專利名稱：嵌合αQ－Gustducin G－蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及嵌合的G-蛋白，尤其是介導味覺受體傳導途徑的那些嵌合G-蛋白。本發明還涉及基于含所說蛋白質的異源表達體系的檢測法，以及它們在篩選人的苦味、甜味和鮮味(umami taste)反應調節劑中的用途。
味覺可被分成五種單獨的形式苦、咸、酸、甜和鮮味。Tastants影響食物和飲料的可口性，從而影響人的營養習性。它們還影響可攝取物質的可口性，諸如口服藥物和營養品(nutraceutica1)。了解和調控味覺轉導機制對于食品業和制藥業而言是有意義的。如果味覺傳導途徑可以被操縱，就有可能建立以異源表達體系為基礎的檢測法，它又可用于鑒別能調節味覺反應的化合物，從而使某些食品更可口或提高患者對口服藥物和營養品的順應性。
已有許多文獻是關于味覺傳導機制的。味覺是由tastant分子與定位于味蕾中所存在的細胞的膜上的tastant分子受體相互作用引發的，味蕾位于蕈狀、葉狀和輪廓乳頭的舌上皮以及軟顎和會厭中。生物醫學和生理學研究的最新進展使得研究者推斷出甜、旨和苦味的傳導主要是由所謂的G蛋白偶聯受體或GPCR所介導的。
GPCR是能與tastant分子結合的細胞表面蛋白質，由此與G蛋白偶聯，引發產生二級信使、諸如鈣離子(使細胞能發送信號至腦部，顯示味覺反應)的細胞過程。通常，GPCR被劃分為Gq-、Gi-、Go-和G8-偶聯受體，下標反映了在其必需的信號傳導途徑中主要的G蛋白效應器。味覺受體由于與Gustducin-一種Gαi-型G-蛋白相互作用而被歸為Gi-偶聯GPCR。
最近鑒定出了據稱與苦、甜和鮮味覺感受有關的GPCR的編碼基因，使得有可能開發出可用于鑒定調節味覺傳導途徑的化學分子的異源表達體系。例如，在異源表達體系中受體的可供利用性和用途使得可以篩選高親和力的味覺活性激動劑、拮抗劑、反激動劑和調節劑。不過，在基于異源表達體系的可靠測定法的研發中還存在許多技術問題。一個問題是高濃度GPCR在異源宿主細胞表面的可靠表達。第二個問題是提供不僅能與許多不同類型的GPCR(通常，這樣的G-蛋白被稱為“混雜的”)偶聯、而且偶聯效率高的G蛋白，從而使得既便GPCR的表面濃度相對較低，細胞信號仍然盡可能的強。
至于第二個問題，已知所謂的Gαq蛋白、Gα15和Gα16結合許多類型的GPCRs。此外，它們還將GPCR與導致細胞內鈣水平增高的磷脂酶C的活化相偶聯。如本領域眾所周知的，此信號級聯反應可通過檢測細胞中的鈣水平而方便快捷的測定出來(參閱例如WO 0118050)。不過，Gα15和Gα16并未被認為是真正普遍混雜的G-蛋白，因為有數種不能激活它們的受體，參閱，例如，Offermanns，S.和Simon，M.，1995，J.Biol.Chem.，27015175-15180；Lee，J.W.M.et al.，1998，JNeurochem.，702203-2211)；Huang，Y.et al.，1996，J.Biol.Chem.2713975-3978.；Wu，D.et al.，1992，J.Biol.Chem.26725798-25802；Wu，D.et al.，1993，Science，261101-103；Zhu，X and Birnbaumer，L.，PNAS USA，932827-2831；Parmentier，M.L.et al.，1998，Mol.Pharmacol.，53778-786)。此外，已發表的文獻表明，大部分這些在激活Gα15和Gα16G-蛋白中特別無效的GPCR是Gi-型GPCRs(Mody，S.M.等，2000，Mol.Pharmacol.，5713-23)。
因而，由于甜味受體、鮮味受體(umami taste receptor)和苦味受體被認為與gustducin(一種Gαi型G-蛋白)相偶聯，且上述研究表明Gα15和Gα16不是Gαi-型GPCRs的最佳配偶體，所以技術熟煉人員不會預見到將活化的味覺受體與Gα15或Gα16有效地偶聯。另一方面，Gustducin本身如不能提供有效的方案，因為此G蛋白調控不易檢測的環核苷酸(cNMP)釋放，例如，它不象鈣離子的增加那樣容易測定。檢測cNMP存在技術上的困難，且需要一種通常需4-6小時、而且只提供一終點測定值的免疫檢測法。此外，在異源細胞表達體系中使用諸如Gustducin等專門的Gαi蛋白是比較復雜的。為此必須將兩個額外的G-蛋白亞基(β和γ亞基)引入異源宿主細胞中，以完全重建味覺-受體-G蛋白復合物。另一方面，Gα16可與諸如HEK293細胞系細胞等哺乳動物細胞內源性的β/γ亞基復合。應用Gα16型G蛋白比應用諸如Gustducin等Gαi型G-蛋白更快捷、方便和靈敏。
仍然需要研發對多種味覺受體，特別是甜、旨和苦味受體顯示高親和力、可加入異源表達體系檢測法中以篩選人味覺反應的調節劑從而量化已知味覺分子的活性并發現新分子的G蛋白。
在現有技術中已建議使用嵌合G蛋白。在WO 02/36622中，描述了用來自轉導素C末端的至少5個氨基酸取代的Gαq嵌合蛋白。所述的嵌合蛋白質被描述為相對于兩種化學感受性GPCR而言比天然Gαq更混雜。不過，有必要指出的是，在此文獻中試驗的唯一一種味覺受體是小鼠苦味受體。因此，尚不清楚是否任何一種所述的嵌合G蛋白都會更有效的與人的苦味、甜味或鮮味受體偶聯。
Mody S.M.在分子藥理學(Molecular Pharmacology)5713-23(2000)中描述了Gα16的嵌合體和Gαz的特殊序列以及它們對Gi-偶聯受體而言增高的混雜性。Mody推斷嵌合蛋白不是GPCR的通用銜接子，但它們能促進GPCR特異亞型的識別。有必要指出的是，在所研究的亞型中沒有一種GPCR包括味覺受體。
令人驚訝的是，我們現已發現基于Gαq-Gustducin的嵌合G蛋白能以高親和力結合多種已知和推斷的苦味受體、甜味和鮮味受體。
因此，本發明的第一方面提供了Gαq-Gustducin嵌合G蛋白。
在一明確的實施方案中，嵌合Gαq-Gustducin是Gα15或16-Gustducin蛋白，更具體而言是Gα16-Gustducin蛋白。
在另一明確的實施方案中，G-蛋白是這樣一種蛋白，其中Gαq的至少最后5個氨基酸被相應數目的Gustducin氨基酸所置換，更具體而言是Gαq的最后44個氨基酸被Gustducin的44個氨基酸單元取代。
在優選的實施方案中，提供了具有如SEQ ID 2所示氨基酸序列的蛋白質。
本發明的另一方面提供了編碼上文所定義蛋白質的核酸。
在優選的實施方案中，所述核酸包含SEQ ID 1所示的核苷酸序列。
盡管本發明的嵌合蛋白質可通過在Gustducin C-末端進行取代而形成，技術人員應理解其它的取代或突變也可能引入G蛋白中，可能影響它們的混雜性和/或它們與給定受體的偶聯程度，這些G蛋白的變體組成了本發明的另一方面。此外，技術人員可能無需任何發明活動而只通過基因工程的常規技術即可完成所述的取代或突變，諸如PCR、基因克隆、定位誘變或cDNA、宿主細胞的轉染和體外轉錄。之后，可針對與受體的功能性偶聯來篩選這些變體。
在本發明特殊的實施方案中，提供了與SEQ ID No.2中所示序列具有80％同源性，優選90％，更優選95％或更高同源性的多肽變體。
本發明的其它方面是包含本文所定義的嵌合G蛋白編碼核酸的表達載體以及用所說載體轉化或轉染的宿主細胞。
在本發明的另一方面，提供了產生所定義的嵌合G蛋白的方法，其中包括在所說G蛋白足以表達的條件下，培養其中已包含編碼嵌合G蛋白的表達載體的所述宿主細胞，從而引起該蛋白質產生，并回收該細胞所產生的蛋白質。
本發明的另一方面，提供了用本文所述嵌合蛋白質分析和發現味覺受體(尤其是苦味、甜味和鮮味受體)的調節劑的方法。
