人生長激素晶體和制備它們的方法

專利名稱：人生長激素晶體和制備它們的方法
技術領域：
本發明涉及人生長激素或人生長激素衍生物的晶體和包含它們的組合物或制劑。此外，本發明提供了生產人生長激素或人生長激素衍生物晶體的方法。本發明的晶體在治療具有障礙的哺乳動物中特別有用，所述障礙與人生長激素缺乏有關或通過用人生長激素治療而得到改善。
發明的背景促生長素或生長激素(“GH”)是一種哺乳動物蛋白，該蛋白包含一類在大腦中由內分泌系統的主要腺體，腺垂體合成和分泌的促激素。腺垂體分泌的GH和其它促激素調節全身其它內分泌腺和組織中細胞的活動。特別地，GH由腺垂體腺的促生長激素細胞分泌，有刺激肝和其它組織合成和分泌IGF-1的功能，IGF-1是一種控制細胞分裂、調節新陳代謝進程的蛋白并以游離的狀態存在或與6個被指定為IGFBP-1至6的其它蛋白中的一個蛋白結合。分泌過程本身由促生長素釋放素(促進GH釋放)和生長激素釋放抑制激素(抑制GH釋放)對抗作用來調節。
人生長激素(″hGH″)是特別有意義的，因為他在細胞和器官生長的調節和各衰老階段的生理功能中都作為重要的激素起作用。例如，hGH的過量產生在兒童導致巨人癥和在成人導致肢端肥大癥，反之，hGH產生不足在兒童導致侏儒癥[Mauras等，J.Clin.Endocrinologyand Metabolism，85(10)，3653-3660(2000)；Frindik等，HormoneResearch，51(1)，15-19(1999)；Leger等，J.Clin.Endocrinologyand Metabolism，83(10)，3512-3516(1998)]、特納綜合征(只限女性)[Bramswig，Endocrine，15(1)，5-13(2001)；Pasquino etal.，Hormone Research，46(6)，269-272(1996)]和慢性腎功能不全[Carroll等，Trends in Endocrinology and Metabolism，11(6)，231-238(2000)；Ueland等，J.Clin.Endocrinology and Metabolism，87(6)，2760-2763(2002)；Simpson等，Growth Hormone&IGFResearch，12，1-33(2002)]。在成人，hGH的缺乏能影響蛋白質、糖類、脂類、礦物質和結締組織的新陳代謝過程，并能導致肌肉、骨或皮膚的萎縮[Mehls and Haas，Growth Hormone &IGF Research，Supplement B，S31-S37(2000)；Fine等，J.Pediatrics，136(3)，376-382(2000)；Motoyama等，Clin.Exp.Nephrology，2(2)，162-165(1998)]。以生長不足為特征的其它hGH缺乏包括AIDS消瘦綜合征[Hirschfeld，Hormone Research，46，215-221(1996)；Tritos等，Am.J.Medicine，105(1)，44-57(1998)；Mulligan等，J.Parenteral and Enteral Nutrition，23(6)，S202-S209(1999)；Torres and Cadman，BioDrugs，14(2)，83-91(2000)]和普-威綜合征[Ritzen，Hormone Research，56(5-6)，208(2002)；Eiholzer等，Eur.J.Pediatrics，157(5)，368-377(1998)]。
迄今為止，人hGH缺乏的治療方案主要集中在皮下注射通過重組DNA技術生產的純化hGH。這種治療劑被包裝成筒中的溶液或者在使用時需要重構的凍干粉末。注射的頻率根據治療的疾病和使用的商業上可獲得的產品而變化。例如，侏儒癥通過每天皮下注射重組hGH來治療。
使用皮下給藥作為hGH的快速遞送途徑是溶液中蛋白的固有的不穩定性所必需的。這種不穩定性起因于蛋白質的氨基酸序列內部特定位置上關鍵的分子內交聯的裂解，這接著又破壞患者體內由細胞表面識別并與其相關聯的必需的三-維結構。hGH的裂解或降解機理主要是由在溶解時蛋氨酸殘基的氧化作用或天冬氨酸殘基的脫酰胺作用協調，因此使蛋白失活。由于這種脆性，在本領域中對穩定和長時間起作用，并且不僅能通過皮下給藥而且能通過其它常規的劑量途徑，例如口部的、皮膚的和靜脈內的途徑給藥的hGH組合物或制劑存在需求。
許多商業上可獲得的hGH產品已經被開發以試圖解決這種需要。例如，Nutropin Depot是一種植入聚交酯-共乙交酯(PLG)微球體的可注射的重組人生長激素(rhGH)的懸浮液(參見http//www.gene.com)。除rhGH和PLG之外，微球體還包含乙酸鋅和碳酸鋅的成分。在給藥之前，固體物質必須用包含羧甲基纖維素鈉鹽、聚山梨酯、氯化鈉和水的水溶液重構。這種主要由聚合物組成的懸浮液每月給藥一次或兩次并要求用21量規的注射針頭進行注射。由于微球體的大小和產品的粘性，會發生不利的注射部位反應，導致小結、紅斑、疼痛、青舯、搔癢、脂肪萎縮和腫脹(參見http//www.genentech.com/gene/products/information/opportunistic/nutropin-depot/index.jsp)。
另一個已在開發中但隨后又被中止的hGH產品是AlbutropinTM，一種通過遺傳學的方法生產的長時間起作用的人白蛋白和人生長激素的融合蛋白(參見http//www.hgsi.com/products/albutropin.html)。據說這種產品在循環中表現出延長的半衰期，比可溶的天然的hGH的半衰期增加大約50％。AlbutropinTM代表性地在每星期的基礎上注射給藥，并且在被從身體內清除很久之后刺激IGF-1的水平。這種產品的生物效應與當前可利用的生長激素療法類似。
另一個已被開發的產品是Infitropin CRTM，一種由聚乙二醇-綴合的hGH分子構成的hGH制劑。這種綴合的hGH要求每星期注射一次并且據說是以連續的速率釋放，沒有明顯的突發效應[Ross等，J.Biol.Chem.，271(36)，21696-21977(1996)]。然而，這種產品已被停止。
美國專利5,981,485和6,448,225提到hGH的水制劑，該制劑據說不需要重構步驟并且每天注射給藥。這種制劑代表性地包含hGH，緩沖液，非離子型表面活性劑和選擇性地，中性的鹽，甘露糖醇，或者防腐劑。
各式各樣的其它藥物給藥技術，例如水凝膠[Katakam等，J.Controlled Release，49(1)，21-26(1997)]、脂質體、油乳劑和生物可降解聚合物微球體，已經被使用以試圖提供持續的hGH釋放。然而，得到的制劑表現出突發的藥物釋放，使用苛刻的條件并且其中的一些對制造來說是復雜的。這些對于基于DL-乳酸共羥基乙酸(PLGA)微球體技術的hGH制劑來說是尤其真實的，因為用于生產微球體的方法趨向使用一些條件例如提高的溫度、表面活性劑、有機溶劑、和水/有機溶劑界面，所有這些可引起蛋白變性[Herberger等，Proc.Intl.Symp.Controlled Release of Bioactive Materials，23，835-836(1996)；Kim等，Intl.J.Pharmaceutics，229(1-2)，107-116(2001)]。
上面描述的一些制劑要求hGH被貯藏在凍干狀態，這可能是一個費時的和貴的過程。美國專利5,780,599和6,117,984涉及到hGH的二價陽離子結晶和生產hGH二價陽離子結晶的方法，不需要冷凍干燥步驟。
盡管努力解決常規的hGH產品的缺點，包括貯藏和注射時的不穩定性、體內半衰期短、突發效應、缺乏口服生物利用度、和給藥困難和給藥頻率，但仍然存在改進hGH制劑的需要。為了滿足這種需要，本發明有利地提供生產穩定的、長時間起作用的hGH的人生長激素的結晶。
發明概述本發明涉及穩定的、長時間起作用的、方便的和患者友好的人生長激素或人生長激素衍生物的晶體。本發明進一步地提供人生長激素或人生長激素衍生物的晶體的組合物，包括它的藥物的可接受的組合物。本發明進一步地提供制備這類晶體，以及包含它們的組合物的方法。本發明的晶體和組合物被有利地用于治療具有障礙的個體的方法，所述障礙與人生長激素缺乏有關或通過用人生長激素治療而得到改善。
人生長激素或人生長激素衍生物的晶體，或者包含它們的組合物或制劑，有幾個優點，包括能夠每周給藥一次，立即可用的晶狀懸浮液形式，安全性，有效性，純度，穩定性，在短時間段內可再懸浮性和可注射性。鑒于本申請的公開內容，本領域的技術人員將理解本發明的其它目的，包括與常規的hGH制劑相比，hGH晶體和包含它們的組合物或制劑的改進。
附圖的簡單說明

