專利名稱：流感病毒非結構蛋白1抑制劑的設計方法
相關申請的交叉引用本申請要求下列臨時申請的優先權60/425,661，申請日為2002年11月13日；60/477,453，申請日為2003年6月10日，其內容在此作為參考。
政府資助研究資金部分由全國衛生研究所資助，合約號為Nos.GM47014和AI11772。
背景技術：
流感病毒是一種關乎人類健康的重要問題。它能夠引發被稱為流感的極具傳染性的急性呼吸道疾病。據估計，1918-1919年“西班牙流感”的大流行在世界范圍內造成5億人發病，結果有2000萬人死亡(Robbins，1986)。1918年的病毒毒力的遺傳決定簇仍然沒有得到鑒定，也沒有專門的臨床預防措施或治療手段來有效的應對其再次發生，參見Tumpey等，PNAS USA 99(15)13849-54(2002)。1918年的或類似的流感病毒再次出現的潛在威脅引起極大的關注是毫不奇怪的，無論它是通過自然原因或由生物恐怖主義造成。甚至在非傳染的年份，流感病毒傳染僅在美國每年造成約2萬到3萬人的死亡(Wright&Webster，(2001)Orthomyxoviruses.In“Fields Virology，4th Edition”(D.M.Knipe，and P.M.Howley，Eds.)pp.1533-1579.Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，PA)。此外，尚有難以計數的由于在幾天或數周中克服疾病的輕微癥狀而造成人們的生產力和生活質量的損失。另一個復雜的因素是流感A病毒要經歷持續的抗原決定簇變化，從而造成每年都能分離新的菌株。簡單的講，就是持續需要新的種類的抗流感病毒試劑。
流感病毒是正粘病毒科的唯一成員，根據它們核蛋白(NP)和基質(M)蛋白的抗原性的不同，被分為3個不同的型(A、B和C)(Pereira，(1969)Progr.Molec.Virol.1146)。正粘病毒為直徑約100納米的有囊膜的動物病毒。流感病毒由含有單鏈RNA基因組的內部核蛋白核心(螺旋狀的核殼體)，以及內部襯有基質蛋白(M)的外層脂蛋白囊膜。分段的流感A病毒的基因組由8個(流感C病毒是7個)分子線性的負極性的編碼10個多肽的單鏈RNAs組成，這10個多肽包括RNA指導的RNA多聚酶蛋白(PB2、PB1和PA)和形成核殼體的核蛋白(NP)；基質蛋白(M1，M2)；兩個從脂蛋白囊膜中突出的表面糖蛋白紅血球凝集素(HA)和神經氨酸酶(NA)；以及非結構蛋白，其功能在下面闡述(NS1和NS2)。基因組的轉錄和復制在核內進行，通過在質膜上的芽生進行組裝。病毒可以在混合感染期間再次分配基因。
流感病毒RNA的復制和轉錄需要4個病毒編碼的蛋白NP和3個病毒RNA依賴的RNA多聚酶成分，PB1、PB2和PA(Huang et al.，1990，J.Virol.645669-5673)。NP是病毒體的主要結構成分，其與基因組RNA相互作用，在RNA合成期間用來抗終止(Beaton&Krug，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 836282-6286)。NP在RNA鏈的延長過程中也是必需的(Shapiro & Krug，1988，J.Virol.622285-2290)，但不是RNA鏈起始所必需的(Honda，et al，1988，J.Biochem.1041021-1026)。
流感病毒通過HA吸附到細胞膜的糖蛋白和糖脂類的唾液酸寡糖上。繼病毒體的內吞之后，HA分子的構象改變發生在細胞的核內體，促進膜融合，這樣就引發了病毒粒子的脫殼。核殼體遷移到細胞核，其中進行的病毒mRNA轉錄是感染的重要起始階段。病毒mRNA通過一個獨特的機制進行轉錄，其中病毒核酸內切酶切割來自于細胞的異種mRNA的“帶有帽子”的5’末端，然后將其作為引物通過病毒的轉錄酶轉錄病毒RNA模板。在距離模板末端的15-22堿基處終止轉錄，在此寡核苷酸(U)序列作為加入模板非依賴的多聚(A)尾的信號。這樣制備的8個病毒mRNA分子中，有6個是單順反子，直接轉錄成HA、NA、NP所代表的蛋白和病毒多聚酶蛋白，PB2、PB1和PA(流感病毒已從人、哺乳動物和鳥類中分離，根據它們的表面糖蛋白、紅血球凝集素(HA)和神經氨酸酶(NA)進行分類)。
其它兩個轉錄子經過剪切，每一個轉錄子都產生2個mRNA，以不同的閱讀框架翻譯得到M1、M2、非結構蛋白-1(NS1)和非結構蛋白-2(NS2)。真核細胞通過產生包含干擾素的一組蛋白來抵御病毒感染。NS1蛋白通過抑制宿主菌中產生的干擾素而促進流感病毒的復制和感染。流感A病毒的NS1蛋白的長度是可變的(Parvinetal.，(1983)Virology 128512-517)，并可耐受其羧基末端的大段刪除而不影響其功能的完整性(Norton et al.，(1987)156(2)204-213)。NS1蛋白含有兩個功能域，即結合雙鏈RNA(dsRNA)的域和效應域。效應域位于蛋白的C末端區域。相對來說它的功能已得到很好的確定。詳細來說，效應區域是通過與宿主核蛋白相互作用來實現將核RNA輸出功能的(Qian et al.，(1994))J.Virol.68(4)2433-2441)。
NS1A蛋白的dsRNA結合域定位于它的氨基末端(Qian et al.，1994)。氨基末端的片段，其由起始的73個氨基末端的氨基酸組成[NS1A(1-73)]，具有全長蛋白的dsRNA結合特性(Qian et al.，(1995)RNA 1948-956)。NS1A(1-73)的NMR溶液和X-射線晶體結構顯示在溶液中其以獨特的六螺旋鏈折疊形成對稱的同源二聚體(Chien et al.，(1997)Nature Struct.Biol.4891-895；Liuet al.，(1997)Nature Struct.Biol.4896-899)。NS1A(1-73)域的每一個多肽鏈都由3個α-螺旋組成，相應的片段為Asn4-Asp24(螺旋1)，Pro31-Leu50(螺旋2)，和Ile54-Lys70(螺旋3)。NS1A(1-73)表面特征的初步分析表明有2個可能的核酸結合位點，一個包含大部分由堿性側鏈組成的螺旋2和2’的暴露于溶劑中的伸展，另一個在分子的相反位置，包括一些螺旋3和螺旋3’的賴氨酸殘基(Chien etal.，1997)。隨后進行的定點突變實驗顯示第二個α-螺旋中的兩個堿性氨基酸(Arg38和Lys41)側鏈是完整二聚體蛋白的dsRNA結合活性所必需的唯一氨基酸側鏈(Wang et al.，1999RNA 5195-205)。這些研究也證明NS1A(1-73)域的二聚化是dsRNA結合所必需的。然而，撇開結合dsRNA不談(例如，Hatada&Futada，(1992)J.Gen.Virol.，Vol.73(12)3325-3329；Lu et al.，(1995)Virology，214222-228；Wang et al.，(1999))，dsRNA的結合域的精確功能還沒有被確定。
本發明概述本發明應用了申請人關于NS1蛋白，特別是蛋白N-末端部分的dsRNA結合域是怎樣參與流感病毒的感染過程的發現。申請人發現NS1A蛋白的RNA結合域對流感A病毒的復制和致病性是至關重要的。申請人發現當NS1A的結合域在宿主細胞中與dsRNA結合時，宿主細胞無法激活它的病毒防御系統來抑制病毒蛋白的產生。NS1A結合dsRNA造成酶、雙鏈RNA激活蛋白激酶(“PKR”)保持無活性狀態，以至于它不能催化翻譯起始因子eIF2α磷酸化，否則此因子會抑制病毒蛋白的合成和復制。他人以前的報道顯示參與抑制PKR的氨基酸不包含結合dsRNA所必需的氨基酸。與這些報道相反的是，申請人還發現流感A和B病毒的NS1蛋白中的兩個氨基酸殘基(也就是，NS1A精氨酸38(R38)和賴氨酸41(K41)；NS1B精氨酸50(R50)和精氨酸53(R53))是RNA結合中的關鍵殘基，也以所述方式與dsRNA結合域的解除宿主細胞防御的能力有關。申請人發現根據上述，NS1A或NS1B與dsRNA有一個結構分界面，并限定了界面的結構性特征，它是藥物設計的靶點。申請人發明了一系列確定NS1A或NS1B與dsRNA之間相互作用的特征的檢測方法，可用于在小范圍和/或高通量篩選這種相互作用的抑制劑。申請人還發現一種氨基末端的片段，其由氨基端的初始93個氨基酸組成[NS1B(1-93)]，具有流感B病毒的全長NS1蛋白的dsRNA結合特性。
本發明的一個方面涉及具有抑制流感病毒活性的化合物的鑒定方法，其包含a)制備一個反應體系，其包括流感病毒NS1蛋白或其dsRNA結合域，與上述蛋白結合的dsRNA或其結合域，和候選化合物，和；b)檢測NS1蛋白和dsRNA間的結合程度，其在該化合物的存在下，與對照相比，NS1蛋白和dsRNA間的結合能力降低預示化合物對流感病毒有抑制活性。對鑒定的對流感具有抑制活性的化合物進行進一步實驗以確定它們是否適合作為藥物。通過這種方式，對流感病毒復制最有效的抑制劑可以在隨后的動物實驗中來確定，也可以用來治療(預防疾病或其它)包括人的動物的流感病毒感染。
相應的，本發明的另一個方面涉及具有抑制流感病毒活性的化合物的鑒定方法，包含a)制備一個反應體系，其包括一種流感病毒NS1蛋白或其dsRNA結合域，與上述蛋白結合的dsRNA或其的結合域，和候選化合物，和；
b)檢測NS1蛋白和dsRNA間的結合程度，其中在此化合物的存在下，與對照相比，NS1蛋白和dsRNA間的結合能力降低預示化合物對流感病毒有抑制活性；和c)檢測b)中鑒定的具有抑制活性的化合物在體外對流感病毒生長的抑制程度。
在一些實施方案中，此方法進一步需要d)確定c)中鑒定的具有在體外抑制流感病毒生長的化合物對非人動物中的流感病毒復制的抑制程度。
此外，本發明的另一個方面涉及一種在體內外抑制流感病毒復制的組合物的制備方法，其包括a)制備一個反應體系，其包括流感病毒NS1蛋白或其dsRNA結合域，與上述蛋白結合的dsRNA或其結合域，和候選化合物；b)檢測NS1蛋白和dsRNA間的結合程度，其中在此化合物的存在下，與對照相比，NS1蛋白和dsRNA間的結合能力降低預示化合物對流感病毒有抑制活性；c)檢測b)中鑒定的具有抑制活性的化合物在體外對流感病毒生長的抑制程度；d)檢測c)中鑒定的在體外抑制流感病毒生長的化合物在非人動物中抑制流感病毒的復制程度；e)將d)中鑒定的在非人類的動物中抑制病毒復制的化合物以抑制有效劑量與載體一起配制以制備組合物。
在上述本發明的每一個方面中，一些實施方案需要用熒光分子標記NS1蛋白或dsRNA，然后通過熒光共振能量轉移或熒光偏振確定結合的程度。在其它實施方案中，對照是dsRNA和NS1蛋白或缺少R38和/或R41氨基酸殘基的dsRNA結合域之間的結合程度。其它實施方案需要流感病毒NS1蛋白/dsRNA復合物形成的鑒定方法。然而，仍有其它的實施方案需要利用流感病毒NS1蛋白/dsRNA復合物形成的方法篩選或優化抑制劑。這些實施方案包括NS1蛋白NMR化學位移擾動或RNA凝膠過濾沉降平衡，以及利用NS1蛋白的結構和NS1-RNA復合物模型進行的有效篩選。
本發明的另一個方面涉及含有反應混合物的組合物，其包括流感病毒NS1蛋白或其dsRNA結合片段，與上述蛋白結合的dsRNA。在一些具體的實施方案中，NS1蛋白是NS1A蛋白，或其dsRNA結合片段，蛋白N端的73個氨基酸殘基。在另一些實施方案中，NS1蛋白是NS1B蛋白或其dsRNA結合片段，蛋白N端的93個氨基酸殘基。在另外一些實施方案中，組合物進一步含有被檢測對流感病毒的抑制活性的候選物被檢化合物。
本發明的另一個方面涉及鑒定能用來治療流感病毒感染的化合物的方法，其包括在藥物篩選實驗中利用NS1蛋白或其dsRNA結合域、NS1A(1-73)或NS1B(1-93)的結構，以及NS1-RNA復合物模型的三維等同物。
本發明的這些和其它方面將參考下圖和詳細說明來得到更好的闡述。
本專利的文件含有至少一幅彩色圖。本專利的帶彩圖的復制件將經要求和支付必要的費用后由專利和商標局提供。
附圖簡述
圖1不同的雙鏈體結合NS1A(1-73)能力的凝膠位移分析。該實驗是在標準的條件下利用指定的32P-標記的雙鏈核苷酸(1.0nM)和有(+)、沒有(-)0.4μM的NS1A(1-73)下進行的。
圖2在NS1A(1-73)存在下不同的雙鏈體的凝膠過濾色譜圖(A)dsRNA；(B)RNA-DNA雜交體；(C)DNA-RNA雜交體；(D)dsDNA。除了(A)中的第一個峰來源于NS1A(1-73)-dsRNA復合物以外，20分鐘到30分鐘間的主峰都對應于雙鏈體。
圖3純化的NS1A(1-73)-dsRNA復合物的凝膠過濾色譜(A)4μM，100μl新鮮的復合物樣品；(B)4μM，100μl制備一個月后的復合物樣品。
圖4(A)根據16000轉/分鐘時的沉降平衡確定3個樣品的化學計量，載樣濃度為0.6(□)、0.3(△)和0.5(沒有顯示以避免數據點重疊)個吸收單位。實線是假設dsRNA∶NS1復合物是1∶1化學計量時，三組數據的聯合擬合；插圖顯示擬合的隨機殘留圖。帶點的線是假設dsRNA∶NS1復合物是1∶2化學計量而畫的。(2∶1復合物具有與帶點的線所顯示的幾乎相同的濃度分布圖，這是因為dsRNA和NS1蛋白的幾乎相同的降低的分子量(參見infra))。(B)3個樣品(見上)在16000(□)，22000(○)和38000(△)轉每分鐘的速度時估計的沉降平衡的解離常數。在此只顯示出了載樣濃度為0.5個吸收單位時的數據。實線是利用一個理想的NONLIN單-二聚體模型的整體擬合，利用Eq.7根據擬合結果計算解離常數。插圖顯示擬合的殘留圖。