在特殊的實施方案中，基于哺乳動物細胞的檢測法應用了編碼本發明嵌合蛋白質以及味覺受體(具體而言是苦味、甜味或鮮味受體)的瞬時轉染基因或cDNA，所述方法包含以下步驟將化合物與所述細胞接觸，并測定該化合物對受體嵌合G蛋白復合體的功能性影響，諸如胞質第二信使的增加。
在此方面的另一特殊實施方案中，本發明涉及利用穩定表達的基因或cDNA進行基于哺乳動物細胞的檢測法。
在另一特殊的實施方案中，本發明涉及基于哺乳動物細胞的檢測法，其中所述細胞穩定表達受體和嵌合G蛋白，優選以可誘導的形式表達。
在本發明的另一方面，提供了將化合物或含該化合物的化合物集合用于本文所定義的檢測法中，該化合物可調節味覺受體，尤其是苦味、甜味或鮮味受體的味覺反應。
在本發明的另一方面，提供了用本文所述檢測方法確定為味覺反應調節劑的化合物或含所述化合物的化合物集合，以及含有它們的食品飲料或口服藥物或營養品制劑。
本發明的各方面將參考詳述、序列表和實施例作更進一步的描述。
發明詳述下文更進一步詳述的完全確立的瞬時表達體系可用于使本發明的嵌合G蛋白具備與GPCR味覺受體(尤其是苦味受體、甜味和鮮味受體)偶聯的能力。
可將表達本發明G蛋白和GPCR二者的細胞與已知的味覺化合物相接觸。
可用于本發明的苦味化合物的例子選自阿克替甙、加率葎草酮、加蛇麻酮、七葉內酯、七葉甙、L-丙氨酸、L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酸、L-丙氨酰-L-異亮氨酰-丙氨酸L-、L-纈氨酰-L-纈氨酰-苦龍苷、Amaropanin苦樟苷、苦杏仁苷、狹葉香茶菜素、Antiacetylhumulone、Antiisohumulone、精氨酸、L-精氨酰亮氨酸、精氨酰亮氨酰亮氨酸、精氨酰脯氨酸、Asaronaldehyde、天冬氨酰天冬氨酸、AsparasaponinI、阿托品、苯甲基β-D-阿糖胞苷、苯甲基β-L-阿糖胞苷、苯甲基β-D-果糖苷、苯甲基β-D-半乳糖苷、苯甲基α-D-葡糖苷、苯甲基β-D-葡糖苷、苯甲基α-D-甘露糖苷、苦味肽、來自大豆蛋白的苦味肽、丁基α-D-葡糖苷、丁基β-D-葡糖苷、咖啡因、CarnosiflosideII、Carnosifloside III、Carnosifloside IV、兒茶酚、表兒茶酸、表兒茶鎵酸(Epicatechin gallate)、卡茄堿、α-卡茄堿、β2-氯霉素、膽酸、野萵苣苷、輔律草酮、科酒花酮、CryptochlorogenicAcid、γ-內酯、葫蘆素β、葫蘆素D、環丙氨酸-甘氨酸、環丙氨酸-苯丙氨酸、環丙氨酸-纈氨酸、環(L-精氨酰甘氨酰-L-脯氨酰-L-脯氨酰-L-苯丙氨酰-L-異亮氨酰-L-纈氨酰)、環天冬氨酰-苯丙氨酸、環甘氨酸-苯丙氨酸、環己酰亞胺、環亮氨酸-色氨酸、環戊(b)氮雜-8(1H)-酮、7-甲基-2，3，6，7-四氫-環戊(b)氮雜-8(1H)-酮、2，3，6，7-四氫-7-羥基-7-甲基-環戊-2-烯-1-酮、2，5-二羥基-5-甲基-3-(1-哌啶基)-環戊-2-烯-1-酮、2，5-二羥基-5-甲基-3-(1-吡咯烷基)環戊-2-烯-1-酮、2，3-二-1-吡咯烷基-環戊-2-烯-1-酮、5-羥基-5-甲基-2，3-二-1-哌啶基-環戊-2-烯-1-酮、5-羥基-5-甲基-2，3-二-1-吡咯烷基-環戊-2-烯-1-酮、5-甲基-2，3-二-1-吡咯烷基-環戊-2-烯-1-酮、5-亞甲基-2，3-二-1-吡咯烷基-環戊-2-烯-1-酮、3-甲基-2-(1-吡咯烷基)-環苯丙氨酸-天冬氨酸、環脯氨酸-丙氨酸、環脯氨酸-天冬酰胺、環脯氨酸-甘氨酸、環脯氨酸-異亮氨酸、環脯氨酸-亮氨酸、環脯氨酸-甲硫氨酸、環脯氨酸-苯丙氨酸、環脯氨酸-脯氨酸、環脯氨酸-纈氨酸、環纈氨酸-苯丙氨酸、Cynaratriol、菜薊苦素、菜薊苦素、大豆黃素、大豆黃甙地那銨苯甲酸鹽、Denatoniumsaccharide、蜀黍氰苷、二羥基苯甲酸、2，3-二羥基苯甲酸、2，4-乙基b-L-阿糖胞苷、乙基-α-D-葡糖苷、乙基β-D-葡糖苷、Eustomoroside、Eustomoside、沒食子酸、表沒食子兒茶精、表焙兒茶素沒食子酸(Epigallocatechin gallate)、Gaudichaudioside F、Gelidoside、染料木黃酮、染料木甙、龍膽苦苷、龍膽酸、Gentomoside、Geshoidin、6′-O-β-D-Glucosylgentiopicroside、ucozaluzanin C、谷氨酰天冬氨酸、谷氨酰谷氨酸、甘氨酰亮氨酸、致甲狀腺腫素、蘆竹堿、大海米菊素、蘇木素四甲基醚水楊醛葡萄(HaematoxylinTetramethyl Ether Helicin)、十七烷-16-烯、1-乙酸基-2，4-二羥基-十七烷-16-烯、1，2，4-三羥基-組氨酸、L-Hulupone、律草靈酮、律草酮、羥基苯甲酸、4-Hymenoside A、Hymenoside B、HymenosideC、Hymenoside D、Hymenoside E、Hymenoside F、Isohumulone、順式-Isohumulone、反式異亮氨酸、L-異羽扇豆烷、異金雀花堿、β-異金雀花堿、10，17-二氧代-β-異金雀花堿、10-氧代-β-萵苣苦素、L-亮氨酸、L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-亮氨酸、N-[(2R)-6-氨基-2-[(4S)-2，5-二氧代-4-(苯基甲基)-1-咪唑烷基]-1-氧代乙基]-L-亮氨酰-L-甲硫氨酰-N-甲基-L-苯丙氨酰-，(4-1)-內酰胺、L-亮氨酸、甘氨酰-L-丙氨酰-亮氨酸、L-L-亮氨酸、N-(N2-L-亮氨酰-L-谷氨酰胺酰)-L-亮氨酸、N-(N-L-亮氨酰-L-a-谷氨酰)-L-亮氨酸、N-[N2-[N2-[N-(1-L-亮氨酰-L-脯氨酰)-L-苯丙氨酰]-L-天冬酰胺酰]-L-谷氨酰胺酰]-L-亮氨酸、N-[N2-[N-[N-(1-L-亮氨酰-L-脯氨酰)-L-苯丙氨酰]-L-絲氨酰]-L-谷氨酰胺酰]-L-亮氨酸、L-亮氨酰-L-纈氨酰-亮氨酰亮氨酸、亮氨酰苯丙氨酸、檸檬堿、檸檬堿單內酯(Limoninmonolactone)、亞麻苦苷、百脈根苷、Lupine、羽扇豆堿、13-羥基-羽扇豆堿、7-羥基-羽扇豆堿、表羽扇豆堿(Epilupinine)，Lupoxes B、Lupoxes C、蛇麻酮、Luputrione、蜂蜜曲菌素、6-甲氧基-甲硫氨酸、L-甲基α-L-阿糖胞苷、甲基β-L-阿糖胞苷、甲基β-D-葡糖苷、甲基α-D-葡糖苷2，3-二-異亮氨酸、甲基α-D-葡糖苷2，3-二-亮氨酸、甲基α-D-葡糖苷2，3-二-L-苯丙氨酸、甲基α-D-葡糖苷2，3-二-蘇氨酸、甲基α-D-葡糖苷2，3-二-酪氨酸、甲基α-D-甘露糖苷、甲基β-L-木糖吡喃糖苷、甲基α-D-木糖苷、柚皮素、新氯原酸、γ-內酯、新陳皮苷、Nuezhenide、Oleonuezhenide、洋橄欖苦甙、Olivieroside A、Olivieroside B、Olivieroside C、Perrottetin H、苯丙氨酸、L-苯基α-D-葡糖苷、苯基α-D-葡糖苷、苯基β-D-葡糖苷、苯硫脲、糙蘇甙II、哌啶-2-羧酸、4-[(2-羧基-2-羥乙基)硫]-哌啶羧酸-2，4-[(2-羧基-2-羥乙基)硫]-Prehumulone、Prelupulone、丙基β-D-果糖苷、丙基α-D-葡糖苷、丙基β-D-葡糖苷、原兒茶酸、野黑櫻苷、Pulcherrimine、奎尼丁、奎寧、Quinolizinium-7-olate、雷尼替丁、甜葉菊甙C、水楊苷、柳得洛苷、Scabraside、ScandenosideR5、Sclareolide、東莨菪苷、Septemfidoside、絲氨酰賴氨酰甘氨酰亮氨酸、芥子酸膽堿、茄堿、α-金雀花堿、金雀花堿、17-氧代-Stevisalioside A、士的寧、Suavioside C1、Suavioside D2、Suavioside F、蔗糖八乙酸酯、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷、Swertiapunimarin、Taxiphyllin、TFI(呋甾烷、β-D-半乳糖吡喃糖苷)、茶黃素、荼黃素沒食子酸酯A、茶黃素沒食子酸酯B、番茄堿、番茄素，α-三環脫氫異律草酮(alpha-Tricyclodehydroisohumulone)、三葉苷、三羥基苯甲酸、2，4，6-色氨酸、L-尿嘧啶、6-丙基-2-硫-L-纈氨酸、L-精氨酰甘氨酰-L-脯氨酰-L-脯氨酰-L-苯丙氨酰-L-異亮氨酰-(BPIa)纈氨酸、和L-育亨賓。
