KLH上清液。來自G2和G4的20μl/孔的KLH廢棄上清液可輕微抑制酶活性(圖2B)。圖示為溫育10分鐘時的數據。
            
競爭實驗本實驗方法檢測抑制劑的能力用競爭實驗測試。簡言之，加入20μl/孔測試雜交瘤上清液，再將20μl酶稀釋于去離子水中。將板蓋好，4℃溫育過夜。溫育后，加入20μl Bis-BODIPYFLC11PC底物。將板蓋好，室溫下溫育60分鐘。溫育后，加入20μl 40mM EDTA終止反應，將板在α-Fusion上使用FITC濾鏡讀數。
            
將免疫小鼠的小鼠血清平行測定兩次。每孔中將血清(20μl或沒有)與0.2μg Fxa裂解的細菌表達的酶和0.4μM底物共同溫育。溫育后30分鐘將板讀數。發現G2和G4血清都可抑制酶活性。在其他時間點讀數得到類似結果。
            
篩選確認在單個384孔板上檢測58種雜交瘤上清液與哺乳動物PLA2酶，及其與Fxa裂解的細菌PLA2酶。哺乳動物酶進行重復檢測而細菌酶只單點檢測。還包括每種酶的對照孔。
            
哺乳動物和細菌表達的兩類酶都在對照孔中得到較好的檢測窗(assaywindow)。對于Fxa裂解的細菌細胞，將150ng酶與400nM底物共同溫育。對于哺乳動物酶，將0.5μl CHO上清液與400nM底物共同溫育。
            
測試雜交瘤上清液抑制酶活性的情況。雜交瘤上清液(20μl/孔)與0.5μlCHO上清液或150ng Fxa裂解的細菌酶溫育過夜。加入底物至終濃度為400nM，將板溫育，在30分鐘和60分鐘讀數。60分鐘后加入EDTA再次讀數。給出加入EDTA后60分鐘時的數據。表8概括了可抑制哺乳動物和細菌表達的酶的試樣(hits)。阻斷酶活性的試樣可抑制20～74％酶活性。識別了幾種可阻斷哺乳動物和細菌PLA2功能活性的抗體。
            
表8抑制酶活性的試樣  
            
     
            
實施例7通過熒光檢測法測量PLA2活性對熒光檢測法進行優化以測量依賴于Ca+2的分泌性PLA2。Bis-BODIPYFLC11-PC(Molecular Probes，Euguen，OR)用作底物。由于BODIPYFL的熒光團接近于鄰近的磷脂酰基鏈，導致熒光的自猝滅，BODIPYFL標記的脂肪酸的磷脂酶A1或A2介導(mediate)釋放，可緩解這一情況。通過在熒光計上使用熒光素濾鏡(激發光波長485nm，發射光波長535nm)測量熒光增強的量，從而測定PLA2活性。
            
簡言之，在96孔板中加入75μl/孔的溶于1.33倍分析緩沖液的0.532μM底物。加入5μl/孔的溶于20％DMSO的檢測化合物，隨后加入20μl的溶于Tris-Cl緩沖液(pH7.6)的5倍PLA2酶。室溫下溫育5分鐘，加入10μl EDTA至終濃度為10mM用以終止反應混合物。在微量板熒光計上使用熒光素濾鏡(激發光波長485nm，發射光波長535nm)測量熒光。在加入EDTA終止反應后的15到30分鐘內進行測量。
            
實施例8抗PLA2單抗功能檢測先前識別的與PLA2結合并阻斷PLA2酶活性的純化抗體，使用前述的PLA2功能檢測方法以作進一步鑒定。發現四種抗體(單抗1.18，2.4，2.25和2.9)抑制PLA2功能，其IC50值＜2nM。所有所述抗體均能阻斷在哺乳動物和細菌細胞中表達的酶。
            
然后將發現可阻斷PLA2酶的抗體在哺乳動物CHO細胞(CHO-PLA2-MTX)中表達。
            
基于IC50值的親和力排序。進行兩項單獨的實驗，6點劑量曲線和12點劑量曲線，為抗體的親和力排序。來自兩條劑量曲線的數據相一致。來自12點劑量曲線的數據顯示于下表9中。
            
表9基于IC50值的排序  
            
     
            
     
            
針對哺乳動物酶和細菌酶對每種抗體測定六點劑量反應曲線。圖3顯示每種抗體最高實驗劑量時的抑制百分率。圖示的是四次重復的結果。均數的標準差(SEM)如圖所示。
            
實施例9抗PLA2單抗的Biacore結合為識別何種抗體結合抗原PLA2的親和力最高，使用配有研究級CM5傳感器芯片的Biacore2000生物傳感器(Biacore，Piscataway，NJ)在25℃下進行分析。在固定中，HBS-P用作工作緩沖液(running buffer)；在結合研究中，HBS-P與各12mg/mL的BSA和葡聚糖用作樣品和工作緩沖液。
            
簡言之，將抗體上清液稀釋1/10，抗體在IgG表面被單個捕獲。一分鐘洗滌步驟之后，在各表面依次注入(一分鐘締合，五分鐘解離)緩沖液和PLA2(300nM)。從-20到0秒測量捕獲水平，用100mM H3PO4的6秒脈沖沖洗使表面再生。
            
從初始篩選，上清液可以分為三類(1)高抗體效價，高抗原識別(＞50RU抗體被捕獲，＞10RU抗原反應)；(2)高抗體效價，低抗原識別(＞50RU抗體被捕獲，＜10RU抗原反應)；(3)低抗體效價，低或可變抗原識別(＜50RU抗體被捕獲，＜10RU抗原反應)。各抗體所獲得的捕獲水平和結合反應顯示于下表10中。
            
表10抗體捕獲水平和PLA2結合反應  
            
     
            
     
            
對于第II類(粗體顯示)和第III類(斜體顯示)抗體上清液使用第II類的1/10稀釋液和第III類的1/2稀釋液再次篩選。延長捕獲時間，注入750nM PLA2以檢測結合。在此條件下所獲得的捕獲水平和結合反應顯示于表11中。只有顯示PLA2結合反應＞10RU的上清液才考慮備選進行高分辨率分析。
            
表11由1/2(第III類)和1/10(第II類)稀釋液獲得的抗體捕獲水平和750nM PLA2結合反應  
            
     
            
基于單個抗體的捕獲水平對數據進行標準化，并全部擬合于1∶1交互作用模型。發現抗體1.1，1.10，1.16，2.18，2.19和2.20是高親和力抗體。測定的動力學常數概括于表12中。
            
親和力由解離速率和締合速率的比值計算。帶有下劃線的解離速率沒有在數據擬合過程中變動。中等分辨率篩選的上清液在下表12中以粗體顯示。
            
表12抗體上清液中按親和力排序的抗體  
            
     
            
     
            
實施例10多重競爭性抗體分箱(MCAB)檢測方法使用多重競爭性抗體分箱(Multiplexed Competitive Antibody Binning，MCAB)檢測方法，基于與抗原結合的交叉競爭，將單克隆抗體分裝在不同的箱中。MCAB檢測方法基于兩個單克隆抗體與單個抗原分子的一個表位的競爭性結合。美國專利申請系列號10/309,419，申請日2002年12月2日，標題“Antibody Characterization Based on Binding Characteristics，”公開號US-2003-0157730-A1。應用MCAB方法之前，先通過ELISA或其他方法識別和確認原代雜交瘤培養上清液中抗體的抗原反應性。每一種抗原免疫活性抗體用于形成抗體-抗原復合物，其中的抗體稱為“基準”抗體。另外，每種抗體用作“探測”抗體以根據競爭性決定分箱。Luminex技術使得探測抗體同時與所有的基準抗體-抗原復合物競爭，為本檢測方法提供了多重性。
            