圖5(A)2.0mM均一的15N-富集的NS1A(1-73)在20℃，pH6.0的含有50mM醋酸銨和1mM疊氮化鈉的95％H2O/5％D2O的溶液中的二維1H-15N的HSQC圖譜。交叉的峰用各自的共振定位來標出，其中顯示氨基酸的一個字母的代碼和序列號。同時也顯示出色氨酸側鏈NH共振和谷氨酰胺及天冬酰胺側鏈的NH2的共振。定位的精氨酸的Nε-Hε共振峰從高磁場中的位置在F1(15N)維經過了折疊。(B)以1HN-15N的HSQC譜表示的15N-富集的NS1A(1-73)和16-bp dsRNA在pH6.0，20℃條件下不形成復合物(紅色)和形成復合物(藍色)的覆蓋圖。標記相應于游離蛋白質的良好分辨的交叉峰的酰胺骨架定位。
圖6(A)NS1A(1-73)的帶狀圖表顯示化學位移擾動測量的結果。在NS1A(1-73)-dsRNA復合物的NMR譜中，產生位移擾動的NS1A(1-73)殘基用藍綠色標出，對其酰胺基的15N和1H的化學位移沒有改變的殘基用粉紅色標出，白色代表由于互相重疊的交叉峰造成的二維HSQC譜中無法鑒別的殘基的化學位移定位。(B)圖6B中顯示的側鏈在此也用所有標記的堿性殘基列出。注意NS1A(1-73)和dsRNA的結合抗原決定簇似乎在結構的底部。
圖7純化的NS1A(1-73)-dsRNA復合物(A)，雙鏈體和NS1A(1-73)的混合物RNA-DNA雜交體(B)，以及DNA-RNA雜交體(C)的CD譜。橙色混合物(雙鏈體和蛋白二聚體摩爾比率為1∶1)的實驗CD光譜。紅色雙鏈體自身。藍色NS1A(1-73)自身。綠色計算的雙鏈體和NS1A(1-73)的總光譜。
圖8NS1A(1-73)的dsRNA結合特性的模型。此模型對驗證暗示假設而設計的實驗是有用的。磷酸鹽骨架和dsRNA的堿基對分別以橙色和黃色顯示。所有的精氨酸和賴氨酸側鏈都以綠色標出。
實施本發明的最好方式本發明提供設計來自流感A和B病毒NS1蛋白的dsRNA結合域的特異抑制劑的方法。流感A病毒NS1蛋白的dsRNA結合域的氨基酸序列，特別是R38和K41殘基實質上是保守的。流感A病毒的各種株的NS1蛋白的多序列比對在表1中描述。
此外，示例性的，流感A病毒的各種株的NS1蛋白的氨基酸序列在下面列出。
流感A病毒A/Udorn/72的NS1蛋白的氨基酸序列1 MDPNTVSSFQ VDCFLWHVRK RVADQELGDA PFLDRLRRDQ KSLRGRGSTL GLDIETATRA61 GKQIVERILK EESDEALKMT MASVPASRYL TDMTLEEMSREWSMLIPKQKVAGPLCIRMD121 QAIMDKNIIL KANFSVIFDR LETLILLRAF TEEGAIVGEI SPLPSLPGHTAEDVKNAVGV181 LIGGLEWNDN TVRVSETLQR FAWRSSNENG RPPLTPKQKR EMAGTIRSEV流感A病毒A/鵝/廣東/3/1997(H5N1)的NS1蛋白的氨基酸序列1 MDSNTITSFQ VDCYLWHIRK LLSMSDMCDA PFDDRLRRDQ KALKGRGSTL GLDLRVATME61 GKKIVEDILK SETNENLKIA IASSPAPRYV TDMSIEEMSREWYMLMPRQKITGGLMVKMD121 QAIMDKRIIL KANFSVLFDQ LETLVSLRAF TESGAIVAEI SPIPSVPGHSTEDVKNAIGI181 LIGGLEWNDN SIRASENIQR FAWGIRDENG GPSLPPKQKR YMAKRVESEV流感A病毒A/QUAIL/NANCHANG/12-340/2000(H1N1)的NS1蛋白的氨基酸序列1 ELGDAPFLDR LRRDQKSLKG RGSTLGLNIE TATCVGKQIV ERILKEESDE AFKMTMASAL61 ASRYLTDMTI EEMSRDWFML MPKQKVAGPLCVRMDQAIMD KNIILKANFSVIFDRLETLT121 LLRAFTEEGA IVGEISPLPS LPGHTNEDVK NAIGVLIGGL EWNDNTVRVS ETL流感A病毒gi|577477|gb|AAA56812.1|[577477]的NS1蛋白的氨基酸序列
1 MDSNTVSSFQ VDCFLWHVRK RFADQEMGDA PFLDRLRRDQ KSLGGRGSTL GLDIETATRA61 GKQIVEPILE EESDEALKMT IASAPVSRYL PDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIRMD121 QAIMDKNITL KANFSIIFDR LETLILLRAF TEEGAIVGEISPVPSLPGHTDEDVKNAIGV181 LIGGLEWNDN TVRDSETLQR FAWRSSNEDR RPPLPPKQKR KMARTIESEV流感A病毒gi|413859|gb|AAA43491.1|[413859]的NS1蛋白的氨基酸序列1 MDSNTVSSFQ VDCFLWHVRK RFADQERGDA PFLDRLRRDQ KSLRGRGSTL GLDIETATCA61 GKQIVERILK EESDEALKMT IASVPASRYL TDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIRMD121 QAIMDKNIIL KANFSVIFDR LETLILLRAF TEEGAIVGEI SPLPSLPGHTDEDVKNAIGV181 LIGGLEWNDN TVRVSETLQR FAWRSSNEDG RPPFPPKQKR KMARTIESEV流感A病毒gi|325085|gb|AAA43684.1|[325085]的NS1蛋白的氨基酸序列1 MDSNTVSSFQ VDCFLWHVPK RFADQKLGDA PFLDRLRRDQ KSLRGRASTL GLDIETATRA61 GKQIVERILE EESNEALKMT IASVPASRYL TDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIRMD121 QAIMEKSIIL KANFSVIFDR LETLILLRAF TEEGAIVGEI SPLHSLPGHTDEDVKNAVGV181 LIGGLEWNGN TVRVSENLQR FAWRSRNENE RPSLPPKQKR EVAGTIRSEV流感A病毒gi|324876|gb|AAA43572.1|[324862]的NS1蛋白的氨基酸序列1 NTVSSFQVDC FLWHVRKRFA DQELGDAPFL DRLRRDQKSL RGRGSTLGLD IETATRAGKQ61 IVERILVEES DEALKMTIVS MPASRYLTDM TLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIRMDQAI121 MDKNIILKAN FSVISDRLET LILLRAFTEE GAIVGEISPL PSLPGHTDEDVKNAIGDLIG181 GLEWNDNTVR VSETLQRFAW RSSNEDGRPL LPPKQKRKMA RTIESEV
流感A病毒gi|324862|gb|AAA43553.1|[324862]的NS1蛋白的氨基酸序列1 MDPNTVSSFQ VDCFLWHVRK QVADQELGDA PFLDRLRRDQ KSLRGRGSTL GLNIETATRV61 GKQIVERILK EESDEALKMT MASAPASRYL TDMTIEEMSRDWFMLMPKQKVAGPLCIRMD121 QAIMDKNIIL KANFSVIFDR LETLILLRAF TEAGAIVGEI SPLPSLPGHTNEDVKNAIGV181 LIGGLEWNDN TVRVSKTLQR FAWRSSDENG RPPLTPK流感A病毒gi|324855|gb|AAA43548.1|[324855]的NS1蛋白的氨基酸序列1 NTVSSFQVDC FLWHVLKRFA DQELGDAPFL DRLRRDQKSL RGRGSTLGLD IETATRAGKQ61 IVERILEEES DEALKMNIAS VPASRYLTDM TLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIRMDQAI121 MDKNIILKAN FSVIFDRLET LILLRAFTEE GAIVGEISPL PSLPGHTDEDVKNAIGILIG181 GLEWNDNTVR VSETLQRFAW RSSNEDGRPP LPPKQKWKMA RTIEPEV流感A病毒gi|324778|gb|AAA43504.1|[324778]的NS1蛋白的氨基酸序列1 NTVSSFQVDC FLWHVRKRFA DLELGDAPFL DRLCRDQKSL RGRSSTLGLD IETATRAGKQ61 IVERILEEES DETLKMTIAS APAFRYPTDM TLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIRMDQAI121 MDKNIILKAN FSVIFDRLET LILLRAFTEE GAIVGEISPL PSLPGHTNEDVKNAIGDLIG181 GLEWNDNTVR VSETLQRFAW RSSNEGGRPP LPPKQKRKMA RTIESEV流感A病毒A/PR/8/34的NS1蛋白的氨基酸序列1 MDSNTITSFQ VDCYLWHIRK LLSMRDMCDA PFDDRLRRDQ KALKGRGSTL GLDLRVATME61 GKKIVEDILK SETDENLKIA IASSPAPRYI TDMSIEEISREWYMLMPRQKITGGLMVKMD121 QAIMDKRITL KANFSVLFDQ LETLVSLRAF TDDGAIVAEI SPIPSMPGHSTEDVKNAIGI181 LIGGLEWNDN SIRASENIQR FAWGIRDENG GPPLPPKQKR YMARRVESEV
流感A病毒A/火雞/俄勒岡州/71(H7N5)的NS1蛋白的氨基酸序列1 MDSNTITSFQ VDCYLWHIRK LLSMRDMCDA PFDDRLRRDQ KALKGRGSTL GLDLRVATME61 GKKIVEDILK SETDENLKIA IASSPAPRYI TDMSIEEISREWYMLMPRQKITGGLMVRPL121 WTRG流感A病毒A/香港/1073/99(H9N2)的NS1蛋白的氨基酸序列1 MDSNTVSSFQ VDCFLWHVRK RFADQELGDA PFLDRLRRDQ KSLRGRGSTL GLDIRTATRE61 GKHIVERILE EESDEALKMT IASVPASRYL TEMTLEEMSRDWLMLIPKQKVTGPLCIRMD121 QAVMGKTIIL KANFSVIFNR LEALILLRAF TDEGAIVGEI SPLPSLPGHTDEDVKNAIGV181 LIGGLEWNDN TVRVSETLQR FTWRSSDENG RSPLPPKQKR KVERTIEPEV流感A病毒A/Fort Monmouth/1/47-MA(H1N1)的NS1蛋白的氨基酸序列1 MDPNTVSSFQ VDCFLWHVRK RVADQELGDA PFLDRLRRDQ KSLKGRGSTL GLNIETATRV61 GKQIVERILK EESDEALKMT MASAPASRYL TDMTIEEMSRDWFMLMPKQKVAGPLCIRMD121 QAIMDKSIIL KANFSVIFDR LETLILLRAF TEEGAIVGEI SPLPSLPGHTNEDVKNAIGV181 LIGGLEWNDN TVRVSKTLQR FA流感B病毒的變株也具有相似的dsRNA的結合域。流感B病毒的各種各樣的變株的NS1蛋白的多序列比對在表2中描述。
此外，僅通過例子，流感B病毒的各種各樣的變株的NS1蛋白的氨基酸序列在下面列出。
流感B病毒(B/Lee/40)的NS1蛋白的氨基酸序列
1 MADNMTTTQI EVGPGATNAT INFEAGILEC YERFSWQRAL DYPGQDRLHR LKRKLESRIK61 THNKSEPENK RMSLEERKAI GVKMMKVLLF MDPSAGIEGPEPYCVKNPSTSKCPNYDWTD121 YPPTPGKYLD DIEEEPENVD HPIEVVLRDM NNKDARQKIK DEVNTQKEGKFRLTIKRDIR181 NVLSLRVLVN GTFLKHPNGD KSLSTLHRLN AYDQNGGLVA KLVATDDRTVEDEKDGHRIL241 NSLFERFDEG HSKRIRAAET AVGVLSQFGQ ERRLSPEEGD N流感B病毒B/Memphis/296的NS1蛋白的氨基酸序列1 MADNMTTTQI EVGPGATNAT INFEAGILEC YERLSWQRAL DYPGQDRLNR LKRKLESRIK61 THNKSEPESK RMSLEERKAI GVKMMKVLLF MDPSAGIEGFEPYCMKSSSNSNCPKYNWTD121 YPSTPGRCLD DIEEEPEDVD GPTEIVLRDM NNKDARQKIK EEVNTQKEGKFRLTIKRDIR181 NVLSLRVLVN GTFLKHPNGY KSLSTLHRIN AYDQSGRLVA KLVATDDLTVEDEEDGHRIL241 NSLFERLNEG HSKPIRAAET AVGVLSQFGQ EHRLSPEEGD N流感B病毒gi|325264|gb|AAA43761.1|[325264]的NS1蛋白的氨基酸序列1 MADNMTTTQI EVGPGATNAT INFEAGILEC YERLSWQRAL DYPGQDRLNR LKRKLESRIK61 THNKSEPESK RMSLEERKAI GVKMMKVLLF MNPSAGIEGFEPYCMKNSSNSNCPNCNWTD121 YPPTSGKCLD DIEEEPENVD DPTEIVLRDM NNKDARQKIK EEVNTQKEGKFRLTIKRDIR181 NVLSLRVLVN GTFLKHPNGY KSLSTLHRLN AYDQSGRLVA KLVATDDLTVEDEEDGHRIL241 NSLFERFNEG HSKPIRAAET AVGVLSQFGQ EHRLSPEEGD N流感B病毒B/Ann Arbor/1/66[gi|325261|gb|AAA43579.1|[325261]]的NS1蛋白的氨基酸序列