可能被提及的甜味物質的例子或改變甜味的化合物有荼皂苷E1、乙酰舒泛K、阿力甜、阿司帕坦、CH 401、甘素、赤藻糖醇、胍甜味劑、Isomalt、異麥芽糖基果糖苷、異棉子糖(isoraffinose)、NC 174、Neotame、紫蘇糖、苯乙酰甘氨酰-L-賴氨酸、糖精、SC 45647、環己氨基磺酸鈉、山梨醇、Sucralose、Sucfononic Acid、Suosan、超阿斯巴甜糖(superaspartame)、甲基α-L-阿糖胞苷、甲基β-L-阿糖胞苷、甲基β-D-葡糖苷、甲基a-D-甘露糖苷、甲基β-L-吡喃木糖苷、甲基α-D-木糖苷、甲基α-D-葡糖苷2、3-二-蘇氨酸、甲基α-D-葡糖苷2，3-二-異亮氨酸、原兒茶酸、洋薊甙、菝葜苷、甜葉菊甙C、Abrusoside A、Abrusoside B、Abrusoside C、Abrusoside D、Abrusoside E、Apioglycyrrhizin、Araboglycyrrhizin、白元參甙、Brazzein、異株瀉根甜味甙、Carnosifloside V、Carnosifloside VI、D.cumminsii、甜茶樹甙A、甜茶樹甙I、甜甙A、芴-4-α，6-二羧酸、4-β，10-α-二甲基-1，2，3，4，5，10-六氫-Gaudichaudioside A、甘草酸、Hernandulcin、Hernandulcin、4β-羥基-Hesperitin-7-葡糖苷二氫查耳酮、Huangqioside E、Huangqioside E、3-羥基根皮苷(3-Hydroxy Phloridzin)、山奈酚、2，3-二氫-6-甲氧基3-O-醋酸鹽、馬檳榔甜素、麥芽糖基-α-(1，6)-新桔皮苷二氫查爾酮、羅漢果甙IIE、羅漢果甙III、羅漢果甙IIIE、羅漢果甙IV、羅漢果甙V、11-氧代羅漢果甙V、Monatin、莫尼糖蛋白、甘草酸單銨酯(Monoammonium Glycyrrhizinate，Mag)、Mukurozioside Iib、柑桔苷二氫查爾酮、Neoastilbin、新橙皮苷二氫查爾酮(NHDHC)、Neomogroside、奧斯拉津、戊二烯、巴西甘草甜素I、巴西甘草甜素II、巴西甘草甜素III、巴西甘草甜素IV、巴西甘草甜素V、糙蘇甙I、根皮苷、葉甜素、Polypodoside A、鉀鎂鈣甘草甜素、PterocaryosidesA、Pterocaryosides B、槲皮素、2，3-二氫-3-O-醋酸鹽、槲皮素、2，3-二氫-6-甲氧基-槲皮素、2，3-二氫-6-甲氧基-3-O-醋酸鹽、甜葉菊甙A、甜葉菊甙B、懸鉤子甙、Scandenoside R6、賽門甙I、甘草酸鈉(Sodium glycyrrhizinate)、Steviolbioside、斯替維苷、斯替維苷、α-糖基Suavioside A、Suavioside B、Suavioside G、Suavioside H、Suavioside I、Suavioside J、竹芋蛋白、甘草酸三銨(Triammonium Glycyrrhizinate，TAG)、三葉苷、Selligueain A、蘇木精、麥芽糖醇、甘露醇、甲基α-D-葡糖苷2，3-二-天冬氨酸、苯甲酸、2-(4-二甲基氨基苯甲酰基)-苯甲酸、2-羥基-4-氨甲基-苯甲酸、2-(3-羥基-4-甲氧基苯甲酰基)-甲基β-D-果糖苷、甲基α-D-半乳糖苷、甲基β-D-半乳糖苷、仙茅甜蛋白、Strogin 1、Strogin 2、Strogin4、奇果甜素、苯乙酸、3，4-二甲氧基-氨基苯甲酸、3-對甲氧基苯甲酸、苯甲醇、3-氨基-4-正丙氧基、3，4-咖啡酸、肉桂酸、二羥基肉桂酸、2，4-阿魏酸、水解瓜爾膠、羥基氨基苯甲酸、2，4-黑曲霉寡糖、甘蔗渣提取物、二羥基苯甲酸、2，3-二羥基苯甲酸、2，4-香豆酸、對二羥基苯甲酸、3，5-羥基苯甲酸、3-Gurmarin、Gymnemasaponin III、Gymnemasaponin IV、Gymnemasaponin V、森林匙羹藤酸I、森林匙羹藤酸II、森林匙羹藤酸III、森林匙羹藤酸IV、勿甜素、JujubasaponinII、Jujubasaponin III、丙酸、(-)-2-(4-甲氧基苯氧基)-Ziziphin、乙基麥芽醇、麥芽醇、丁酸、2-氧代-3-甲基-丙氨酸、N-(1-甲基-4-氧代-2-咪唑啉-2-基)肌氨酸苷、Abrusoside E、單甲酯、拉克替醇、Periandrinic acd I單葡糖醛酸化物、Periandrinic acid II(monoglycuronide)、木糖醇、塔格糖、d-苯甲酰氧基乙酸、4-甲氧基Hoduloside I、4-硝基苯基α-D-半乳糖苷、4-硝基苯基α-D-葡糖苷、4-硝基苯基β-D-葡糖苷、4-硝基苯基α-D-吡喃甘露糖苷、尿素、(N-(4-氰基苯基)-N′-((sodiosulfo)甲基)-氯霉素、氯原酸、甲基α-D-葡糖苷、甲基α-D-葡糖苷2，3-二-丙氨酸、甲基α-D-葡糖苷2，3-二-甘氨酸、甲基α-D-葡糖苷2，3-二-脯氨酸、甲基α-D-葡糖苷2，3-二-纈氨酸、苯胺、2-丁氧基-5-硝基-苯胺、2-乙氧基-5-硝基-苯胺、2-甲氧基-5-硝基-苯胺、3-硝基-(+)-Baiyuno1-β-D-葡糖苷-α-D-葡糖苷、苯胺、1，3-羥基-4-甲氧基芐基苯胺、2-丙氧基-5-硝基-(P4000)苯并-1，4-二氧雜環己烷2-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-苯并-1，3-二氧雜環己烷-4-酮2-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-苯甲酸、2-苯甲酰基-4-甲氧基-苯甲酸、2-(4-甲氧基苯甲酰基)-苯并-1，3(4H)-xathiane、2-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-苯并-1，4-xathiane3-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-丁酸、4-[3，5-二羥基-4-[3-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-1-氧代丙基]苯氧基]-2-羥基-單鈉鹽、丁酸、4-[3，5-二羥基-4-[3-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-1-氧代丙基]苯氧基]-3-氧代-單鈉鹽、環己二烯-1，41-Carboxaldehyde-4-(甲氧基甲基)-、(E)肟乙苯、β-(1，3-羥基-4-甲氧基苯甲基)-Hespertin二氫查爾酮、3′-羧基-Hespertin二氫查爾酮、3′-甲酰基-異香豆素、3，4-二氫-3-(3-羥基-4-甲氧基)-紫蘇糖、8，9-環氧-苯基3-羥基-4-甲氧基苯甲基醚、膦酸、[3-[3，5-二羥基-4-[3-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-1-氧代丙基]苯氧基]丙基]單鉀鹽、斯替維苷類似物、氨基磺酸、[2-[3，5-二羥基-4-[3-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-1-氧代丙基]苯氧基]乙基]-單鉀鹽、尿素和N-(4-氰基苯基)-N′-(2-羧乙基)-L-茶氨酸。