圖1說明了如通過光學顯微術成像的，在860mM磷酸銨(pH8.9)存在下hGH晶體生長。見實施例1。
圖2說明了如通過光學顯微術成像的，在390mM檸檬酸鈉存在下hGH晶體生長。見實施例2。
圖3說明了如通過光學顯微術成像的，在600mM磷酸二鈉和100mM Tris-HCl(pH8.6)存在下hGH晶體生長。見實施例3。
圖4說明了如通過光學顯微術成像的，在85mM乙酸鈣和100mMTris-HCl(pH8.6)存在下hGH晶體生長以及與硫酸魚精蛋白(1mg/ml)共結晶。見實施例4。
圖5顯示了作為時間的函數并在280nm監測的，從磷酸銨、檸檬酸鈉、磷酸二鈉和乙酸鈣/魚精蛋白沉淀劑生成的hGH晶體的溶解度。見實施例5。
圖6說明了如通過光學顯微術成像的，在10％(v/v)異丙醇、85mM乙酸鈣和100mM Tris-HCl(pH8.6)存在下hGH晶體生長。見實施例6。
圖7說明了如通過光學顯微術成像的，在5％(v/v)異丙醇、85mM氯化鈣和100mM Tris-HCl(pH8.6)存在下hGH晶體生長。見實施例7。
圖8說明了如通過光學顯微術成像的，在10％(v/v)乙醇、10％(v/v)PEG-6000和100mM Tris-HCl(pH8.6)存在下hGH晶體生長。見實施例8。
圖9顯示了作為以分為單位的時間的函數，在280nm監測的，按照實施例6-8生成的hGH晶體的溶解度。見實施例9。
圖10說明了如通過光學顯微術成像的，在85mM乙酸鈣、2％(v/v)PEG-6000和100mM Tris-HCl(pH8.6)存在下hGH晶體生長。見實施例10。
圖11說明了如通過光學顯微術成像的，在500mM乙酸鈉、6％(v/v)PEG-6000和100mM Tris-HCl(pH8.6)存在下hGH晶體生長。見實施例11。
圖12說明了如通過光學顯微術成像的，在85mM氯化鈣、6％(v/v)PEG-6000和100mM Tris-HCl(pH8.6)存在下hGH晶體生長。見實施例12。
圖13說明了如通過光學顯微術成像的，在85mM乙酸鈣、6％(v/v)PEG-6000、100mM Tris-HCl(pH8.6)存在下hGH晶體生長和與硫酸魚精蛋白(1mg/ml)共結晶。見實施例13。
圖14說明了如通過光學顯微術成像的，在125mM乙酸鈣、6％(v/v)PEG-MME-6000和100mM Tris-HCl(pH8.6)存在下hGH晶體生長。見實施例14。
圖15顯示了作為以分為單位的時間的函數，在280nm監測的，按照實施例10-14生成的hGH晶體的溶解度。見實施例15。
圖16顯示了商業上的hGH(可溶的hGH)和按照實施例10制備的hGH(hGH晶體)在雌性Sprague-Dawley大鼠中的血清水平(ng/ml)，每只大鼠單次皮下給予2.5mg/kg劑量的可溶的或結晶hGH后，24小時內取樣。在t＝0，0.5，1，2，4，6，8，12和24小時測定血清水平。見實施例16。
圖17說明了在添加不同量的硫酸魚精蛋白后的hGH晶體(在85mM乙酸鈣、2％(v/v)PEG-6000和100mM Tris-HCl(pH8.6)存在下形成)的溶解特征。然后將這些不同的hGH晶體的制劑添加到溶解緩沖液中并在通過RP-HPLC測定上清液中可溶hGH的濃度(面積)前，允許放置1小時。見實施例17。
圖18A表明了如通過TEM縱長成像的，在500mM乙酸鈉、6％v/vPEG-6000和100mM Tris-HCl(pH8.6)存在下hGH晶體生長。見實施例18。
圖18B說明了如通過TEM橫切面成像的，在500mM乙酸鈉、6％v/vPEG-6000和100mM Tris-HCl(pH8.6)存在下hGH晶體生長。見實施例18。
圖19A顯示了組3-5和9的雌性Sprague-Dawley大鼠中hGH的血清水平(ng/ml)，每只大鼠七天內每天皮下給予或七天內單次皮下給予6.7mg/kg劑量的hGH后168小時內取樣(顯示的0-72小時)。見實施例22和表7-12。
圖19B顯示了每只大鼠七天內每天皮下給予(組2)或在七天的第一天單次皮下給予(組4和9)6.7mg/kg劑量的hGH后8天內，選擇制劑(組2、4和9)的雌性Sprague-Dawley大鼠的體重增加。見實施例22和表13。
圖20A顯示了雌性幼獼猴作為時間的函數的血清中hGH的濃度，按照表16，所述猴每天皮下給予可溶的hGH(組1)、與聚精氨酸絡合的hGH鈉晶體(組2)和與魚精蛋白絡合的hGH鈉晶體(組3)。見實施例23。
圖20B顯示了雌性幼獼猴作為時間的函數的血清中IGF-1的濃度，按照表18，所述猴每天皮下給予可溶的hGH(組1)、與聚精氨酸絡合的hGH鈉晶體(組2)和與魚精蛋白絡合的hGH鈉晶體(組3)。見實施例23。
圖21A顯示了雌性幼獼猴作為時間的函數的血清中hGH的濃度，按照表20，所述猴被每天皮下給予可溶的hGH(組1)、與魚精蛋白絡合的hGH鈉晶體(3∶1比率的hGH∶魚精蛋白)(組2)和與魚精蛋白絡合的hGH鈉晶體(2∶1比率的hGH∶魚精蛋白)(組3)。見實施例24。
圖21B顯示了雌性幼獼猴作為時間的函數的血清中IGF-1的濃度，按照表22，所述猴被每天皮下給予可溶的hGH(組1)、與魚精蛋白絡合的hGH鈉晶體(3∶1比率的hGH∶魚精蛋白)(組2)和與魚精蛋白絡合的hGH鈉晶體(2∶1比率的hGH∶魚精蛋白)(組3)。見實施例24。
圖22說明了雄性Wistar大鼠的七天生長，按照表25，所述大鼠被皮下給予對照(組1，七天內每天一次)、可溶的hGH(組4和5，七天內每天一次)和晶體hGH(組6、7、9和10，七天內一次)。見實施例25。
圖23說明了七天內每天誘導的雄性Wistar大鼠的體重增加(克)，按照表26，所述大鼠被皮下給予對照(組1，七天內每天一次)、可溶的hGH(組4和5，七天內每天一次)和晶體hGH(組6、7、9和10，七天內一次)。見實施例25。
本發明的詳細說明定義除非在此處有另外的定義，與本發明有關使用的的科學和技術術語應具有本領域普通技術人員一般理解的含義。此外，除非上下文的另外要求，單一的術語應包含復數的術語并且復數的術語應包括單一的術語。一般來說，與這里描述的柱色譜法、光學顯微術、UV-VIS分光術、藥物動力學分析、重組DNA方法、肽和蛋白質化學、核酸化學和分子生物學有關的專門用語和技術是眾所周知的和在本領域中通常使用的。
下列術語，除非另外指明，應被理解為具有下列含義術語“生長激素(GH)”通常指哺乳動物垂體腺分泌的生長激素。盡管沒有一個窮盡的列表，哺乳動物的例子包括人、猿、猴、大鼠、豬、狗、兔、貓、母牛、馬、小鼠、大鼠和山羊。根據本發明的一個優選的實施方案，哺乳動物是人。
“人生長激素(hGH)”表示一種具有天然的人生長激素的氨基酸序列、結構和功能特征的蛋白質。正如這里使用的，人生長激素(hGH)也包括天然的人生長激素的任何一種同種型，包括但不限于，分子質量為5、17、20、22、24、36和45kDa的同種型[Haro等，J.Chromatography B，720，39-47(1998)]。這樣，術語hGH包括天然hGH(促生長素)的191個氨基酸序列和包含N-末端蛋氨酸的192個氨基酸序列(Met-hGH)和人蛋氨生長激素[美國專利4,342,832和5,633,352]。hGH也可以通過從生物來源分離純化或通過重組DNA方法來獲得。如果通過重組DNA方法來制成，hGH被命名為重組人生長激素(rhGH)。Met-hGH代表性地是通過重組DNA方法制備的。
術語“人生長激素衍生物”指具有與自然存在的人生長激素可比較的氨基酸序列的蛋白質。術語“可比較的”指與hGH的191個氨基酸序列或Met-hGH的192個氨基酸序列有從2％到100％之間同源的氨基酸序列。在本發明的不同實施方案中，人生長激素衍生物包含hGH或Met-hGH的有機陽離子、生物合成的hGH或Met-hGH蛋白質的置換、缺失和插入的變異體、翻譯后修飾的hGH或Met-hGH蛋白質，包括脫酰胺作用、磷酸化作用、糖基化作用(glycoslylation)、乙酰化作用、聚合和酶裂解反應[Haro等，J.Chromatography B，720，39-47(1998)]，化學修飾的來自于生物來源的hGH或Met-hGH蛋白質、包含類似于hGH或Met-hGH的氨基酸序列的多肽類似物和化學合成肽。
用于制備hGH或Met-hGH的方法包括從生物來源中分離、重組DNA方法、合成化學途徑或它們的組合。迄今為止，編碼hGH的不同的DNA序列的基因包括hGH-N和hGH-V[Haro等，J.Chromatography B，720，39-47(1998)；Bennani-Baiti等，Genomics，29，647-652(1995)]。
術語“價”被定義為一種元素與其它元素結合的能力，它由在原子最外殼的電子數目決定并且表達為能夠結合(或替代)它的原子的氫(或者任何其它標準單價元素)的原子數[Webster′s New WorldDictionary of Science，Lindley，D.and Moore T.H.，Eds.，Macmillan，New York，New York，1998]。術語“一價陽離子”和“二價陽離子”指分別具有一價狀態或二價狀態的帶有正電荷的離子。具有不同價狀態的陽離子在自然界可以是有機的或者無機的。一價無機陽離子的例子包括銨(NH4+)和周期表組I元素(H+、Li+、Na+、K+、Rb+、Cs+和Fr+)，并且二價無機陽離子包括組II元素(Be+、Mg2+、Ca2+、Sr2+、Ba2+、Mn2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+、MO2+和Ra2+)。
“人生長激素或人生長激素衍生物的鈣晶體”指在二價鈣離子存在時已經被結晶的人生長激素或它的衍生物。二價鈣離子以鈣鹽的形式被導入結晶溶液。在優選的實施方案中，人生長激素或人生長激素衍生物的鈣晶體包含每個人生長激素或人生長激素衍生物的單體或單體鏈約1到約500個鈣分子。在一個更優選的實施方案中，人生長激素或人生長激素衍生物的鈣晶體包含每個人生長激素或人生長激素衍生物的單體或單體鏈約1到約140個鈣分子組成。
術語“鈣鹽”包括與鈣離子組成離子鍵的無機的和有機的反荷離子或者分子。不同鈣鹽的例子包括乙酸鈣水合物、乙酸鈣一水合物、乙酰丙酮化鈣水合物、L-抗壞血酸鈣二水合物、雙(6，6，7，7，8，8，8-庚氟-2，2-二甲基-3，5-辛二酮化)鈣、雙(2，2，6，6-四甲基-3，5-庚二酮化)鈣、溴化鈣、碳酸鈣、氯化鈣、二水氯化鈣、六水氯化鈣、氯化鈣水合物、檸檬酸鈣四水合物、磷酸二氫鈣、2-乙基己酸鈣、氟化鈣、葡萄糖酸鈣、氫氧化鈣、次氯酸鈣、碘酸鈣、碘化鈣、碘化鈣水合物、實電解質I鈣、鉬酸鈣、硝酸鈣、草酸鈣、草酸鈣水合物、氧化鈣、泛酸鈣、丙酸鈣、焦磷酸鈣和硫酸鈣。在本發明的一個優選的實施方案中，鈣鹽選自由乙酸鈣、氯化鈣、硫酸鈣和葡萄糖酸鈣組成的組。在一個更優選的實施方案中，鈣鹽是乙酸鈣。
“人生長激素或人生長激素衍生物的有機陽離子晶體”指在有機陽離子存在時已經被結晶的人生長激素。術語“有機陽離子”指帶正電荷的原子或包含碳的原予團。有機陽離子的例子包括季銨陽離子、四乙銨(TEA)、三丁基甲基銨(TBuMA)、普魯卡因酰胺ethobromide(PAEB)、疊氮基普魯卡因酰胺N-甲碘化物(APM)、右旋筒箭毒堿、二甲箭毒維庫溴銨(metocurine vecuronium)、羅庫溴銨、1-甲基-4-苯基吡啶鎓、膽堿和N-(4，4-axo-正戊基)-21-脫氧阿馬林(ajmalinium)(APDA)。
hGH商業上可以凍干形式得到并且代表性地通過重組DNA方法來生產。根據本發明，hGH的結晶通常通過制備hGH的緩沖溶液、純化和/或脫鹽、透析和濃縮溶液和向溶液中加入一價或二價陽離子或鹽來完成。后面的步驟導致結合的hGH有機或無機陽離子的形成。
本發明的一個優選的實施方案涉及hGH或hGH衍生物的一價陽離子晶體。在一個更優選的實施方案中，一價陽離子選自由鋰、鈉、鉀和銨組成的組。在一個最優選的實施方案中，一價陽離子是鈉。在一個最優選的實施方案中，人生長激素或人生長激素衍生物包含每個人生長激素或人生長激素衍生物的單體或單體鏈約從1到約500個一價陽離子分子。
術語“一價陽離子鹽”包括與一價離子組成離子鍵的無機的和有機的反荷離子或者分子。在一個優選的實施方案中，一價陽離子鹽是鈉鹽。在一個更優選的實施方案中，鈉鹽選自由檸檬酸鈉、磷酸鈉和乙酸鈉組成的組。在一個最優選的實施方案中，鈉鹽是乙酸鈉。
本發明的另一個優選的實施方案涉及hGH或hGH衍生物的魚精蛋白晶體。同樣地，也在另一個優選的實施方案中，本發明涉及hGH或hGH衍生物的聚精氨酸(polyarginine)晶體。
本發明的另外一個優選的實施方案包括與魚精蛋白或聚精氨酸結合或共結晶的hGH或hGH衍生物的一價或二價晶體。更優選地，晶體是與魚精蛋白或聚精氨酸絡合或共結晶的鈉晶體。
hGH的可溶形式可以用多種方法表征，包括反相高效液相色譜法(RP-HPLC)、大小排阻色譜法高效液相色譜法(SEC-HPLC)和疏水相互作用色譜法(HIC)[Wu等，J.Chromatography，500，595-606(1990)；″Hormone Drugs″，FDA publication，(1982)]。另一方面，hGH的晶狀形式可以用光學顯微術和X射線衍射表征。一般而言，結晶條件將決定蛋白晶體的形狀，也就是，選自由球狀、針狀、棒狀、盤狀(六角形的和正方形的)、菱形的、立方體、雙錐體和棱柱組成的組的形狀。
根據本發明，當用光學顯微術成像時，hGH或hGH衍生物的晶體形成棒狀或針狀的形態。在一個實施方案中，hGH或hGH衍生物的晶體形成長度在大約0.1到大約200μm之間的棒狀或針狀。在一個優選的實施方案中，hGH或hGH衍生物的晶體形成長度在大約3到大約100μm之間的棒狀或針狀。在一個更優選的實施方案中，hGH或hGH衍生物的晶體形成長度在大約10到大約25μm之間的棒狀或針狀。
本發明的另一個實施方案涉及包含hGH或hGH衍生物的鈣、一價陽離子、魚精蛋白或聚精氨酸晶體和藥物上可接受的賦形劑的組合物。也在另一個優選的實施方案中，hGH或hGH衍生物的晶體和賦形劑大約1∶250到大約1∶20摩爾比率的hGH∶賦形劑存在于這樣組合物中。在另一個可選擇的優選的實施方案中，hGH或hGH衍生物的晶體和賦形劑以大約3∶1到大約1∶10摩爾比率的hGH∶賦形劑存在。在還另一個優選的實施方案中，hGH或hGH衍生物的晶體和賦形劑以大約1∶10到大約1∶0.125摩爾比率的hGH∶賦形劑存在。在一個優選的實施方案中，hGH或hGH衍生物的晶體與乙酸鈉一起生長，它可能與聚精氨酸或魚精蛋白結晶或包被。
人生長激素或人生長激素衍生物的晶體可與任何藥物上可接受的賦形劑結合。根據本發明，“藥物上可接受的賦形劑”是在藥物組合物中使用的起填料或填料組合物作用的賦形劑。包括在該類別中的優選的賦形劑是1)氨基酸類，例如甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、脯氨酸；2)糖類，例如，單糖類例如葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、核糖；3)二糖類，例如乳糖、海藻糖、麥芽糖、蔗糖；4)多糖類，例如麥芽糖糊精、葡聚糖、淀粉、糖原；5)非環多羥醇類，例如甘露糖醇、木糖醇、乳糖醇、山梨糖醇；6)葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸；7)環糊精類，例如甲基環糊精、羥丙基-β-環糊精和類似物；8)無機分子類，例如氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、鈉和鉀的磷酸鹽、硼酸、碳酸銨和磷酸銨；9)有機分子類，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽、抗壞血酸鹽、乳酸鹽；10)乳化或增溶/穩定劑例如阿拉伯膠、二乙醇胺、甘油單硬脂酸酯、卵磷脂、單乙醇胺、油酸、油醇、泊洛沙姆、聚山梨酯、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸、失水山梨糖醇單月桂酸酯、失水山梨糖醇單硬脂酸酯、和其它失水山梨糖醇衍生物、聚烴氧基衍生物、蠟、聚氧化乙烯衍生物、失水山梨糖醇衍生物；和11)增加粘性試劑例如，瓊脂、海藻酸和它的鹽、瓜耳樹膠、果膠、聚乙烯醇、聚乙烯氧化物、纖維素和它的衍生物、碳酸丙烯、聚乙二醇、己二醇、泰洛沙泊。這些化合物的鹽也可以用。更優選的一組賦形劑包括蔗糖、海藻糖、乳糖、山梨糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、肌醇、鈉和鉀的鹽、例如乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽和硼酸鹽、甘氨酸、精氨酸、聚乙烯氧化物、聚乙烯醇、聚乙二醇、己二醇、甲氧基聚乙二醇、明膠、羥丙基-β-環糊精、聚賴氨酸和聚精氨酸。
在本發明的一個實施方案中，賦形劑選自由氨基酸、鹽、醇、糖類、蛋白質、脂類、表面活性劑、聚合物、聚氨基酸和它們的混合物組成的組。在一個優選的實施方案中，賦形劑選自由魚精蛋白、聚乙烯醇、環糊精、葡聚糖、葡萄糖酸鈣、聚氨基酸、例如聚精氨酸、聚賴氨酸和聚谷氨酸、聚乙二醇、dendrimers、聚鳥氨酸(polyorthinine)、聚乙烯亞胺、脫乙酰殼多糖和它們的混合物組成的組。在一個更優選的實施方案中，賦形劑選自由魚精蛋白、聚精氨酸、聚乙二醇和它們的混合物組成的組。
根據本發明，人生長激素或人生長激素衍生物的晶體也可以與載體或賦形劑結合，該載體或賦形劑是一種當將其加入一種治療劑時，可以加速或改進治療劑的作用的物質。[The On-Line MedicalDictionary，http//cancerweb.ncl.ac.uk/omd/index.html]。載體或賦形劑的例子包括，例如，緩沖劑物質、例如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、鹽或電解質、例如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、氯化鈉、鋅鹽、膠體硅、鎂、三硅酸鹽、纖維素基的物質和聚乙二醇。凝膠基質形式的載體或賦形劑可以包括，例如，羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯類、聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物、聚乙二醇和木蠟醇(wood wax alcohols)。
在還一個更優選的實施方案中，賦形劑是魚精蛋白。而且，hGH或hGH衍生物的晶體和魚精蛋白以大約5∶1到大約1∶10(w/w)比率的hGH∶魚精蛋白存在。這個比率也可以在大約10∶1到大約20∶1(w/w)之間。更優選，這個比率在大約12∶1到大約15∶1(w/w)之間。根據一個可選擇的實施方案，這個比率在大約3∶1到大約1∶10(w/w)之間。在另一個實施方案中，這個比率在大約5∶1到大約40∶1(w/w)之間。而且，在進一步的實施方案中，這個比率是大約5∶1(w/w)。
在本發明的另一方面，藥物上可接受的賦形劑選自由聚氨基酸，包括聚賴氨酸、聚精氨酸和聚谷氨酸組成的組。在本發明的一個優選的實施方案中，賦形劑是聚賴氨酸。在一個更優選的實施方案中，聚賴氨酸的分子量在大約1,500和大約8,000kD之間。在另一個實施方案中，hGH或hGH衍生物的晶體和聚賴氨酸以大約5∶1到大約40∶1比率的(w/w)hGH∶聚賴氨酸存在。這個比率也可以在大約10∶1到大約20∶1(w/w)之間。更優選，這個比率在大約12∶1到大約15∶1(w/w)之間。根據一個可選擇的實施方案，這個比率在大約5∶1到大約1∶50(w/w)之間。而且，在進一步的實施方案中，這個比率是大約5∶1(w/w)。
在本發明的還另一個優選的實施方案中，賦形劑是聚精氨酸。在一個更優選的實施方案中，聚精氨酸的分子量在大約15,000和大約60,000kD之間。在另一個實施方案中，hGH或hGH衍生物的晶體和聚精氨酸以大約5∶1到大約40∶1(w/w)比率的hGH∶聚精氨酸存在。這個比率也可以在大約10∶1到大約20∶1(w/w)之間。更優選，這個比率在大約12∶1到大約3∶1(w/w)之間。根據一個可選擇的實施方案，這個比率在大約5∶1到大約1∶50(w/w)的之間。在另一個實施方案中，這個比率在大約12∶1到大約15∶1(w/w)的范圍。而且，在進一步的實施方案中，這個比率是大約5∶1(w/w)。
根據本發明的一個實施方案包括含有大約20mg/ml hGH或hGH衍生物的晶體的一種可注射的晶狀懸浮液。這種懸浮液特征為容易再懸浮、慢沉淀和大約為7天的時間作用特征。它可以每周注射一次，用30量規的注射器并提供80％水平的有效負荷。如通過參數0.02％集聚(SE-HPLC)和2.3％相關蛋白質(RP-HPLC)反映的，該懸浮液是純的。這種純度在冷藏的條件下維持至少4個月。
本發明的一個實施方案涉及hGH或hGH衍生物的晶體，與常規的可溶hGH或hGH制劑相比，它們的特征為當置入個體時具有溶解延遲行為。根據本發明，hGH或hGH衍生物的晶體的溶解特征為體內或體外的溶解參數。例如，將體外溶解描述為在一個連續的溶解過程中，每15分鐘或每一洗滌步驟所得到的可溶hGH的濃度(表示為最初存在的總的hGH或hGH衍生物的晶體的百分比或者總的hGH或hGH衍生物的晶體的mg)(參見實施例5)。在本發明的一個實施方案中，hGH或hGH衍生物的晶體的特征表現為在溫度37℃時暴露于溶解緩沖液(50mM HEPES(pH7.2)，140mM NaCl，10mM KCl和0.02％(v/v)NaN3)時，每一洗滌步驟大約2到大約16％的所說晶體的體外溶解率，其中溶液中hGH或hGH衍生物的濃度以大約2mg/ml存在。在另一個實施方案中，hGH或hGH衍生物的晶體的特征表現為在一個連續的溶解過程中，每一洗滌步驟大約0.04到大約0.32mg的所說晶體的體外溶解率(參見實施例5)。另一方面，通過在單次注射hGH入哺乳動物后，哺乳動物體內隨時間的hGH血清水平描述體內溶解。
在哺乳動物體內，GH刺激組織合成和分泌IGF-1，一種依次在細胞分裂和新陳代謝過程中起作用的蛋白質。正如本領域技術人員將理解的，血清hGH和IGF-1水平取決于許多因素，包括生理學的和治療相關的因素。這樣的因素包括，但不限于生理學因素，例如出生年齡和骨年齡、性別、體重、發育階段(例如，在青春期增加的水平)和治療相關的因素，例如劑量、給藥的速率(動力學)和給藥途徑。同樣地，本領域技術人員將理解，從安全和功效的立場來看，對于不同的患者人群不同的hGH和IGF-1水平也可能是有益的。
患有多種hGH缺乏、疾病狀態或綜合征的成人或兒童可以通過用根據本發明的hGH晶體或hGH衍生物的晶體，通過多種外源性遞送的hGH的方案來治療。例如，內分泌學家可以用大約0.2mg/kg/周的劑量對兒童開始治療，經過幾個星期或幾個月的治療以后增加劑量到0.3mg/kg/周，在青春期左右，劑量可進一步增加到大約0.7mg/kg/周。正如本領域技術人員將理解的，這種外源性遞送的對需要hGH遞送的成人或兒童遞送hGH的水平也取決于hGH存在的生理水平或濃度。
成人和兒童的hGH劑量方案用mg/kg或國際單位(IU/kg)表示。這樣的方案通常按天或周排定，也就是，mg/kg/天或mg/kg/周。有這種考慮，根據本發明的一個實施方案，hGH或hGH衍生物的晶體，或包含這些晶體的組合物的單次給藥，例如，每30kg兒童每周單次給藥大約9mg，在給藥后第1和第2天提供體內hGH血清濃度大于大約10ng/ml，在給藥后第3和第4天體內hGH血清濃度大于大約5ng/ml和在給藥后第5和第7天體內hGH血清濃度大約0.3ng/ml。可選擇地，hGH或hGH衍生物的晶體，或包含這些晶體的組合物的單次給藥，在所說的哺乳動物中提供大約0.3ng/ml到大約2,500ng/ml hGH，優選大約0.5ng/ml到大約1,000ng/ml hGH，更優選大約從1ng/ml到大約100ng/ml hGH的體內hGH血清濃度，達給藥后大約0.5小時到大約40天，優選給藥后大約0.5小時到大約10天、7天或1天中的任一項。同樣地，hGH或hGH衍生物的晶體，或包含這些晶體的組合物的單次給藥，在所說的哺乳動物中提供大于大約2ng/ml hGH，優選大于大約5ng/ml hGH，更優選大于大約10ng/ml hGH的體內血清濃度，達給藥后大約0.5小時到大約40天，優選給藥后大約10天、7天或1天中的任一項。在本發明的一個更優選的實施方案中，hGH或hGH衍生物的晶體，或包含這些晶體的組合物的單次給藥，在所說的哺乳動物中提供大于大約0.3ng/ml hGH的體內血清濃度，達給藥后大約0.5小時到大約40天，優選給藥后10天、7天或1天中的任一項的任一階段。根據本發明的一個實施方案，hGH或hGH衍生物的晶體，或包含這些晶體的組合物的單次給藥，在給藥后第1和第2天提供體內hGH血清濃度大于大約10ng/ml，在給藥后第3和第4天體內hGH血清濃度大于大約5ng/ml和在給藥后第5和第7天體內hGH血清濃度大于大約0.3ng/ml。而且，在進一步的實施方案中，單次給藥hGH或hGH衍生物的晶體，或包含這類晶體的組合物，提供大于大約0.3ng/ml hGH的體內血清濃度，達給藥后約0.5小時至約10天。
按照本發明的一個實施方案，單次給藥hGH或hGH衍生物的晶體，或包含這類晶體的組合物，提供體內IGF-1血清升高，該血清升高在所述施用前的基線IGF-1水平以上，從施用后約10小時至約72小時大于約50ng/ml，以及從施用后約72小時至約15天，優選施用后約10天，在約0.5ng/ml至約50ng/ml之間。可替代地，單次給藥hGH或hGH衍生物的晶體，或包含這類晶體的組合物，提供約5ng/ml至約2,500ng/ml，優選約100ng/ml至約1,000ng/ml的體內IGF-1血清升高，達施用后約0.5小時至約40天，優選施用后約7天。可替代地，單次給藥hGH或hGH衍生物的晶體，或包含這類晶體的組合物，按照本發明可提供約50ng/ml以上，優選約100ng/ml以上的體內IGF-1血清升高，達施用后約0.5小時至約40天，優選施用后約7天。按照本發明的一個實施方案，單次給藥hGH或hGH衍生物的晶體，或包含這類晶體的組合物，提供體內IGF-1血清升高，該血清升高在所述施用前的基線IGF-1水平以上，從施用后約10小時至約72小時大于約50ng/ml，以及從施用后約72小時至約15天或施用后約72小時至約10天，在約0.5ng/ml至約50ng/ml之間。
按照本發明，將單次給藥定義為約0.01mg/kg/周至約100mg/kg/周hGH晶體或hGH衍生物晶體，或包含這類晶體的組合物，其中給藥的體積在0.1ml和約1.5ml之間。例如，可以以約0.3mg/kg/周，例如對于30kg兒童來說約9mg，用hGH晶體或hGH衍生物晶體，或包含這類晶體的組合物給藥兒童生長激素缺乏。可以以約0.375mg/kg/周，例如對于30kg兒童來說約11.25mg，用hGH晶體或hGH衍生物晶體，或包含這類晶體的組合物給藥特納綜合征。另外地，可以以約0.2mg/kg/周，例如對于80kg成人來說約16mg，用hGH給藥成人生長激素缺乏。可以以6mg/天，例如42mg/周，用hGH給藥AIDS消瘦疾病。
在本發明的還一個實施方案中，hGH晶體或hGH衍生物晶體，或包含這類晶體的組合物，在哺乳動物中顯示與可溶的hGH類似的相對生物利用度。與通過相同途徑遞送的可溶hGH的相對生物利用度比較，按照本發明的晶體具有至少50％或更大的相對生物利用度，其中對于所述可溶的hGH和所述晶體，通過總的體內hGH血清濃度的曲線下面積(AUC)測定所述生物利用度。因此hGH或hGH衍生物的晶體以有利的體內溶解速率為特征。
本發明進一步提供對具有障礙的哺乳動物給予hGH或hGH衍生物的晶體的方法，所述障礙與人生長激素缺乏有關或或通過用hGH治療得到改善。所述方法包括對哺乳動物給予治療有效量的hGH或hGH衍生物晶體的步驟。可替代地，所述方法包括對哺乳動物給予治療有效量的包含hGH或hGH衍生物晶體單獨或具有賦形劑的組合物的步驟。按照本發明的hGH或hGH衍生物晶體的不同實施方案是hGH或hGH衍生物的鈣晶體、一價晶體、魚精蛋白晶體或聚精氨酸晶體。可以通過每三天約一次、一周約一次、每兩周約一次或每月約一次的時間方案給予這樣的晶體，或包含它們的組合物。
可以按照本發明治療的與hGH缺乏有關的障礙包括，但不限于成人生長激素缺乏、兒童生長激素缺乏、普-威綜合征、特納綜合征、短腸綜合征、慢性腎功能不全、自發的短身材、侏儒癥、垂體功能減退侏儒癥、骨再生、雌性不育癥、宮內生長遲緩、AIDS有關的惡病質、局限性回腸炎、燒傷、以及其它遺傳和代謝障礙。在本發明的一個實施方案中，所述障礙是兒童生長激素缺乏并且在經歷治療的兒童中，治療導致約7cm和約11cm之間的每年生長速度。
在本發明的另一個實施方案中，hGH或hGH衍生物的鈣晶體在哺乳動物中可以作為骨治療，以及人生長激素缺乏的治療的有用輔助劑而起作用。
本發明還提供在哺乳動物中誘導體重增加的方法，該方法包括對所述哺乳動物給予治療有效量的hGH或hGH衍生物的晶體的步驟。可替代地，這類方法包括對所述哺乳動物給予治療有效量的包含hGH或hGH衍生物的晶體和賦形劑的組合物的步驟。在這類方法的一個實施方案中，在一周一次通過注射給予所述晶體后，在切除垂體的大鼠中誘導的體重增加在約5％和約40％之間。
hGH的晶體、hGH衍生物的晶體或包含它們單獨，或具有賦形劑的組合物可以單獨，或作為藥物、治療或預防制劑的部分被給予。可以通過任何常規給藥途徑包括，例如，胃腸外、口、肺、鼻、耳、肛門、皮膚、眼、靜脈內、肌內、動脈內、腹膜內、粘膜、舌下、皮下、透皮、局部、頰或顱內途徑給予它們。
在本發明的一個實施方案中，通過口途徑或胃腸外途徑給予hGH或hGH衍生物的晶體，或包含它們的組合物，有或沒有賦形劑。在優選的實施方案中，通過皮下或肌內途徑給予hGH或hGH衍生物的晶體，或包含它們的組合物，有或沒有賦形劑。
在優選的實施方案中，使用具有大于或等于27的量規的針，通過皮下途徑給予本發明的晶體或組合物。在本發明的一個實施方案中，所述針量規可以等于30。可以從預填充的注射器或變劑量輸注泵給予所述晶體或組合物。或者，通過無針注射給予它們。
本發明有利地允許hGH持續釋放到哺乳動物中。在一個實施方案中，一周約一次給予按照本發明的晶體或組合物。在另一個實施方案中，每兩周約一次給予按照本發明的晶體或組合物。在還另一個實施方案中，每月約一次給予按照本發明的晶體或組合物。本領域的技術人員將理解，具體治療方案將取決于因素例如將要治療的疾病、將要治療的患者的年齡和體重、患者的一般身體狀況和治療醫生的判斷。
根據一個實施方案，包含本發明hGH或hGH衍生物晶體的組合物以大于約0.1mg/ml的hGH濃度為特征。例如，所述濃度可以在約0.1mg/ml和約100mg/ml之間。或者，那些組合物可能以約1mg/ml和約100mg/ml之間或約10mg/ml和約100mg/ml之間的hGH濃度為特征。這樣的組合物還包括下列組分甘露糖醇—約0.5mg/ml至約100mg/ml；乙酸鈉—約5mM至約250mM(優選約25mM至約150mM)；Tris HCl-約5mM至約100mM；pH約6.0至約9.0(優選約6.5至約8.5)；PEG(MW800-8000，優選3350、4000、6000或8000)-0至約25％；魚精蛋白，優選3∶1比率的hGH∶魚精蛋白；以及聚精氨酸，優選5∶1比率的hGH∶聚精氨酸。這樣的組合物可以選擇性地包含蔗糖-0mg/ml至約100mg/ml；氨基酸(例如精氨酸和甘氨酸)-0mg/ml至約50mg/ml；防腐劑(抗微生物劑，苯酚，間甲酚(matacrescol)，苯甲醇，對羥基苯甲酸酯)-0％至約5％(優選0％至約0.9％)；以及聚山梨酯-0mg/ml至約10mg/ml。根據一個實施方案，按照本發明的組合物以80％有效載荷為特征。
按照本發明優選的制劑載體包含約100mM乙酸鈉、約5％PEG6000MW和約25mM Tris HCl，pH7.5。使用這樣的載體制備的hGH組合物可以包含約9.35mg/ml結晶hGH和約1.81mg/ml聚精氨酸(或約3.12mg/ml魚精蛋白)。如本領域的技術人員將理解的，假定按照本發明的組合物可以包含約1mg/ml至約100mg/ml hGH濃度，因此應該調整聚精氨酸(或魚精蛋白)的濃度，使得足以保持5∶1 hGH∶聚精氨酸(w/w)比率或3∶1hGH∶魚精蛋白(w/w)比率并且保持低溶解度和約5ng/ml的hGH的釋放。例如，對于上面描述的制劑，如果期望的hGH濃度是約20mg/ml，那么聚精氨酸(或魚精蛋白)濃度應該是約4mg/ml。
本發明進一步提供了制備hGH或hGH衍生物的晶體的方法。一種這樣的方法包括如下步驟(a)將人生長激素或人生長激素衍生物的溶液與結晶溶液混合，所述結晶溶液包含鹽和離子型聚合物；以及(b)在約4℃和約37℃之間的溫度下培育所述溶液大于約12小時，直到形成人生長激素或人生長激素衍生物的晶體為止。在另一個實施方案中，所述方法包括如下步驟(a)將人生長激素或人生長激素衍生物的溶液與結晶溶液混合，所述結晶溶液包含鹽和沉淀劑；以及(b)在約4℃和約37℃之間的溫度下培育所述溶液大于約16小時，直到形成人生長激素或人生長激素衍生物的晶體為止。在另一個實施方案中，上述任一種方法的步驟(b)中的溶液可以在約15℃的溫度下被培育大于約一周。在優選的實施方案中，hGH或hGH衍生物的晶體是鈣晶體、一價陽離子晶體、魚精蛋白晶體或聚精氨酸晶體并且離子型聚合物是魚精蛋白或聚精氨酸。在另一個實施方案中，離子型聚合物是聚賴氨酸或聚鳥氨酸(polyorthinine)。在還另一個實施方案中，離子型聚合物是魚精蛋白、聚精氨酸和聚賴氨酸中的任何兩種或更多種的混合物。
在上述方法的步驟(a)中的鹽可以是一價的也可以是二價的并且可以是無機的或有機的。優選的二價鹽的實施方案是鈣鹽。在更優選的實施方案中，鈣鹽選自由乙酸鈣、氯化鈣、葡糖酸鈣和硫酸鈣組成的組。在還更優選的實施方案中，鈣鹽是乙酸鈣。在另一個優選的實施方案中，一價陽離子選自由鋰、鈉、鉀和銨組成的組。在更優選的實施方案中，一價陽離子是鈉。
在本發明可替代的優選實施方案中，一價陽離子鹽是鈉鹽。在更優選的實施方案中，鈉鹽選自由檸檬酸鈉、磷酸鈉和乙酸鈉組成的組。在還更優選的實施方案中，鈉鹽是乙酸鈉。
在上述方法中，當所述鹽是鈣鹽或一價陽離子鹽時，它以約0.01mM和約1M之間的濃度存在于步驟(a)的結晶溶液中。在優選的實施方案中，該濃度在約25和約205mM之間。當所述鹽是鈣鹽時，它以約0.01mM和235mM之間的濃度存在于步驟(a)的結晶溶液中。
在優選的實施方案中，步驟(a)的結晶溶液進一步包含pH緩沖液。在更優選的實施方案中，緩沖液具有約pH6和約pH10之間的pH。在更優選的實施方案中，緩沖液的pH在約pH7.5和約pH10之間。在更優選的實施方案中，緩沖液的pH在約pH7.0和約pH10之間。在還更優選的實施方案中，緩沖液的pH在約pH6和約pH9之間。在還一個更優選的實施方案中，緩沖液的pH在約pH7.8和約pH8.9之間。
在上述方法的另一方面，步驟(a)中的緩沖液選自由Tris、HEPES、乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽、咪唑和甘氨酸組成的組。在上述方法的優選實施方案中，步驟(a)中的緩沖液選自由碳酸氫鹽、咪唑-蘋果酸鹽、甘氨酸、2，2-雙(羥基甲基)-2，2’，2”-次氮基三乙醇(“雙-tris”)、碳酸鹽、N-(乙酰氨基)-亞氨基二乙酸、2-氨基-2-甲基-1，3丙二醇和(N-(1-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸組成的組。
在上述方法之一中，用于制備hGH或hGH衍生物晶體的沉淀劑典型地是聚合的，包括低分子量聚醇和魚精蛋白。在本發明的另一個實施方案中，上述方法之一步驟(a)中的沉淀劑是非離子型聚合物。在優選的實施方案中，非離子型聚合物選自由醇、聚乙二醇(PEG)和聚乙烯醇或乙醇組成的組。在更優選的實施方案中，沉淀劑是異丙醇或乙醇。在還一個更優選選的實施方案中，PEG具有約200和約8000之間的分子量。PEG以具有3350、4000、6000或8000的分子量。在一個更優選選的實施方案中，PEG具有約6000的分子量。在還另一個優選的實施方案中，PEG以約0.5％和約12％w/v之間的濃度存在。
在上述方法之一的另一個實施方案中，步驟(a)中的沉淀劑是非離子型聚合物。在優選的實施方案中，非離子型聚合物選自由魚精蛋白、聚精氨酸、聚鳥氨酸和聚賴氨酸組成的組。
上述方法的混合步驟(a)包括將hGH或hGH衍生物的溶液與結晶溶液混合。在所述方法的一個實施方案中，得到的hGH或hGH衍生物在所述結晶溶液中的濃度在約1mg/ml和約1,000mg/ml之間。在優選的實施方案中，在所述溶液中的hGH或hGH衍生物以約2mg/ml和約50mg/ml之間的濃度存在。在進一步的實施方案中，在所述溶液中的hGH或hGH衍生物以約10mg/ml和約25mg/ml之間的濃度存在。
在上述制備hGH或hGH衍生物晶體的方法的優選實施方案中，在步驟(b)中在約33℃的溫度下培育包含hGH或hGH衍生物和結晶溶液的溶液達約0.25天至約兩天。可替代地，所述溫度可以是約37℃。在另一個實施方案中，在約25℃的溫度下培育包含hGH或hGH衍生物和結晶溶液的溶液達約0.25天至約兩天。在還另一個實施方案中，在約15℃的溫度下培育包含hGH或hGH衍生物和結晶溶液的溶液達約0.25天至約兩天。
本發明進一步提供了制備hGH晶體、hGH衍生物的晶體或包含這類晶體和賦形劑的組合物的替代方法。該方法包括如下步驟(a)將hGH或hGH衍生物的溶液與結晶緩沖液混合以產生結晶溶液；(b)向所述結晶溶液中添加去離子水；(c)向所述結晶溶液中添加離子型小分子或離子型聚合物；(d)向所述結晶溶液中添加鹽；以及(e)在約10℃和約40℃的溫度下培育所述結晶溶液約2至約168小時，直到形成hGH或hGH衍生物的晶體為止。在本發明的進一步實施方案中，所述培育進行約4至約48小時。在另一個優選的實施方案中，在上述方法的步驟(e)的結晶溶液，在約4℃和約40℃之間的溫度下被培育約4至約48小時，直到形成hGH或hGH衍生物的晶體為止。按照替代的實施方案，進行上述方法，在步驟(b)后具有任意的步驟。所述任意的步驟包括向所述結晶溶液中添加沉淀劑。在上述方法的進一步實施方案中，步驟(c)是任意的。不論是否使用那些任意的步驟，在優選的實施方案中，在約15℃和約37℃之間的溫度下培育步驟(e)的結晶溶液約1至約2天。在另一個優選的實施方案中，在約4℃和約37℃之間的溫度下培育步驟(e)的結晶溶液約1至約2天。
在按照本發明的優選實施方案中，在上述方法的步驟(d)中，所述鹽是鈣鹽或一價陽離子鹽。在優選的鈣晶體實施方案中，鈣鹽選自由乙酸鈣、氯化鈣、葡糖酸鈣和硫酸鈣組成的組。在還一個更優選的實施方案中，鈣鹽是乙酸鈣。在優選的實施方案中，乙酸鈣呈具有約3和約9.0之間的pH的水溶液形式。在更優選的實施方案中，乙酸鈣水溶液具有約7.0和約8.6之間的pH。在另一個實施方案中，在步驟(e)溶液中的乙酸鈣以約0.1mM和約205mM之間的濃度存在。在更優選的實施方案中，在步驟(e)結晶溶液中的乙酸鈣以約85mM和約100mM之間的濃度存在。
在更優選的實施方案中，一價陽離子鹽選自由鋰、鈉、鉀和銨組成的組。在還一個更優選的實施方案中，上述方法步驟(d)中的一價陽離子鹽是鈉。相似地，在更優選的實施方案中，一價陽離子鹽選自由檸檬酸鈉、磷酸鈉和乙酸鈉組成的組。在還一個更優選的實施方案中，一價陽離子鹽是乙酸鈉。在優選的實施方案中，乙酸鈉呈具有約3和約9.0之間的pH的水溶液形式。在更優選的實施方案中，乙酸鈉水溶液具有約7.0和約8.6之間的pH。在另一個實施方案中，在步驟(e)結晶溶液中的乙酸鈉以約0.5mM和約800mM之間的濃度存在。在更優選的實施方案中，在步驟(e)結晶溶液中的乙酸鈉以約100mM和約500mM之間的濃度存在。所述濃度也可以在約85mM和約100mM之間。
在還另一個優選的實施方案中，在上述方法步驟(e)結晶溶液中的hGH或hGH衍生物以約2mg/ml和約17.5mg/ml之間的濃度存在。在另一個優選的實施方案中，在上述方法步驟(e)結晶溶液中的hGH或hGH衍生物以約14.5mg/ml和約15.5mg/ml之間的濃度存在。在進一步的實施方案中，在步驟(e)結晶溶液中的hGH或hGH衍生物以約2mg/ml和約100mg/ml之間的濃度存在。
在優選的實施方案中，在上述方法步驟(a)的結晶緩沖液選自由Tris-HCl、HEPES、乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽、咪唑和甘氨酸組成的組。可替代地，結晶緩沖液選自由Tris-HCl、甘氨酸、HEPES、咪唑、雙-Tris、AMP(2-氨基-2甲基丙醇)、AMPD(2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇)、AMPSO(3-([1，1-二甲基-2-羥基乙基]氨基)-2-羥基丙烷磺酸)、N-二(羥乙基)甘氨酸、乙醇胺、glyclglycine、TAPS、牛磺酸(Taurin)、Triane和它們的混合物組成的組。在另一個優選的實施方案中，步驟(a)溶液中的結晶緩沖液以約10mM和約800mM之間的濃度存在。
在上述方法另一個實施方案中，步驟(a)中的結晶緩沖液以約3和約10之間的pH存在。在優選的實施方案中，結晶緩沖液以約6和約9之間的pH存在。在還另一個優選的實施方案中，結晶緩沖液以約7.5和約10之間的pH存在。
在另一個優選的實施方案中，上述方法步驟(e)溶液中的結晶緩沖液的pH在約3和約10之間。在更優選的實施方案中，溶液中的結晶緩沖液的pH在約6和約9.5之間。在還一個更優選的實施方案中，溶液中的結晶緩沖液的pH在約7.5和約9.5之間。
在那些包括向結晶溶液中添加沉淀劑的步驟(b)后的任意步驟的方法的優選實施方案中，所述沉淀劑是非離子型小分子或非離子型聚合物。在優選的實施方案中，非離子型聚合物選自由聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇、和它們的混合物組成的組。在另一個優選的實施方案中，PEG具有選自由約200和約8000之間、約6000、約4000、和約3350組成的組的分子量。在還另一個優選的實施方案中，PEG以約0.5％和約20％(w/v)之間的濃度存在于結晶溶液中。在上述方法的另一個優選實施方案中，沉淀劑選自由氨基酸、肽、聚氨基酸和它們的混合物組成的組。
在另一個優選的實施方案中，在上述方法的步驟(c)中，離子型聚合物選自由魚精蛋白、聚精氨酸、聚賴氨酸、聚鳥氨酸和八精氨酸(octarginine)組成的組。在另一個優選的實施方案中，在上述方法的步驟(c)中，以在5∶1和約1∶25之間的hGH∶聚精氨酸的比率添加聚精氨酸。在約15℃和約37℃之間的溫度下培育得到的結晶溶液達約16至約48小時。
本發明還提供了制備人生長激素的晶體、人生長激素衍生物的晶體或包含這類晶體和賦形劑的組合物的還另一種方法。該方法包括如下步驟(a)將人生長激素或人生長激素衍生物的溶液與結晶緩沖液混合以產生結晶溶液；(b)向所述結晶溶液中添加去離子水；(c)向所述結晶溶液中添加沉淀劑；(d)向所述結晶溶液中添加鹽；(e)在約10℃和約40℃之間的溫度下培育所述結晶溶液約2至約168小時，直到形成人生長激素或人生長激素衍生物的晶體為止，以及(f)向所述人生長激素或人生長激素衍生物的晶體中添加離子型聚合物。按照上述方法的一個實施方案，步驟(f)是任意的。在優選的實施方案中，在約15℃和約37℃之間的溫度下，培育步驟(e)的結晶溶液達約一至約兩天。在另一個優選的實施方案中，在約4℃和約37℃之間的溫度下，培育步驟(e)的結晶溶液達約一至約兩天。在本發明的進一步實施方案中，所述培育進行約2至約48小時。在另一個優選的實施方案中，在約4℃和約40℃之間的溫度下，培育上述方法步驟(e)的結晶溶液達約4至約48小時，直到形成hGH或hGH衍生物的晶體為止。
在按照本發明的優選實施方案中，在上述方法的步驟(d)中，所述鹽是鈣鹽或一價陽離子鹽。在更優選的實施方案中，所述鈣鹽選自由乙酸鈣、氯化鈣、葡糖酸鈣和硫酸鈣組成的組。在還一個更優選的實施方案中，所述鈣鹽是乙酸鈣。在優選的實施方案中，乙酸鈣呈具有約3和約9.0之間的pH的水溶液形式。在更優選的實施方案中，乙酸鈣水溶液具有約7.0和約8.6之間的pH。在另一個實施方案中，在步驟(e)結晶溶液中的乙酸鈣以約0.1mM和約205mM之間的濃度存在。在更優選的實施方案中，在步驟(e)結晶溶液中的乙酸鈣以約85mM和約100mM之間的濃度存在。
在更優選的實施方案中，一價陽離子選自由鋰、鈉、鉀和銨組成的組。在還一個更優選的實施方案中，一價陽離子是鈉。相似地，在更優選的實施方案中，一價陽離子鹽選自由檸檬酸鈉、磷酸鈉合乙酸鈉組成的組。在還一個更優選的實施方案中，一價陽離子鹽是乙酸鈉。在優選的實施方案中，乙酸鈉呈具有約3和約9.0之間的pH的水溶液形式。在更優選的實施方案中，乙酸鈉水溶液具有約7.0和約8.6之間的pH。在另一個實施方案中，在步驟(e)溶液中的乙酸鈉以約0.5mM和約800mM之間的濃度存在。在更優選的實施方案中，在步驟(e)結晶溶液中的乙酸鈣以約100mM和約500mM之間的濃度存在。可替代地，所述濃度還可以在約85mM和約100mM之間。
在還另一個實施方案中，在上述方法的步驟(e)結晶溶液中的hGH或hGH衍生物以約2mg/ml和約17.5mg/ml之間的濃度存在。在另一個優選的實施方案中，在步驟(e)結晶溶液中的hGH或hGH衍生物以約14.5mg/ml和約15.5mg/ml之間的濃度存在。在進一步的實施方案中，在上述方法的步驟(e)結晶溶液中的hGH或hGH衍生物以約2mg/ml和約100mg/ml之間的濃度存在。
在優選的實施方案中，上述方法的步驟(a)的結晶緩沖液選自由Tris-HCl、HEPES、乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽、咪唑和甘氨酸組成的組。在另一個優選的實施方案中，步驟(a)溶液中的結晶緩沖液以約10mM和約800mM之間的濃度存在。
在上述方法的另一個實施方案中，步驟(a)中的結晶緩沖液以約3和約10之間的pH存在。在優選的實施方案中，結晶緩沖液以約6和約9之間的pH存在。在還另一個優選的實施方案中，結晶緩沖液以約7.5和約10之間的pH存在。
在另一個優選的實施方案中，上述方法步驟(e)溶液中結晶緩沖液的pH在約3和約10之間。在更優選的實施方案中，溶液中結晶緩沖液的pH在約6和約9.5之間。在還一個更優選的實施方案中，溶液中結晶緩沖液的pH在約7.5和約9.5之間。
在優選的實施方案中，在上述方法步驟(c)中，沉淀劑是非離子型小分子或非離子型聚合物。在優選的實施方案中，非離子型聚合物選自由聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇和它們的混合物組成的組。在另一個優選的實施方案中，PEG具有選自由約200和約8000之間、約6000、約4000和約3350組成的組的分子量。在還另一個優選的實施方案中，PEG以約0.5％合約20％(w/v)的濃度存在于結晶溶液中。在另一個優選的實施方案中，在上述方法步驟(c)中，沉淀劑選自由氨基酸、肽、聚氨基酸和它們的混合物組成的組。
在另一個優選的實施方案中，在上述方法步驟(f)中，離子型聚合物選自由魚精蛋白、聚精氨酸、聚賴氨酸、聚鳥氨酸和八精氨酸組成的組。在另一個優選的實施方案中，在上述方法步驟(f)中，以約5∶1和約1∶25之間的hGH∶聚精氨酸(mg∶mg)比率添加聚精氨酸。在替代的實施方案中，以約1∶5和約1∶25之間的hGH∶聚精氨酸(mg∶mg)比率添加聚精氨酸。在約15℃和約37℃之間的溫度下培育得到的步驟(f)中的溶液達約16至約48小時。通過完全溶解所需的洗滌次數反映聚合物對hGH或hGH衍生物的晶體溶解速率的影響。對于完全溶解，對照晶體需要約7至約13次洗滌，而對于完全溶解，用聚精氨酸制備的晶體需要約30至90次之間的溶解緩沖液的相同洗滌。洗滌是連續溶解過程中的洗滌步驟(見實施例5)。
在上述方法中任一種的替代實施方案中，鈣鹽或一價陽離子鹽可以以約0.01M和約1M之間或約25mM和約205mM之間的濃度存在于結晶溶液中。在上述方法中任一種的替代實施方案中，培育結晶溶液，時間和溫度選自由在約33℃的溫度下，約0.25天至約兩天；在約25℃的溫度下，約0.25天至約兩天和在約15℃的溫度下，約0.25天至約兩天組成的組。
本發明還包括篩選用于治療制劑中的hGH或hGH衍生物的晶體的方法。這類方法的步驟包括(1)在37℃的溫度下用溶解緩沖液洗滌所述hGH或hGH衍生物的晶體(例如，2mg的晶體和1ml的溶解緩沖液)和(2)測定在所述溶解緩沖液中每次洗滌的所述hGH或hGH衍生物的晶體的體外溶解速率，其中所述晶體的所述體外溶解速率是在約10分鐘和約1500分鐘之間，約2％和約16％之間的所述晶體，在連續溶解過程中的每次洗滌步驟約2分鐘至約32分鐘(見實施例5)。所述晶體的體外溶解速率還可以是約15分鐘內約4％和約10％之間的所述晶體或者約15分鐘內約0.04和約0.32mg之間的所述晶體。
為了更好地理解本發明，陳述下面的實施例。這些實施例僅為舉例說明的目的，不應被解釋為以任何的方式限制本發明的范圍。
實施例在下面陳述的實施例中使用了以下材料。
材料商業上可獲得的重組人生長激素(rhGH)來自BresaGen Ltd.(Thebarton，Australia)，具有4000或6000(PEG-4000或PEG-6000)平均分子量的聚乙二醇來自Hampton Research(Laguna Niguel，California)以及硫酸魚精蛋白購自Fisher from ICN BiomedicalsInc.(Pittsburgh，PA)。磷酸銨、Tris-HCl、檸檬酸鈉、磷酸二鈉、乙酸鈣、氯化鈣、乙酸鋅、HEPES、氯化鈉、氯化鉀、疊氮化鈉、異丙醇(IPA)、乙醇和聚乙二醇單甲基醚各自從Fisher(Pittsburgh，PA)獲得。Sprague-Dawley大鼠從Charles River Laboratories(Worcester，MA)或從Biomedical Research Labora tories，Inc.(Worcester，MA)獲得。聚精氨酸從Sigma(St.Louis)獲得。
分析技術和試驗反相高效液相色譜法。在裝備有C5，5cm×4.6mm，3μm柱(Supelco，Bellefonte，PA)的Agilent 1100系列HPLC(Palo Alto，CA)上獲得反相高效液相色譜(RP-HPLC)。將樣品溶解在溶解緩沖液(50mM HEPES pH7.2，140mM NaCl，10mMKCl和0.02％(v/v)NaN3)中并在注射前過濾(0.2μm)。使用溶劑A和B的梯度方法在214和280nm監測洗脫曲線。溶劑A由99.9％去離子水/0.1％TFA組成。溶劑B由99.9％乙腈/0.1％TFA組成。所有化學物質都是HPLC級的，從Fisher獲得。使用0-2分鐘40-50％B，2-12分鐘50-60％B，和12-1560-85％B的梯度，進行洗脫15分鐘。通過運行維持1ml/min的流速和35℃的柱溫。使用Agilent化學工作站軟件(Palo Alto，CA)分析數據。
使用溶劑A(99.9％去離子水/0.1％TFA)和B(99.9％乙腈/0.1％TFA)的梯度方法測定樣品制劑中的魚精蛋白或聚精氨酸的濃度。使用0-2.5分鐘95∶5(A∶B)，2.5-7.5分鐘65∶35(A∶B)，7.5-15.5分鐘25∶75(A∶B)，15.5-17.0分鐘25∶75(A∶B)，17-17.1分鐘95∶5(A∶B)的梯度設計，以1ml/min的流速進行洗脫20分鐘。在6.2分鐘獲得典型的魚精蛋白或聚精氨酸的洗脫，在14分鐘洗脫出完整的hGH。在213nm測定AUC計算。由標準曲線計算魚精蛋白和/或聚精氨酸添加劑的含量(mg/ml)，所述標準曲線由各添加劑的每個生成。可以使用這一相同的方法來分析從絡合物中釋放的賦形劑。
用分開但相似的反相方法測定有關降解的hGH。例如，在C5Supelco Discovery Bio Wide Pore柱(5cm×4.6mm，3μm粒徑，30nm孔徑)上進行分析，在整個運行中維持37℃的恒溫器溫度。使用具有流動相A(20％ACN，80％H2O，0.1％TFA)和流動相B(20％ACN，80％2-propanol，01.％TFA)的梯度方法監測洗脫曲線。梯度系統在0至5分鐘內從20％變化至45％B，在5至15分鐘內從45％變化至55％B，在15至15.1分鐘內從55％變化至90％B，90％B固定直到17分鐘并且在這一步驟后，重建立20％B直至達到20分鐘。
大小排阻色譜法。在裝備有TSK-Gel G2000SWXL柱(part#；08450，Tosoh Biosep LLC，Montgomeryville，PA)(7.8mm×30cm，5μm)和Agilent 1100系列MWD(UV)的Agilent 1100系列HPLC(Palo Alto，CA)上獲得高效大小排阻色譜(SEC-HPLC)。將樣品溶解在0.2ml溶解緩沖液中并在注入Agilent 1100系列溫度控制自動加樣器前用0.2μm過濾。在214和280nm監測洗脫曲線，流動相為50mM Tris-HCl，150mM Nacl，0.05％NaN3，pH7.5。維持柱溫在25℃，使用Agilent 1100系列脫氣器將溶劑脫氣。
UV-VIS吸收和光學顯微術。在Beckman Coulter Inc.，Fullerton，CA的Beckman DU 740分光光度計上獲得UV-VIS分光光譜。通過使用Olympus BX-51顯微鏡的明視場成像并用Sony DXC-970MD 3CCD彩色數字視頻照相機獲得在放大40x至400x下光學顯微照片，使用Media Cybernetics L.P.，Silver Springs，Maryland的Image-Pro軟件。
透射電鏡術(TEM)。TEM分析進行如下。用水洗滌母液中的hGH晶體懸浮液兩次以除去過量的母液然后用0.5％乙酸雙氧鈾陰性染色1小時。將染色的hGH晶體懸浮液(1-5μL)轉移到銅TEM柵極上。過量的液體流掉(wicked away)并且短暫地空氣干燥樣品柵極。將TEM柵極轉移到JEOL 1210透射電子顯微鏡的樣品載物臺上并使用80KV電子束收集圖像。在晶體內觀察到組織非常好的點陣結構，具有與晶體棱柱軸成一直線的定向。
實施例1用磷酸銨結晶hGH。首先將商業上可獲得的hGH(50mg)溶解在15ml Tris-HCl(10mM，pH8.0)中并使用具有10,000分子量切割值(cut off)(MWCO)的Pierce透析儀筒對著2×4000ml Tris-HCl(10mM，pH8.0)進行透析。通過使用Millipore濃縮器(MWCO10,000)在4000rpm離心20-30分鐘調節蛋白質濃度。如在280nm/0.813(1mg/ml hGH A280＝0.813吸收單位)通過吸收測量的，發現hGH的濃度在30-45mg/ml的范圍內。向溶液中加入去離子水以產生10-20mg/ml的終蛋白質濃度。通過向溶液中添加磷酸銨(NH4H2PO4)(2.5M；pH8.9)以致獲得860mM NH4H2PO4的終濃度，生成hGH的晶體。然后在25℃下培育溶液16小時。獲得針狀晶體并通過光學顯微術成像。發現獲得的晶體長度為大約8至15μm，結晶收率大于90％。見圖1。
實施例2用檸檬酸鈉結晶hGH。按照實施例1中所述，純化并濃縮商業上可獲得的hGH。向濃縮的hGH溶液中加入去離子水以產生17.5mg/ml的終蛋白質濃度。通過向溶液中添加檸檬酸鈉(1.5M)，以致獲得390mM檸檬酸鈉的終濃度，生成hGH的晶體。不需要pH調節，除已經在10mM Tris-HCl中的hGH外。然后在25℃下培育溶液16小時。獲得針狀晶體并通過光學顯微術成像。發現獲得的晶體長度小于8μm，結晶收率大于85％。見圖2。
實施例3用磷酸鈉結晶hGH。按照實施例1中所述，純化并濃縮商業上可獲得的hGH。向濃縮的hGH溶液中加入去離子水以產生12.5-17.5mg/ml的終蛋白質濃度。添加Tris-HCl(1M，pH8.6)至100mM的終濃度。通過向溶液中添加磷酸氫二鈉(Na2HPO4)(1M)生成hGH的晶體，以致獲得600mM Na2HPO4的終濃度。然后在25℃下培育溶液16小時。獲得針狀晶體并通過光學顯微術成像。發現獲得的晶體長度在5和25μm之間，結晶收率大于75％。見圖3。
實施例4用乙酸鈣和硫酸魚精蛋白結晶hGH。按照實施例1中所述，純化并濃縮商業上可獲得的hGH。向濃縮的hGH溶液中加入去離子水以產生15mg/ml的終蛋白質濃度。添加Tris-HCl(1M，pH8.6)至100mM的終濃度。向溶液中，添加硫酸魚精蛋白至1mg/ml的終濃度。通過向溶液中添加乙酸鈣(1M)，以致獲得85mM乙酸鈣的終濃度，生成hGH的晶體。然后在37℃下培育溶液8小時。獲得針狀晶體并通過光學顯微術成像。發現獲得的晶體長度小于20μm，結晶收率大于70％。見圖4。
實施例5由鹽誘導結晶制備的hGH晶體的溶解度特征。培育實施例1-4中的結晶溶液后，沉淀晶體并除去余下的上清液。通過吸移或渦旋將晶體沉淀塊(0.4mg)重懸浮在0.200ml溶解緩沖液(50mM HEPES(pH7.2)，140mM NaCl，10mM KCl和0.02％(v/v)NaN3)中，然后在37℃平衡約15分鐘。然后在10,000xg離心樣品約2分鐘并且完全除去上清液用于通過RP-HPLC、SEC-HPLC或UV-VIS在280nm測量的蛋白質濃度測定。進一步將晶體沉淀塊重懸浮在0.200ml溶解緩沖液中并重復上述過程直到在上清液中測量不到可檢測的蛋白質。這一過程被稱為連續溶解。
圖5顯示了在上述實施例1-4中用一價(Na或NH4)或二價(Ca)鹽制備的不同hGH晶體的作為以分鐘為單位的時間函數的溶解度行為。hGH溶解被以衍生自RP-HPLC的累積百分比釋放作圖，其中使用UV-VIS分光光度計以mg/ml測量蛋白質樣品的AUC值。數據說明，通過添加390mM檸檬酸鈉制備的hGH晶體在60分鐘后完全溶解。另外，通過添加600mM Na2HPO4或860mM NH4H2PO4制備的hGH晶體分別在60或75分鐘后完全溶解。另一方面，通過添加85mM乙酸鈣和硫酸魚精蛋白制備的hGH晶體在390分鐘后完全溶解(見下表1)。
表1.在280nm測量的hGH鹽在溶解緩沖液中的連續溶解試驗—將蛋白質濃度表示為釋放總計的百分比