1 MADNMTTTQI EVGPGATNAT INFEAGILEC YERLSSQRAL DYPGQDRLNR LKRKLESRIK61 THNKSEPESK RMSLEERKAI GVKMMKVLLF MNPSAGIEGFEPYCMKNSSNSNCPNCNWTD121 YPPTPGKCLD DIEEEPENVD DPTEIVLRDM NNKDARQKIK EEVNTQKEGKFRLTIKRDIR181 NVLSLRVLVN GTFLKHPNGY KSLSTLHRLN AYDQSGRLVA KLVATDDLTVEDEEDGHRIL241 NSLFERFNEG HSKPIRAAET AVGVLSQFGQ EHRLSPEEGD N流感B病毒gi|325256|gb|AAA43756.1|[325256]的NS1蛋白的氨基酸序列1 MADNMTTTQI EVGPGATNAT INFEAGILEC YERFSWQRAL DYPGQDRLHR LKRKLESRIK61 THNKSEPENK RMSLEERKAI GVKMMKVLLF MDPSAGIEGFEPYCVKNPSTSKCPNYDWTD121 YPPTPGKYLD DIEEEPENVD HPIEVVLRDM NNKDARQKIK DEVNTQKEGKFRLTIKRDIR181 NVLSLRVLVN GTFLKHPNGD KSLSTLHRLN AYDQNGGLVA KLVATDDRTVEDEKDGHRIL241 NSLFERFDEG HSKPIRAAET AVGVLSQFGQ EHRLSPEEGD N流感B病毒(B/Shangdong/7/97)的NS1蛋白的氨基酸序列1 MADNMTTTQI EVGPGATNAT INFEAGILEC YERLSWQRAL DYPGQDRLNR LKRKLESRIK61 THNKSEPESK RMSLEERKAI GVKMMKVLLF MDPSAGIEGFEPYCMKSSSNSNYPKYNWTD121 YPSTPGRCLD DIEEETEDVD DPTEIVLRDM NNKDARQKIK EEVNTQKEGKFRLTIKRDIR181 NVLSLRVLVN GTFLKHPNGY KSLSTLHRLN AYDQSGRLVA KLVATDDLTVEDEEDGHRIL241 NSLFERLNEG HSKPIRAAET AVGVLSQFGQ EHRLSPEEGD N流感B病毒(B/Nagoya/20/99)的NS1蛋白的氨基酸序列
1 MADNMTTTQI EVGPGATNAT INFEAGILEC YERLSWQRAL DYPGQDRLNR LKRKLESRIK61 THNKSEPESK RMSLEERKAI GVKMMKVLLF MDPSAGIEGFEPYCMKSSSNSNYPKYNWTN121 YPSTPGRCLD DIEEETEDVD DPTEIVLRDM NNKDARQKIK EEVNTQKEGKFRLTIKRDIR181 NVLSLRVLVN GTFLKHPNGY KSLSTLHRLN AYDQSGRLVA KLVATDDLTVEDEEDGHRIL241 NSLFERLNEG HPKPIRAAET AVGVLSQFGQ EHRLSPEEGD N流感B病毒(B/Saga/S172/99)的NS1蛋白的氨基酸序列1 MADNMTTTQI EVGPGATNAT INFEAGILEC YERLSWQRAL DYPGQDRLNR LKRKLESRIK61 THNKSEPESK RMSLEERKAI GVKMMKVLLF MDPSAGIEGFEPYCMKSSSNSNCPKYNWTD121 YPSTPGRCLD DIEEEPEDVD GPTEIVLRDM NNKDARQKIK EEVNTQKEGKFRLTIKRDIR181 NVL8LRVLVN GTFLKHPNGY KSLSTLHRLN AYDQSGRLVA KLVATDDLTVEDEEDGHRIL241 NSLFERLNEG HSKPIRAAET AVGVLSQFGQ EHRLSPEEGD N流感B病毒(B/Kouchi/193/99)的NS1蛋白的氨基酸序列1 MADNMTTTQI EVGPGATNAT INFEAGILEC YERLSWQRAL DYPGQDRLNR LKRKLESRIK61 THNKSEPESK RMSLEERKAI GVKMMKVLLF MDPSAGIEGFEPYCMKSSSNSNCPKYNWTD121 YPSTPGRCLD DIEEEPEDVD GPTEIVLRDM NNKDARQKIK EEVNTQKEGKFRLTIKRDIR181 NVLSLRVLVN GTFLKHPNGY KSLSTLHRLN AYDQSGRLVA KLVATDDLTVEDEEDGHRIL241 NSLFERLNEG HSKPIRAAET AMGVLSQFGQ EHRLSPEEGD N這樣，利用發明中公開的任何一種NS1蛋白或它的與dsRNA結合的片段(有完整NS1A的R38、K41殘基，有完整NS1B的R50、R53殘基)可以鑒定對流感A病毒和流感B病毒株有抑制活性的化合物。
本發明不需要蛋白質是自然界存在的。也可以使用NS1蛋白的類似物，只要它具有與自然界存在的蛋白相當功能的dsRNA結合特異性。代表性的類似物包括蛋白的片段，例如，dsRNA的結合域。除了NS1蛋白的片段，類似物還可以通過替換，刪去或增加一個或更多氨基酸而與天然存在的蛋白有所區別。例如，功能相當的氨基酸殘基可以通過替換序列中的殘基來改變序列。這樣的替換可以選自屬于同類的其它的氨基酸；例如，非極性的(疏水的)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；和正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸；負電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。可以改變NS1A的R38和K41殘基，但有一定限制。例如，申請人確定用賴氨酸殘基置換R38，沒有觀察到對RNA的結合有影響，然而，用丙氨酸替換時就破壞了這種結合活性，表明在這個位置正電荷的堿性氨基酸側鏈(例如，賴氨酸或精氨酸)是這些dsRNA-蛋白相互作用所必需的；用剩余的17個天然的常見氨基酸的任何一個替換，象丙氨酸一樣，都能預見到活性被破壞。然而在優選的實施方案中，R38和K41殘基是完整的。上述說明對NS1B的R50和R53殘基同樣是適用的。對于本發明的目的，術語“dsRNA結合域”是指包括與自然界存在的蛋白在結合dsRNA方面有相當功能的NS1蛋白的類似物。
本發明的NS1蛋白可根據現有的手冊進行制備。流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA結合域可從天然來源獲得，例如，利用本領域已知的蛋白分離技術，分別從流感病毒感染的細胞和病毒中純化；通過本領域已知的重組DNA技術生產(見例如，Sambrook et al.，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratories Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)；和/或利用本領域已知技術全部或部分化學合成；例如，多肽可以通過固相技術合成，從樹脂上切割，利用制備性高效液相純化(見例如，Creighton，1983，ProteinStructures and Molecular Principles，W.H.Freeman&Co.，N.Y.，pp.50-60)。在Qian et al.，RNA1(9)948-56(1995)和Chien et al.，(1997)中已報道NS1A1-73氨基酸限定的多肽的生物合成實驗方法，其帶有或不帶有適合NMR分析的同位素標記。合成的多肽的組成可以通過氨基酸分析或測序得以確定；例如，利用Edman降解法(見例如，Creighton，1983，supra atpp.34-49)。
申請人的另一個發現是流感病毒非結構蛋白1的NS1A(1-73)dsRNA結合域與在大多數真核和原核蛋白中發現的dsRNA結合域的主要類別，即dsRBMs是不同的。含有dsRBM域的蛋白包括真核蛋白激酶R(PKR)(Nanduri et al.，1998)，該激酶在細胞抗病毒反應中起關鍵作用，Drosophila melonogaster Staufen(Ramos et al.，2000)，和Escherichia coli RnaseIII(Kharrat et al.，1995)。dsRBM域包含一個單體的α-β-β-β-α折疊。結構分析已確定這個域跨越靶dsRNA的兩個小溝和介于其間的大溝(Ryter&Schultz，1998)。dsRBM域的幾個氨基酸參與直接的以水作為媒介的磷酸二酯骨架、核糖2’-OH基團以及少量的堿基之間的相互作用。這種結合的結果是，典型的A-型dsRNA雙鏈體在復合物形成時扭曲。這種結合相對來說是較強的，Kd約1納摩爾。這樣，本發明的方法利用了存在于感染的真核細胞中的病毒蛋白和dsRNA之間專門發生的現象。因此，根據本發明的方法鑒定的化合物或許并不影響正常的細胞功能。
申請人還發現NS1A蛋白的RNA結合域的細胞內的功能之一是通過結合dsRNA阻止PKR的活化。申請人生產編碼NS1A蛋白的重組A/Udorn/72病毒，其僅缺失了RNA結合功能。由于38位R(R38)和41位K(K41)是唯一的RNA結合所必需的氨基酸，我們用A替換其中一個或兩個氨基酸。這3個突變的病毒都大大消弱了毒力R38和K41突變病毒形成針狀噬菌斑，雙重突變(R38/K41)不能形成可見的噬菌斑。用任何一個突變病毒對A549細胞的高復數感染期間，PKR被活化，eIF2a被磷酸化，病毒蛋白合成被抑制。令人意外的是，在PKR被激活后，PKR被降解。R38/K41雙重突變在誘導PKR活化方面是最有效的。
NS1A(1-73)結合dsRNA，但不結合dsDNA或RNA/DNA雜交體。NS1A(1-73)和全長的NS1A蛋白已顯示與雙鏈RNAs(dsRNAs)非序列特異性結合(Lu et al.，(1995)Virology 214，222-228，Qianet al.，(1995)RNA 1，948-956，wang et al.，1999)，但直到本發明，一直沒有確定NS1A(1-73)或NS1A蛋白能否與RNA-DNA雜交體或雙鏈DNA結合。申請人將NS1A(1-73)和四個32P-標記的雙鏈體一起孵育16-bp的dsRNA(RR)，dsDNA(DD)和兩個RNA-DNA雜交雙鏈體(RD和DR)。然后將這些混合物在一個自制的15％聚丙烯酰胺凝膠(圖1)上分析。和其他人報道的一樣(Roberts and Crothers(1992)Science 258，1463-1466；Ratmeyer et al.，(1994)Biochemistry33，5298-5304；Lesnik and Preier(1995)Biochemistry 34，10807-10815)，申請人觀察了游離的雙鏈體在自制的凝膠上的遷移方式(最快-最慢)DD＞DR/RD＞RR(泳道分別是1，3，5和7)。更重要的是，發現僅dsRNA和NS1A(1-73)形成復合物，產生一個30％凝膠位移(泳道2)，然而，所有其它的雙鏈都不能和蛋白結合(泳道4，6和8)。這些數據表明在這樣的條件下，NS1A(1-73)能特異性的識別dsRNA(A型構象)的有別于dsDNA(B型構象)或RNA/DNA雜交體(介于A/B構象之間)的構象和/或結構特征。
dsRNA的長度和核苷酸序列不是關鍵的。在此所述的一些工作例子中，本發明的方法可利用一個短的合成的16-堿基對(bp)的dsRNA進行操作，來鑒定蛋白質RNA相互作用的方式的關鍵特征。這個dsRNA分子有一個來自于通常使用的29bp的dsRNA結合底物的序列，可以將質粒pGEM1的多接頭的有義和反義轉錄子退火而少量制備(Qian etal.，1995)。根據沉降平衡的測量手段，NS1A(1-73)與這個合成的16-bp的dsRNA雙鏈在溶液中的結合化學計量大約為1∶1(1個蛋白質二聚物和一個dsRNA雙鏈分子)，其雙分子解離常數(Kd)在微摩爾范圍內。申請人建議其作為適合的dsRNA底物分子可在高通量結合分析中使用。NMR化學位移擾動實驗顯示NS1A(1-73)的dsRNA-結合抗原決定簇是與反向平行螺旋2和2’相關的，和前面的通過定點突變研究中所示一樣(Wang et al.，1999)。純化的NS1A(1-73)-dsRNA復合物的圓形二色性(CD)光譜和游離的dsRNA和NS1A(1-73)的總的CD光譜是相似的，說明作為結合的結果，蛋白或它的A-型靶dsRNA很少發生或沒有發生變化。此外，由于已表明NS1A(1-73)既不與相應的DNA-DNA雙鏈體也不與DNA-RNA雜交雙鏈體結合，NS1A(1-73)似乎識別特定的規范的A-型RNA的構象特征，這樣，另一個重要的方式，本發明的方法精確的模仿流感病毒NS1蛋白和它的宿主間的相互作用。
本發明的方法有利于在體外的高通量分析的情況下應用。在本發明的這個實施方案中，分析體系可以使用一個或同時使用標準的熒光共振能量轉移或熒光偏振方法以及標記的dsRNA分子，或者NS1A或NS1A(1-73)，或NS1B或NS1B(1-93)分子，來檢測這些靶蛋白和各種dsRNA雙鏈間的相互作用，測量結合親和性。根據上面揭示的NS1蛋白的結構，這些分析將用來篩選化合物以鑒定抑制靶NS1和RNA底物間的相互作用的分子。