連接鼠抗hIgG單克隆抗體與Luminex微珠。簡言之，將來自一組抗原反應性雜交瘤的每種雜交瘤上清液(作為基準抗體)取一部分，與連接有鼠抗hIgG單克隆抗體且具有獨特光譜編碼的微珠溫育，方法如Luminex100用戶手冊(版本1.7)中所述。活化后，微珠與鼠抗hIgG單抗(Pharmingen，San Diego，CA)連接，并在室溫下溫育2小時，或在4℃下溫育過夜。溫育后，阻斷包被的微珠，然后使用Coulter細胞計數器計數。
            
表位分箱。然后將連有微珠的基準抗體混合并均分至96孔板的孔中。各孔中均加入抗原以形成抗體-抗原復合物。將上清液中的每種抗體(現作為探測抗體)加至單個孔中。最后，加入生物素化的鼠抗hIgG單抗，隨之加入鏈親和素-PE以檢測探測抗體的結合情況。
            
簡言之，每種微珠-鼠抗hIgG復合物分別與基準抗體在旋轉器(rotator)上4℃溫育過夜。捕獲基準抗體后，微珠標記的鼠抗hIgG-基準抗體復合物匯集到一起，立即加至96孔過濾板的每個孔中，抽濾。然后每孔加入50ng抗原，室溫下溫育1小時。洗滌后，每孔加入100到500ng/ml的探測抗體，室溫下溫育2小時。結合的探測抗體使用1μl/ml的生物素化抗體檢測，所述生物素化抗體為與用于捕獲基準抗體的單克隆鼠抗hIgG相同的抗體的生物素化形式。最后，加入0.5μg/ml鏈親和素-PE，室溫下溫育30分鐘。
            
同時還進行無抗原的平行檢測作為每種單抗結合的背景對照。然后使用Luminex100掃描每孔收集的微珠，以定量測定任何給定探測抗體與每一多重抗原-基準抗體-微珠復合物的結合程度。以相對熒光單位表示的陽性信號表明探測抗體能夠與結合有基準抗體的抗原相結合，因此抗體對不競爭結合。與背景等同的信號表明探測抗體不能與結合有基準抗體的抗原相結合，抗體對競爭結合，因此屬于同一箱。同一箱中的抗體有相同的或重疊的表位。
            
體外檢測中從一組針對PLA2的抗體中識別出十七(17)種有效中和抗體。通過MCAB檢測的表現識別出兩箱中和抗體。(見表13)。箱1包含14種抗體，箱2包含3種抗體。中和PLA2活性的17個抗體只產生2種種系VH基因。頻率最高的基因，VH5-51種系基因在被分析的17種抗體中的14種中表達，并只限于箱1。功能性抗體的選擇和分箱顯示了特定箱中的抗體表達相同的IgVH，某些情況下表達相同的VHDJH重排。
            
表13抗PLA2單抗序列/分箱總結  
            
     
            
繪制高分辨率表位圖譜。從兩箱中各選出兩種獨特的抗體繪制其高分辨率表位圖譜，以驗證分箱結果。使用SPOTs技術(Sigma Genosys，Inc.)對重疊肽進行肽掃描，以繪制表位圖譜。簡言之，將PLA2的全部157氨基酸序列作為一系列重疊的12聚體寡肽定制合成，偏移量為兩個殘基，從而在尼龍膜(Sigma Genosys，Inc.)上產生陣列排布的重疊肽集合(library)。在蛋白質印跡法的標準條件下，檢測抗體與陣列排布的寡肽的結合情況。通過ELISA法中使用與HRP接合(conjugate)的二次抗體，繼而通過增強化學發光(ECL)，測定單抗與膜結合肽的結合情況。顯示結合的斑點與包含表位的寡肽對應。抗PLA2單抗2.12、2.25、2.15和2.23顯示可通過斑點印跡識別線性表位。
            
抗PLA2單抗2.15.1和2.23.1定位(map)于箱2，兩者結合于同一線性表位，GPAENK(SEQ ID NO2中的氨基酸119-124)。抗PLA2單抗2.12.1和2.25.1均定位于箱1。抗PLA2單抗2.12.1定位于較大表位，PQFLCEPD(SEQ ID NO2中的氨基酸153-160)，而抗PLA2單抗2.25.1定位于最小的表位，PQFL(SEQ ID NO2中的氨基酸153-156)，而該表位被包含于抗PLA2單抗2.21.1的表位之中，從而證實了MCAB檢測結果的最基本的分子基礎。箱1和箱2中的抗PLA2單抗具有保守性VH基因使用。例如，箱1中的抗體均使用VH5-51但具有不同的CDR3序列和輕鏈組成。箱2中的抗體均使用VH3-33，具有不同的CDR3序列和輕鏈組成。已經觀察到，基于結合競爭性的分箱及功能性檢測中的抗體活性，與對其他、但非所有的抗原目標的可變區組成之間具有相關性(數據未列出)。
            
全部種系中只有部分成員顯示可用于形成相應的互補位，對于每個抗原表位，有限數量的L和H鏈基因可配對形成特異性互補位。箱1中的單抗被發現共享相同的重鏈和輕鏈基因使用。盡管輕鏈上的CDR3和FR2長度存在差異，兩者均與重疊表位結合。箱2中的單抗共享相同的重鏈和輕鏈基因使用。盡管輕鏈上的CDR3和FR2長度存在差異，兩者均與同一表位結合。
            
實施例11使用抗PLA2單抗12.2淘選噬菌體呈現隨機肽文庫針對抗PLA2單抗2.12，對與M13噬菌體的次要外殼蛋白(pIII)融合的12聚體隨機肽Ph.D.-12TM噬菌體呈現文庫(phage display library)(New England BioLabs)進行淘選。使用ELISA法選擇可特異性結合者，并對其測序。然后將可特異性結合者的肽序列與PLA2抗原序列比對。可與抗PLA2單抗2.12特異性結合者的肽序列的比對顯示于圖4中。已經確定與PLA2序列殘基153-156比對得到的共有序列PXFL列入SEQ IDNO2中。
            
實施例12體外轉錄/翻譯測試四種單克隆抗體與連接有Luminex微珠的體外轉錄(IVT)產物的結合情況。所有構建體均表達為6Xhis標記的融合蛋白。觀察到與全長IVT產物結合的情況，但未觀察到與片段1-36PLA2His和1-63PLA2His結合的情況，說明表位在氨基酸63以后、分子的C末端區。
            
表14箱1中抗體的重鏈比對  
            
     
            
     
            
     
            
表15箱1中抗體的κ鏈比對  
            
     
            
     
            
     
            
*2.12顯示序列復制并在FR2中插入3個殘基實施例13抗PLA2抗體和抗體結合物用于治療炎癥PLA2抗原的特異性抗體，如抗PLA2抗體，可用于表達這些抗原的心血管靶細胞，例如在治療動脈粥樣硬化和再狹窄中用作降脂質劑。
            