實施例6用乙酸鈣和10％異丙醇結晶hGH。按照實施例1中所述，純化并濃縮商業上可獲得的hGH。向濃縮的hGH溶液中加入去離子水以產生15mg/ml的終蛋白質濃度。添加Tris-HCl(1M，pH8.6)至100mM的終濃度。通過向溶液中添加乙酸鈣(1M)，以致獲得85mM乙酸鈣的終濃度，生成hGH的晶體。向該溶液中，添加10％(v/v)異丙醇(IPA)。然后在25℃下培育溶液16小時。獲得棒狀晶體并通過光學顯微術成像。發現獲得的晶體長度在大于100μm，結晶收率大于85％。見圖6。
實施例7用氯化鈣和5％異丙醇結晶hGH。按照實施例1中所述，純化并濃縮商業上可獲得的hGH。向濃縮的hGH溶液中加入去離子水以產生15mg/ml的終蛋白質濃度。添加Tris-HCl(1M，pH8.6)至100mM的終濃度。通過向溶液中添加氯化鈣(CaCl2)(1M)，以致獲得85mM氯化鈣的終濃度，生成hGH的晶體。向該溶液中，添加5％(v/v)異丙醇(IPA)。然后在25℃下培育溶液16小時。獲得棒狀晶體并通過光學顯微術成像。發現獲得的晶體長度在大于200μm，結晶收率大于85％。見圖7。
實施例8用10％PEG-6000和10％乙醇結晶hGH。按照實施例1中所述，純化并濃縮商業上可獲得的hGH。向濃縮的hGH溶液中加入去離子水以產生25mg/ml的終蛋白質濃度。添加Tris-HCl(1M，pH8.6)至100mM的終濃度。通過向溶液中添加10％(v/v)PEG-6000和10％(v/v)乙醇(EtOH)生成hGH的晶體。然后在37℃下培育溶液16小時。獲得棒狀晶體并通過光學顯微術成像。發現獲得的晶體長度小于25μm，結晶收率大于70％。見圖8。
實施例9用醇制備的hGH晶體的溶解度特征。培育實施例6-8中制備的結晶溶液后，沉淀晶體并除去余下的上清液。通過吸移或渦旋將晶體沉淀塊重懸浮在0.200ml溶解緩沖液(見實施例5)中，然后在37℃平衡約15分鐘。然后在10,000xg離心樣品2分鐘并且除去上清液用于通過RP-HPLC、SEC-HPLC或UV-VIS在280nm測量的蛋白質濃度測定。hGH溶解被測量為累積百分比并衍生自AUC值或UV-VISmg/ml測量值。進一步將晶體沉淀塊重懸浮在溶解緩沖液中并重復上述過程直到在上清液中測量不到可檢測的蛋白質。
圖9和表2說明了用10％IPA/85mM乙酸鈣、5％IPA/85mM氯化鈣和10％乙醇/10％PEG-6000制備的hGH晶體作為以分為單位的時間函數的溶解度行為。結果證實，通過添加390mM檸檬酸鈉制備的hGH晶體在60分鐘后完全溶解。另外，通過添加10％IPA/85mM乙酸鈣制備的hGH晶體在150分鐘后完全溶解，而通過添加5％IPA/85mM氯化鈣和10％乙醇/10％PEG-6000制備的hGH晶體分別在120分鐘和135分鐘后完全溶解。
表2.用乙醇制備的hGH晶體的體外溶解結果(實施例6-8)—蛋白質濃度在280nm進行測量并被表示為釋放總量的百分比