根據本發明，可檢驗各種各樣的對流感病毒有抑制活性的化合物，包括隨機的和偏向的化合物庫。偏向的化合物庫是利用靶NS1-RNA底物相互作用的位點，例如，根據已發表的結果推論的特殊的結構特征而設計。見例如，Chien et al.，Nature Struct.Biol.4891-95(1997)；Liu et al.，Nature Struct.Biol.4896-899(1997)；和Wang et al.，RNA 5195-205(1999)。
干擾NS1A蛋白和病毒復制所需要的dsRNA間的相互作用的化合物的篩選方法流感病毒的NS1蛋白或其dsRNA結合域，與它相互作用和結合的dsRNA在本文中有時候稱為“結合伴侶”。許多分析體系中的任何一種都可用來檢驗化合物干擾結合伴侶間的相互作用的能力。然而篩選大量化合物的快速高通量分析，包括但不僅限于配基(天然的或合成的)，也優選多肽或小的有機分子。通過此方法鑒定的干擾結合伴侶間的相互作用的化合物應通過基于細胞水平的實驗，動物模型的體系和在本文中描述的病人來進一步評價其抗病毒活性。用來鑒定干擾流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA結合域，與dsRNA間相互作用的化合物的分析體系的基本的原理包括在一定條件下制備含有流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA結合域與dsRNA的反應混合物，反應進行足夠的時間來允許兩個結合伴侶相互作用和結合，從而形成一個復合物。為了檢驗化合物的抑制活性，反應在有和沒有被檢驗的化合物的存在的條件下進行，例如，被檢測的化合物可以在一開始加入到反應混合物中，或在加入流感病毒NS1蛋白，或它的dsRNA結合域，和dsRNA之后一段時間后加入；對照是在沒有被檢測的化合物或有安慰劑的條件下孵育的。然后檢測流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA結合域，與dsRNA間形成的復合物。在對照反應中形成復合物，但在含有被檢測化合物的反應混合物中沒有形成復合物表明化合物干擾流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA結合域與dsRNA間的相互作用。
本發明的另一個方面包括有效篩選可用來治療流感病毒感染的化合物的方法，包括在藥物篩選分析中利用流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA結合域NS1A(1-73)或NS1B(1-93)的結構和NS1-RNA復合物模型的三維同等物。
本發明的另一方面包括利用復合物模型的三維同等物設計化合物庫用以篩選的方法。
相應的，本發明提供鑒定可用來治療流感病毒感染的化合物和藥物的方法。這樣一個實施方案包含鑒定用作流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA結合域的抑制劑的化合物的方法，以及含有來自于流感A或B病毒NS1蛋白或它的dsRNA結合域的三維同等物的數據庫。優選與計算機模擬聯用而進行的篩選。
在一個實施方案中，潛在的化合物是通過根據流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA結合域的三維同等物進行合理藥物設計而篩選的。如上所述，優選和計算機模擬聯用而進行的篩選。然后潛在的化合物與流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA結合域，及dsRNA接觸，干擾它們之間的結合，然后確定化合物抑制結合的能力(例如測量)。當流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA結合域與dsRNA結合能力降低時，潛在的化合物被鑒定為抑制結合的化合物。或者，潛在的化合物接觸和/或加到流感病毒感染的細胞培養液，測定了病毒培養物的生長。當病毒培養物的生長降低時，潛在的化合物被鑒定為有抑制病毒生長能力的化合物。
在一個優選的實施方案中，方法進一步包括分子置換分析和二代候選藥物的設計，此藥物是通過利用藥物的三維同等物的合理藥物設計進行篩選的。優選與計算機模型聯用進行的篩選。然后利用本文中舉例的標準的生化方法在大量的藥物篩選分析中檢驗候選藥物。本發明的這些例子中NS1A蛋白的三維同等物和NS1A-dsRNA復合物模型或NS1B-dsRNA復合物模型為(a)設計用來篩選的抑制劑庫，(b)先導化合物的合理優化，和(c)潛在抑制劑的虛擬篩選提供了方法。
有可能應用的本發明的方法中的其它分析組成和各種形式在下面的部分中描述。
分析組成可以將分析體系中使用的結合伴侶之一直接的或間接的標記，來測定NS1蛋白或dsRNA結合部分與dsRNA間的結合程度。根據以下詳細描述的分析形式，結合程度可以以流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA結合域，與dsRNA間的絡合作用的形式，或在候選化合物存在下，事先形成的復合物的解離程度來測定。可以使用適合標記體系的任意一種包括但不限定于如125I的放射性同位素；暴露于底物時，產生可檢測的比色信號或光的酶標體系；和熒光標記。
利用重組DNA技術來產生流感病毒的NS1蛋白或它的dsRNA結合域與分析中的dsRNA結合伴侶有利于工程化融合蛋白，所述融合蛋白能促進標記、固定和/或檢測。例如，流感病毒的NS1蛋白或它的dsRNA結合域的編碼序列能與具有酶活性或作為酶底物的異源蛋白融合，以促進標記和檢測。融合構建物應該設計成使融合產物的異源組分不干擾流感病毒的NS1蛋白或它的dsRNA結合域與dsRNA結合。
間接標記包括使用第三個蛋白，例如標記的抗體，其與流感病毒的NS1蛋白，或它的dsRNA結合域特異結合。這種抗體包括但不限定于多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達庫產生的片段。
為了生產抗體，用流感病毒的NS1蛋白，或它的dsRNA結合域注射免疫各種宿主動物。這樣的宿主動物可包括但不限定于兔，小鼠和大鼠，僅指出一些。根據宿主的種，可使用各種佐劑來增加免疫反應，包括但不限定于Freund’s(完全和不完全)，礦物凝膠如氫氧化鋁，表面活性劑如溶血卵磷脂，復合多元醇，聚陰離子，肽，油乳，鎖眼形血藍蛋白，二硝基酚和潛在的有使用價值的人佐劑例如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌菌苗。
可以利用任何連續培養細胞生產抗體分子的技術制備單克隆抗體。這些技術包括但不限定于由Kohler和Milstein首次描述的雜交瘤技術(Nature，1975，256495-497)，人B-細胞雜交瘤技術(Kosboret al.，1983，Immunology Today，472，Cote et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.，802026-2030)和EBV-雜交瘤技術(Cole et al.，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。此外，發展的生產“嵌和抗體”的技術也可以使用(Morrison et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.，816851-6855；Neuberger et al.，1984，Nature，312604-608；Takeda et al.，1985，Nature，314452-454)，即通過將來自于鼠的適合的抗原特異性的抗體分子的基因和來自于人的適合的生物活性抗體分子的基因拼接在一起。或者，可以采用生產單鏈抗體(U.S.Pat.No.4,946,778)的技術來產生特異性的針對流感病毒的NS1蛋白，或它的dsRNA結合域的單鏈抗體。
可識別特定抗原決定簇的抗體片段可以通過已知技術生產。例如，這樣的片段包括但不僅限于通過用胃蛋白酶消化抗體分子而產生的F(ab’)2片段和通過還原F(ab’)2片段的二硫橋而產生的Fab片段。或者，可以構建Fab表達庫(Huse et al.，1989，Science，2461275-1281)來對帶有預期的特異性的單克隆Fab片段進行快速的容易的檢測。
分析形式可以以多相或均相的形式進行分析。多相分析包括將結合伴侶之一錨定在固相上，檢測反應末錨定在固相上的復合物。均相分析中，整個反應在液相中進行。在任何一個方法中，可以改變加入反應物的順序來獲得被檢化合物的不同信息。例如，檢驗干擾結合伴侶間相互作用的化合物，例如通過競爭，可以在被檢測底物的存在下進行反應而鑒定；也就是提前或同時將被檢測底物和流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA結合域，和dsRNA加入到反應混合物中。另一方面，破壞預先形成的復合物的化合物，例如化合物有更高的結合常數從復合物置換其中一個結合伴侶，可以通過在已形成復合物以后的反應混合物中加入檢測化合物而鑒定。以下將簡單描述各種形式。
在多相分析體系中，結合伴侶之一，例如，流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA結合域，或dsRNA被錨定在固相表面，用直接或間接方法標記沒有被錨定的結合伴侶。實際上，使用微孔板更方便。錨定的部分可以通過非共價或共價附著以固定。或者，可以使用對流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA結合域特異的已固定的抗體來將流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA結合域錨定在固相表面上。可以事先制備和貯藏此表面。
為了進行分析，將固定的部分的結合伴侶加入到用或不用檢測化合物覆蓋的表面。反應完成后，移去沒有反應的組分(例如通過漂洗)，任何形成的復合物仍將固定在固相表面。可以使用許多方法檢測錨定在固相表面的復合物。當結合伴侶被事先標記時，檢測固定在表面的標志顯示形成了復合物。當結合伴侶沒有被事先標記時，可以使用間接標記來檢測錨定在固相表面的復合物；例如，使用對結合伴侶特異的標記抗體(反過來，可以直接標記抗體或用標記的抗Ig的抗體間接標記抗體)。根據反應組分的加入順序，可以檢測抑制復合物形成或破壞事先形成的復合物的被檢化合物。
備選地，可以在液相中在被檢化合物存在或不在的條件下進行反應，將反應產物從未反應的組分中分離并檢測復合物；例如，使用對流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA結合域特異的固定的抗體，來錨定溶液中形成的任何復合物。再次的，根據液相中反應組分的加入順序，可以檢測抑制復合物形成或破壞事先形成的復合物的被檢化合物。
本發明的其它實施方案可以使用均相分析。在此方法中，制備事先形成的流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA結合域與dsRNA的復合物，其中結合伴侶之一被標記，但標記產生的信號因復合物的形成而淬滅(見例如，Rubenstein的U.S.Pa t.No.4,109,496,利用這種方法進行免疫分析)。和事先形成的復合物競爭并置換結合伴侶之一的檢測物質的加入會造成背景之上的信號的產生。以這種方法，可以鑒定破壞流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA結合域與dsRNA的相互作用的被檢物質。
例如，一個特定的例子是使用之前描述的重組DNA技術制備流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA結合域用來固定化。利用融合載體pGEX-5X-1，它的編碼域可以融合到谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)基因中，以這種方式在產生的融合蛋白中保留它的結合活性。可以通過上述的和本領域常規的方法純化流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA結合域，用來產生對NS1或NS1片段特異的單克隆抗體。這種抗體可以用放射同位素125I標記，例如，通過本領域常規的方法。在多相分析中，例如可以將GST-NS1融合蛋白錨定在谷胱甘肽-瓊脂糖珠上。然后在被檢化合物存在或不在的條件下加入dsRNA以使dsRNA與融合蛋白的NS1部分相互作用而結合。在被檢化合物加入后，可以洗去未結合的物質，在體系中加入標記的NS1特異的單克隆抗體以使其結合到復合的結合伴侶上。通過測量谷胱甘肽-瓊脂糖珠上殘留的放射活性的量檢測NS1和dsRNA間的相互作用。被檢化合物對相互作用的成功抑制會引起測量到的放射活性降低。
或者在液相中沒有固體谷胱甘肽-瓊脂糖珠時，將GST-NS1融合蛋白和dsRNA混合起來。被檢化合物可以在結合伴侶相互作用期間或之后加入。然后將混合物加至谷胱甘肽-瓊脂糖珠并洗去未結合的物質。通過測量谷胱甘肽-瓊脂糖珠上殘留的放射活性的量檢測NS1和dsRNA間的相互作用的抑制程度。
根據本發明，抑制一種病毒的給定化合物可以用來檢測對大范圍不同的流感病毒的全面的抗病毒活性。例如，不限定于此方法，根據下文所說的分析，可以檢測通過和NS1結合位點結合而抑制流感A病毒NS1和dsRNA間相互作用的化合物對流感A病毒和流感B病毒的不同的變株。
為了篩選藥物研發中潛在的先導化合物，已鑒定的對靶NS1和RNA底物間的相互作用的抑制劑可首先在組織培養，然后在動物模型實驗中進一步驗證它們對流感病毒復制的抑制能力。利用高和低的感染復數確定每個抑制劑的有效抑制流感病毒復制的最低濃度。