使用抗PLA2抗體治療小鼠。為確定抗PLA2抗體治療心血管損傷的體內效果，血管損傷模型的基因剔除小鼠每隔預先確定的一段時間注射一次有效量的抗PLA2抗體。通過在頸動脈綁扎箍帶，繼而產生PLA2的炎性滲液，誘導小鼠體內的血管損傷。由此，出現與動脈粥樣硬化和再狹窄患者情況相似的頸動脈壁發炎和加厚。在抗PLA2抗體治療期間，定期對小鼠進行檢查以確定血管損傷情況。結果發現血管損傷程度明顯減輕。
            
實施例14使用抗PLA2抗體治療人類為確定抗PLA2抗體治療患有諸如動脈粥樣硬化和再狹窄等炎癥性疾病的人類患者的體內效果，所述人類患者每隔預定的時間注射一次有效量的完全人源抗PLA2抗體。治療過程中對人類患者作定期檢查以確定炎癥程度是否明顯減輕。
            
發現使用抗PLA2抗體治療的患有動脈粥樣硬化的患者，與未治療患者和/或使用對照抗體治療的患者相比，其脂質水平較低。使用的對照抗體包括與測試的抗PLA2抗體同種型相同的抗體，并且所述對照抗體可能沒有結合PLA2的能力。
            
實施例15使用抗PLA2抗體結合物治療為了確定抗PLA2抗體結合物的體內作用效果，患有諸如動脈粥樣硬化或再狹窄等炎癥性疾病的人類患者或動物，每隔一預定時間注射一次有效量的抗PLA2抗體結合物。在一個實施方案中，施用的抗PLA2抗體結合物為美登素(maytansine)-抗PLA2抗體結合物或放射性同位素-抗PLA2抗體結合物。治療期間對人類患者或動物定期檢查，以確定炎癥是否減輕，尤其是血管損傷程度是否明顯減輕。
            
結果發現，患有動脈粥樣硬化或再狹窄并且經過美登素-抗PLA2抗體結合物或放射性同位素-抗PLA2抗體結合物治療的人類患者或動物，與患有動脈粥樣硬化或再狹窄并且經過諸如對照美登素-抗體或對照放射性同位素-抗體等對照抗體結合物治療的對照患者或動物相比，其血管損傷和炎癥水平較低。可以使用的對照美登素-抗體包括含有美登素的結合物，所述美登素連接有與抗PLA2抗體的同種型相同的抗體，但更特定地不具有結合PLA2抗原的能力。可以使用的對照放射性同位素-抗體包括含有放射性同位素的結合物，所述放射性同位素連接有與抗PLA2抗體的同種型相同的抗體，但更特定地不具有結合PLA2抗原的能力。
            
實施例16抗PLA2抗體用作診斷劑檢測樣品中的PLA2抗原開發了一種酶聯免疫吸附測定法(ELISA)用以檢測樣品中的PLA2抗原。該檢測方法中，用針對抗原的一次完全人源單克隆抗體吸附微量滴定板的孔數小時，例如96孔微量滴定板或384孔微量滴定板。固定的抗體充當可能存在于試樣中的任何此抗原的捕捉抗體。將孔洗滌并以牛乳蛋白或白蛋白等封閉劑處理，以防止分析物的非特異性吸附。
            
隨后，孔使用懷疑含有此抗原的試樣處理，或者使用含有標準量此抗原的溶液處理。此樣品可以是，例如，從懷疑具有一定水平的循環抗原的受試者處采得的血清樣品，所述抗原被認為是病理學的診斷特征。
            
洗去試樣或標準溶液之后，孔使用與生物素結合標記的二次完全人源單克隆抗PLA2抗體處理。標記的抗PLA2抗體充當檢測抗體。洗去多余的二次抗體之后，孔使用親和素結合的辣根過氧化酶(HRP)和適當的顯色底物處理。通過與標準樣品得到的標準曲線相比確定試樣中的抗原濃度。
            
本ELISA檢測法為檢測試樣中的PLA2抗原提供了高特異性和高靈敏度的檢測方法。
            
確定患者的PLA2抗原濃度開發了夾心(sandwich)ELISA法以定量測定人血清中PLA2水平。用于夾心ELISA法中的兩種完全人源單克隆抗PLA2抗體可識別出PLA2分子上的不同表位(數據未列出)。該ELISA法按如下步驟進行將溶于包被緩沖液(0.1M NaHCO3，pH9.6)的50μl捕捉抗PLA2抗體以2μg/ml濃度包被于ELISA板(Fisher)上。4℃溫育過夜后，板使用200μl封閉緩沖液(0.5％BSA，0.1％吐溫20，0.01％硫柳汞溶于PBS)在25℃下處理1小時。使用0.05％溶于PBS的吐溫20(洗滌緩沖液，WB)洗板(三次)。正常或患者血清(Clinomics，Bioreclaimation)稀釋于含50％人血清的封閉緩沖液中。加有血清樣品的板在4℃下溫育過夜，使用WB洗滌，然后加入100μl/孔生物素化的檢測抗PLA2抗體，在25℃下溫育1小時。洗滌后，板中加入HRP-鏈親和素溫育15分鐘，如前洗滌，然后使用100μl/孔溶于H2O2的鄰苯二胺(Sigma顯影液)處理以顯示顏色。用50μl/孔的H2SO4(2M)終止反應，使用酶免疫分析儀(ELISA plate reader)在492nm分析。使用四參數曲線擬合程序通過與純化的PLA2抗原稀釋液對比來計算血清樣品中PLA2抗原的濃度。
            
判斷患者炎癥性疾病的病期應該知道，基于以上實施例所闡明和討論的結果，通過使用本發明的實施方案，可以根據PLA2抗原的表達水平來判斷受試者心血管損傷的病期。對于給定的損傷類型，血液樣品采自被診斷處于疾病發展不同階段，和/或疾病治療不同階段的受試者。存在于血樣中的PLA2抗原的濃度通過一種方法確定，所述方法可特異性測定存在的該抗原的量。所述方法包括一種ELISA法，例如以上實施例中所述方法。使用可為病情進展或治療的各個階段提供統計上顯著結果的抽樣總體，可確定作為各個階段的特征的抗原濃度范圍。
            
為確定所研究受試者的疾病發展階段，或確定受試者對一個療程的反應，從受試者身上采得血樣，并測定存在于樣品中的PLA2抗原的濃度。如此獲得的濃度用于確定該值落在哪個濃度范圍。如此確定的范圍與在多種診斷的受試者群體中確定的疾病發展階段或治療階段相互關聯，從而可提供所研究受試者的病期。
            
以上說明書被認為足以使本領域技術人員實施本發明。本文所述發明的實施方案不局限于具體列舉的構思的范圍，因為具體列舉的實施方案僅出于對本發明某方面的說明目的，任何功能等效的構思均涵蓋于本發明的范圍之內。本文列舉了某些資料并不等于承認本文中的描述不足以使發明的任一方面包括其最佳方式得到實施，也不能被解釋為權利要求范圍限于引用的材料中的具體說明。
            
等同聲明前述說明書及實施例詳細敘述了本發明的優選實施方案，并敘述了發明者預期的最佳方法。然而應該理解的是，無論前述內容以文本形式表現的如何詳細，本發明仍可以多種方式實施，并且應根據修改的權利要求及其任何等同物解釋本發明。
            
序列表<110>阿布格尼克斯公司萊克斯康遺傳物質公司G.M.蘭德斯M.哈克-弗蘭德肖L.陳Y.R.李M.L.梁X.馮X.賈M.R.諾斯瑞尼<120>針對磷脂酶A2的抗體<130>ABGENIX.072A<140>未知<141>2003-12-01<150>n/a<151>  
            