實施例10用乙酸鈣和2％PEG-6000結晶hGH。按照實施例1中所述，純化并濃縮商業上可獲得的hGH。向濃縮的hGH溶液中加入去離子水以產生15mg/ml的終蛋白質濃度。添加Tris-HCl(1M，pH8.6)至100mM的終濃度。向該溶液中添加2％(v/v)PEG-6000。通過向溶液中添加乙酸鈣(1M)，以致獲得85mM乙酸鈣的終濃度，生成hGH的晶體。然后在25℃下培育溶液16小時。獲得針狀晶體并通過光學顯微術成像。發現獲得的晶體長度在約25和約75μm，結晶收率大于85％。見圖10。
實施例11
用乙酸鈉和6％PEG-6000結晶hGH。按照實施例1中所述，純化并濃縮商業上可獲得的hGH。向濃縮的hGH溶液中加入去離子水以產生15mg/ml的終蛋白質濃度。添加/Tris-HCl(1M，pH8.6)至100mM的終濃度。向該溶液中，添加6％(v/v)PEG-6000。通過向溶液中添加乙酸鈉(1M)，以致獲得500mM乙酸鈉的終濃度，生成hGH的晶體。然后在25℃下培育溶液16小時。獲得針狀晶體并通過光學顯微術成像。發現獲得的晶體長度在約25和約75μm，結晶收率大于85％。見圖11。
實施例12用氯化鈣和6％PEG-6000結晶hGH。按照實施例1中所述，純化并濃縮商業上可獲得的hGH。向濃縮的hGH溶液中加入去離子水以產生15mg/ml的終蛋白質濃度。添加Tris-HCl(1M，pH8.6)至100mM的終濃度。向該溶液中，添加6％(v/v)PEG-6000。通過向溶液中添加CaCl2(1M)，以致獲得85mM CaCl2的終濃度，生成hGH的晶體。然后在25℃下培育溶液16小時。獲得針狀晶體并通過光學顯微術成像。發現獲得的晶體長度在大于100μm之間，結晶收率大于90％。見圖12。
實施例13用乙酸鈣、6％PEG-6000和硫酸魚精蛋白結晶hGH。按照實施例1中所述，純化并濃縮商業上可獲得的hGH。向濃縮的hGH溶夜中加入去離子水以產生15mg/ml的終蛋白質濃度。添加Tris-HCl(1M，pH8.6)至100mM的終濃度。向該溶液中，添加硫酸魚精蛋白(1mg/ml)和6％PEG-6000(v/v)。通過向溶液中添加乙酸鈣(1M)，以致獲得85mM乙酸鈣的終濃度，生成hGH的晶體。然后在37℃下培育溶液16小時。獲得針狀晶體并通過光學顯微術成像。發現獲得的晶體長度小于25μm，結晶收率大于70％。見圖13。
實施例14
用乙酸鈣和6％PEG-MME-5000結晶hGH。按照實施例1中所述，純化并濃縮商業上可獲得的hGH。向濃縮的hGH溶液中加入去離子水以產生15mg/ml的終蛋白質濃度。添加Tris-HCl(1M，pH8.6)至100mM的終濃度。向該溶液中，添加聚乙二醇單甲基醚(PEG-MME-500)。通過向溶液中添加乙酸鈣(1M)，以致獲得125mM乙酸鈣的終濃度，生成hGH的晶體。然后在25℃下培育溶液16小時。獲得針狀晶體并通過光學顯微術成像。發現獲得的晶體長度小于50μm，結晶收率大于90％。見圖14。
實施例15用聚乙二醇制備的hGH晶體的溶解度特征。培育實施例10-14中制備的結晶溶液后，沉淀晶體并除去余下的上清液。通過吸移或渦旋將晶體沉淀塊重懸浮在0.2ml溶解緩沖液(見實施例5)中，然后在37℃平衡約15分鐘。然后在10,000xg離心樣品2分鐘并且除去上清液用于通過RP-HPLC、SEC-HPLC或UV-VIS在280nm測量的蛋白質濃度測定。進一步將晶體沉淀塊重懸浮在溶解緩沖液中并重復上述過程直到在上清液中測量不到可檢測的蛋白質。
圖15和表3說明了用2％PEG-6000/85mM乙酸鈣、6％PEG-6000/500mM乙酸鈉、6％PEG-6000/85mM CaCl2、6％PEG-6000A/85mM乙酸鈣/魚精蛋白和6％PEG-MME-5000/125mM乙酸鈣制備的hGH晶體作為以分為單位的時間的函數的溶解度行為。hGH溶解被測量為累積百分比并衍生自AUC值或UV-VISmg/ml測量值。結果證實，通過添加6％PEG-6000/85mM乙酸鈣/魚精蛋白制備的hGH晶體溶解最慢，在495分鐘后出現完全溶解。添加2％PEG-6000/85mM乙酸鈣晶體的其它晶體在300分鐘時溶解或者其它hGH晶體在更少時間內溶解。
表3.在280nm測量的PEG和hGH鹽在溶解緩沖液中的連續溶解試驗—蛋白質溶度被表示為釋放總量的百分比