可能提及的鮮味劑有谷胱甘十二碳肽、谷氨酰谷氨酸、(Z)-6-十二碳烯-4-交酯、肌苷酸、十二碳-Z6-烯-4-交酯、谷氨酸、L-烏頭酸、N-(1-脫氧-果糖-1-基)谷氨酸鹽、水解的植物蛋白質、甲基α-D-葡糖苷、2，3-二-賴氨酸、甲基α-D-葡糖苷2，3-二-鳥氨酸、L-天冬酰胺、L-a-谷氨酰-L-a-谷氨酰-L-谷氨酸、L-a-天冬氨酰-L-a-谷氨酰-谷氨酰纈氨酸、小麥麩質水解物、天冬氨酸L-、L-a-天冬氨酰-L-a-天冬氨酰-L-a-天冬氨酰-二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)和(4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z)-L-茶氨酸。
依照本領域已知的技術，通過檢測諸如細胞內IP3和Ca2+等傳導途徑參數的變化，或通過諸如用GTPγS標記等其它G蛋白特異檢測試驗，可測定味覺分子對G蛋白的功能性影響，這在下文有更充分的描述。
許多功能性的孤兒苦味受體以及甜味和鮮味受體能與本發明的嵌合G蛋白偶聯。就苦味受體而言，可提及的有那些所謂的T2Rs或TAS2Rs，參閱Bufe等，Nature Genetics 32397-401或Chandrashekar等，Cell，100703-711或Matsunami，Nature，404601-604。同時，就甜味或鮮味受體而言，可提及的有已知的T1R受體，參閱Li，X.等，2002，PNAS USA，994692-4696；Nelson，G.et al.，2002，Nature，416199-202；和Nelson，G.et al.，2001，Cell，101381-390。更進一步的，與天然Gαq蛋白和上文所提及的那些嵌合Gαq蛋白相比較，本發明的嵌合G蛋白在配體與給定GPCR相結合時能引起更強的細胞應答。
為了說明這一點，可以將用已知為TAS2R16并被Bufe(見上述文獻)所描述和定義的已知功能性苦味受體和本發明的嵌合G-蛋白Gα16-gustducin 44轉染了的哺乳動物細胞，如HEK293T細胞，按以下流程與5mM水楊苷或5mM苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷(二者都是已知的苦味劑)接觸，以產生強熒光信號(利用Flexstation)，所述信號比參照的嵌合G蛋白(Gα16-z44)強3倍，而比野生型Gα16強約7倍。
所述流程參閱“G蛋白偶聯受體(信號傳導系列)”編輯TatsuyaHaga和Gabriel Berstein，第一版，第424頁，CRC Press-BocaRaton FL；1999年9月，且可總結如下1.第0天每孔用20K細胞的量接種96孔板并將其在營養型生長培養基中37℃培養過夜。
2.第1天每孔用300ng GPCR DNA和0.6μl Lipofectamine2000(Invitrogen)的量轉染細胞。被轉染細胞在營養型生長培養基中37℃培養過夜。
3.第2天丟棄生長培養基，并將細胞用75μl鈣檢測溶液保溫1小時(室溫黑暗中)，所述溶液由溶于在37℃已補充了10mM Hepes、200μM氯化鈣和0.1％牛血清白蛋白，pH7.4的Hanks平衡鹽溶液(HBSS)中的1.5μM Fluo-4AM(Molecular Probes)和2.5mMprobenicid組成。
4.將溶于Hanks平衡鹽溶液(HBSS)的2.5mM probenicid組成的、且在37℃補充有10mM Hepes、200μM氯化鈣和0.1％牛血清白蛋白，pH7.4的125μl漂洗緩沖液加入各孔中，并將平板在室溫下黑暗中進一步保溫30分鐘。
5.丟棄緩沖溶液并用100μl漂洗緩沖液漂洗平板3次，細胞重懸于200μl漂洗緩沖液中并在37℃保溫15分鐘。
6.將平板放置于熒光微量滴定板讀數器，例如Flexstation(Molecular Devices)或FLIPR(Molecular Devices)上，在加入20μl10X濃度的配體貯液后起始受體的活化作用。在加入配體前持續監測熒光15秒，在加入配體后監測45-75秒。受體活化水平通過以下兩個等式確定為％活化率＝(最大熒光-基線熒光/基線熒光)×100或熒光增加量＝最大熒光量-基線熒光量，其中的基線熒光量代表配體加入前的平均熒光水平。
在另一實施例中，使經過已知為小鼠T2R5的已知功能性苦味受體和本發明的嵌合G-蛋白Gα16-gustducin 44轉染的HEK293T細胞(參閱Chandreshekar等，Cell，卷100，70-711，March 172000)與10μM環己酰亞胺接觸，后者能引起比野生型Gα16強5倍的強熒光信號。
在另一實施例中，使經已知的功能性人苦味受體TAS2R10和本發明的嵌合G蛋白G16-gustducin 44穩定轉染的HEK293T-RexTM細胞(參閱Bufe等，Nature Genetics 32397-401)接觸250μM馬錢子堿，后者能引起強熒光信號。
在另一實施例中，使經TAS2R38(苯基硫脲的推測苦味受體，參閱Kim等，Science 299，1221-5和Bufe等，Nature Genetics 32397-401)和本發明的嵌合G蛋白G16-gustducin 44穩定轉染的HEK293T-RexTM細胞接觸250uM苯基硫脲，后者能引起強熒光信號。同樣的，250μM丙硫尿嘧啶(propythiouracil)引起了強烈的應答。
在另一實施例中，使經TAS2R43和本發明的嵌合G蛋白G16-gustducin 44穩定轉染的HEK293T-RexTM細胞接觸10μM馬兜鈴酸，后者能引起強熒光信號。
在另一實施例中，使經TAS2R44和本發明的嵌合G蛋白G16-gustducin 44穩定轉染的HEK293T-RexTM細胞接觸10μM馬兜鈴酸，后者能引起強熒光信號。
在更進一步的實施例中，使經過由人TASlR2和TASlR3的雜二聚體形成的已知功能性甜味受體復合物(Li，X.et al.，2002，PNAS USA，994692-4696；Nelson，G.et al.，2001，Cell，101381-390.)和嵌合G蛋白Gα16-gustducin 44轉染的HEK293T細胞接觸2.5mM天冬甜素、丁磺氨K或sucralose，所有這些都能引起比野生型Gα16強2倍的熒光信號。
所述嵌合構建體可用聚合酶鏈式反應以本身已知的形式產生。在某一實施方案中，可使用橋重疊PCR誘變策略生產嵌合構建體(參閱Mody S.M.et al，2000，Mol.Pharmacol.，5713-23)，為此將引物設計成與Gαq的一個末端(如C末端)退火，并且編碼至少5個gustducin來源的氨基酸。PCR的嵌合產物可克隆入適當的載體，例如pCR2.1-Topo(可購自Invitrogen)中，并進行DNA測序，以證實Gαq末端的正確置換。