<160>222<170>FastSEQ，Windows版，版本4.0<210>1<211>1020<212>DNA<213>人<400>1ggccttccaa agtgctggga ttacaggcgt gagtcaccgc gcccggccaa ataaaataaa  60atgttaaagc aaattcagga ctacccctcc tccaagtctt ctgttccctt tgggcgccca  120ggtgagcggg ggaggggctg ggggagtaat aacatcaaaa gagcgccttt tcctccctta  180ttccgaggag acttccctgg gcctgactcc cggtcctgtc cccagcgccc cgcggcctct  240ggagcccctt cagtgaccaa gatacagaga tcaggacgcc tttgcgccgc cccaggtgcc  300cgcccctagc tggctctgct tgggccgcga gggaaggtga ggtcgggggc ggagccgggg  360cgtgacagcc ggggtgtgtg tccgccgggc ttggtgcctc cggtggccct gcagcaccgt  420cccacctctg ccaccctccg atggggccgc tacctgtgtg cctgccaatc atgctgctcc  480tgctactgcc gtcgctgctg ctgctgctgc ttctacctgg ccccgggtcc ggcgaggcct  540  
            
ccaggatatt acgtgtgcac cggcgtggga tcctggaact ggcaggaact gtgggttgtg  600ttggtccccg aacccccatc gcctatatga aatatggttg cttttgtggc ttgggaggcc  660atggccagcc ccgcgatgcc attgactggt gctgccatgg ccacgactgt tgttacactc  720gagctgagga ggccggctgc agccccaaga cagagcgcta ctcctggcag tgcgtcaatc  780agagcgtcct gtgcggaccg gcagagaaca aatgccaaga actgttgtgc aagtgtgacc  840aggagattgc taactgctta gcccaaactg agtacaactt aaagtacctc ttctaccccc  900agttcctatg tgagccggac tcgcccaagt gtgactgact accttgactt gaaatgctct  960tttgcacaag gaaataaagc gtcctctcag taatgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa  1020<210>2<211>165<212>PRT<213>人<400>2Met Gly Pro Leu Pro Val Cys Leu Pro Ile Met Leu Leu Leu Leu Leu1   5  10  15Pro Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Gly Pro Gly Ser Gly Glu20  25  30Ala Ser Arg Ile Leu Arg Val His Arg Arg Gly Ile Leu Glu Leu Ala35  40  45Gly Thr Val Gly Cys Val Gly Pro Arg Thr Pro Ile Ala Tyr Met Lys50  55  60Tyr Gly Cys Phe Cys Gly Leu Gly Gly His Gly Gln Pro Arg Asp Ala65  70  75  80Ile Asp Trp Cys Cys His Gly His Asp Cys Cys Tyr Thr Arg Ala Glu85  90  95Glu Ala Gly Cys Ser Pro Lys Thr Glu Arg Tyr Ser Trp Gln Cys Val100 105 110Asn Gln Ser Val Leu Cys Gly Pro Ala Glu Asn Lys Cys Gln Glu Leu115 120 125Leu Cys Lys Cys Asp Gln Glu Ile Ala Asn Cys Leu Ala Gln Thr Glu130 135 140Tyr Asn Leu Lys Tyr Leu Phe Tyr Pro Gln Phe Leu Cys Glu Pro Asp145 150 155 160Ser Pro Lys Cys Asp165<210>3<211>118<212>PRT<213>人  
            
<400>3Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Ser Tyr20  25  30Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg His Trp Ser Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala115<210>4<211>109<212>PRT<213>人<400>4Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1   5  10  15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Gly20  25  30Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Phe Leu35  40  45Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50  55  60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65  70  75  80Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro85  90  95Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105<210>5<211>118  
            
<212>PRT<213>人<400>5Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Ser Tyr20  25  30Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg Ser Trp Thr Tyr Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Ala100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala115<210>6<211>109<212>PRT<213>人<400>6Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1   5  10  15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Pro Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn20  25  30Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35  40  45Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50  55  60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Ser Arg Leu Glu65  70  75  80Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro85  90  95Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105  
            
<210>7<211>118<212>PRT<213>人<400>7Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Tyr20  25  30Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg His Ser Gly Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala115<210>8<211>112<212>PRT<213>人<400>8Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1   5  10  15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser20  25  30Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35  40  45Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro50  55  60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65  70  75  80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Gly Val Tyr Phe Cys Met Gln Gly85  90  95Leu Lys Thr Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg100 105 110  
            
<210>9<211>117<212>PRT<213>人<400>9Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr20  25  30Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg His Arg Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser Ala115<210>10<211>108<212>PRT<213>人<400>10Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1   5  10  15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp20  25  30Leu Asp Trp Cys Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile35  40  45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50  55  60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65  70  75  80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Asn Tyr Pro Pro85  90  95  
            
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105<210>11<211>117<212>PRT<213>人<400>11Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr20  25  30Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg His Arg Glu Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val100 105 110Thr Val Ser Ser Ala115<210>12<211>113<212>PRT<213>人<400>12Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1   5  10  15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser20  25  30Asn Gly Tyr Asn Phe Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35  40  45Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro50  55  60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65  70  75  80  
            
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala85  90  95Leu Gln Thr Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110Arg<210>13<211>118<212>PRT<213>人<400>13Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20  25  30Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg Ser Trp Thr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala115<210>14<211>109<212>PRT<213>人<400>14Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1   5  10  15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn20  25  30Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35  40  45  
            
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50  55  60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65  70  75  80Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro85  90  95Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105<210>15<211>118<212>PRT<213>人<400>15Gly Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr20  25  30Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg Gly Gly Val Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala115<210>16<211>110<212>PRT<213>人<400>16Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1   5  10  15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile Arg Arg Ser20  25  30  
            
Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35  40  45Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50  55  60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65  70  75  80Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro85  90  95Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg100 105 110<210>17<211>118<212>PRT<213>人<400>17Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Gly Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20  25  30Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg Ser Thr Ser Ser Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala115<210>18<211>108<212>PRT<213>人<400>18Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1   5  10  15  
            
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr20  25  30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35  40  45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50  55  60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65  70  75  80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro85  90  95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105<210>19<211>118<212>PRT<213>人<400>19Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Ile Thr Tyr20  25  30Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Leu Thr Gly Thr Arg Ala Phe Glu Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala115<210>20<211>111<212>PRT<213>人<400>20  
            
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1   5  10  15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Tyr20  25  30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys35  40  45Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg50  55  60Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser65  70  75  80Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Asn85  90  95Thr Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg100 105 110<210>21<211>119<212>PRT<213>人<400>21Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1   5  10  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20  25  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35  40  45Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50  55  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65  70  75  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg Arg Asp Trp Asn Tyr Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110Met Val Thr Val Ser Ser Ala115<210>22<211>108<212>PRT<213>人  
            
<400>22Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1   5  10  15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr20  25  30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile35  40  45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly50  55  60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65  70  75  80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Ile85  90  95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg100 105<210>23<211>121<212>PRT<213>人<400>23Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1   5  10  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20  25  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35  40  45Ala Ala Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Trp Tyr Ala Asp Ser Val50  55  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65  70  75  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg Gly Gly Thr Gly Thr Pro Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala115 120<210>24<211>112  
            
<212>PRT<213>人<400>24Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1   5  10  15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser20  25  30Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35  40  45Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro50  55  60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65  70  75  80Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala85  90  95Leu Gln Thr Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg100 105 110<210>25<211>121<212>PRT<213>人<400>25Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1   5  10  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20  25  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35  40  45Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Lys Tyr Ala Asp Ser Val50  55  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65  70  75  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg Asp Gly Pro Tle Phe Gly Val Val Met Gly Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala115 120  
            