實施例16使用Sprague-Dawley大鼠的藥物動力學研究。皮下給予24只雌性Sprague-Dawley大鼠2.5mg/kg劑量的可溶的(商業上可獲得的)或晶體(85mM乙酸鈣/2％PEG-6000)hGH(按實施例10中所述的制備)懸浮液。每只大鼠的平均體重為200克。將所述24只大鼠分成兩組。每組包括各含4只大鼠的3個組的子系統。在每個子系統中以三個特定的時間點經由頸靜脈導管植入物收集出血。由于在給定時間點能夠抽取的血液的量有限，使用跳步(leap frog)設計。為了保持動物的穩定性，組內的動物子系統在注釋的時間點出血。然后編輯血清樣品以形成線性進展的時間線(timeline)。通過在給定時間點子系統內血清水平與所述子系統的平均值的變異測定標準離差。見表4-6。在表4-5中，指定的動物1-12接受可溶的hGH并且動物13-24接受結晶的hGH，每只動物的劑量為500μg。
圖16說明了可溶的和結晶的hGH的作為時間的函數的血清中hGH的水平。結晶hGH的半衰期幾乎比可溶hGH的半衰期高19倍。對結晶的hGH來說，血清中出現最大hGH的時間是4小時，而對可溶的hGH來說是0.5小時。假定以5.5mg/ml的濃度，等于2.2mg/kg的劑量，用可溶的hGH或結晶的hGH處理大鼠的組和子系統，表6中如下所列的Cmax值顯示，與相同的可溶劑量比較，以晶體形式遞送的hGH顯著減少最大血清濃度。另外，可溶的hGH對hGH晶體的總血清水平的AUC相似，這表明結晶不顯著影響生物利用度。計算了可溶和結晶結果的T90％值。該參數表明90％的總AUC發生的時間。更高的T90％值表明藥物保留在血清中更長時間。表6中所含的T90％結果清楚地顯示，晶體形式導致升高的hGH水平比可溶解形式顯著更長時間。
表4.可溶hGH的hGH動物藥物動力學研究結果