在序列證實后，可將嵌合Gαq-GustducincDNA片段亞克隆入適當的載體，如pcDNA 3.1哺乳動物表達載體中，并瞬時轉染入哺乳動物宿主細胞(例如HEK293T或HEK T-RexTM)中以證實轉基因的正確表達。
在后轉染期后，如48小時后，可以制備細胞裂解物，經蛋白質印跡分析，以證實嵌合蛋白質的正確表達。一旦證實到正確的蛋白質表達，就可依照本領域眾所周知的技術轉染合適的哺乳動物細胞，如HEK293T細胞或HEK T-RexTM，從而產生穩定表達的嵌合Gαq-Gustducin。
在實施本發明有關克隆、闡明配體-受體對和發現苦味、甜味或鮮味反應調制器的各個方面和實施方案中，可以借助分子生物學、微生物學中的常規技術和重組技術。因此，技術人員完全了解這些技術，下文對這些技術只概略的提及，以便更完整的描述本發明的內容。
為了表達編碼G蛋白或受體的cDNAs，通常需將適當的cDNA亞克隆入含有指導轉錄的強啟動子、轉錄/翻譯終止子和用于翻譯起始的核糖體結合位點的表達載體中。合適的細菌啟動子在本領域中是眾所周知的，例如大腸桿菌、芽孢桿菌屬和沙門氏菌屬，而用于這些表達體系的試劑盒已有商品化。類似的，用于哺乳動物細胞、酵母和昆蟲細胞的真核表達體系是本領域眾所周知的并且也是商品化的。真核表達載體可以是例如腺病毒載體、腺伴隨病毒載體或逆轉錄病毒載體。
除了啟動子之外，表達載體通常包含含有在宿主細胞中G蛋白或受體編碼核酸表達所需的所有附加元件的轉錄單元或表達盒。因此典型的表達盒包含與編碼G蛋白或受體的核酸序列可操作性連接的啟動子以及轉錄物有效聚腺苷酸化、核糖體結合位點和翻譯終止所需的信號。視具體情況而定，編碼G蛋白或受體的核酸序列通常可以與膜定向信號連接，諸如大鼠生長激素抑制素-3受體序列的N末端45個氨基酸，從而促進重組G蛋白或受體的有效的細胞表面表達。額外的元件可以包括，例如增強子。
表達盒還應包含位于結構基因下游的轉錄終止區，以提供有效的終止。終止區可以與啟動子序列獲自同一基因或者可以獲自不同的基因。
對于G蛋白或受體的表達而言，可以使用本領域眾所周知用于真核或原核細胞表達的常規載體。載體的例子包括，但不局限于標準細菌表達載體，包括諸如基于pBR322的質粒、pSKF、pET23D等質粒以及諸如GST和LacZ等融合表達體系。
包含來自真核病毒的調控元件的表達載體通常用于真核表達載體中，如SV40載體、巨細胞病毒載體、乳頭瘤病毒載體和來自Epstein-Barr病毒的載體。其它例證性的真核載體包括pMSG、pAV009/A.sup.+、pMTO10/A.sup.+、pMAMneo-5、桿狀病毒pDSVE、pcDNA3.1、pIRES和允許在以下啟動子指導下進行蛋白質表達的任何其它載體SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒啟動子、勞氏肉瘤病毒啟動子、多角體蛋白啟動子或顯示在真核細胞中對表達有效的啟動子。
某些表達體系具有供基因擴增的標記物，諸如胸苷激酶、潮霉素B磷酸轉移酶和二氫葉酸還原酶。或者，不涉及基因擴增的高效表達體系也是合適的。
表達載體中通常包含的元件也含有能在大腸桿菌中起作用的復制子、編碼藥物抗性從而便于選擇含重組質粒的細菌的基因以及位于質粒的非必需區便于真核序列插入的獨特限制性位點。所選擇的具體藥物抗性基因不是關鍵的，本領域已知的許多藥物抗性基因中任一種都是合適的。非必要地，可以選擇原核序列，以便在有必要時使它們不與真核細胞中的DNA復制相互干擾。
可使用標準轉染方法產生表達大量G蛋白或受體的細菌、哺乳動物、酵母或昆蟲細胞系，然后用標準方法純化G蛋白或受體。
任何用于將核苷酸序列引入宿主細胞的眾所周知的方法都可使用。這些方法包括使用磷酸鈣轉染、聚凝胺、原生質體融合、電穿孔、脂質體、顯微注射、原生質載體、病毒載體和將克隆基因組DNA、cDNA、合成DNA或其它外源遺傳物質引入宿主細胞的其它眾所周知的任何方法。唯一必需的是所用的具體遺傳工程步驟應能將至少一個基因成功的引入能表達受體的宿主細胞中。
例如，可以使用T-RexTM表達體系(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)。T-RexTM體系是四環素調控的哺乳動物表達體系，它使用了來自大腸桿菌Tn10編碼的四環素(Tet)抗性操縱子的調控元件(Hillen andBerens 1994，Annu.Rev.Microbiol.48，345-369；Hillen et al.，1983，Control，J.Mol.Biol.169，707-721)。在T-RexTM體系中的四環素調控基于的是四環素與Tet阻遏子的結合和控制目的基因表達的啟動子的去抑制(Yao et al.1998，Hum.Gene Ther.9，1939-1950)。
在將表達載體引入細胞中后，可在標準培養條件下培養被轉染的細胞。可用標準技術從培養物中回收G蛋白或受體蛋白。例如，在進行沉淀和層析步驟前，可通過機械方法或滲透休克突然破裂細胞，該方案的特征和順序將取決于具體的待回收重組物質。或者，可以從已在其中培養過重組細胞的培養基中回收重組G蛋白或受體。
受體與配體的結合活性以及G蛋白與受體的偶聯都可用各種體外和體內檢測法檢測，以確定功能、化學和物理作用，如，檢測配體的結合、第二信使(如cAMP、cGMP、IP3、DAG或Ca2+)、離子流、磷酸化水平、轉錄水平、神經遞質水平，等等。此外，正如本領域眾所周知的，這樣的檢測法可用于測試受體的抑制劑。
可以將經潛在受體抑制劑處理的樣品或檢測物與不含待測化合物的對照樣品比較，以檢查調節的程度。對對照樣品(未用抑制劑處理)假設相對受體活性值為100。當受體活性值相對于對照而言更低時即達到了對受體活性的抑制作用，相反，當活性相對于對照而言更高時，受體的活性被增強。
待測化合物對受體功能的影響可通過檢查上述任何參數而被測定。任何影響受體活性的適當生理學變化都可用于評估待測化合物對受體與本發明G蛋白的偶聯的影響。當用完整細胞或動物來測定功能性因果關系時，我們可以檢測各種影響，諸如Ca2+、IP3或cAMP等細胞內第二信使的變化。用于進行所述測定的適當檢測法參閱在此收編作為參考的WO 01 18050。
優選用于G蛋白偶聯受體的檢測法包括裝載了離子敏感染料以報道受體活性的細胞，在收編于此作為參考的下述文獻中對此有更完整的描述“G蛋白偶聯受體(信號傳導系列)G-protein coupledreceptotors(Signal Transduction Series)”，CRC Press 1999；第一版；編輯Haga和Berstein。在用于鑒定調節性化合物的檢測法中，將分別用離子敏感性或膜電壓熒光指示劑監測細胞質中離子水平或膜電壓的變化。
受體活化通常會起動隨后的細胞內活動，如，IP3等第二信使的增加，它將細胞內鈣離子的貯備釋放出來。某些G蛋白偶聯受體的活化道過磷脂酶C介導的磷脂酰肌醇的水解刺激了三磷酸肌醇(IP3)的形成(Berridge & Irvine，Nature 312315-21(1984))。IP3隨后刺激細胞內鈣離子貯備的釋放。因此，細胞質鈣離子水平的變化或諸如IP3等第二信使水平的變化都可用于評估G蛋白偶聯受體的作用。表達所述G蛋白偶聯受體的細胞可能因細胞內貯備和通過離子通道的活化二者導致呈現提高了的細胞質鈣水平，在這樣的情況下，盡管不是必需的，但可能期望在任選補充有EDTA等螯合劑的無鈣緩沖液中進行所述的檢測，從而區別釋放自內部貯備的鈣所產生的熒光反應。
在優選的實施方案中，通過在具有將所述受體與磷脂酶C信號轉導途徑聯系起來的上述G蛋白的細胞內表達該受體來檢測受體活性。任選地，細胞系是HEK-293，盡管其它的哺乳動物細胞也是優選的，諸如CHO和COS細胞。通過檢測細胞內Ca2+水平的變化來測定味覺傳導的調控作用，通過施用與受體相關的分子，胞內Ca2+水平響應于對受體信號傳導途徑的調控而發生變化。任選用熒光Ca2+指示劑染料和熒光測定成像法測定Ca2+水平的變化。