<210>26<211>108<212>PRT<213>人<400>26Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1   5  10  15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr20  25  30Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Ile Leu Leu Ile35  40  45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50  55  60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65  70  75  80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Ile85  90  95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg100 105<210>27<211>118<212>PRT<213>人<400>27Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Ser Tyr20  25  30Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Ala Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg Thr Thr Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala115  
            
<210>28<211>108<212>PRT<213>人<400>28Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1   5  10  15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr20  25  30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35  40  45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50  55  60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65  70  75  80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Pro Pro85  90  95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105<210>29<211>118<212>PRT<213>人<400>29Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ile Tyr20  25  30Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Gln Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg His Asp Ser Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr100 105 110  
            
Val Thr Val Ser Ser Ala115<210>30<211>118<212>PRT<213>人<220>  
            
<221>變體<222>102<223>Xaa＝任何氨基酸<400>30Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20  25  30Trp Ile Gly Trp Leu Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg Ser Thr Ser Xaa Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala115<210>31<211>118<212>PRT<213>人<400>31Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20  25  30Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met  
            
35  40  45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Mer Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg His Val Arg Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala115<210>32<211>23<212>DNA<213>人<220>  
            
<221>misc_特征<222>21<223>n＝次黃嘌呤核苷<400>32caggtgcagc tggagcagtc ngg  23<210>33<211>24<212>DNA<213>人<400>23gctgagggag tagagtcctg agga 24<210>34<211>19<212>DNA<213>人<400>34cacaccgcgg tcacatggc   19<210>35<211>20  
            
<212>DNA<213>人<400>35ctactctagg gcacctgtcc  20<210>36<211>11<212>DNA<213>人<400>36tgggacctac t   11<210>37<211>15<212>DNA<213>人<400>37ggatacagct atggt   15<210>38<211>16<212>DNA<213>人<400>38gtatagcggt ggctgg  16<210>39<211>15<212>DNA<213>人<400>39tatagtagct cgtcc   15<210>40<211>15<212>DNA<213>人<400>40  
            
atagcagcag ctggt   15<210>41<211>12<212>DNA<213>人<400>41gggtatagca gt  12<210>42<211>10<212>DNA<213>人<400>42tccttttaaa 10<210>43<211>10<212>DNA<213>人<400>43ctggaactac 10<210>44<211>15<212>DNA<213>人<400>44ggatacagct atggt   15<210>45<211>13<212>DNA<213>人<400>45cagtggctgg tac 13<210>46<211>10  
            
<212>DNA<213>人<400>46ctggaactac 10<210>47<211>20<212>DNA<213>人<400>47tatgattacg tttgggggag  20<210>48<211>15<212>DNA<213>人<400>48ggatacagct atggt   15<210>49<211>10<212>DNA<213>人<400>49agggactgga 10<210>50<211>15<212>DNA<213>人<400>50ggatacagct atggt   15<210>51<211>10<212>PRT<213>人<400>51  
            
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn1   5  10<210>52<211>17<212>PRT<213>人<400>52Phe Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1   5  10  15Gly<210>53<211>9<212>PRT<213>人<400>53Lys Gly Asp Trp Asn Tyr Glu Asp Tyr1   5<210>54<211>10<212>PRT<213>人<400>54Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly1   5  10<210>55<211>17<212>PRT<213>人<400>55Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln1   5  10  15  
            
Gly<210>56<211>8<212>PRT<213>人<400>56Leu Gly Pro Thr Pro Phe Asp Tyr1   5<210>57<211>10<212>PRT<213>人<400>57Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile His1   5  10<210>58<211>17<212>PRT<213>人<400>58Trp Ile His Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln1   5  10  15Gly<210>59<211>17<212>PRT<213>人<400>59Asp Arg Asp Thr Ala Met Val Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp1   5  10  15  
            
Val<210>60<211>12<212>PRT<213>人<400>60Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn1   5  10<210>61<211>18<212>PRT<213>人<400>61Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val1   5  10  15Lys Ser<210>62<211>16<212>PRT<213>人<400>62Gly Glu Tyr Ser Gly Gly Trp Asn Phe Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val1   5  10  15<210>63<211>10<212>PRT<213>人<400>63Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser1   5  10  
            
<210>64<211>17<212>PRT<213>人<400>64Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1   5  10  15Gly<210>65<211>13<212>PRT<213>人<400>65Glu Gly Val Thr Thr Ile Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu1   5  10<210>66<211>12<212>PRT<213>人<400>66Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser1   5  10<210>67<211>16<212>PRT<213>人<400>67Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser1   5  10  15  
            
<210>68<211>11<212>PRT<213>人<400>68Glu Val Ile Val Ala Arg Pro Trp Phe Asp Pro1   5  10<210>69<211>10<212>PRT<213>人<400>69Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr Gly Met His1   5  10<210>70<211>17<212>PRT<213>人<400>70Ile Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1   5  10  15Gly<210>71<211>12<212>PRT<213>人<400>71Glu Ile Ala Ala Ala Gly Ser Ser Gly Met Asp Val1   5  10<210>72<211>10  
            
<212>PRT<213>人<400>72Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly1   5  10<210>73<211>17<212>PRT<213>人<400>73Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln1   5  10  15Gly<210>74<211>12<212>PRT<213>人<400>74Pro Pro Pro Gly Ile Ala Val Pro Phe Lys Asp Tyr1   5  10<210>75<211>10<212>PRT<213>人<400>75Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His1   5  10<210>76<211>17<212>PRT<213>人  
            
<400>76Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Tyr Arg Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys1   5  10  15Gly<210>77<211>5<212>PRT<213>人<400>77Arg Gly Phe Asp Tyr1   5<210>78<211>10<212>PRT<213>人<400>78Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn1   5  10<210>79<211>17<212>PRT<213>人<400>79Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1   5  10  15Gly<210>80<211>17<212>PRT<213>人  
            
<400>80Glu Gly Leu Glu Leu Arg Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp1   5  10  15Val<210>81<211>10<212>PRT<213>人<400>81Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His1   5  10<210>82<211>17<212>PRT<213>人<400>82Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln1   5  10  15Gly<210>83<211>17<212>PRT<213>人<400>83Asp Arg Asp Thr Ala Met Val Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Leu Asp1   5  10  15Val<210>84<211>10  
            
<212>PRT<213>人<400>84Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser1   5  10<210>85<211>17<212>PRT<213>人<400>85Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1   5  10  15Gly<210>86<211>13<212>PRT<213>人<400>86Glu Gly Val Thr Thr Ile Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu1   5  10<210>87<211>10<212>PRT<213>人<400>87Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly1   5  10<210>88<211>17<212>PRT<213>人  
            
<400>88Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln1   5  10  15Gly<210>89<211>7<212>PRT<213>人<400>89Gln Arg Arg Gly Phe Asp Tyr1   5<210>90<211>10<212>PRT<213>人<400>90Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Ala1   5  10<210>91<211>17<212>PRT<213>人<400>91Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln1   5  10  15Gly<210>92<211>7<212>PRT<213>人  
            
<400>92Gly Arg Gly Gly Phe Asp Tyr1   5<210>93<211>10<212>PRT<213>人<400>93Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gly Met His1   5  10<210>94<211>17<212>PRT<213>人<400>94Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1   5  10  15Gly<210>95<211>10<212>PRT<213>人<400>95Ala Val Ala Gly Thr Gly Ala Phe Asp Ile1   5  10<210>96<211>10<212>PRT<213>人<400>96  
            