表5.結晶hGH(85mM乙酸鈣/2％PEG-6000)的hGH動物藥物動力學研究結果

表6.基于表4和表5中數據的藥物動力學參數

實施例17硫酸魚精蛋白對hGH晶體的溶解特征的影響。圖17說明了按照實施例10(85mM乙酸鈣，2％(v/v)PEG-6000和100mM Tris-HCl(pH8.6))制備的hGH晶體，在向預先存在的hGH鈣晶體溶液中添加給定量的硫酸魚精蛋白后，在37℃溶解緩沖液中培育1小時后的溶解量。HGH與魚精蛋白的比率(mg∶mg)顯示在圖17中。所述圖說明，魚精蛋白顯著影響hGH晶體的溶解。
實施例18用乙酸鈉結晶hGH。這里，從兩種儲備液獲得可溶的重組生產的hGH(rhGH)冷凍的大量進料溶液—一種來自大腸桿菌(E.coli，Novartis)以及另一種來自酵母(Lucky Gold)。不論其來源，來自大腸桿菌和酵母儲備溶液的rhGH單獨分析產生具有相同結晶和溶解度特征的rhGH。使用由BioRad供應的10DG-脫鹽柱純化大約3.3ml(供應在未知緩沖液中的10-20mg/ml rhGH)解凍的rhGH進料溶液。在樣品裝載前，通過用30ml Tris-HCl(10mM，pH8.0)洗滌柱來處理柱。然后裝載rhGH樣品并允許其借助重力進入所述柱。棄去第一個3ml洗脫液后，加入另一個5ml的10mM Tris-HCl pH8.0。洗脫并收集4.5ml脫鹽的rhGH。然后使用Millipore濃縮器(MWCO 10,000)在3500rpm下進行離心濃縮20-30分鐘。hGH的濃度在30mg/ml的范圍內，如通過在280nm/0.813的吸收度(1mg/ml hGH A280＝0.813吸收度單位)測定的。通過添加去離子水、Tris-HCl(pH8.6)、PEG-6000和乙酸鈉至它們分別在總溶液中終濃度為100mM、6％(v/v)和500mM，蛋白質終濃度為15mg/ml，以生產晶體。然后溫和地混合溶液并在33℃下培育溶液12-16小時。獲得了針狀或棒狀晶體并TEM成像(圖18A和18B)。晶體長度從大約2至25μm之間變化。離心并使晶體沉淀成小丸后，提取上清液并且，結晶收率被測量大于85％。在33℃和15℃之間的溫度下也能夠形成晶體，但需要增加的結晶時間并可能導致收率的減少。
實施例19hGH鈉與離子型聚合物添加劑的絡合。測定結晶收率后(見實施例18)，將rhGH鈉晶體重懸浮在母液(250mM NaOAc，25mM Tris-HCl(pH8.6)、6％PEG-6000，以及7mg/ml硫酸魚精蛋白或4.2mg/ml聚精氨酸)中，以致達到21mg/ml rhGH鈉晶體的終濃度。對于rhGH與硫酸魚精蛋白來說，蛋白質與添加劑的比率為約3∶1(mg∶mg)，對于rhGH與聚精氨酸來說，蛋白質與添加劑的比率為5∶1(mg∶mg)。將這些比率計算為摩爾比率，該摩爾比率對于rhGH與魚精蛋白來說為約1∶1.715，對于rhGH與聚精氨酸來說為約1∶0.587。將上述rhGH沉淀均勻地重懸在適合的母液中并在離心獲得冷凝的小丸前在2-8℃下培育過夜。除去上清液并將小丸重懸浮在相同的母液(沒有離子型聚合物添加劑)并在4℃下儲存。
通過變化母液的添加劑濃度(mg/ml)但仍然重懸浮至21mg/ml的rhGH，可以獲得另外的rhGH∶聚合物添加劑比率。例如，可以使用母液中增加的硫酸魚精蛋白的濃度(10.5mg/ml)以在重懸后獲得2∶1的rhGH∶添加劑的比率。
實施例20
用乙酸鋅結晶rhGH。用乙酸鋅和丙酮結晶rhGH。使用由BioRad供應的10DG-脫鹽柱純化大約3.3ml(10-20mg/ml)解凍的rhGH進料溶液。在樣品裝載前，通過用30ml Na2HPO4/NaH2PO4(10mM，pH6.1)洗滌柱來處理柱。然后裝載rhGH樣品并允許其借助重力進入所述柱。棄去第一個3ml洗脫液后，加入另一個5.0ml的10mM Na2HPO4/NaH2PO4pH6.1。洗脫并收集脫鹽rhGH的4.5ml等分樣。然后使用Millipore濃縮器(MWCO 10,000)在3500rpm下進行離心濃縮5-10分鐘。hGH的濃度在15mg/ml的范圍內，如通過在280nm/0.813的吸收度(1mg/ml hGH A280＝0.813吸收度單位)測定的。通過添加400μl含有去離子水、8.91mM Na2HPO4/NaH2PO4pH6.1、0.88mg/ml乙酸鋅、9.89％丙酮的母液，至100μl在10mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH6.1)中的制備的15mg/ml蛋白質，以生產晶體。然后溫和地混合溶液并在15℃下培育溶液24-48小時。獲得了六方形樣的晶體，寬度從大約2至25μm之間變化。離心并使晶體成小丸狀后，提取上清液并且，結晶收率被測量大致55％。
實施例21用乙酸鈣結晶hGH以及hGH鈣與離子型聚合物添加劑(聚精氨酸)的絡合。這里，從兩種儲備液獲得可溶的重組生產的hGH(rhGH)的冷凍的大量進料溶液—一種來自大腸桿菌(Novartis)，另一種來自酵母(Lucky Gold)。使用由BioRad供應的10DG-脫鹽柱純化大約3.5ml(Tris-HCl(10mM，pH8.0)中的12mg/mlrhGH)解凍的rhGH進料溶液。在樣品裝載前，通過用30ml Tris-HCl(10mM，pH8.0)洗滌柱來處理柱。然后將rhGH樣品裝載并允許其借助重力進入所述柱。棄去第一個3ml洗脫液后，添加另一個5.0ml的10mM Tris-HCl pH8.0。洗脫并收集4.5ml脫鹽的rhGH。然后使用Millipore濃縮器(MWCO10,000)在3500rpm進行離心濃縮20-30分鐘。如通過在280nm/0.813處的吸收度(1mg/ml hGH A280＝0.813吸收度單位)測量的，hGH的濃度在30mg/ml的范圍內。通過向rhGH 30mg/ml儲備溶液中添加1MTris-HCl(pH8.6)、50％PEG-6000和1M乙酸鈣，以便獲得15mg/ml rhGH、100mM Tris-HCl(pH8.6)、2％(v/v)PEG-6000和85mM乙酸鈣的終濃度，以生產晶體。然后溫和地混合并在33℃下培育溶液12-16小時。獲得長度范圍在大約2知25μm的針狀晶體。提取上清液并離心以及使晶體成小丸后，結晶收率被測量為大于85％。在33℃和15℃之間的溫度下也能夠形成所述晶體，但需要增加的結晶時間并減少收率。測定結晶收率后(見實施例18)，將rhGH鈣重懸浮在制劑介質(5mMCaOAc、100mM Tris-HCl(pH8.6)、6％PEG-6000和4.2mg/ml聚精氨酸)中，以便達到21mg/ml rhGH鈣的終濃度。對于rhGH與聚精氨酸來說，蛋白質與添加劑的比率為5∶1(mg∶mg)。對于rhGH與聚精氨酸來說，計算這些比率為大約10∶0.587的摩爾比率。將上述rhGH小丸均勻地重懸浮在適合的母液中并在離心獲得冷凝的小丸前，在2-8℃下培育過夜。去除上清液以及將小丸重懸浮在沒有離子型添加劑的相同母液中并在4℃下貯藏。
實施例22使用Sprague-Dawley大鼠皮下給予的hGH和hGH二價陽離子晶體的藥物動力學和藥效學研究。本研究的目的是評估hGH從hGH晶體懸浮液中的控制釋放以及在切除垂體的Sprague-Dawley大鼠中皮下植入hGH晶體懸浮液后增加的體重。研究設計如下
表7.研究設計

a所有樣品被儲存在4℃并且如果希望，在用d中定義的制劑介質稀釋前被溫熱至室溫達30分鐘，以及注射到所示數量的大鼠中。
b緩沖液包含7.5mg/ml D-甘露糖醇、12mg/ml蔗糖。
c商業上可獲得的hGH從BesaGen Ltd.，澳大利亞獲得。
d5mM CaOAc、4％PEG-6000、0.025M甘氨酸(pH8.6)、15mg/ml D-甘露糖醇、60mg/ml蔗糖。
e乙酸鋅、NaH2PO4(pH6.1)、乙醇。
f使用d中定義的單個制劑介質作為所有這些組的介質對照。
到達后，將80只雌性Sprague-Dawley大鼠，體重大約150克±25克以及大約4-6周齡，分別養在控制條件下(大致溫度21±3℃，相對濕度50±20％，在每個24小時周期中12小時光和12小時黑暗，每小時10-15次空氣交換)并在整個研究中讓其自由獲得純水和實驗室糧食。在測試前，允許大鼠適應環境一周。
80只大鼠中，48只被按照表7給予hGH懸浮液。在第一天一次或每天一次連續七天以單次快速濃注的形式在背部位皮下給予試驗化合物。在注射前，將注射部位剃光并標記直到三天，此后視需要以促進注射。使用連接在300μl注射器的30-量規×8mm針給予試驗化合物。在抽入注射器之前以及再在給藥之前，小心地翻轉試驗化合物以確保懸浮液或溶液均一性，不引起發泡。注射體積大約是每只大鼠0.1ml。
在第一天注射后的第4、32、96和168小時從組1、5、7和8中(每組具有3只大鼠)大鼠中采集血液樣品。將來自組2、3、4和9(每組具有9只大鼠)大鼠的血液樣品進一步再分成3組，每組3只大鼠。在這里，在第一天注射后的第0.5、24、72和168小時從第一亞組的大鼠中采集血液樣品，在第4、32、96和168小時從第二亞組的大鼠中采集血液樣品，以及在第8、48、120和168小時從第三亞組的大鼠中采集血液樣品。通常通過眼窩竇在未麻醉或CO2/O2麻醉的大鼠上收集出血，并且收集在具有血清分離劑的BD Microtainer管中。然后在大約4℃下離心樣品以及回收血清并在測定hGH和IGF-1水平前冷凍貯藏(約-80℃)。
然后匯集血清樣品并在組2、3、4和9的情況下，形成線性漸進的時間線(timeline)。通過在給定時間點的亞組內血清水平與所述亞組的平均值的變異，測定標準離差。見表8-14和圖19A。當以特別的晶體制劑給藥時，顯示rhGH的血清水平(ng/ml)。按照研究方案在和給藥相應的具體時間點給動物取血。結果清楚地顯示，在絡合的晶體物質(例如魚精蛋白和聚精氨酸)和非絡合的晶體制劑(例如CaOAC和ZnOAC)的吸收之間存在差異。
表8.hGH動物藥物動力學研究結果，組2每天可溶的

表9.hGH動物藥物動力學研究結果，組3乙酸鈣、PEG

表10.hGH動物藥物動力學研究結果，組4乙酸鈣、PEG、魚精蛋白

表11.hGH動物藥物動力學研究結果，組5乙酸鋅

表12.hGH動物藥物動力學研究結果，組9乙酸鈣、聚精氨酸

表13.基于表8-12中的數據的藥物動力學參數

在研究的第一天注射前以及再在研究的每個連續的早晨取血時間前，測量并記錄每只大鼠的體重。因此，通過從每個連續天(注射前)的體重減去第1天(注射前)的體重，計算每組內每只大鼠的體重增加或減少。計算每天組內全部大鼠的體重平均值。將這些結果提供在表14中。
表14.Sprague-Dawley大鼠的每天體重增加或減輕(克)