在另一實施方案中，受體的配體結合結構域可在體外應用于可溶性或固態反應中，以檢測配體的結合。可在溶液中，在附著于脂單層或囊泡中固相的雙層膜中檢測受體或受體結構域中的配體結合。這樣，調節劑與受體或結構域的結合可利用分光計數值的變化來進行觀察，如熒光、吸收或折射指數；或流體力學(如，形狀)、色譜或溶解特性，這在本領域中是普遍已知的。
作為受體調節劑的待測化合物可以是任何小的化學化合物或生物學實體，諸如蛋白質、糖、核酸或脂類。通常，待測化合物是小化學分子。盡管根據各個受體的配體特異性的有關知識，技術人員可以預先選擇感興趣的化合物，但基本上任何化學化合物都可用作本發明檢測法中的潛在調節劑或配體。某些優選的化合物已在上文提出。測定法可設計成通過使檢測步驟自動化并提供來自任何方便來源的化合物用于檢測來篩選大的化學文庫，該方法通常以平行的方式進行(如，以微量滴定的形式在微量滴定板上自動檢測)。技術人員應了解有許多化學化合物的供應商。
檢測可以用高流通量的篩選方法進行，其中包括提供組合的化學文庫或肽文庫，所述文庫中含有大量潛在的治療劑或味覺化合物(潛在的配體化合物)。然后如本文所述在一個或多個試驗中篩選所說的文庫以鑒定展示預期特征性活性的文庫成員(具體的化合物種類或亞類)。由此鑒定的化合物可用作前導化合物以進一步研發終產物的調節劑，或自身可用作實際的調節劑。
組合化學文庫是化學合成或生物學合成，通過組合諸如試劑等許多化學“構建塊”而產生的多樣化合物的集合。例如，線性組合化學文庫，諸如多肽文庫是通過以所有可能的方式組合一套化學構建塊(氨基酸)達到給定的化合物長度(即，在多肽化合物中的氨基酸數目)而形成的。數百萬的化學化合物可通過這種化學結構塊的組合型混合而合成。
組合型化學文庫的制備和篩選對于本領域的技術人員而言是眾所周知的，因而在此無需詳述。
在本發明的高流通量檢測中，可能在一天內篩選多達數千種的不同調節劑或配體。具體而言，微量滴定板的各孔可用于進行針對選定潛在調節劑的獨立試驗，或，如果要觀察濃度或保溫時間效應，每5-10個孔可測試一種調節劑。因此，一個標準微量滴定板可檢測約100(如96)種調節劑。如果使用1536孔平板，那么一個平板就可容易的檢測約100至約1500種不同的化合物。有可能每天檢測數個不同的平板；使用本發明的綜合體系可能檢測篩選多達約6000-20000種不同的化合物。
上述檢測技術所發現的前導化合物或由所說前導化合物形成的研發化合物可直接施用于人受試者以調節味覺。或者，可用制劑的其它成分配制所述化合物以便用于口服，例如，食品和飲料、藥品或營養品或順勢療法制劑(homeopathic preparations)。
待口服化合物的量必須足以在人受試者內產生有益的反應，這可由具體味覺調制器的功效和與具體化合物的施用有關的任何不利副作用的存在、特性和程度而確定。
以下實施例用于說明本發明。
所有實施例均使用了HEK293細胞；對于受體的瞬時轉染而言，使用HEK293T細胞，而對于受體的穩定轉染而言，使用T-RexTMHEK293細胞(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)。
實施例1Gα16-gustducin44嵌合體的產生用pcDNA3.1中的人Gα16和大鼠gustducin cDNA為模板，以T7和SP6啟動子序列作為外側引物區，通過橋重疊PCR誘變構建Gα16gustducin44。
所用的基因特異性引物是16gust44-S(5’GGCCCCGAGGGCAGCAACTTAAAAAAAGAAGATAAGGAA3’)16gust44-AS(5’TTCCTTATCTTCTTTTTTTAAGTTGCTGCCCTCGGGGCC3’)首先，擴增相應于Gα16和gustducin的兩個重疊PCR片段。用16gust44-AS引物和T7引物制備5’Ga16片段，而3’gustducin片段則用16gust44-S引物和SP6引物制備。將各PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳分離和純化。將已純化的PCR產物混合、一起退火并隨后用T7和SP6引物擴增全長的嵌合片段。PCR混合物中含1.5mM MgCl2使用來自Applied Biosystems的GeneAmp PCR System 9700，用以下熱循環參數擴增PCR產物94℃45秒，50℃90秒和72℃120秒。將裝配好的嵌合PCR片段亞克隆入pcDNA3.1并通過DNA測序和限制性作圖檢查其完整性。通過用抗Gα16多克隆抗體(Torrey Pines Biolabs)對來自轉染細胞的完整細胞裂解物進行蛋白質印跡分析，證實了融合蛋白質的正確表達。
實施例2Fluo-4鈣檢測用前一天在每孔中已接種了20K被轉染細胞且在適當的生長培養基中37℃保溫過夜的亮底黑色96孔平板進行所有的試驗。測定時，丟棄生長培養基，并將細胞在于37℃已補充了10mM Hepes、200μM氯化鈣和0.1％牛血清白蛋白，pH7.4的Hanks平衡鹽溶液(HBSS)中的1.5μM Fluo-4AM(Molecular Probes)和2.5mMprobenicid(Sigma-Aldrich)組成的75μl鈣檢測溶液中保溫1小時(室溫下，黑暗中)。在裝載期開始1小時后，將由溶于在37℃已補充了10mM Hepes、200μM氯化鈣和0.1％牛血清白蛋白，pH7.4的Hanks平衡鹽溶液(HBSS)中的2.5mM probenicid組成的125μl漂洗緩沖液加入各孔中，將平板進一步在室溫下黑暗中保溫30分鐘，以便使Fluo-4-AM完全去酯化。丟棄緩沖液，平板用100μl漂洗緩沖液洗3次，最后將細胞重溶于200μl洗滌緩沖液中，并在37℃保溫保溫15分鐘。為了測試讀數，將平板放置于熒光微量滴定板讀數器，例如Flexstation(Molecular Devices)上，在添加20μl 10X濃縮的配體貯液后啟動受體的活化作用。在加入配體前15秒至加入配體后45-75秒持續監測熒光。受體活化水平用以下兩個等式確定活化百分數＝(最大熒光讀數-基線熒光讀數/基線熒光讀數)×100，或者熒光增加值＝最大熒光讀數-基線熒光讀數，其中基線熒光值代表配體加入前的平均熒光水平。
實施例3針對T2R苦味受體的轉染在第0天，將穩定表達G蛋白的細胞以每孔20000個細胞的量接種于黑色亮底96孔板中并在選擇性生長培養基中培養過夜。在第1天，將培養基換成無抗生素的生長培養基并用300ng GPCR DNA和0.6μl Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉染細胞。將細胞培養過夜并于次日用上文實施例2中所述的Fluo-4鈣檢測條件進行處理。
實施例4針對T1R甜味受體的轉染在第0天，將穩定表達G蛋白的細胞以每孔800,000-950,000個細胞的密度接種于6孔板中并在選擇性培養基中培養過夜。第1天，將培養基換成無抗生素的生長培養基并用2μg T1R2和2μg T1R3cDNA以及10μl Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉染細胞。將細胞在無抗生素的生長培養基中維持過夜。第2天，將細胞以每孔20,000個細胞的量接種于黑色亮底96孔板中，并培養過夜。進行鈣測定的早晨，用補充了Glutamax和透析過的FBS的低葡萄糖培養基置換原培養基以使糖和谷氨酸鹽的受體脫敏作用最小化。將細胞于37℃在此培養基中再保溫6小時。在此階段的最后，按上述條件處理細胞用于進行鈣測定。