病毒生長實驗前述的分析體系中確定的抑制劑的阻止病毒生長的能力可以通過噬菌斑形成或其它的病毒生長的指數分析，例如TCID50或在雞胚尿囊中的生長。這些實驗中，用野生型的流感病毒感染合適的細胞系或含胚卵，在感染時或感染后將被檢化合物加入到組織培養基中。被檢化合物的效果通過病毒顆粒形成定量進行評價，由感染細胞或感染的雞胚尿囊液上清測定的紅血球凝集素(HA)滴定量；通過病毒噬菌斑的呈現；或不呈現噬菌斑表型的情況下，通過TCID50或在雞胚尿囊中的生長指數，或紅血球凝集素分析而評價。抑制劑可以通過被檢化合物抑制HA滴定量或噬菌斑形成，或降低病毒感染的細胞或雞胚尿囊的細胞病變效果的能力，或降低在紅血球凝集素分析中測定的病毒顆粒形成的能力而評價。
動物模型實驗通過本發明的方法鑒定的對病毒復制最有效果的抑制劑可以用來進行后續的動物實驗。抑制劑阻止流感病毒復制的能力可以在天然的或改造的流感宿主的動物模型中分析。這些動物可以包括如豬，雪貂，小鼠，猴，馬和靈長類的哺乳動物，或鳥類。和在此詳述的一樣，這些動物模型可用來確定動物中的LD50和ED50，這些數據可用來獲得NS1A(1-73)或NS1B(1-93)和dsRNA相互作用的抑制劑的治療指數。
經高通量篩選確定的抑制劑表征的NS1蛋白或它的dsRNA結合域表面的結合位點有助于優化設計先導化合物。這些表征可以利用核磁共振化學位移擾動NMR和NMR共振定位而進行。NMR可以確定小分子抑制劑對RNA的結合位點。對這些結合位點的定位可以為聯合多起始抑制劑先導物和先導物設計的優化提供數據。
藥物制備和給藥方法已鑒定的抑制病毒復制的化合物可以在治療有效的劑量下讓病人服用來治療病毒感染。治療有效劑量是指足夠導致病毒感染癥狀緩解的化合物的量。
這類化合物的治療效率和毒性可通過細胞培養或實驗動物中標準的藥學程序來確定，例如，確定LD50(使50％動物死亡的劑量)和ED50(使50％動物有效治療的劑量)。毒性和治療有效的劑量比值是治療指數，可表示成比例LD50/ED50。優選顯示大的治療指數的化合物。使用表現有毒副作用的化合物的同時，要小心設計一個將此化合物靶向定位到感染部位的輸送體系，來最大限度減少藥物對不感染的細胞的損傷并減少副作用。
從細胞培養分析和動物研究中獲得的數據可以用來計算在人身上使用的劑量范圍。優選包括有很少或沒有毒性的ED50的循環濃度范圍內的化合物劑量。劑量可根據使用的劑型和給藥方式在此范圍內變動。本發明的方法中使用的任一種化合物，可以從最初的細胞培養實驗中估計有效劑量。在動物模型中計算劑量以實現包括在細胞培養中確定的IC50(也就是，獲得半數最大感染，或半數最大抑制的被檢化合物的濃度)的循環血漿濃度范圍。這些信息可用來更精確的確定人類中的使用劑量。可以測量血漿中的水平，例如，通過高效液相層析。
根據本發明使用的藥物組合物可以用傳統的方式用一個或更多的生理可接受的載體或賦形劑配制。
這樣，化合物和它們的生理可接受的鹽和溶劑化鹽可配制成通過吸入或吹入(或通過口或鼻)或口服、口腔、非腸道或直腸的給藥方式用藥。
對于通過吸入的給藥方式，本發明使用的化合物可便利的以氣霧噴射呈現的形式，用適合的推進劑例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合適的氣體，從壓力器或噴射式霧化器中輸送。在使用壓力氣霧劑的情況下，可通過提供一個閥門輸送一定數量的氣體而確定劑量單位。在吸入或吹入的給藥方式中使用的例如明膠的膠囊和藥桶可制成含有化合物和如乳糖或淀粉的合適的粉末基的粉末混合物。
對于口服的給藥方式，藥物組合物通過常規的方法用制藥上可接受的賦形劑如粘結劑(例如，預糊化的玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羥丙甲纖維素)；填充劑(例如，乳糖，微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂，滑石或硅石)；崩解劑(例如，馬鈴薯淀粉或羥基乙酸淀粉鈉)；或潤濕劑(例如，月桂基硫酸鈉)制備成如片劑或膠囊的形式。可用本領域已知的方法給片劑包衣。口服藥物的液體制劑可采用，如溶液，糖漿或懸浮液的形式，或它們以干產品的形式出現但在使用前用水或其它適當的介質配成。可通過常規方式加入制藥上可接受的添加劑，例如懸浮劑(例如，山梨醇糖漿，纖維素衍生物或氫化的可食用脂肪)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯樹膠)；非水媒介(例如，杏仁油，油酯，酒精或分餾的植物油)；和防腐劑(例如，對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸)制備液體制劑。制劑中也可以含有適量的緩沖鹽，調味品，色素和甜味劑。
口服給藥的制劑可以適當的配制成活性化合物的可控制釋放形式。
口腔給藥的組合物可采用常規方式配制成片劑或止咳糖漿的形式。
化合物可以配制成通過注射的非腸道給藥形式，例如，通過大丸藥注射或連續灌輸。用來注射的制劑可以以單位劑量形式呈現，例如，在加有防腐劑的安瓿或多劑量容器中。組合物可采用懸浮液，溶液，或油介質或水介質的乳狀液的形式，可含有賦形劑例如，懸浮，穩定和/或分散劑。或者，活性的組分以粉狀的形式與適合的介質例如，無熱源的無菌水在使用前配成。
化合物也可制成直腸給藥的組合物如栓劑或滯留型灌腸劑，例如，含有傳統的如可可油或其它的甘油酯的栓劑基。
除了前述的制劑以外，化合物也可以制成儲存劑型。這種長效制劑可通過移植(例如皮下或肌肉內)或通過肌肉注射給藥。這樣，例如，化合物可與適當的聚合或疏水材料(例如作為可接受的油中的乳液)或離子交換樹脂，或以惰性的(Sparingly)可溶衍生物，例如，惰性的可溶鹽的形式進行配制。
如果希望的話，組合物可存在于包裝或分配器中，其可包含含有活性組分的一個或多個單位劑量形式。例如此包裝可包括金屬或塑料薄片，例如硬質泡沫塑料襯墊包裝。此包裝或分配器和用藥說明書放在一起。
本發明并不限定于在本文中所述的實施方案，只要不脫離本發明的范圍都可以修飾或改變。
實施例1蛋白樣品的制備用編碼NS1A(1-73)的表達載體pET11a轉化E.coli BL21(DE3)細胞培養物，在37℃的條件下培養，然后在菌體密度OD600＝0.6時，用1mM IPTG在含有均一富集的15NH4Cl和13C6-葡萄糖分別作為唯一的氮源和碳源的MJ最小培養基(Janssonet al.，(1996)J.Biomol.NMR 7，131-141.)中誘導5個小時。細胞經超聲破碎，接著在4℃，100,000×g的條件下離心1個小時。然后根據別處描述的方法，使用Pharmacia FPLC系統的離子交換和凝膠過濾層析方法從上清中純化蛋白(Qian et al.，(1995)RNA 1，948-956.)。純化的NS1A(1-73)的總產量每升培養液約5毫克。蛋白的濃度是利用5750M-1Gm-1單體摩爾消光系數(ξ280)在280nm的吸光度(A280)而確定。
實施例2RNA寡聚體的合成和純化利用標準的亞磷酰胺化學(Wincott et al.，(1995)Nucleic Acids Res.23，2677-2684)在一個DNA/RNA合成儀Model 392(Applied Biosystem，InC.)化學合成兩個單鏈(ss)的16-核苷酸(16-nt)RNA，CCAUCCUCUACAGGCG(有義)和CGCCUGUAGAGGAUGG(反義)。然后將這兩個RNA寡聚體通過Bio-Rad Econo-Pac 10DG柱脫鹽，通過20％(w/v)聚丙烯酰胺，7M尿素變性膠的制備凝膠電泳純化。將通過UV影像觀察的適當的產物條帶切去，壓碎，在溫和的搖動過夜的條件下將產物提取到90mM Tris-硼酸，2mM EDTA，pH8.0的緩沖液中。將得到的溶液通過凍干而濃縮并使用Econo-Pac 10DG柱再次脫鹽。然后將純化的RNA寡聚物再次凍干，在-20℃保存。含有同樣序列的類似的16-nt有義和反義DNA鏈可以從Genosys Biotechnologies，Inc購買。根據260nm處的吸收(A260)利用下面的摩爾消光系數(□260，在20℃的M-1cm-1)(+)RNA，151 530；(-)RNA，165 530；(+)DNA，147 300；(-)DNA，161 440；dsRNA，262 580；RNA/DNA，260 060；DNA/RNA，273 330；dsRNA，275 080計算核酸樣品濃度。單鏈的消光系數是由20℃單體和二聚體的消光系數計算的(Cantor et al.，(1965)J.Mol.Bio.13，65-77)，假定摩爾吸收率是最近鄰域特性和寡核苷酸在20℃是單鏈(Hung et al.，(1994)，Nucleic Acids Res.22，4326-4334)。雙鏈的摩爾消光系數從20和90℃的A260值利用下列表達式計算ε(260，20°)＝[A，260，20°)/A，260， 90°)]×ε(260，90°，calc)，在此，ε(260，90°，calc)是假定雙鏈在90℃的溫度下完全溶解時從單鏈的總和而獲得的摩爾消光系數。
實施例3聚丙烯酰胺凝膠移位結合分析合成的單鏈16-nt的RNA和DNA寡核苷酸在其5’端利用T4多核苷酸激酶用[γ32P]ATP標記并用變性尿素-PAGE純化。將摩爾比約1∶1單鏈(ss)有義RNA(或DNA)和反義RNA(或DNA)在50mM Tris，100mM NaCl，pH8.0的緩沖液中。將溶液在90℃加熱2分鐘然后緩慢冷卻到室溫將雙鏈退火。將最終濃度為0.4μM NS1A(1-73)分別加入到20μl的結合緩沖液(50mM Tris-甘氨酸，8％的甘油，1mM二硫蘇糖醇，50納克/微升的tRNA，40單位的RNasin，pH8.0)中的四個雙鏈(ds)核酸中(dsRNA(RR)，RNA-DNA(RD)和DNA-RNA(DR)雜交體，和dsDNA(DD)，10,000cpm，終濃度約等于1納摩爾)。將反應混合物冰浴30分鐘。蛋白-核酸復合物在4℃，15％非變性PAGE在150伏電壓電泳6個小時，在50mM Tris-硼酸，1mMEDTA，pH8.0的緩沖液中從游離的雙鏈或單鏈寡聚體中溶解。
實施例4凝膠過濾層析分析4個16-nt的雙鏈體(RR，RD，DR和DD)的微摩爾溶液用10mM磷酸鉀，100mM KCl，50μM EDTA，pH7.0緩沖液制備并如上述方法退火。然后利用Superdex-75HR 10/30凝膠過濾柱(Pharmacia)從沒有退火的或過剩的單鏈中純化這些雙鏈，然后將雙鏈調節濃度至4μM。然后將每一種雙鏈核酸加入到1.5mMNS1A(1-73)(單體的濃度)中使雙鏈和蛋白摩爾比例為1∶1。在Superdex-75HR 10/30柱(Pharmacia)上進行凝膠過濾層析。用四個標準蛋白校準此柱白蛋白(67kDa)，卵清蛋白(43kDa)，胰凝乳蛋白酶原A(25kDa)和核糖核酸酶A(13.7kDa)。在10mM磷酸鉀，100mM KCl，50μM EDTA，pH7.0緩沖液中在20℃進行層析，流速為0.5毫升每分鐘。將1∶1摩爾比的蛋白-雙鏈樣品上柱，通過它們的A260檢測流出部分的核酸的存在；由于與核酸雙鏈相比NS1A(1-73)的ε260相對小，可以忽略它對UV吸收的貢獻。
實施例5NS1A(1-73)-DSRNA復合物的純化收集相應于凝膠過濾層析中的第一個峰的摩爾比為1∶1的NS1A(1-73)二聚體和dsRNA混合物部分，用Centricon濃縮器(Amicon，Inc.)濃縮到1毫升以下。然后將這個濃縮樣品再次上到同樣的凝膠過濾柱上再次收集主要的流出部分。純化的NS1A(1-73)-dsRNA復合物的濃度通過測量260nm處的UV吸收而確定。通過將4μM樣品加樣100μl，利用分析型凝膠過濾對立即制備的和制備一個月以后的樣品檢測復合物的純度和穩定性。
實施例6沉降平衡利用一個Beckman XL-I儀器在25℃進行沉降平衡實驗。為獨立評價這些自由組分的行為，利用Beckman 8-道12毫米路徑的charcoal-Epon室在30K至48K轉每分鐘的速度下進行NS1A(1-73)和dsRNA的短柱層析，上樣濃度分別為0.2-2毫克每毫升和0.2-0.6毫克每毫升。利用雷利干擾光學系統獲得數據。為了研究NS1A(1-73)二聚體和dsRNA的結合行為，利用Beckman 6-道(1.2厘米路徑)的charcoal-Epon室在16K至38K轉每分鐘的速度下對用凝膠過濾層析純化的復合物的樣品進行長柱層析。利用UV吸收光學系統在260nm，上樣濃度為0.3，0.5和0.6吸收單位時獲得這些數據。為確保樣品平衡，短柱每隔0.5小時共4小時，長柱每隔1-6個小時共28小時進行測量。利用WINMACH(由Yphantis，D.A.和Larry，J開發，由National Analytical Ultracentrifugation Facility at TheUniversity of Connecticut供銷)程序計算，當分開一個小時的兩次掃描間的區別對于雷利干擾光學在0.005-0.008的范圍內，或對于吸光度在0.005OD之時，確定已建立了平衡。
利用WINNL106程序，根據原始的非線性最小平方程序NONLIN(Johnson et al.，1981)的Windows95版本進行數據分析。這些數據要么是每一個數據集中針對特定上樣濃度和速度的分別的擬合，要么是幾個數據集的組合中針對不同的上樣濃度和/或速度聯合的擬合。整體擬合是指通過利用所有的數據集和作為普通參數處理的結合常數InK一起進行得到。為了避免偏離Beer’s定律而造成的復雜化，除非標明，吸收數據用與基線區不同的OD≤1.0截斷值編輯。
NS1A(1-73)的偏微比體積vNS1和溶劑密度ρ，在25℃利用sednterp程序(Laue et al.，1992)經計算分別為0.7356和1.01156。dsRNA的微比體積vRNA，通過dsRNA樣品的沉降平衡實驗確定為0.5716(詳見結論)。NS1A(1-73)-dsRNA復合物微比體積v復合物，假定1∶1化學計量利用Cohn和Edsall(Cohn&Edsall，1943)方法計算為0.672。