表14和圖19B說明了與給予日劑量商業上可獲得的hGH的七天影響相比，給予單劑量(第1天)本發明的晶體的七天影響。例如，圖19B證實，與聚精氨酸絡合的hGH晶體鈣實現了體重增加，該體重增加比得上在相同時間段內只一次劑量的每天可溶劑量的體重增加。在比較增加的體重和rhGH在血清中各自的釋放特征中，明顯的是，更長釋放的聚精氨酸制劑與體重增加的更持續的速度相關。
實施例23在雌性幼獼猴(jiuvenile cynomologous monkeys)中的比較藥效學研究。本研究的目的是評估當皮下給予雌性幼獼猴時，結晶重組人生長激素(rhGH)的體內藥物動力學特征。生成這些數據以建立結晶rhGH在血清中的控制釋放和作為結晶rhGH釋放的函數的體重增加的模型。
表15.靈長類研究I的研究設計

a商業上可獲得的hGH(可溶的，未結晶的形式)從Novarits獲得并在WFI中滲濾。組1(陽性對照)在每個給藥天接受可溶的hGH。
b關于制備見實施例18和19。
c在每天取血后遞送所有的劑量。
將12只雌性幼獼猴分成三組，每組具有四只動物，并且給予可溶的rhGH(組1)、具有PEG和聚精氨酸的rhGH鈉晶體(組2，根據實施例18和19)或具有PEG和魚精蛋白的rhGH鈉晶體(組3，根據實施例18和19)。將在處理開始時體重2-6kg和年齡4-7歲的猴單個地養在裝備有自動給水系統或水瓶的不銹鋼籠中。控制動物房間環境(大約21±3℃，30-70％濕度，每24小時周期中12小時光和12小時黑暗，以及每小時12-20次空氣交換)并且每天兩次用標準有保證的商業上的靈長類糧食(Harlan Teklad Certified Primate Diet#2055C)喂養猴。
為了測量和比較給予可溶的rhGH(組1)、具有PEG和聚精氨酸的rhGH鈉晶體(組2)或具有PEG和魚精蛋白的rhGH鈉晶體(組3)后的hGH和IGF-1的血清濃度，進行本靈長類研究。在轉移和上述表15中所示時間上給藥前，記錄所有動物的體重。在第-216、-120、0、2、4、6、8、10、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288和312天的早晨，經股靜脈、肱靜脈或隱靜脈從每只動物收集血液樣品(大約1ml)。將血液收集在血清分離管中，在室溫下放置30-45分鐘以允許凝結，以及在3000rpm2-8℃下離心10分鐘。將每個血清樣品分成為100μl等份試樣和余下的等份試樣，在分析前它們全部被貯藏在-70±10℃下。典型地，被用于rhGH測定的100μl等份試樣越小，被用于IGF-1測定的余下部分就越大。由于需要的復制體積，存在一些例外。
然后對收集的血清樣品進行hGH濃度分析(見表16)。對落在標準值范圍外的rhGH濃度作適當的稀釋。使用所有值以獲得靈長類GH的每只動物個體的平均背景水平。從在每個時間點測定的所述試驗對象的血清水平中減去該每只動物平均值。然后將每個時間點的修正值平均以獲得血清中rhGH的修正平均值。然后通過使用修正平均值的標準離差計算標準誤差并且除以N＝4的平方根。
表16.組1(每天可溶的)，2(rhGH鈉/聚精氨酸)和3(rhGH鈉/魚精蛋白)的rhGH水平

注rhGH值是來自4只動物的平均值，它被基線調整，即，值減去基線。基線是在t＝-216、-120和0小時值的平均值。
圖20A說明了組1、2和3中，在基線調整后，作為以小時為單位的時間的函數的血清中rhGH的水平。
表17.基于表16中數據的藥物動力學參數的總結

a將商業上可獲得的hGH(可溶的，未結晶的形式)在WFI中滲濾。組1(陽性對照)在7個給藥天的每一天接受可溶的hGH。
上述數據證實，對于聚精氨酸絡合的hGH鈉晶體，最大值hGH出現在血清中的時間(Tmax)為10小時，對于魚精蛋白絡合的hGH鈉晶體，為10小時，以及對于可溶的hGH，為2小時。假定以1/7th劑量的晶體施用遞送可溶的hGH，上述表17中列出的Cmax值顯示，當以兩種絡合的結晶形式的任一種遞送hGH時，顯著減低初始血清濃度尖峰。另外，計算了可溶和晶體組的T90％值。組1(可溶形式)的T90％為20小時，而組2和組3(絡合的結晶形式)的T90％分別為74和77小時。這些結果清楚地顯示，絡合的結晶形式導致升高的hGH水平維持比可溶的形式明顯更長的時間。
除了測定hGH的血清濃度以外，還測量了作為時間的函數的IGF-1的水平。通過測量IGF-1的產生，確定了rhGH的功效。下表18報道了組1-3中動物的IGF-1濃度。圖20B說明，在減去內源性IGF-1水平的基線后，絡合的晶體制劑已經證實了刺激IGF-1釋放的能力，該能力比得上每天可溶的施用。在非人靈長類中的這些結果顯示，可有利地使用本發明的制劑以在人中達到相似的功效。
表18.組(每天可溶的、rhGH鈉/聚精氨酸和rhGH鈉/魚精蛋白)的IGF-1水平

注IGF-1值被報道為由4只動物計算的平均值，它被基線調整，即，值減去基線。基線是在t＝-216、-120和0小時值的平均值。
實施例24用不同的魚精蛋白比率在雌性幼獼猴中的比較藥效學研究。本研究的目的是評估當皮下給予雌性幼獼猴時，結晶重組人生長激素(rhGH)的體內藥物動力學特征。生成這些數據以研究hGH鈉與魚精蛋白的比率對結晶rhGH在血清中的控制釋放和作為結晶rhGH釋放的函數的體重增加的影響。
表19.靈長類研究II的實驗研究

a商業上可獲得的hGH(可溶的，未結晶的形式)從Novarits獲得并在WFI中滲濾。組1(陽性對照)在每個給藥天接受可溶的hGH。
b關于制備見實施例18和19。
c在每天取血后遞送所有的劑量。
在靈長類研究II中，將在靈長類研究I中所述的12只雌性幼獼猴分成三組，每組具有四只動物，并且給予可溶的rhGH(組1)、具有PEG和魚精蛋白的rhGH鈉晶體(3∶1 rhGH∶魚精蛋白)(組2)(實施例18和19)或具有PEG和魚精蛋白的rhGH鈉晶體(2∶1 rhGH∶魚精蛋白)(組3)(實施例18和19)。將在處理開始時體重2-6kg和年齡4-7歲的猴單個地養在裝備有自動給水系統或水瓶的不銹鋼籠中。控制動物房間環境(大約21±3℃，30-70％濕度，每24小時周期中12小時光和12小時黑暗，以及每小時12-20次空氣交換)并且每天兩次用標準有保證的商業上的靈長類糧食(Harlan TekladCertified Primate Diet #2055C)喂養猴。
為了測量和比較給予可溶的rhGH(組1)、具有PEG和魚精蛋白的rhGH鈉晶體(3∶1 rhGH∶魚精蛋白)(組2)和具有PEG和魚精蛋白的rhGH鈉晶體(2∶1 rhGH∶魚精蛋白)(組3)后的hGH和IGF-1的血清濃度，進行本靈長類研究。在轉移和上述表19中所示時間給藥前，記錄所有動物的體重。在第-144、-120、-96、-72、-48、-24、0、2、4、6、8、10、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288和312天的早晨，經股靜脈、肱靜脈或隱靜脈從每只動物收集血液樣品(大約1ml)。將血液收集在血清分離管中，在室溫下放置30-45分鐘以允許凝結，以及在3000rpm 2-8℃下離心10分鐘。將每個血清樣品分成為100μl等份試樣和余下的等份試樣，在檢測前它們全部被貯藏在-70±10℃下。
分析并基線修正收集的血清樣品中的hGH濃度(ng/ml)(見表20中的數據)。注意，對落在標準值范圍外的rhGH濃度作適當的稀釋。然后使用所有值以獲得靈長類hGH的每只動物個體的平均背景水平。從在每個時間點測定的所述試驗對象的血清水平中減去該每只動物平均值。然后將每個時間點的修正值平均以獲得血清中rhGH的修正平均值。然后通過使用修正平均值的標準離差計算標準誤差并且除以N＝4的平方根。
表20.組1(每天可溶的)、2(rhGH鈉/魚精蛋白(3∶1))和3(rhGH鈉/魚精蛋白(2∶1))的rhGH水平

注rhGH值被報道為由4只動物計算的平均值，它被基線調整，即，值減去基線。基線是在t＝-144、-120、-96、-72、-48、-24和0小時值的平均值。
圖21A說明了組1、2和3中，在基線調整后，作為以小時為單位的時間的函數的血清中rhGH的水平。
表21.基于表20中數據的藥物動力學參數的總結

a將商業上可獲得的hGH(可溶的，未結晶的形式)在WFI中滲濾。組1(陽性對照)在7個給藥天的每一天接受可溶的hGH。
這些數據證實，對于魚精蛋白(3∶1)絡合的hGH晶體，最大值hGH出現在血清中的時間為10小時，對于魚精蛋白(2∶1)絡合的hGH晶體，為24小時，以及對于可溶的hGH，為4小時。假定以1/7th劑量的晶體施用遞送可溶的hGH，上述表22中列出的Cmax值顯示，當以兩種絡合的結晶中的任一種形式遞送hGH時，顯著減低最大血清濃度。組1(可溶形式)的T90％為20小時，而組2和組3(絡合的結晶形式)的T90％分別為119和72小時。這些結果清楚地顯示，絡合的結晶形式導致升高的hGH水平維持比可溶的形式明顯更長的時間。
除了測定hGH的血清濃度以外，還測量了作為時間的函數的IGF-1的水平。通過測量IGF-1的產生，確定了rhGH的功效。下表22報道了組1-3中動物的IGF-1濃度。圖21B說明，在減去內源性IGF-1水平的基線后，絡合的晶體制劑能夠刺激IGF-1釋放，該能力比得上每天可溶的施用。這些非人靈長類結果顯示，可有利地使用本發明的制劑以在人中引起相似的功效。
表22.組1(每天可溶的)、2(rhGH鈉/魚精蛋白(3∶1))和3(rhGH鈉/魚精蛋白(2∶1))的IGF-1水平

注IGF-1值被報道為由4只動物計算的平均值，它被基線調整，即，值減去基線。基線是在t＝-144、-120、-96、-72、-48、-24和0小時值的平均值。
實施例25通過單次或每天皮下注射給切除垂體的雄性大鼠給予的人生長激素的藥效學研究。本研究的目的是比較當一次或每天連續七天皮下給予切除垂體的雄性Wistar大鼠時，不同hGH制劑的功效。研究設計如下表23.研究設計-樣品說明

a使用WFI在無菌條件下制備全部樣品。將溶液調至它們各自的終體積后，用0.22μm濾器過濾載體和可溶的hGH樣品。
表24.研究設計-給藥

到達后，將138只雌性Wistar大鼠，體重大約90-100克以及大約25-30天大，分組養在控制條件下(大致溫度23±3℃，相對濕度30-70％，在每個24小時周期中12小時光和12小時黑暗，每小時10-15次空氣交換)并在整個研究中讓其自由獲得純水和實驗室糧食。在測試前，允許大鼠適應環境兩周。
按照表24中的濃度、體積和給藥方案給予138只大鼠樣品。一次或每天一次連續七天以單次快速濃注形式在背部皮下給予試驗化合物。在給藥前，將注射部位剃光并標記直到三天，此后視需要以促進注射。使用連接在300μl注射器上的30-量規×8mm針給予試驗化合物。在抽入注射器之前以及再在給藥之前，小心地翻轉試驗化合物以確保懸浮液或溶液均一性，不引起發泡。
在-3周和-2周期間每周兩次以及從-7天至14天每天測量并記錄體重增加。給藥時，大鼠體重大約是100g±10％。在圖22和23中提供并在表25和26中總結了誘導生長的百分比結果。表25中“高劑量”表示5.6mg/kg/周。數據說明了單次注射rhGH∶聚精氨酸(組7，實施例18和19)或rhGH∶魚精蛋白(組9和10，實施例18和19)晶體七天期間與每天注射對照(組1，沒有hGH)或可溶的hGH樣品(組4和5)相同的七天期間大鼠體重增加的比較。組1，假垂體切除術大鼠，顯示了七天期間的正常生長。此外，七天一次注射給予rhGH∶聚精氨酸(組7)的大鼠比七天每天給予可溶的hGH(組5)的那些大鼠具有更高的誘導生長百分比。這些結果說明，按照本發明的hGH晶體和制劑與一周每天給予可溶的rhGH一樣有效。
表25.在切除垂體的大鼠中8天誘導的體重增加