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn1   5  10<210>97<211>17<212>PRT<213>人<400>97Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1   5  10  15Gly<210>98<211>17<212>PRT<213>人<400>98Glu Gly Leu Glu Leu Arg Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp1   5  10  15Val<210>99<211>12<212>PRT<213>人<400>99Gly Gly Ser Ile Ser Arg Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly1   5  10<210>100<211>16<212>PRT<213>人<400>100  
            
Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser1   5  10  15<210>101<211>10<212>PRT<213>人<400>101Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Ile His1   5  10<210>102<211>17<212>PRT<213>人<400>102Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Tyr Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys1   5  10  15Gly<210>103<211>5<212>PRT<213>人<400>103Arg Gly Phe Asp Ser1   5<210>104<211>10<212>PRT<213>人<400>104Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His1   5  10  
            
<210>105<211>17<212>PRT<213>人<400>105Ala Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1   5  10  15Gly<210>106<211>11<212>PRT<213>人<400>106Gly Gly Thr Gly Thr Pro Gly Ala Phe Asp Ile1   5  10<210>107<211>10<212>PRT<213>人<400>107Gly Phe Ile Phe Ser Asn Ala Trp Met Ser1   5  10<210>108<211>19<212>PRT<213>人<400>108Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro1   5  10  15Val Lys Gly  
            
<210>109<211>12<212>PRT<213>人<400>109Gly Met Ile Thr Phe Gly Gly Ala Met Phe Asp Phe1   5  10<210>110<211>10<212>PRT<213>人<400>110Gly Tyr Thr Phe Asn Asp Tyr Tyr Met His1   5  10<210>111<211>17<212>PRT<213>人<400>111Trp Ile His Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln1   5  10  15Gly<210>112<211>17<212>PRT<213>人<400>112Asp Arg Asp Thr Ala Met Val Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp1   5  10  15Val  
            
<210>113<211>10<212>PRT<213>人<400>113Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Gly Met His1   5  10<210>114<211>17<212>PRT<213>人<400>114Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1   5  10  15Gly<210>115<211>8<212>PRT<213>人<400>115Gly Val Tyr Gly Asp Phe Asp Tyr1   5<210>116<211>10<212>PRT<213>人<400>116Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met Hisl   5  10  
            
<210>117<211>17<212>PRT<213>人<400>117Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1   5  10  15Gly<210>118<211>9<212>PRT<213>人<400>118Arg Asp Trp Asn Tyr Gly Met Asp Val1   5<210>119<211>10<212>PRT<213>人<400>119Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met His1   5  10<210>120<211>17<212>PRT<213>人<400>120Trp Ile Ser Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln1   5  10  15Gly  
            
<210>121<211>17<212>PRT<213>人<400>121Asp Arg Asp Thr Ala Met Val Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp1   5  10  15Val<210>122<211>10<212>PRT<213>人<400>122Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His1   5  10<210>123<211>17<212>PRT<213>人<400>123Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1   5  10  15Gly<210>124<211>16<212>PRT<213>人<400>124Gln Gly Ile Ala Ala Arg Arg Asn Tyr Tyr Tyr Ser Gly Met Asp Val1   5  10  15  
            
<210>125<211>10<212>PRT<213>人<400>125Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asp Ile Asn1   5  10<210>126<211>17<212>PRT<213>人<400>126Trp Met Asp Pro Asn Ser Gly His Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln1   5  10  15Gly<210>127<211>9<212>PRT<213>人<400>127Glu Gly Asn Trp Gly Ser Phe Asp Tyr1   5<210>128<211>10<212>PRT<213>人<400>128Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp Ile Gly1   5  10<210>129<211>17  
            
<212>PRT<213>人<400>129Phe Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Glu1   5  10  15Gly<210>130<211>7<212>PRT<213>人<400>130His Thr Gly Ala Leu Asp Tyr1   5<210>131<211>10<212>PRT<213>人<400>131Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His1   5  10<210>132<211>17<212>PRT<213>人<400>132Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys1   5  10  15Gly<210>133<211>9  
            
<212>PRT<213>人<400>133Arg Gly Pro Leu Tyr Ala Phe Asp Ile1   5<210>134<211>118<212>PRT<213>人<220>  
            
<221>變體<222>101，102<223>Xaa＝任何氨基酸<400>134Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20  25  30Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg Gly Gly Xaa Xaa Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala115<210>135<211>118<212>PRT<213>人<220>  
            
<221>變體  
            
<222>102<223>Xaa＝任何氨基酸<400>135Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20  25  30Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg Ser Ser Ser Xaa Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala115<210>136<211>121<212>PRT<213>人<220>  
            
<221>變體<222>99，100，103，104，105<223>Xaa＝任何氨基酸<400>136Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1   5  10  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20  25  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35  40  45Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50  55  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65  70  75  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys  
            
85  90  95Ala Arg Xaa Xaa Thr Gly Xaa Xaa Xaa Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala115 120<210>137<211>119<212>PRT<213>人<220>  
            
<221>變體<222>99，100<223>Xaa＝任何氨基酸<400>137Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1   5  10  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20  25  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35  40  45Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50  55  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65  70  75  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg Xaa Xaa Trp Asn Tyr Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110Met Val Thr Val Ser Ser Ala115<210>138<211>117<212>PRT<213>人<220>  
            
<221>變體<222>99，100，102  
            
<223>Xaa＝任何氨基酸<400>138Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20  25  30Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg Xaa Xaa Leu Xaa Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser Ala115<210>139<211>118<212>PRT<213>人<220>  
            
<221>變體<222>101<223>Xaa＝任何氨基酸<400>139Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20  25  30Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85  90  95  
            
Ala Arg Ser Trp Xaa Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala115<210>140<211>118<212>PRT<213>人<220>  
            
<221>變體<222>99<223>Xaa＝任何氨基酸<400>140Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20  25  30Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg Xaa Trp Cys Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala115<210>141<211>118<212>PRT<213>人<220>  
            
<221>變體<222>97，98，102<223>Xaa＝任何氨基酸  
            
<400>141Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20  25  30Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85  90  95Xaa Xaa Thr Gly Thr Xaa Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala115<210>142<211>121<212>PRT<213>人<220>  
            
<221>變體<222>99，100<223>Xaa＝任何氨基酸<400>142Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1   5  10  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20  25  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35  40  45Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50  55  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65  70  75  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg Xaa Xaa Thr Ile Phe Gly Val Val Ile Asp Tyr Trp Gly Gln  
            
100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala115 120<210>143<211>118<212>PRT<213>人<220>  
            
<221>變體<222>99，100<223>Xaa＝任何氨基酸<400>143Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20  25  30Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg Xaa Xaa Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala115<210>144<211>117<212>PRT<213>人<220>  
            
<221>變體<222>99，100，101<223>Xaa＝任何氨基酸  
            
<400>144Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Ieu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20  25  30Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg Xaa Xaa Xaa Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val100 105 110Thr Val Ser Ser Ala115<210>145<211>118<212>PRT<213>人<400>145Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20  25  30Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg His Ser Gly Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala115<210>146  
            
<211>12<212>PRT<213>人<400>146Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Arg Tyr Leu Ala1   5  10<210>147<211>7<212>PRT<213>人<400>147Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr1   5<210>148<211>9<212>PRT<213>人<400>148Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Gln Ile Thr1   5<210>149<211>11<212>PRT<213>人<400>149Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Asp Leu Ala1   5  10<210>150<211>7<212>PRT<213>人  
            