實施例7解離常數的計算1∶1的NS1A(1-73)-dsRNA復合物解離常數是根據原始溶液中游離NS1A(1-73)蛋白和游離dsRNA的量是等摩爾的假設計算的。如果在這些測定中使用的經凝膠過濾純化的復合物樣品實際上是1∶1化學計量時，該假設是有效的。在這種情況下，游離的dsRNA和游離的NS1A(1-73)的量對應從1∶1復合物中解離的量。此外，由于NS1A(1-73)二聚體和dsRNA的分子量降低(在下面Eq.2中定義)的差別僅是3％，將兩個自由的大分子當作在沉降期間具有同樣的流體動力類型處理。沉降平衡時理想系統的ith類型的濃度分配可以表示成Ci(r)=Ci(r1)eσi(r2/2-r2/2)----(Eq.1)]]>(Johnson et al.，1981)其中C(r)i是在半徑為r時ith組分的重量濃度，r’是柱溶液中的一個參考位置。上述等式中的□i是降低的分子量(Yphantis&Waugh，1956)σi＝Mi(1-viρ)ω2/RT. (Eq.2)Eq.2中的Mi和vi是ith種類的分子量和偏微比體積，R是氣體常數，T是絕對溫度，ω是角速度。濃度通常用重量濃度標度(毫克每毫升)表示，然而，在本例中用摩爾濃度m，mi＝CI/Mi更方便。
基于質量守恒原理(Van Holde&Baldwin，1958)，dsRNA可由下式表示 質量mo是指原始溶液的濃度，m(r)指沉降平衡時半徑為r的濃度。下標“RNA，t”，“RNA，游離”和“RNA，x”是分別指dsRNA，游離的dsRNA和NS1A(1-73)-dsRNA復合物中的dsRNA的總量；Tm和rb分別是指溶液柱中半月板和底部的半徑值。為了簡化以下結果，r’被設定為在rm的位置。綜合等式3然后得到
其中m(rb)RNA，游離和m(rb)RNA，x分別指在溶液柱底部的游離的dsRNA和NS1A(1-73)-dsRNA復合物中的dsRNA的濃度。同樣的等式也可以表示NS1A(1-73)蛋白。在moRNA等于moNS1時得到等式 利用對于特定蛋白RNA復合物σRNA≈σNS1的事實，Eq.5顯示在參考位置m(r’)RNA，游離＝m(r’)NS1，游離，這樣，在任何半徑r時m(r)RNA，游離＝m(r)NS1，游離。
最終，沉降平衡時半徑r的吸收可表示成A260(r)=Exm(r1)RNAeσRNA(r2/2-r2/2)+(1/Ex)Ka[Exm(r1)RNAeσRNA(r2/2-r2/2)]2----(Eq.6)]]>在上面的等式中，Ex＝(εRNA+εNS1)l，其中ε是消光系數，l是光學距離。Ka是摩爾濃度標度表示的結合常數，在mRNA＝mNS1的條件下以函數mx和mRNA袁示(Eq.7)。
Ka＝mx/mRNA2(Eq.7)這樣，在沉降期間NS1A(1-73)和dsRNA的結合體系被簡化為一個兩個組分的簡單體系。它易于用擬合參數K2＝Ka/Ex和理想的單體-二聚體自我結合的NONLIN模型進行擬合，NS1A(1-73)和dsRNA復合物的解離常數，Kd從下面的等式中計算KD＝1/(ExE2). (Eq.8)實施例8NMR光譜學所有的NMR數據都是在20℃在4道的Varian INOVA500和600NMR分光計體系中收集的。使用程序VNMR(Varian Associates)，NMRCompass(Molecular Simulations，Inc.)，和AUTOASSIGN(Zimmerman et al.，(1997)J.Mol.Biol.269，592-610)進行數據的處理和分析。質子化學位移參考內2，2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸；13C和15N的化學位移間接參考使用各自的磁旋比，13C∶15N(0.251449530)和13N∶15H(0.101329118)(Wishart et al.，(1995)J.Biomol.NMR 6，135-140)。
實施例9NS1A(1-73)序列特異性定位用于定位的游離的13C，15N-NS1A(1-73)NMR樣品在Shigemi易感性相配的NMR試管中制備，其中有270μl含有50mM醋酸銨和1mM疊氮化鈉，pH 6.0的95％H2O/5％D2O溶液中二聚體蛋白濃度為1.0-1.25mM。通過13C，15N-富集的蛋白的三共振NMR光譜自動分析，利用計算機程序AUTOASSIGN(Zimmerman etal.，(1997)J.Mol.Biol.269，592-610)確定骨架1H，13C，15N和13C□共振定位。AUTOASSIGN的輸入包括來自于二維1H-15N HSQC和三維HNCO光譜的峰值列表，同時還有來自于3個內部殘基[HNCA，CBCANH，和HA(CA)NH]和3個相互殘基[CA(CO)NH，CBCA(CO)NH和HA(CA)(CO)NH]實驗的峰值列表。這些脈沖序列和優化參數的詳細情況在別處已評述(Montelione et al.，(1999)，Berliner，L.J.，和Krishna，N.R.，Eds，Vol.17，pp 81-130，Kluwer Academic/Plenum Publishers，New York)。AUTOASSIGN所用的峰值列表是利用NMRCompass通過自動峰值采集而產生，然后手工編輯以移去明顯的噪音峰和人為的光譜。然后通過手工分析三維HCC(CO)NH TOCSY(Montelione et al.，(1992)J.Am.Chem.Soc.114，10974-10975)，HCCH-COSY(Ikruaet al.，(1991)J.Biomol.NMR 1，299-304)和15N-編輯的TOCSY(Fesik et al.，(1988)J.Magn.Reson.78，588-593)實驗和二維TOCSY光譜，記錄的混合時間為32，53和75ms(Celda和Montelione(1993)J.Magn.Reson.Ser.B 101，189-193)獲得側鏈共振定位(除了芳香環側鏈的13C定位以外)。
實施例10NMR化學位移擾動實驗如上所述純化和制備15N-富集的NS1A(1-73)。先使用250μl15N-富集的NS1A(1-73)，0.1mM二聚體，在50mM醋酸銨中，1mM疊氮化鈉，5％D2O，pH6.0溶液來收集游離蛋白的1HN-15N HSQC光譜。16-nt的有義和反義RNA鏈以1∶1摩爾比例在200mM醋酸銨，pH7.0的溶液中退火，凍干3次，以同樣的NMR樣品緩沖液溶解，最終的RNA雙鏈濃度為10mM。然后用這個高度濃縮的dsRNA溶液來滴定游離15N-富集的NS1A(1-73)NMR樣品，制備比例為(二聚體蛋白)比(dsRNA)為2∶1、1∶1、1∶1.5和1∶2的蛋白-dsRNA樣品。為了預防NS1A(1-73)的沉淀，樣品溶液是通過將游離的蛋白溶液緩慢加入到濃縮的dsRNA中而制備。游離的15N-富集的NS1A(1-73)的HSQC光譜用每增量為80次掃描和200×2048復合物數據點獲得，在t1維的調零之后轉入1024×2048點。利用每增量320次掃描以同樣的數字分析收集dsRNA滴定法測量實驗的HSQC光譜。
實施例11CD測量利用配備有1厘米路徑長度的小室的Aviv模型62-DS分光偏振計在20℃，200-350納米區記錄CD光譜。從1.1毫升，4μM上述磷酸鹽緩沖液中的樣品獲得四個核酸雙鏈(RR，RD，DR，DD)的CD光譜。然后每一個雙鏈和1.5mM NS1A(1-73)(單體濃度)結合形成蛋白和雙鏈1∶1的摩爾比。在同樣的條件下收集這些蛋白-雙鏈混合物的CD光譜，假定每個樣品的總雙鏈濃度仍然是4μM。也獲得了在相同的磷酸鹽緩沖液中4μM濃度的1.1毫升的游離NS1A(1-73)和柱純化的NS1A(1-73)-dsRNA復合物的CD光譜。利用來自于游離NS1A(1-73)和每一個雙鏈核酸各自的CD數據的總和獲得計算的蛋白-雙鏈混合物的CD光譜。CD光譜敘述為εL-εR，單位為M-1cm-1每摩爾核苷酸。
實施例12通過凝膠過濾層析對NS1A(1-73)-DSRNA復合物的純化和表征上述的四個NS1A(1-73)-核酸雙鏈混合物進一步利用分析型凝膠過濾層析分析復合物的形成。NS1A(1-73)-dsRNA混合物在260納米檢測(圖2A)的層析圖中顯示兩個主要的峰，而含有dsDNA和RNA/DNA的混合物只被洗脫為一個峰(圖2B，C，D)。由于層析洗脫液檢測在260納米處的吸收，這些層析圖反映核酸在這些樣品中的狀態。在dsRNA的例子中(圖2A)，快一點和慢一點的洗脫峰分別相應于NS1A(1-73)-dsRNA復合物和未結合的dsRNA雙鏈。對于更快的洗脫峰的洗脫時間和相應的分子量(～26kDa)與1∶1化學計量(蛋白二聚體對dsRNA)的復合物是一致的。在層析條件下使用了復合物組分中約70％的RNA和蛋白werte。其它樣品中沒有觀察到相應于復合物形成的峰。這些結果進一步為NS1A(1-73)與dsRNA，而不是與在此研究中的dsDNA或RNA/DNA雜交體特異性結合提供了證據。在后續的實驗(例如，沉降平衡和CD)和評價復合物的長期穩定性(圖3)之前也使用制備型凝膠過濾層析純化NS1A(1-73)-dsRNA復合物。新鮮純化的NS1A(1-73)-dsRNA復合物再次用色譜法分析產生一個相應于相對穩定和純的復合物的單峰(圖3A)。然而，在4℃存放一個月后觀察到游離dsRNA的增加(圖3B)，表明復合物在長時間時會緩慢的不可逆的分解。
實施例13沉降平衡游離NS1A(1-73)和DSRNA使用沉降平衡來確定NS1A(1-73)和16-bp dsRNA雙鏈間復合物形成的化學計量和解離常數。首先，利用多個加樣濃度和多轉速將純化的NS1A(1-73)蛋白和純化的dsRNA樣品進行短柱平衡層析。在溶液中NS1A(1-73)蛋白以二聚體形式存在，分子量為16,851克每摩爾，沒有明顯的解離信號(無數據)。在一些例子中，用于這些沉降平衡實驗的NS1A(1-73)樣品包括大的非特異聚集體的存在。每一個樣品聚集體形式的總量有所變化，而在高速度下從二聚體種類中分離。這預示聚集是一個緩慢的樣品依賴的聚集過程。接著，和dsRNA復合的蛋白樣品通過凝膠過濾純化，之后進行沉降平衡檢測(見圖3)。純化的dsRNA樣品在沉降期間表現為一種理想的單一組分溶液。將數據和NONLIN模型的單一組分的擬合而得到的估計的降低的分子量不隨載樣濃度和/或速度的改變而改變。這樣利用Eqn.2(見上)，根據估計的減少的分子量能夠計算dsRNA的微比體積。獲得的值，vRNA＝0.57單位，與典型的DNA(0.55-0.59單位)和RNA(0.47-0.55單位)的偏微比體積有很好的一致性(Ralston，1993)。vRNA的值離dsRNA比離典型的RNA樣品要更接近的事實的可能歸因于它的雙鏈構型。在減少的分子量中，據保守估計，大約有7％的誤差翻譯成微比體積中大約相同的誤差。在此分析中，假設復合物的形成對dsRNA和NS1A(1-73)蛋白的微比體積沒有顯著影響。
實施例14根據沉降平衡而得的復合物形成的化學計量和熱力學利用上述中制備的純化的并經分析型的凝膠過濾確定是均一的NS1A(1-73)-dsRNA復合物樣品研究NS1A(1-73)蛋白和dsRNA的結合(圖3A)。根據16000轉每分收集的數據確定復合物的化學計量(圖4A)。在這樣低的速度下，游離的dsRNA和NS1A(1-73)蛋白有一個小于0.5的σi值(Eqn.2)。在這樣低速度的條件下，兩個更低的分子量的種類(也就是，游離的NS1A(1-73)和游離的dsRNA)不再進行顯著的重新分配，這樣對吸收曲線有一個基線的貢獻。相應的，利用NONLIN(圖4A和表3)將這些數據擬合成一個理想的單組分模型。估計的表觀分子量(Mapp)約等于24.4kDa，與從相應的氨基酸和核苷酸序列計算的1∶1NS1A(1-73)-dsRNA復合物的分子量非常接近。相對低的RMS值和隨機的殘基圖(圖4A的插圖)顯示與1∶1化學計量很好的擬合。當數據用截去溶液柱的基底的OD260為0.8編輯時，這種擬合的質量得到進一步改善(表3)。估計的平均分子量26,100克每摩爾，在1∶1NS1A(1-73)-dsRNA復合物的公式分子量的約3％之內。這表明該純化的NS1A(1-73)-dsRNA復合物具有1∶1的化學計量。為了估計解離常數Kd，根據1∶1的化學計量，3個不同載樣濃度和3個速度的數據然后擬合成NONLIN的平衡單體-二聚體NONLIN模型(圖4B)。利用這個模型，當用小RMS值和隨機殘留曲線做判斷時，數據獲得了很好的擬合。為了確認這個擬合模型是正確的，單獨的數據集也分別或聯合應用不同的組合例如單個載樣濃度在3個不同的速度的數據，或不同的載樣濃度但在一個速度的數據，等等來擬合。對于每一個擬合，比較了不同的模型。在所有的例子中，單體-二聚體模型是最好的。一個例外是在16,000轉每分鐘得到的數據，其對于單組分體系和單體-二聚體模型同樣很好的擬合。也可能在室的底部用不同的截留值來編輯數據；這就導致了最終的擬合結果在0.8-1.5吸收單位的截去范圍彼此獨立。根據進行的特定的擬合，利用Eq.8計算的Kd值落在相對窄的范圍內，Kd＝0.4-1.4μM。
表3NS1A(1-73)-dsRNA復合物的表觀分子量
a通過260納米的吸收測定的初始的溶液的濃度。
b大于截留值的OD260數據沒有包括在擬合中。
c以吸收單位擬合的均方根值。
d表觀分子量，單位是千克每摩爾，是通過將數據與單組分的理想溶液擬合而估計的(圖4A)。數據或在每個載樣濃度單獨擬合或聯合擬合所有3個數據集。
e根據沉降平衡數據的表觀分子量(Mapp)與由相應的氨基酸和核酸序列計算的1∶1NS1A(1-73)-dsRNA復合物的分子量的比例(Mx)。