表26.在切除垂體的大鼠中每天誘導的體重增加

實施例26用乙酸鈉和硫酸魚精蛋白結晶hGH。這里，從兩種儲備液—一種來源于大腸桿菌(Novartis)，另一種來源于酵母(Lucky Gold)獲得可溶的重組生產的hGH(rhGH)的冷凍大量進料溶液。不論其來源，來源于大腸桿菌和酵母儲備溶液中rhGH的單獨分析產生具有相同結晶和溶解度特征的rhGH。使用由BioRad供應的10DG脫鹽柱純化大約3.3ml(10-20mg/ml)解凍的rhGH進料溶液。樣品裝載前，通過用30ml Tris-HCl(10mM，pH8.0)洗滌來處理柱。然后裝載rhGH樣品并允許其借助重力進入所述柱。棄去第一個3ml洗脫液后，添加另一個5.0ml的10mM Tris-HCl pH8.0。洗脫并收集4.5ml的脫鹽rhGH。然后使用Millipore濃縮器(MWCO 10,000)在3500rpm下進行離心濃縮20-30分鐘。如通過在280nm/0.813處的吸收度(1mg/mlhGH A280＝0.813吸收度單位)測量的，hGH的濃度在30mg/ml的范圍內。通過添加去離子水、Tris-HCl(pH8.6)、PEG-4000、硫酸魚精蛋白和乙酸鈉至它們在總溶液中分別為100mM、6％(v/v)、2mg/ml和500mM的終濃度，最終蛋白質濃度為15mg/ml，生成晶體。然后溫和地混合溶液并在33℃下培育溶液12-16小時。獲得了長度為約2至25μm的針狀晶體。離心并使晶體成小丸后，提取上清液以及，結晶收率被測量為大于90％。
實施例27用乙酸鈉和聚精氨酸HCl結晶hGH。這里，從兩種儲備液—一種來源于大腸桿菌(Novartis)，另一種來源于酵母(Lucky Gold)，獲得可溶的重組生產的hGH(rhGH)的冷凍大量進料溶液。不論其來源，來源于大腸桿菌和酵母儲備溶液中rhGH的單獨分析產生具有相同結晶和溶解度特征的rhGH。使用由BioRad供應的10DG脫鹽柱純化大約3.3ml(10-20mg/ml)解凍的rhGH進料溶液。樣品裝載前，通過用30ml Tris-HCl(10mM，pH8.0)洗滌來處理柱。然后裝載rhGH樣品并允許其借助重力進入所述柱。棄去第一個3ml洗脫液后，添加另一個5.0ml的10mM Tris-HCl pH8.0。洗脫并收集4.5ml的脫鹽rhGH。然后使用Millipore濃縮器(MWCO 10,000)在3500rpm下進行離心濃縮20-30分鐘。如通過在280nm/0.813處的吸收度(1mg/mlhGH A280＝0.813吸收度單位)測量的，hGH的濃度在30mg/ml的范圍內。通過添加去離子水、Tris-HCl(pH8.6)、PEG-4000、聚精氨酸HCl和乙酸鈉至它們在總溶液中分別為100mM、2％(v/v)、2mg/ml和500mM的終濃度，最終蛋白質濃度為15mg/ml，生成晶體。然后溫和地混合溶液并在33℃下培育溶液12-16小時。獲得了長度為約2至25μm的針狀晶體。離心并使晶體成小丸后，提取上清液以及，結晶收率被測量為大于90％。
盡管用舉例說明和為理解清楚的目的的實施例，以一些細節描述了前述發明，但根據本發明的教導，對本領域的技術人員輕易明顯的是，不偏離本申請公開內容(包括所附實施方案)的精神或范圍，可以對本發明作出某些變化和修改。
權利要求
1.人生長激素或人生長激素衍生物的鈣晶體。
2.人生長激素或人生長激素衍生物的一價陽離子晶體。
3.人生長激素或人生長激素衍生物的魚精蛋白晶體。
4.人生長激素或人生長激素衍生物的聚精氨酸晶體。
5.按照權利要求2的一價陽離子晶體，其中所述一價陽離子選自由鋰、鈉、鉀和銨組成的組。
6.按照權利要求5的一價陽離子晶體，其中所述一價陽離子是鈉。
7.按照權利要求1、2、3或4的任一項的晶體，其中對哺乳動物的單次給藥所述晶體在所述哺乳動物中提供體內hGH血清濃度，該血清濃度選自由下列各項組成的組(a)在約0.3ng/ml至約2,500ng/ml hGH之間；(b)在約0.5ng/ml至約1,000ng/ml hGH之間；(c)在約1ng/ml至約100ng/ml hGH之間，經過選自由如下各項組成的組的時間段(i)在施用后約0.5小時和約40天之間；(ii)在施用后約0.5小時和約10天之間；(iii)在施用后約0.5小時和約7天之間；以及(iv)在施用后約0.5小時和約1天之間。
8.按照權利要求1、2、3或4的任一項的晶體，其中對哺乳動物的單次給藥所述晶體在所述哺乳動物中提供體內IGF-1血清升高，該血清升高在所述施用前的基線IGF-1水平以上，選自由下列各項組成的組(a)在約5ng/ml至約2,500ng/ml之間；以及(b)在約100ng/ml至約1,000ng/ml之間，經過選自由如下各項組成的組的時間段(i)在施用后約0.5小時和約40天之間；(ii)在施用后約0.5小時和約7天之間。
9.按照權利要求1、2、3或4的任一項的晶體，其中與通過相同的施用途徑遞送的相同劑量可溶的hGH的相對生物利用度相比，所述晶體具有至少50％或更多的相對生物利用度，其中通過所述可溶的hGH和所述晶體的總體內hGH血清濃度的AUC測量所述生物利用度。
10.按照權利要求7或8的晶體，其中所述哺乳動物是人。
11.按照權利要求1的晶體，其中所述晶體包含約1至約500個鈣分子每人生長激素或人生長激素衍生物的單體。
12.按照權利要求2的晶體，其中所述晶體包含約1至約500個一價陽離子每人生長激素或人生長激素衍生物的單體。
13.按照權利要求1的晶體，其中所述晶體包含選自由乙酸鈣、氯化鈣、硫酸鈣和葡糖酸鈣組成的組的鈣鹽。
14.按照權利要求13的晶體，其中所述鈣鹽是乙酸鈣。
15.按照權利要求6的晶體，其中所述晶體包含選自由檸檬酸鈉、磷酸鈉和乙酸鈉組成的組的鈉鹽。
16.按照權利要求15的晶體，其中所述鈉鹽是乙酸鈉。
17.一種組合物，該組合物包含人生長激素或人生長激素衍生物的晶體和賦形劑，其中所述晶體選自由下列各項組成的組(a)人生長激素或人生長激素衍生物的鈣晶體；(b)人生長激素或人生長激素衍生物的一價陽離子晶體；(c)人生長激素或人生長激素衍生物的魚精蛋白晶體；(d)人生長激素或人生長激素衍生物的聚精氨酸晶體。
18.按照權利要求17的組合物，其中所述晶體和所述賦形劑以hGH∶賦形劑為約1∶10至約1∶0.125的摩爾比存在于所述組合物中。
19.按照權利要求17的組合物，其中所述賦形劑選自由氨基酸、鹽、醇、碳水化合物、蛋白質、脂質、表面活性劑、聚合物、聚氨基酸和它們的混合物組成的組。
20.按照權利要求19的組合物，其中所述賦形劑選自由魚精蛋白、聚乙烯醇、環糊精、葡聚糖、葡糖酸鈣、聚氨基酸、聚乙二醇、dendrimers、聚鳥氨酸、聚乙烯亞胺、脫乙酰殼多糖和它們的混合物組成的組。
21.按照權利要求20的組合物，其中所述賦形劑選自由魚精蛋白、聚精氨酸、聚乙二醇和它們的混合物組成的組。
22.按照權利要求17的組合物，其中人生長激素或人生長激素衍生物在所述組合物中的濃度選自由下列各項組成的組(a)在約0.1和約100mg/ml之間；(b)在約1和約100mg/ml之間；以及(c)在約10和約100mg/ml之間。
23.一種治療具有障礙的哺乳動物的方法，所述障礙與人生長激素缺乏有關或被用人生長激素治療改善，該方法包括給予所述哺乳動物治療有效量的權利要求1、2、3或4任一項的晶體或權利要求17的組合物的步驟。
24.一種在哺乳動物中誘導體重增加的方法，該方法包括給予所述哺乳動物治療有效量的權利要求1、2、3或4任一項的晶體或權利要求17的組合物的步驟。
25.按照權利要求24的方法，其中所述哺乳動物是垂體切除的大鼠并且通過一周一次注射施用所述晶體后在所述大鼠中誘導的體重增加在5％和約40％之間。
26.按照權利要求23的方法，其中所述障礙選自由成人生長激素缺乏、兒童生長激素缺乏、普-威綜合征、特納綜合征、短腸綜合征、慢性腎功能不全、自發的短身材、侏儒癥、垂體功能減退侏儒癥、骨再生、雌性不育癥、宮內生長遲緩、AIDS有關的惡病質、局限性回腸炎和燒傷組成的組。
27.按照權利要求26的方法，其中所述障礙是小兒生長激素缺乏并且所述方法在所述哺乳動物中導致約7和約11cm之間的每年生長速度。
28.按照權利要求23或24的方法，其中通過口途徑、胃腸外途徑、皮下途徑或肌內途徑給予所述哺乳動物所述晶體或組合物。
29.按照權利要求28的方法，其中通過使用具有大于或等于27的量規的針的皮下途徑給予所述哺乳動物所述晶體或組合物。
30.按照權利要求23或24的方法，其中通過無針注射或變劑量輸注泵給予所述哺乳動物所述晶體或組合物。
31.按照權利要求23或24的方法，其中通過選自由下列各項組成的組的時間方案給予所述哺乳動物所述晶體或組合物(a)每三天約一次；(b)一周約一次；(c)每兩周約一次；以及(d)每月約一次。
32.按照權利要求23或24的方法，其中所述哺乳動物是人。
33.一種生產人生長激素或人生長激素衍生物的鈣晶體、一價陽離子晶體、魚精蛋白晶體或聚精氨酸晶體的方法，該方法包括如下步驟(a)將人生長激素或人生長激素衍生物的溶液與結晶溶液混合，所述結晶溶液包含鈣鹽或一價陽離子晶體鹽和離子型聚合物，其中所述離子型聚合物是魚精蛋白或聚精氨酸；以及(b)在約4℃和約37℃之間的溫度下，培育所述晶體溶液大于約12小時，直到產生人生長激素或人生長激素衍生物的鈣晶體、一價陽離子晶體、魚精蛋白晶體或聚精氨酸晶體為止。
34.按照權利要求33的方法，其中所述離子型聚合物是聚賴氨酸。
35.按照權利要求33的方法，其中所述離子型聚合物是魚精蛋白、聚精氨酸和聚賴氨酸中的任何兩種或更多種的混合物。
36.一種生產人生長激素或人生長激素衍生物的鈣晶體或一價陽離子晶體的方法，該方法包括如下步驟(a)將人生長激素或人生長激素衍生物的溶液與結晶緩沖液混合以產生結晶溶液；(b)向所述結晶溶液中添加去離子水；(c)向所述結晶溶液中添加沉淀劑；(d)向所述結晶溶液中添加鈣鹽或一價陽離子鹽；(e)在約10℃和約40℃之間的溫度下，培育所述結晶溶液約2至約168小時，直到形成人生長激素或人生長激素衍生物的鈣晶體或一價陽離子晶體為止；以及(f)向所述人生長激素或人生長激素衍生物的鈣晶體或一價陽離子晶體中添加離子型聚合物或離子型小分子。
37.一種生產人生長激素或人生長激素衍生物的鈣晶體或一價陽離子晶體的方法，該方法包括如下步驟(a)將人生長激素或人生長激素衍生物的溶液與結晶緩沖液混合以產生結晶溶液；(b)向所述結晶溶液中添加去離子水；(c)向所述結晶溶液中添加離子型小分子或離子型聚合物；(d)向所述結晶溶液中添加鈣鹽或一價陽離子鹽；(e)在約10℃和約40℃之間的溫度下，培育所述結晶溶液約2至約168小時，直到形成人生長激素或人生長激素衍生物的鈣晶體或一價陽離子晶體為止。
38.按照權利要求37的方法，其中，步驟(b)之后和步驟(c)之前，所述方法包括向所述結晶溶液中添加沉淀劑的步驟。
39.按照權利要求33、36或37中任一項的方法，其中所述鈣鹽選自由乙酸鈣、氯化鈣、葡糖酸鈣、和硫酸鈣組成的組。
40.按照權利要求39的方法，其中所述鈣鹽是乙酸鈣。
41.按照權利要求33、36或37中任一項的方法，其中所述一價陽離子選自由鋰、鈉、鉀和銨組成的組。
42.按照權利要求41的方法，其中所述一價陽離子是鈉。
43.按照權利要求33、36或37中任一項的方法，其中所述一價陽離子鹽選自由檸檬酸鈉、磷酸鈉和乙酸鈉組成的組。
44.按照權利要求43的方法，其中所述一價陽離子鹽是乙酸鈉。
45.按照權利要求33的方法，其中所述結晶溶液進一步包含pH緩沖液。
46.按照權利要求45的方法，其中所述pH緩沖液具有選自由下列各項組成的組的pH(a)在約pH6和約pH10之間的pH；(b)在約pH7和約pH10之間的pH；(c)在約pH6和約pH9之間的pH；以及(d)在約pH7.8和約pH8.9之間的pH。
47.按照權利要求45的方法，其中所述pH緩沖液是選自由Tris、HEPES、乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽、咪唑和甘氨酸組成的組的緩沖液。
48.按照權利要求36或38的方法，其中所述沉淀劑是非離子型小分子或非離子型聚合物。
49.按照權利要求48的方法，其中所述非離子型聚合物選自由聚乙二醇、聚乙烯醇、和它們的混合物組成的組。
50.按照權利要求49的方法，其中所述聚乙二醇具有選自由下列各項組成的組的分子量(a)約200和約8000之間的分子量；(b)約6000的分子量；(c)約4000的分子量；以及(d)約3350的分子量。
51.按照權利要求50的方法，其中所述聚乙二醇以約0.5％和約20％(w/v)之間的濃度存在于所述結晶溶液中。
52.按照權利要求36或38的方法，其中所述沉淀劑選自由氨基酸、肽、聚氨基酸、和它們的混合物組成的組。
53.按照權利要求33、36或37的方法，其中所述人生長激素或人生長激素衍生物以選自由下列各項組成的組的濃度存在于所述結晶溶液中(a)約1mg/ml和約1,000mg/ml之間的濃度；(b)約2mg/ml和約50mg/ml之間的濃度；以及(c)約10mg/ml和約25mg/ml之間的濃度。
54.按照權利要求33、36或37的方法，其中所述鈣鹽或所述一價陽離子鹽以選自由下列各項組成的組的濃度存在于所述結晶溶液中(a)約0.01和約1M之間的濃度；以及(b)約25和約205mM之間的濃度。
55.按照權利要求33、36或37的方法，其中培育所述結晶溶液，時間和溫度選自由下列各項組成的組(a)在約33℃的溫度下約0.25天和約兩天之間；(b)在約25℃的溫度下約0.25天和約兩天之間；以及(c)在約15℃的溫度下約0.25天和約兩天之間。
56.按照權利要求36或37的方法，其中所述離子型小分子選自由氨基酸、肽和它們的混合物組成的組。
57.按照權利要求36或37的方法，其中所述離子型聚合物選自由魚精蛋白、多糖、聚氨基酸、聚精氨酸、聚賴氨酸、聚谷氨酸、dendrimers、聚鳥氨酸、聚乙烯亞胺、脫乙酰殼多糖和它們的混合物組成的組。
58.按照權利要求57的方法，其中所述離子型聚合物是魚精蛋白或聚精氨酸。
59.按照權利要求36或37的方法，其中，在權利要求36的步驟(e)中或權利要求37的步驟(e)中，在約4℃和約40℃之間的溫度下培育所述結晶溶液約4至約48小時，直到形成人生長激素或人生長激素衍生物的鈣晶體或一價陽離子晶體為止。
60.按照權利要求36或37的方法，其中，在權利要求36的步驟(e)或權利要求37的步驟(e)中，所述人生長激素或人生長激素衍生物以約2mg/ml和約100mg/ml之間的濃度存在于所述結晶溶液中。
61.按照權利要求36或37的方法，其中，在權利要求36的步驟(e)或權利要求37的步驟(e)中，所述人生長激素或人生長激素衍生物以約14.5mg/ml和約15.5mg/ml之間的濃度存在于所述結晶溶液中。
62.按照權利要求36或37的方法，其中所述結晶緩沖液選自由Tris-HCl緩沖液、甘氨酸緩沖液、HEPES緩沖液、咪唑緩沖液、Bis-Tris緩沖液、AMP、AMPD、AMPSO、N-二(羥乙基)甘氨酸、乙醇胺、glyclglycine、TAPS、牛磺酸、Triane和它們的混合物組成的組。
63.按照權利要求36或37的方法，其中，在權利要求36的步驟(a)中或權利要求37的步驟(a)中，所述結晶緩沖液以約10mM和約800mM之間的濃度存在于所述結晶溶液中。
64.按照權利要求36或37的方法，其中，在步驟(a)中，所述結晶緩沖液具有選自由下列各項組成的組的pH(a)約3和約10之間的pH；(b)6和約9之間的pH；以及(c)約7.5和約10之間的pH。
65.按照權利要求36或37的方法，其中，在權利要求36的步驟(e)中或權利要求37的步驟(e)中，在所述結晶溶液中的所述結晶緩沖液使所述溶液達到選自由下列各項組成的組的pH(a)約3和約10之間的pH；(b)約6和約9.5之間的pH；以及(c)約7.5和約9.5之間的pH。
66.按照權利要求64或65的方法，其中所述緩沖液選自由Tris、HEPES、乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽、咪唑和甘氨酸組成的組。
67.按照權利要求40的方法，其中所述乙酸鈣呈水溶液的形式，該水溶液具有選自由下列各項組成的組的pH(a)約3.0和約9.0之間的pH；以及(b)7.0和約8.6之間的pH。
68.按照權利要求40的方法，其中，在權利要求36的步驟(e)中或權利要求37的步驟(e)中，所述乙酸鈣以選自由下列各項組成的組的濃度存在于所述結晶溶液中(a)約0.1mM和約205mM之間的濃度；以及(b)約85mM和約100mM之間的濃度。
69.按照權利要求44的方法，其中所述乙酸鈣呈水溶液的形式，該水溶液具有選自由下列各項組成的組的pH(a)約3.0和約9.0之間的pH；以及(b)7.0和約8.6之間的pH。
70.按照權利要求45的方法，其中，在權利要求36的步驟(e)中或權利要求37的步驟(e)中，所述乙酸鈣以選自由下列各項組成的組的濃度存在于所述溶液中(a)約0.5mM和約800mM之間的濃度；以及(b)約100mM和約500mM之間的濃度。
71.按照權利要求36或37的方法，其中，在權利要求36的步驟(e)中或權利要求37的步驟(e)中，在約4℃和約37℃之間的溫度下培育所述溶液約一天至約兩天。
全文摘要
本發明涉及人生長激素或人生長激素衍生物的穩定、延長釋放晶體和包含這類晶體的組合物或制劑。本發明還提供了生產那些晶體和組合物的方法。本發明進一步提供了使用那些晶體和組合物或制劑治療具有障礙的個體的方法，所述障礙與人生長激素缺乏有關或通過用人生長激素治療而得到改善。
文檔編號C07K14/61GK1744914SQ200380109408
公開日2006年3月8日 申請日期2003年12月31日 優先權日2002年12月31日
發明者C·戈夫達恩, N·卡拉夫, B·P·西米恩 申請人:阿爾特斯制藥公司