<400>150Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser1   5<210>151<211>9<212>PRT<213>人<400>151Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Leu Thr1   5<210>152<211>11<212>PRT<213>人<400>152Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly1   5  10<210>153<211>7<212>PRT<213>人<400>153Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser1   5<210>154<211>9<212>PRT<213>人<400>154Leu Gln His Asn Ile Tyr Pro Leu Thr1   5  
            
<210>155<211>17<212>PRT<213>人<400>155Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu1   5  10  15Thr<210>156<211>7<212>PRT<213>人<400>156Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser1   5<210>157<211>9<212>PRT<213>人<400>157Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Arg Thr1   5<210>158<211>12<212>PRT<213>人<400>158Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Arg Tyr Leu Ala1   5  10<210>159  
            
<211>7<212>PRT<213>人<400>159Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ala1   5<210>160<211>10<212>PRT<213>人<400>160Gln Gln Cys Asp Tyr Ser Pro Pro Cys Ser1   5  10<210>161<211>12<212>PRT<213>人<400>161Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Lys Ser Tyr Leu Ala1   5  10<210>162<211>7<212>PRT<213>人<400>162Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr1   5<210>163<211>9<212>PRT<213>人  
            
<400>163Gln Gln Tyr Asp Tyr Ser Pro Ile Thr1   5<210>164<211>17<212>PRT<213>人<400>164Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu1   5  10  15Ala<210>165<211>7<212>PRT<213>人<400>165Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser1   5<210>166<211>9<212>PRT<213>人<400>166Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Arg Thr1   5<210>167<211>16<212>PRT<213>人<400>167Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Gln Ser Asn Gly Tyr Lys Tyr Leu Glu  
            
1   5  10  15<210>168<211>7<212>PRT<213>人<400>168Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser1   5<210>169<211>9<212>PRT<213>人<400>169Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Leu Thr1   5<210>170<211>11<212>PRT<213>人<400>170Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala1   5  10<210>171<211>7<212>PRT<213>人<400>171Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr1   5<210>172  
            
<211>10<212>PRT<213>人<400>172Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Cys Ser1   5  10<210>173<211>11<212>PRT<213>人<400>173Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ile Leu Ala1   5  10<210>174<211>7<212>PRT<213>人<400>174Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr1   5<210>175<211>9<212>PRT<213>人<400>175Gln Gln Tyr His Asn Trp Pro Ile Thr1   5<210>176<211>16<212>PRT<213>人  
            
<400>176Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp1   5  10  15<210>177<211>7<212>PRT<213>人<400>177Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser1   5<210>178<211>9<212>PRT<213>人<400>178Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Phe Thr1   5<210>179<211>11<212>PRT<213>人<400>179Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn1   5  10<210>180<211>7<212>PRT<213>人<400>180Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr1   5  
            
<210>181<211>9<212>PRT<213>人<400>181Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Ile Thr1   5<210>182<211>17<212>PRT<213>人<400>182Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Tyr Phe Leu1   5  10  15Ala<210>183<211>7<212>PRT<213>人<400>183Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser1   5<210>184<211>9<212>PRT<213>人<400>184Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Trp Thr1   5<210>185  
            
<211>17<212>PRT<213>人<400>185Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Arg Ser Asn Asn Lys Asn Phe Leu1   5  10  15Ala<210>186<211>7<212>PRT<213>人<400>186Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser1   5<210>187<211>9<212>PRT<213>人<400>187Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Leu Thr1   5<210>188<211>17<212>PRT<213>人<400>188Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu1   5  10  15Ala<210>189  
            
<211>7<212>PRT<213>人<400>189Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser1   5<210>190<211>9<212>PRT<213>人<400>190Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Arg Thr1   5<210>191<211>11<212>PRT<213>人<400>191Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Ala1   5  10<210>192<211>7<212>PRT<213>人<400>192Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser1   5<210>193<211>9<212>PRT<213>人  
            
<400>193Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Pro Thr1   5<210>194<211>12<212>PRT<213>人<400>194Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala1   5  10<210>195<211>7<212>PRT<213>人<400>195Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr1   5<210>196<211>10<212>PRT<213>人<400>196Gln His Tyr Gly Ser Leu Pro Pro Cys Ser1   5  10<210>197<211>16<212>PRT<213>人<400>197Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr1   5  10  15  
            
<210>198<211>7<212>PRT<213>人<400>198Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser1   5<210>199<211>9<212>PRT<213>人<400>199Met Gln Ser Ile Gln Leu Pro Leu Thr1   5<210>200<211>17<212>PRT<213>人<400>200Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Phe Arg Ser Asn Asn Arg Asn Tyr Leu1   5  10  15Ala<210>201<211>7<212>PRT<213>人<400>201Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser1   5<210>202  
            
<211>9<212>PRT<213>人<400>202Gln Gln Tyr Tyr Ser Ile Pro Arg Thr1   5<210>203<211>16<212>PRT<213>人<400>203Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr1   5  10  15<210>204<211>7<212>PRT<213>人<400>204Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser1   5<210>205<211>9<212>PRT<213>人<400>205Met Gln Ser Ile Gln Leu Pro Leu Thr1   5<210>206<211>16<212>PRT<213>人  
            
<400>206Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp1   5  10  15<210>207<211>7<212>PRT<213>人<400>207Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser1   5<210>208<211>8<212>PRT<213>人<400>208Met Gln Ala Leu Gln Thr Ile Thr1   5<210>209<211>108<212>PRT<213>人<400>209Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1   5  10  15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr20  25  30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35  40  45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50  55  60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65  70  75  80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Ile85  90  95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg  
            
100 105<210>210<211>109<212>PRT<213>人<400>210Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1   5  10  15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser20  25  30Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35  40  45Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50  55  60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65  70  75  80Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro85  90  95Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105<210>211<211>108<212>PRT<213>人<400>211Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1   5  10  15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp20  25  30Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile35  40  45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50  55  60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65  70  75  80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Pro85  90  95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg  
            
100 105<210>212<211>113<212>PRT<213>人<400>212Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1   5  10  15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser20  25  30Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35  40  45Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro50  55  60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65  70  75  80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala85  90  95Leu Gln Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110Arg<210>213<211>110<212>PRT<213>人<400>213Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1   5  10  15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser20  25  30Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35  40  45Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50  55  60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65  70  75  80Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro  
            
85  90  95Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg100 105 110<210>214<211>108<212>PRT<213>人<400>214Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1   5  10  15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr20  25  30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35  40  45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50  55  60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65  70  75  80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro85  90  95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105<210>215<211>112<212>PRT<213>人<400>215Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1   5  10  15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser20  25  30Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35  40  45Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro50  55  60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65  70  75  80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala  
            
85  90  95Leu Gln Thr Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg100 105 110<210>216<211>111<212>PRT<213>人<220>  
            
<221>變體<222>43，44，45，46<223>Xaa＝任何氨基酸<400>216Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1   5  10  15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr20  25  30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Lys35  40  45Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg50  55  60Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser65  70  75  80Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser85  90  95Thr Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg100 105 110<210>217<211>110<212>PRT<213>人<400>217Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20  25  30Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35  40  45  
            
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala100 105 110<210>218<211>110<212>PRT<213>人<400>218Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Ser Tyr20  25  30Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Ala Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg Thr Thr Gln Asp Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala100 105 110<210>219<211>110<212>PRT<213>人<400>219Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1   5  10  15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Ile Thr Tyr20  25  30Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35  40  45  
            