實施例15游離NS1A(1-73)的1H、15N和13C的共振定位確定游離的NS1A(1-73)蛋白的基本上完整的NMR共振定位，這是通過NMR分析它和dsRNA的復合物所需要的。總之，總共65/71(92％)的指定的15N-1HN位點利用AUTOASSIGN(Zimmerman et al.，(1997)J.Mol.Biol.269，592-610)自動定位。這種自動分析通過內部殘基和/或序列連通性提供71/78Hα、68/73Cα、64/71C’和44/68Cβ共振定位。接著進行的同樣的三共振數據的手工分析證實了這些AUTOASSIGN的結果，也完成了剩余的骨架原子和60/68Cβ的共振定位。定位了除Met1NH2、Pro31N和C末端殘基Ser73的C’以及Pro之前的殘基Ala30以外的所有骨架共振。然后獲得了所有殘基的完整的非-交換質子和質子化碳的完整側鏈定位(不包括芳香碳)。關于可交換側鏈基團，還定位了所有的ArgNεH、GlnNε2H、AspNδ2H和TrpNε1H共振，但在這些光譜中沒有觀察到ArgNηH或Ser和Thr的羥基質子。在20℃pH6.0的條件下，這些NS1A(1-73)的1H、13C和15N的化學位移數據已在BioMagResBank(http//www.bmrb.wisc.edu；登錄號4317)存放。
在圖5中顯示了20℃pH6.0時15N富集的NS1A(1-73)1H-15N HSQC光譜。所有骨架酰胺峰(除了Pro31和Met1的N末端)都標記了，如同ArgNεH、GlnNε2H、AspNδ2H和TrpNε1H的側鏈共振。總之，光譜展示了合理的好的化學位移分布，即使有一些簡并的15N-1HN交叉峰。例如，Arg37和Arg38殘基對HN、N、C’、Cα、Hα和Cβ幾乎有相同的化學位移。
實施例16利用化學位移擾動的抗原決定簇作圖通過收集一系列的1HN-15N HSQC光譜，和16bp的dsRNA一起完成了15N富集的NS1A(1-73)的滴定檢測。1H和15N核的化學位移對它們的局部的電子環境是敏感的，因此被用作標記蛋白和未標記RNA間相互作用的探針。觀察到和RNA直接接觸或參與結合RNA后主要的構象改變的殘基在電子環境中有最強的擾動。
記錄含有0.1mM NS1A(1-73)二聚體濃度的樣品，二聚體蛋白和dsRNA的依次降低的摩爾比例是2∶1、1∶1、1∶1.5和1∶2時的四個HSQC光譜。當這個比例達到5∶1以上時誘導蛋白質沉淀。在2∶1比例的樣品的HSQC光譜中，1HN-15N交叉峰非常寬，難以分析，表明蛋白有可能和dsRNA形成更大分子量的復合物。盡管引入更多的dsRNA以改善敏感度，等于或小于1∶1化學計量的光譜顯示僅有一組峰。由于NS1A(1-73)-dsRNA復合物的大分子量，新的復合物中的NS1A(1-73)的骨架定位未能完成。然而，通過比較游離的和dsRNA結合的NS1A(1-73)的HSQC光譜(圖5B，上述的滴定實驗中產生的數據)，盡管觀察到復合物的形成沒有影響螺旋3和3’中的骨架酰胺化學位移，但是幾乎所有的螺旋2和2’中的殘基顯示復合物形成時15N和1H位移擾動。另外，螺旋1和1’在復合物形成時也顯示化學位移擾動。結合時的15N-1H化學位移的變化由圖6中的游離NS1A(1-73)的三維結構中描述。在復合物形成(以藍綠色表示)時觀察到所有顯著的相應于NS1A(1-73)骨架原子的化學位移擾動，或在含有許多的精氨酸和賴氨酸的螺旋2和2’中，或在和螺旋2和2’有密切接觸的螺旋1和1’中(圖7B)。然而，骨架NHs殘基沒有經歷明顯的化學位移變化，顯示很少或沒有結構改變(以粉色表示)，趨向于遠離明顯的結合抗原決定簇。這些結果確定了dsRNA結合的抗原決定簇的區域在反向平行-螺旋2和2’中或周圍的鑒定，與前面的定點突變的研究是一致的(Wanget al.，(1999)RNA，5195-205)。進一步表明，由于遠離結合抗原決定簇的酰胺基的化學位移沒有被復合物的形成所擾動，所有的NS1A(1-73)的結構沒有因dsRNA的結合而嚴重破壞。
實施例17圓形二色性(CD)光譜圓形二色性為核酸和蛋白質的二級結構元件和完全的構象特征提供了有用的探針。對于蛋白質，CD光譜的180-240納米的區域主要反映骨架構象的種類(Johnson，W.C.，Jr.(1990)Proteins 7205-214)。一旦形成蛋白-核酸復合物在250納米以上觀察到CD光譜的變化主要是由于核酸二級結構的變化(Gray，D.M.(1996)Circular Dichroism and the ConformationAnalysis of Biomolecules，Plenum Press，New York，469-501)。四個16bp的雙鏈(RR、RD、DR和DD)的CD譜和它們各自的雙鏈類型(圖7，紅色的痕跡)是截然不同的并且是特有的(Gray and Ratliff(1975)Biopolymers 14487-498；Wells and Yang(1974)Biochemistry 131317-1321；Gray et al.，(1978)Nucleic AcidsRes.53679-3695)。RR雙鏈的特征是在295納米處有輕微的負方向帶，在210納米處有一個強的負帶，在260納米附近有一個正方向帶，是A-型dsRNA構象特有的特征(圖7A)(Huang et al.，(1994)NucleicAcids Res.254098-4105)。DD雙鏈在220納米以上有大致相同的正向和反向的帶，交叉的結果是在260納米處有一個典型的B-DNA(圖7D)的正向帶(Id.，Gray et al.，(1992)MethodsEnzymol.211389-406)。兩個雜交體RD和DR，顯示顯著的彼此不同的特點，然而這兩者都大致介于A-型dsRNA和B-型dsDNA結構之間(圖7B，7C)((Hung et al.，(1994)，Nucleic Acids Res.224326-4334)；Roberts和Crothers(1992)Science 2581463-1466；Ratmeyer et al.，(1994)Biochemistry 335298-5304；Lesnik和Freier(1995)Biochemistry 3410807-10815)；Clark et al.，(1997)Nucleic Acids Res.254098-4105。此外，在260納米的正向帶的強度看起來對有A特征的雜交雙鏈最敏感(Clark et al.，(1997)Nucleic Acids Res.254098-4105)。在圖7中顯示了在等摩爾量的RR、RD、DR或DD雙鏈存在時NS1A(1-73)的CD光譜(橙色痕跡)。
在dsRNA(圖7A)的例子中，使用凝膠過濾純化的NS1A(1-73)-dsRNA復合物用來避免游離dsRNA存在的干擾(見圖2和3)。也顯示了每一種情況中的游離的NS1A(1-73)的光譜(藍色痕跡)。NS1A(1-73)主要占據了CD光譜的200-240納米區(Qian et al.，(1995)RNA 1948-956)，而核酸雙鏈的結構信息主要占據250-320納米的區域。上述的凝膠位移分析和凝膠過濾數據顯示只有dsRNA底物和NS1A(1-73)形成復合物。然而，和圖8A所示的一樣，形成的復合物(黃色痕跡)沒能引起250-320納米區對核苷酸雙鏈構象最敏感的顯著的CD光譜變化。這些數據證明RNA雙鏈在蛋白-dsRNA復合物中主要保持它的A-型構象。此外，dsRNA-NS1A(1-73)的CD光譜(黃色)和簡單的加入游離的NS1A(1-73)和游離的dsRNA用計算機計算的光譜(綠色)在200-240納米區也非常相似，顯示NS1A(1-73)骨架結構也沒有因復合物的形成而廣泛的改變。盡管NS1A(1-73)沒有和其它雙鏈結合，也將每一個RD、DR和DD與等摩爾量的NS1A(1-73)混合而獲得的CD光譜作為對照(圖7B、C、D)。這些數據證實當這些分子的結構沒有改變時檢測到的混合物的CD光譜是與單獨的雙鏈和蛋白的光譜的總和是一致的。
由流感A病毒的NS1蛋白的N末端和兩個合成的寡核苷酸形成的16bp的dsRNA間的相互作用，已確定i)NS1A(1-73)和dsRNA結合，而不和dsDNA或相應的異種雙鏈結合；ii)NS1A(1-73)-dsRNA復合物顯示1∶1的化學計量和約等于1μ摩爾的的解離常數；iii)對稱相關的反向平行螺旋2和2’在結合靶dsRNA中起到重要的作用；iv)dsRNA的結構和NS1A(1-73)的骨架結構在它們復合物形成中比它們在相應的未結合分子中沒有顯著的改變。全面來說，這個信息為建立這個新的dsRNA結合基序和雙鏈RNA間的復合物的假設的模型提供了重要的生物物理證據。此外，這個信息確定了NS1A(1-73)和16bp dsRNA間的復合物是未來進行三維結構分析的一個適合的試劑，也就是說，它是一個均一的1∶1復合物。
實施例18NS1A(1-73)DSRNA復合物的生物物理特征凝膠位移聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠過濾層析和CD旋光分光學都顯示NS1A(1-73)特異性的與dsRNA結合，對同序列的dsRAN和雜交雙鏈沒有可檢測的親和性。文獻中的大量的光譜證據包括核磁共振、X射線、CD和Raman光譜研究已確定dsDNA是C2’-內部糖折疊的B-型構象特征，dsRNA采用一個以C3’-內部糖為特征的A-型結構，以及DNA/RNA雜交體顯示介于A-和B-型構象之間的中間構象(Huang.et al.，(1994)Nucleic Acids Res.224326-4334；Lesnik和Freier(1995)Biochemistry 3410807-10815；Dickerson et al.，(1982)Science 21675-85；Chou et al.，(1989)Biochemistry282435-2443；Lane et al.，(1991)Biochem.J.279269-81；Arnottet al.，(1968)Nature 220561-564；Egli et al.，(1993)Biochemistry 2541-50；Gyi et al.，(1996)，Biochemistry3512538-12548；Nishizaki et al.，(1996)Biochemistry354016-4025；Salazar et al.，(1996)Biochemistry358126-8135；Rice和Gao(1997)Biochemistry 36399-411；Hashem等，(1998)Biochemistry 3761-72；Gray et al.，(1995)MethodsEnzymol.24619-34)。
此外，規范的雙鏈的拓撲化是不同的，A-型以一個寬的，淺的小溝為特征，而B-型以一個窄的，深的大溝為特征。由于NS1A(1-73)僅明確與dsRNA結合，而沒有序列特異性，很明顯這個蛋白很大程度上是根據雙鏈構象區別這些核酸螺旋(也就是，A-型構象)。然而，不排除分子也根據雙鏈的每一個鏈的2’-OH基的存在而進行識別過程。這些結果為全長的NS1A蛋白和NS1A(1-73)和另一個靶RNA，在一個剪接體小核RNAs中的特定莖-突，U6 snRNA的結合提供了解釋(Qianet al.，(1994)J.Virol.682433-2441；Wang和Krug，(1996)Virology 22341-50)。假定這個U6 snRNA的莖突在溶液中形成了一個象dsRNA的A-型結構，允許NS1A(1-73)和U6 snRNA以本文中NS1A(1-73)和16-bp dsRNA片段為特征的類似方式形成復合物。
如上所述的沉降平衡實驗證實NS1A(1-73)二聚體和dsRNA雙鏈以1∶1的方式結合，解離常數Kd約為1μM。有趣的是，約30％的dsRNA在二聚體和雙鏈的摩爾比是1∶1的分子篩實驗中是未形成復合物的(圖2A)，在凝膠移位分析中檢測到更多的游離dsRNA(圖1)。發現未結合的dsRNA的部分從一個NS1A(1-73)制備物變化為另一個制備物，新鮮純化的復合物樣品的凝膠過濾層析中沒有觀測到未結合dsRNA(圖3A)。此外，觀察到復合在長期存放時會緩慢解離(圖3B)。因此，推測在這些研究中使用的條件下NS1A(1-73)顯示了緩慢的不可逆的自我聚合。這個假設也通過利用激光散射作為檢測方法觀察沉降平衡實驗中的大分子而獲得支持。此外，在一些游離NS1A(1-73)樣品的凝膠過濾層析中，在NS1A(1-73)二聚體洗脫之前觀察到一個前導峰，顯示有可能是聚合物的峰。然而，將純化的NS1A(1-73)-dsRNA復合物再次上樣到凝膠過濾柱時，沒有觀察到過量的游離dsRNA。樣品以μM范圍的Kd值表現為緊密復合物，和沉降平衡實驗中估計的是一致的。形成的復合物本身，在某種程度上，提供了從樣品中存在的“非活性物質”分離活性的NS1A(1-73)二聚體-活性dsRNA復合物的純化機制。因此，不管污染物、聚集物和/或不合格的樣品的性質，這些因素都不影響基于利用純化的NS1A(1-73)-dsRNA復合物的沉降平衡實驗對化學計量和解離常數的估計。此外，凝膠純化的復合物表現為緊密的，均一的復合物的實證顯示這些復合物應符合X-射線結晶學或核磁共振的結構分析。