實施例5在表達不同G蛋白的細胞中苦味葡糖苷對人TAS2R16的活化作用將5mM苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷加入表達hTAS2R16以及野生型Gα16、本發明Gα16gustducin44的嵌合體和對照嵌合體Gα16z44中任一種的細胞中。用人TAS2R16苦味受體瞬時轉染穩定表達不同G蛋白的細胞24小時。轉染后，用Fluo-4處理細胞，并按上文實施例2中所述檢測細胞內鈣熒光。持續監測細胞熒光，并將配體加入前15秒中測量的平均熒光值設定為基線，即未刺激水平的熒光。表達Gα16gustducin44嵌合體的細胞在經配體刺激后呈現出強于表達Gα16的細胞的受體活化作用。
表1具有G蛋白變體的人苦味受體的功能活性混雜G蛋白味覺受體 Gα16gustducin44Gα16Gα16z44假轉染(對照) 21621024 1541人TAS2R16 23821 3494 8296
所有數據均用相對熒光單位(RFUs)表示，并代表了加入配體后基線以上的平均熒光值的增加。配體和所用的終濃度是5mM苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷。用5mM D-水楊苷也得到類似的結果。
實施例6G蛋白對小鼠苦味受體(T2R5)的功能活性依照實施例5中所述的方法得到以下的結果表2 混雜的G蛋白味覺受體 Gα16gustducin44Gα16假轉染(對照) 3989 1705小鼠T2R5 10407 2569所有數據均以相對熒光單位(RFUs)表示，并代表配體加入后基線以上的平均熒光值的增加。配體和所用的終濃度是10μM環己酰亞胺。
實施例7在穩定表達Gα16gustducin44和TAS2R10的細胞中馬錢子堿對人苦味受體TAS2R10的活化作用本實施例基本上按實施例5中所述進行，只是用穩定表達人TAS2R10和G16gust44的四環素可誘導細胞系代替瞬時轉染。細胞保持在75-80％的密度。獲得了以下結果表3 混雜的G蛋白味覺受體 Gα16gustducin44只加入G蛋白(對照w/o四環素) 13238G蛋白+人TAS2R10(具四環素)24280所有數據均以相對熒光單位(RFUs)表示，代表了配體加入后超過基線的平均熒光值的增加。配體和所用的終濃度是250μM馬錢子堿。
實施例8在穩定表達Gα16gustducin44和TAS2R38的細胞中苯基硫脲或丙硫尿嘧啶對人苦味受體TAS2R38的活化作用本實施例基本上按實施例5中所述進行，只是用穩定表達人TAS2R38和G16gust44的四環素可誘導型細胞系代替瞬時轉染。細胞保持在75-80％的密度。獲得了以下結果表4 混雜的G蛋白味覺受體 Gα16gustducin44只加入G蛋白(對照w/o四環素) 3422G-蛋白+人TAS2R38(含四環素) 8989
所有數據均以相對熒光單位(RFUs)表示，代表了配體加入后超過基線的平均熒光值的增加。配體和所用的終濃度是250μM苯基硫脲。用250μM丙硫尿嘧啶獲得了類似的結果。
實施例9具有G蛋白的人苦味受體(TAS2R43)的功能活性本實施例基本上按實施例5中所述進行，只是用穩定表達人TAS2R43和G16guSt44的四環素可誘導型細胞系代替瞬時轉染。細胞保持在75-80％的密度。獲得了以下結果表5 混雜的G蛋白味覺受體 Gα16gustducin44只加入G-蛋白 3955G蛋白+人TAS2R43 26766所有數據均以相對熒光單位(RFUs)表示，代表了配體加入后超過基線的平均熒光值的增加。配體和所用的終濃度是10μM的馬兜鈴酸。
實施例10具有G蛋白的人苦味受體(TAS2R44)的功能活性本實施例基本上按實施例5中所述進行，只是用穩定表達人TAS2R44和G16gust44的四環素可誘導型細胞系代替瞬時轉染。細胞保持在75-80％的密度。獲得了以下結果
表6 混雜的G蛋白味覺受體Gα16gustducin44只加入G-蛋白 5700G蛋白+人TAS2R44 17254所有數據均以相對熒光單位(RFUs)表示，代表了配體加入后超過基線的平均熒光值的增加。配體和所用的終濃度是10μM的馬兜鈴酸。
實施例11具有G蛋白的人甜味受體的功能活性依照實施例5中所述方法獲得以下結果表7 混雜的G蛋白味覺受體 Gα16gustducin44Gα15假轉染(對照) 1370643人TAS1R2/TAS1R3 46171300所有數據均以相對熒光單位(RFUs)表示，代表了配體加入后超過基線的平均熒光值的增加。配體和所用的終濃度是2.5μM sucralose。用2.5μM的天冬甜素或丁磺氨K獲得了類似的結果。
序列表<110>Givaudan SA<120>G-蛋白<130>30069PCT<150>US 60/434,790<151>2002-12-18<160>2<170>Patentln version 3.1<210>1<211>1122<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)..(1122)<223>
<400>1atg gcc cgc tcg ctg acc tgg cgc tgc tgc ccc tgg tgc ctg acg gag481 5 10 15gat gag aag gcc gcc gcc cgg gtg gac cag gag atc aac agg atc ctc9620 25 30ttg gag cag aag aag cag gac cgc ggg gag ctg aag ctg ctg ctt ttg14435 40 45ggc cca ggc gag agc ggg aag agc acc ttc atc aag cag atg cgg atc19250 55 60
atc cac ggc gcc ggc tac tcg gag gag gag cgc aag ggc ttc cgg ccc24065 70 75 80ctg gtc tac cag aac atc ttc gtg tcc atg cgg gcc atg atc gag gcc28885 90 95atg gag cgg ctg cag att cca ttc agc agg ccc gag agc aag cac cac336100 105 110gct agc ctg gtc atg agc cag gac ccc tat aaa gtg acc acg ttt gag384115 120 125aag cgc tac gct gcg gcc atg cag tgg ctg tgg agg gat gcc ggc atc432130 135 140cgg gcc tgc tat gag cgt cgg cgg gaa ttc cac ctg ctc gat tca gcc480145 150 155 160gtg tac tac ctg tcc cac ctg gag cgc atc acc gag gag ggc tac gtc528165 170 175ccc aca gct cag gac gtg ctc cgc agc cgc atg ccc acc act ggc atc576180 185 190aac gag tac tgc ttc tcc gtg cag aaa acc aac ctg cgg atc gtg gac624195 200 205gtc ggg ggc cag aag tca gag cgt aag aaa tgg atc cat tgt ttc gag672210 215 220