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50  55  60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Leu Trp Gly Gln Arg Thr Met Glu Thr Val Ser Ser Ala100 105 110<210>220<211>111<212>PRT<213>人<220>  
            
<221>變體<222>44，45，46<223>Xaa＝任何氨基酸<400>220Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1   5  10  15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr20  25  30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Xaa Xaa Xaa Pro Lys35  40  45Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg50  55  60Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser65  70  75  80Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser85  90  95Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105 110<210>221<211>111<212>PRT<213>人<220>  
            
<221>變體  
            
<222>44，45，46<223>Xaa＝任何氨基酸<400>221Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1   5  10  15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr20  25  30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Xaa Xaa Xaa Pro Lys35  40  45Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg50  55  60Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser65  70  75  80Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn85  90  95Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105 110<210>222<211>111<212>PRT<213>人<400>222Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1   5  10  15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Tyr20  25  30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys35  40  45Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg50  55  60Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser65  70  75  80Leu Arg Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Asn85  90  95Thr Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg100 105 110
            
權利要求
            
1.一種與磷脂酶A2(PLA2)結合的人源單克隆抗體，并且包括具有選自SEQ ID NO3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，30和31的氨基酸序列的重鏈。
            
2.根據權利要求1所述的抗體，進一步包括具有選自SEQ ID NO4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26和28的氨基酸序列的輕鏈。
            
3.根據權利要求2所述的人源單克隆抗體，其中重鏈具有包括序列SEQID NO3的氨基序列，輕鏈具有包括序列SEQ ID NO4的氨基序列。
            
4.根據權利要求2所述的人源單克隆抗體，其中重鏈具有包括序列SEQID NO5的氨基序列，輕鏈具有包括序列SEQ ID NO6的氨基序列。
            
5.根據權利要求2所述的人源單克隆抗體，其中重鏈具有包括序列SEQID NO7的氨基序列，輕鏈具有包括序列SEQ ID NO8的氨基序列。
            
6.根據權利要求2所述的人源單克隆抗體，其中重鏈具有包括序列SEQID NO9的氨基序列，輕鏈具有包括序列SEQ ID NO10的氨基序列。
            
7.根據權利要求2所述的人源單克隆抗體，其中重鏈具有包括序列SEQID NO11的氨基序列，輕鏈具有包括序列SEQ ID NO12的氨基序列。
            
8.根據權利要求2所述的人源單克隆抗體，其中重鏈具有包括序列SEQID NO13的氨基序列，輕鏈具有包括序列SEQ ID NO14的氨基序列。
            
9.根據權利要求2所述的人源單克隆抗體，其中重鏈具有包括序列SEQID NO15的氨基序列，輕鏈具有包括序列SEQ ID NO16的氨基序列。
            
10.根據權利要求2所述的人源單克隆抗體，其中重鏈具有包括序列SEQID NO17的氨基序列，輕鏈具有包括序列SEQ ID NO18的氨基序列。
            
11.根據權利要求2所述的人源單克隆抗體，其中重鏈具有包括序列SEQID NO19的氨基序列，輕鏈具有包括序列SEQ ID NO20的氨基序列。
            
12.根據權利要求2所述的人源單克隆抗體，其中重鏈具有包括序列SEQID NO21的氨基序列，輕鏈具有包括序列SEQ ID NO22的氨基序列。
            
13.根據權利要求2所述的人源單克隆抗體，其中重鏈具有包括序列SEQID NO23的氨基序列，輕鏈具有包括序列SEQ ID NO24的氨基序列。
            
14.根據權利要求2所述的人源單克隆抗體，其中重鏈具有包括序列SEQID NO25的氨基序列，輕鏈具有包括序列SEQ ID NO26的氨基序列。
            
15.根據權利要求2所述的人源單克隆抗體，其中重鏈具有包括序列SEQID NO27的氨基序列，輕鏈具有包括序列SEQ ID NO28的氨基序列。
            
16.一種固定于不溶性基質上的抗體，其中所述抗體為權利要求2的抗體。
            
17.一種檢測患者樣品中磷脂酶A2(PLA2)水平的方法，其中所述方法包括使用權利要求2的抗PLA2抗體在患者樣品分析中檢測PLA2的水平。
            
18.根據權利要求17的方法，其中患者樣品為血液。
            
19.一種組合物，包括權利要求2的抗體或其結合片段，以及藥學上可接受的載體。
            
20.一種有效治療炎癥性疾病的方法，包括選擇需要進行炎癥性疾病治療的動物；和給所述動物施用治療有效量的與磷脂酶A2(PLA2)特異性結合的抗體，或其結合片段。
            
21.根據權利要求20的方法，其中所述動物為人類。
            
22.根據權利要求20的方法，其中所述抗體為完全人源單克隆抗體。
            
23.根據權利要求20的方法，其中所述炎癥性疾病選自源于關節、皮膚和血管處炎癥反應的炎性和退行性病變，關節炎，牛皮癬，哮喘，阿爾察默病，動脈粥樣硬化和再狹窄。
            
24.根據權利要求20的方法，其中所述抗體為權利要求2的抗體。
            
25.一種有效治療再狹窄的方法，包括選擇需要進行炎癥性疾病治療的動物；和給所述動物施用治療有效量的與磷脂酶A2(PLA2)特異性結合的抗體，或其結合片段。
            
26.根據權利要求25的方法，其中所述動物為人類。
            
27.根據權利要求25的方法，其中所述抗體為完全人源單克隆抗體。
            
28.根據權利要求25的方法，其中所述抗體為權利要求2的抗體。
            
29.完全人源抗體或其結合片段在制備有效治療動物炎癥性疾病的藥物中的應用，其中所述單克隆抗體或其結合片段與磷脂酶A2(PLA2)結合。
            
30.根據權利要求29的應用，其中所述動物為人類。
            
31.根據權利要求29的應用，其中所述炎癥性疾病選自源于關節、皮膚和血管處炎癥反應的炎性和退行性病變，關節炎，牛皮癬，哮喘，阿爾察默病，動脈粥樣硬化和再狹窄。
            
32.根據權利要求29的應用，其中所述抗體為權利要求2的抗體。
            
33.完全人源抗體或其結合片段在制備有效治療動物再狹窄的藥物中的應用，其中所述單克隆抗體或其結合片段與磷脂酶A2(PLA2)結合。
            
34.根據權利要求33的應用，其中所述動物為人類。
            
35.根據權利要求33的應用，其中所述抗體為權利要求2的抗體。
            
全文摘要
            
本發明涉及針對抗原磷脂酶A2(PLA2)的抗體以及所述抗體的應用。尤其是，根據本發明的某些實施方案，提供針對抗原PLA2的完全人源單克隆抗體。本發明提供編碼以下序列的核苷酸序列和含有以下序列的氨基酸序列，所述序列為免疫球蛋白分子的重鏈和輕鏈，特別是對應于跨骨架區和/或互補決定區(CDR)的連續重鏈和輕鏈序列的序列，具體從FR1到FR4或從CDR1到CDR3。本發明還提供表達這些免疫球蛋白分子和單克隆抗體的雜交瘤或其他細胞系。
            
文檔編號C07K16/40GK1878795SQ200380109453 
            
公開日2006年12月13日 申請日期2003年12月2日 優先權日2002年12月2日
            
發明者G·M·蘭德斯, M·哈克-弗蘭德肖, L·陳, Y·R·李, M·L·梁, X·馮, X·賈, M·R·諾斯瑞尼 申請人:阿布格尼克斯公司, 萊克斯康遺傳物質公司
            
                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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