實施例19NS1A(1-73)DSRNA親和性和化學計量的交替估計比較前面的利用凝膠移位測量的NS1A(1-73)dsRNA親和性的估計已報告了表觀解離常數(KD)值的范圍為20-200nM(Qian et al.，1995；Wang et al.，1999)。這些研究都是用小量的比上述生物物理測量中更長的具有不同的序列的dsRNA底物進行的。在早期的工作中，觀察到NS1A(1-73)dsRNA結合(根據凝膠移位值)的化學計量依賴于dsRNA底物的長度，并且結合是半合作的(Wang et al.，1999)。已報道了類似的全長的NS 1A的半合作結合結果(Lu et al.，(1995)Virology214，222-228)。本申請中描述的NS1A(1-73)和16-bp dsRNA雙鏈分子間的復合物是當多個NS1A的RNA-結合域沿著較長的dsRNA結合時發生的完全的相互作用的部分的模型，認為和體內發生的一樣。申請人在本發明中觀察到的1∶1化學計量排除了可能的蛋白-蛋白間的相互作用和其它的在一個更大的體系的多重結合的模式中可能出現的合作影響。在NS1A蛋白結合到更大的dsRNAs時，有許多可能的非特異結合位點的情況下，通過位形熵效應而調整表觀親和性(Wang et al.，(1999)RNA5，195-205)。例如，Wang et al.(1999)已報道NS1A(1-73)對140-bp的dsRNA底物的親和性要比類似的55-bp的dsRNA底物的親和性高10倍。因為這幾個原因，本申請中報道的簡單的1∶1的NS1A(1-73)二聚體和16-bp dsRNA片段的親和常數比之前報道的更大的合作體系的表觀親和性要低。然而，本工作中描述的復合物模型僅捕獲了完整的多個結合合作體系的全部結構信息的一部分，本工作中描述的復合物被很好的表征，易于生產，更適合下面NS1A-RNA分子識別過程的蛋白質-dsRNA相互作用的詳細的結構研究。
實施例20NS1A(1-73)中的RNA結合位點最近在NS1A中進行的丙氨酸掃描突變研究(Wang et al.，1999)揭示對較大的dsRNA片段和U6snRNA的結合已確定i)為了結合靶標，蛋白必需是二聚體，和ii)僅R38是結合RNA所絕對必需的，即使K41也起一個顯著的作用。通過上述15N-1H HSQC共振的化學位移擾動確定的NS1A(1-73)的RNA結合抗原決定簇支持和擴充了這些突變數據。在螺旋2和2’中的所有骨架酰胺基共振的化學位移一旦與dsRNA結合就會發生改變。這和螺旋2和2’中殘基的一個或更多的暴露于溶劑的堿性側鏈，包括Arg38和Lys41(圖6B)參與dsRNA的直接接觸的模型是一致的。也可能暴露于溶劑的堿性側鏈Arg37和Arg44，還有部分包埋的Arg35和Arg46側鏈(參與分子內和分子間鹽橋(Chien et al.，(1997)，NatureStruct.Biol.4891-895；Liu et al.，(1997)NatureStruct.Biol.4896-89917)也直接和dsRNA相互作用。此外，化學位移擾動數據排除了假設的在螺旋3和3’上的潛在的RNA結合位點的參與(Chien et al.，(1997))，由于第三個螺旋上殘基的大部分骨架1HN、15N原子在復合物形成時沒有顯示任何的化學位移，顯示結合抗原決定簇遠離螺旋3和3’，并且NS1A(1-73)的所有骨架構造都不受RNA結合的影響。蛋白核心區的螺旋1和1’上的一些殘基的化學位移的差別歸因于RNA相互作用誘導的自身環境的變化。總的說來，這些核磁共振數據顯示NS1A(1-73)的六螺旋鏈的折疊構象與dsRNA結合時是完整的。這個結論和從CD研究中得到的復合物形成時NS1A(1-73)和dsRNA均未顯示出大量的骨架結構改變的結論有很好的一致性。
實施例21NS1A(1-73)-DSRNA復合物的三維模型在此展示的NS1A(1-73)-dsRNA復合物的所有數據的分析揭示了編碼非特定dsRNA結合功能的新的結構特征。NS1A(1-73)的結合位點由反向平行的富含精氨酸表面的螺旋2和2’組成。假設的模型與我們累積的NS1A(1-73)對dsRNA的結合特性的知識是一致的，蛋白的對稱型的結構的結合表面橫越規范的A-型RNA的小溝(圖8)。在這個假設的模型中，反向平行的螺旋2和2’的向外的精氨酸和賴氨酸的側鏈和反向平行的形成大溝邊緣的磷酸酯骨架以一種對稱的模式相互作用，同時螺旋2和2’間的表面離子對與小溝中的堿基形成氫鍵。NS1A(1-73)螺旋2和2’軸之間的顯著相似的空間(約16.5)和越過小溝的磷酸酯間的距離(約16.8)給NS1A(1-73)‘坐在’A-型RNA的小溝上的模型增加了憑證，需要A-型以進行正確的停靠。此外，這些蛋白-RNA的相互作用很少或不需要特定的序列，這一點也和NS1A和dsRNA的相互作用缺乏特征性的特定序列是一致的(Hatada和Fukuda(1992)J.Gen.Virol.73，3325-3329；Lu et al.，(1995)Virology 214，222-228；Qian et al.，(1995)RNA 1，948-956)。
實施例22與其它蛋白DSRNA復合物的比較當將其放入已知的RNA-蛋白相互作用的背景中，本申請主張的假定的NS1A(1-73)dsRNA模型構成了一個新的蛋白-dsRNA復合物形成的模型。精氨酸富集的α-螺旋肽，例如來自于HIV-1 Rev蛋白已知通過特定的大溝間的相互作用而結合到ds RNA(Battiste et al.，(1996)，Science2731547-1551.)。然而，規范的A-型雙鏈中的大溝太窄太深甚至不能容納一個單α-螺旋。結果，Rev-蛋白-RNA復合物結合精氨酸富集的螺旋造成嚴重的核酸Id結構的扭曲。因此，NS1A(1-73)螺旋2/2’和它的靶dsRNA的大溝間的類似的相互作用可以排除，原因為復合物形成時蛋白和核酸保留它們的游離態的構象。大多數結合dsRNA的蛋白典型地含有超過一個拷貝的普遍存在的ca.70氨基酸，α1-β1-β2-β3-α2模塊，被稱為dsRNA結合域(dsRBD)(Fierro-Monti&Matthews，2000)。來自于非洲爪蟾RNA-結合蛋白A的dsRBD和dsRNA的復合物的X-射線晶體結構，揭示兩個鏈間的兩個α-螺旋加上一個環形成集體的跨越一個16bpwindow-兩個小溝和介于其間的大溝-雙鏈的一個面的相互作用(Ryter&Schultz，1998)。事實上所有這些蛋白-RNA間的接觸都包括小溝中的2’羥基部分和磷酸二酯骨架中的非橋氧。最近也報道了果蠅staufen蛋白的dsRBD和dsRNA間的復合物的核磁共振結構中的一個類似的觀點(Ramos et al.，2000)。對于NS1A(1-73)，在兩個體系中蛋白dsRNA間的相互作用大部分是非序列特異的，造成相對小的雙鏈和游離的蛋白結構的擾動(Kharrat et al.，1995；Bycroft et al.，1995；Nanduri et al.，1998)。然而，和本模型不同的是，dsRDB的非螺旋區和核苷酸形成了關鍵的接觸。除了包括對核苷酸識別至關重要的，在NS1A(1-73)中沒有出現并且形成復合物后似乎也不形成的非螺旋構象以外，這些dsRBM模塊缺少NS1A(1-73)的很有可能在分子識別過程中使用的對稱特征。
工業適用性本發明已申請在控制流感病毒生長、流感病毒化學和抗病毒治療方面的應用。
雖然在本文中通過參考特定的例子來描述本發明，要理解這些例子只是對本發明的原理和應用的說明。因此，要理解可以進行許多修改來說明情況，并且可以設計其它的安排而不離開通過附加的權利要求所限定本發明的精神和范圍。
說明書中引用的所有出版物都表明了本發明所屬的技術領域的技術人員的技術水平。所有這些出版物被本文應用作為參考，其程度就如同每一個單獨出版物被特定的單獨的指明被引用作為參考。
表1流感A病毒NS1蛋白序列 NS1A-I1
NS1A-I2
NS1A-I3
NS1A-I4
NS1A-I5
NS1A-II1
NS1A-II2
NS1A-II3
NS1A-II4
NS1A-II5
表2流感B病毒NS2蛋白序列 NS1B I-all
NS1B II-1
NS1B II-權利要求
1.一種包含反應混合物的組合物，該混合物含有流感病毒NS1蛋白或其dsRNA結合片段以及結合所述蛋白的dsRNA的復合物。
2.權利要求1所述的組合物，其中NS1蛋白是流感A的NS1蛋白(NS1A)。
3.權利要求2所述的組合物，其含有所述NS1A蛋白的dsRNA結合域。
4.權利要求3所述的組合物，其中所述dsRNA結合片段包括NS1A的1-73氨基酸殘基。
5.權利要求1所述的組合物，其中所述NS1蛋白是流感B的NS1蛋白(NS1B)。
6.權利要求5所述的組合物，其包含所述NS1B蛋白的dsRNA結合域。
7.權利要求6所述的組合物，其中所述dsRNA結合片段包括NS1B的1-93氨基酸殘基。
8.權利要求1所述的組合物，其中所述dsRNA的長度為約16個堿基對。
9.權利要求1所述的組合物，其中所述dsRNA結合部分包含NS1A的1-73氨基酸殘基，并且其中所述dsRNA的長度為約16個堿基對。
10.權利要求1所述的組合物，其中所述dsRNA結合部分包含NS1B的1-93氨基酸殘基，并且其中所述dsRNA的長度為約16個堿基對。
11.權利要求1所述的組合物，其進一步包含一種被檢測抗流感病毒抑制活性的化合物。
12.權利要求1所述的組合物，其中NS1蛋白或dsRNA被可檢測地標記。
13.一種鑒定具有抗流感病毒抑制活性的化合物的方法，其包括a)制備包含流感病毒NS1蛋白或其dsRNA結合域，種結合所述蛋白的dsRNA或其結合域，以及候選化合物的反應體系；和b)檢測NS1蛋白和dsRNA間的結合程度，其中在化合物存在時，相對于對照，NS1蛋白和dsRNA間的結合降低表明化合物對流感病毒有抑制活性。
14.權利要求13所述的方法，其中NS1蛋白或其dsRNA結合域被固定在固相支持物上。
15.權利要求13所述的方法，其中候選化合物先于或與NS1蛋白和dsRNA同時加入到反應體系中。
16.權利要求13所述的方法，其中候選化合物在加入NS1蛋白和dsRNA之后加入到反應體系中。
17.權利要求13所述的方法，其進一步包括在所述檢測之前，用可檢測的標記物標記dsRNA、NS1蛋白或其dsRNA結合域。
18.權利要求17所述的方法，其中可檢測的標記包括與NS1蛋白或其dsRNA結合域結合的抗體或其片段。
19.權利要求17所述的方法，其中可檢測的標記包括一種酶，并且反應體系中進一步包含該酶的底物。
20.權利要求17所述的方法，其中可檢測的標記包括放射性同位素。
21.權利要求17所述的方法，其中可檢測的標記包括熒光標記。
22.權利要求13所述的方法，其中所述檢測是通過熒光共振能量轉移進行的。
23.權利要求13所述的方法，其中所述檢測是通過熒光偏振各向異性測量進行的。
24.權利要求13所述的方法，其中NS1蛋白或其dsRNA結合片段在反應體系中是以與谷胱甘肽-S-轉移酶融合蛋白的形式存在的。
25.權利要求13所述的方法，其中所述NS1蛋白是NS1A蛋白。
26.權利要求13所述的方法，其中所述NS1蛋白是NS1B蛋白。
27.權利要求13所述的方法，其中反應體系包括NS1蛋白的片段，該片段包含所述NS1蛋白的dsRNA結合域。
28.權利要求27所述的方法，其中dsRNA結合域包含NS1A(1-73).
29.權利要求27所述的方法，其中dsRNA結合域包含NS1B(1-93).
30.權利要求13所述的方法，其中dsRNA的長度為約16個堿基對。
31.權利要求13所述的方法，其中鑒定方法包括高通量篩選方法。
32.一種鑒定對流感病毒具有抑制活性的化合物的方法，其包含a)制備包含流感病毒NS1蛋白或其dsRNA結合域、結合所述蛋白的dsRNA或其結合域以及候選化合物的反應體系；和b)檢測NS1蛋白和dsRNA間的結合程度，其中在化合物存在時，相對于對照，NS1蛋白和dsRNA間的結合降低表明化合物對流感病毒有抑制活性；和c)確定b)中鑒定的具有抑制活性的化合物在體外抑制流感病毒生長的程度。
33.權利要求32所述的方法，其中鑒定具有抑制活性的化合物的方法選自a)核磁共振化學位移擾動，b)凝膠過濾層析，或(c)利用分析型的超速離心機的沉降平衡測量。
34.權利要求32所述的方法，進一步包括d)確定c)中鑒定的在體外抑制流感病毒生長的化合物在非人類的動物中抑制流感病毒復制的程度。
35.一種制備用于體內或體外抑制流感病毒復制的組合物的方法，其包含a)制備包含流感病毒NS1蛋白或其dsRNA結合域、結合所述蛋白的dsRNA或其結合域，以及候選化合物的反應體系；b)檢測NS1蛋白和dsRNA間的結合程度，其中在化合物存在時，相對于對照，NS1蛋白和dsRNA間的結合降低表明化合物對流感病毒有抑制活性；c)確定b)中鑒定具有抑制活性的化合物體外抑制流感病毒生長的程度；d)確定c)中鑒定的在體外抑制流感病毒生長的化合物在非人類的動物中抑制流感病毒復制的程度；和e)通過將d)中鑒定的在非人類的動物中抑制流感病毒復制的化合物以有效抑制劑量和載體配制以制備組合物。
36.權利要求35所述的方法，其進一步包含f)根據c)和d)中獲得的結果確定化合物的有效抑制劑量。
37.權利要求35所述的方法，其中載體適合通過吸入或吹入法給動物施用。
38.一種鑒定用作流感病毒的抑制劑的化合物的方法，其包含a)獲得流感病毒NS1蛋白三維結構的同等物；b)根據用步驟a)中獲得的所述三維結構的同等物進行合理的藥物設計選擇潛在的化合物，其中所述的選擇是與NS1-dsRNA復合物的計算機模擬聯合進行的；c)將潛在的化合物與流感病毒接觸；和d)測定流感病毒的活性，其中當化合物存在時，流感病毒活性比沒有化合物時降低，就鑒定潛在的化合物是抑制流感病毒的化合物。
39.權利要求38所述的方法，其中NS1蛋白是NS1A蛋白或其dsRNA結合域。
40.權利要求39所述的方法，其中dsRNA結合域是NS1A(1-73)。
41.權利要求38所述的方法，其中NS1蛋白是NS1B蛋白或其dsRNA結合域。
42.權利要求41所述的方法，其中dsRNA結合域是NS1B(1-93)。
全文摘要
本發明公開了用于鑒定流感病毒如流感A和B病毒的抑制劑的方法和組合物。還公開了用于制備組合物的方法，所述組合物施用于流感病毒感染的動物，包括人，或者保護動物，包括人抗流感病毒感染。
文檔編號C07K14/00GK1738831SQ200380108643
公開日2006年2月22日 申請日期2003年11月13日 優先權日2002年11月13日
發明者G·T·蒙特利奧內, R·M·克魯格 申請人:拉特格斯州立大學