aac gtg atc gcc ctc atc tac ctg gcc tca ctg agt gaa tac gac cag720225 230 235 240tgc ctg gag gag aac aac cag gag aac cgc atg aag gag agc ctc gca768245 250 255ttg ttt ggg act atc ctg gaa cta ccc tgg ttc aaa agc aca tcc gtc816260 265 270atc ctc ttt ctc aac aaa acc gac atc ctg gag gag aaa atc ccc acc864275 280 285tcc cac ctg gct acc tat ttc ccc agt ttc cag ggc cct aag cag gat912290 295 300gct gag gca gcc aag agg ttc atc ctg gac atg tac acg agg atg tac960305 310 315 320acc ggg tgc gtg gac ggc ccc gag ggc agc aac tta aaa aaa gaa gat1008325 330 335aag gaa atc tat tct cac atg acc tgc gct act gac aca caa aac gtc1056340 345 350aaa ttc gtg ttt gat gcc gtg aca gat ata ata ata aaa gag aac ctc1104355 360 365aaa gac tgt ggg ctc ttc1122370
<210>2<211>374<212>PRT<213>人<400>2Met Ala Arg Ser Leu Thr Trp Arg Cys Cys Pro Trp Cys Leu Thr Glu1 5 10 15Asp Glu Lys Ala Ala Ala Arg Val Asp Gln Glu Ile Asn Arg Ile Leu20 25 30Leu Glu Gln Lys Lys Gln Asp Arg Gly Glu Leu Lys Leu Leu Leu Leu35 40 45Gly Pro Gly Glu Ser Gly Lys Ser Thr Phe Ile Lys Gln Met Arg Ile50 55 60Ile His Gly Ala Gly Tyr Ser Glu Glu Glu Arg Lys Gly Phe Arg Pro65 70 75 80Leu Val Tyr Gln Asn Ile Phe Val Ser Met Arg Ala Met Ile Glu Ala85 90 95Met Glu Arg Leu Gln Ile Pro Phe Ser Arg Pro Glu Ser Lys His His100 105 110Ala Ser Leu Val Met Ser Gln Asp Pro Tyr Lys Val Thr Thr Phe Glu115 120 125
Lys Arg Tyr Ala Ala Ala Met Gln Trp Leu Trp Arg Asp Ala Gly Ile130 135 140Arg Ala Cys Tyr Glu Arg Arg Arg Glu Phe His Leu Leu Asp Ser Ala145 150 155 160Val Tyr Tyr Leu Ser His Leu Glu Arg Ile Thr Glu Glu Gly Tyr Val165 170 175Pro Thr Ala Gln Asp Val Leu Arg Ser Arg Met Pro Thr Thr Gly Ile180 185 190Asn Glu Tyr Cys Phe Ser Val Gln Lys Thr Asn Leu Arg Ile Val Asp195 200 205Val Gly Gly Gln Lys Ser Glu Arg Lys Lys Trp Ile His Cys Phe Glu210 215 220Asn Val Ile Ala Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Glu Tyr Asp Gln225 230 235 240Cys Leu Glu Glu Asn Asn Gln Glu Asn Arg Met Lys Glu Ser Leu Ala245 250 255Leu Phe Gly Thr Ile Leu Glu Leu Pro Trp Phe Lys Ser Thr Ser Val260 265 270Ile Leu Phe Leu Asn Lys Thr Asp Ile Leu Glu Glu Lys Ile Pro Thr275 280 285Ser His Leu Ala Thr Tyr Phe Pro Ser Phe Gln Gly Pro Lys Gln Asp
290 295 300Ala Glu Ala Ala Lys Arg Phe Ile Leu Asp Met Tyr Thr Arg Met Tyr305 310 315 320Thr Gly Cys Val Asp Gly Pro Glu Gly Ser Asn Leu Lys Lys Glu Asp325 330 335Lys Glu Ile Tyr Ser His Met Thr Cys Ala Thr Asp Thr Gln Asn Val340 345 350Lys Phe Val Phe Asp Ala Val Thr Asp Ile Ile Ile Lys Glu Asn Leu355 360 365Lys Asp Cys Gly Leu Phe370
權利要求
1.Gαq-Gustducin嵌合G-蛋白。
2.權利要求1的嵌合Gαq-Gustducin，其特征在于它是Gα15or16-Gustducin蛋白。
3.權利要求1或權利要求2的嵌合G蛋白，其中Gαq的至少最后5個氨基酸被相應數目的Gustducin氨基酸置換。
4.權利要求3的嵌合G蛋白，其中Gαq的最后44個氨基酸被Gustducin的44個氨基酸單元取代。
5.依照權利要求1的嵌合G蛋白，其具有SEQ ID 2中所列的氨基酸序列。
6.依照權利要求1的G蛋白，其由含有SEQ ID 1中所示核苷酸序列的核酸編碼。
7.包含SEQ ID 1中所示核苷酸序列且編碼權利要求1中所定義的G蛋白的核酸。
8.含有其中含有SEQ ID 1中所示核苷酸序列且編碼權利要求1所述G蛋白的核酸的表達載體。
9.用權利要求8所述表達載體轉染的宿主細胞。
10.穩定表達嵌合G蛋白和味覺受體的權利要求9的宿主細胞。
11.產生如權利要求1所述嵌合G蛋白的方法，包括以下步驟在足以表達所述G蛋白的條件下培養其中已含有編碼嵌合G蛋白的表達載體的宿主細胞，從而使該蛋白質產生并回收該細胞所產生的蛋白質。
12.用權利要求1所述嵌合蛋白質分析和發現味覺受體調節劑的方法。
13.用權利要求1所述嵌合蛋白質分析和發現味覺受體調節劑的方法，所述味覺受體選自苦味受體、甜味受體和鮮味受體。
14.依照權利要求12的方法，其中應用了以哺乳動物細胞為基礎的檢測法，該檢測法中采用了編碼本發明嵌合蛋白和味覺受體的轉染基因或cDNA，所述方法包括如下步驟使化合物接觸細胞并測定化合物對受體嵌合G蛋白復合物的功能效應。
15.依照權利要求12至14中任一項的方法，其中通過檢測諸如IP3或鈣2+等細胞內信使的變化而測定功能性效應。
全文摘要
G
文檔編號C07K14/47GK1726224SQ200380106507
公開日2006年1月25日 申請日期2003年12月17日 優先權日2002年12月18日
發明者J·P·斯萊克, T·S·麥克拉斯基 申請人:吉萬奧丹股份有限公司