專利名稱：檢查齲齒危險性的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及通過利用人基因診斷檢查齲齒危險性的方法。
因為如果在人唾液中存在大量致齲變鏈球菌，那么未來將進(jìn)一步產(chǎn)生新的齲齒，所以為了容易地檢測唾液中致齲變鏈球菌含量，已經(jīng)進(jìn)行了很多嘗試。例如，在公開號為No.02177898的日本專利和公開號為No.10036400的日本專利中就提出了方法，其中致齲變鏈球菌的量根據(jù)和變形鏈球菌特異性反應(yīng)的單克隆抗體來確定，以及美國專利No.5374538公開的方法，其中自身生長在簡化培養(yǎng)試劑盒的細(xì)菌細(xì)胞量根據(jù)目測觀察進(jìn)行確定。但是，為了通過檢測唾液中存在的致齲變鏈球菌的含量來檢查齲齒危險性，存在的問題就是在判斷具有高齲齒危險性時，很多情況下致齲變鏈球菌實際上應(yīng)該存在于口腔中，而且齲齒已經(jīng)發(fā)生。
另一方面，已知致齲變鏈球菌含量的增加過程在不同個體之間是不同的，而且如果上述增加過程的區(qū)別能夠事先檢測到，那么不論致齲變鏈球菌的實際增加或者含量，就可得知齲齒危險性。因此，作為能夠在被上述致齲變鏈球菌感染之前測定致齲變鏈球菌含量的檢測齲齒危險性的方法，注意力已經(jīng)被吸引到這樣一個過程，其中為了判斷一個人是否被特定感染所感染而檢測存在于人體內(nèi)的特定感染源產(chǎn)生的抗體。
在一種致齲變鏈球菌S.Mutans的細(xì)菌細(xì)胞表層物質(zhì)中，鑒定到一種稱作PAc(蛋白抗原血清型C)、分子量為大約190000的蛋白抗原，其和致齲變鏈球菌和牙齒表面的最初吸附相關(guān)，該研究利用單克隆抗體，其中所述蛋白抗原用作抗原。此外，一項為了明確PAc中特定部分的研究已經(jīng)取得進(jìn)展，所述Pac特定部分僅僅相關(guān)于致齲變鏈球菌和牙齒表面的最初吸附，而且已經(jīng)鑒定到在PAc中具有α螺旋結(jié)構(gòu)的A區(qū)(部分氨基酸序列216-464)顯著影響S.mutans在牙齒表面的移殖和吸附，Takahashi I等人，“鏈球菌表面蛋白抗原合成肽對S.mutans口腔移殖的免疫原性和保護(hù)效果”，J.Immunol，(USA)，1991，146，第332-6頁，Takahashi I.Infect Immun(USA)，Baltimore Md.美國免疫學(xué)家協(xié)會，1992，60，第623-629頁或者Okahashi N等人，Mol.Microbiol.(USA)，Blackwell Scientific Publications，1993，3，第221-228頁。另外，作為本發(fā)明發(fā)明者之一的Senpuku解決了在PAc的A區(qū)什么是最重要的序列的問題(參考非專利文獻(xiàn)1，Senpuku H等人，“誘導(dǎo)交叉反應(yīng)抗體的抗源肽抑制S.Mutans PAc和人唾液組分的相互作用”Infect Immun(USA)，Baltimore Md.美國免疫學(xué)家協(xié)會，1995，63，第4695-4703頁)。下文，鑒定到顯著作用人免疫系統(tǒng)、作為PAc的A區(qū)域抗原的序列為人B-細(xì)胞表位的Y---L--Y，以及和多種人HLA-DR分子反應(yīng)的部分和L--V-K--A[參考非專利文獻(xiàn)2，Senpuku等人，“鑒定和人MHC II型分子結(jié)合的S.mutans的Pac肽基元(DRBI*0802，*1101，*1401，和*1405)Immunology(England)，Blackwell ScientificPublications，1998，95，第322-330頁，和非專利文獻(xiàn)3，Senpuku等人，“在S.Mutans體外實時附著和體內(nèi)重新移殖中MoAbs抗表面蛋白抗原的抑制效果”Scand.J.Immunol.(England)，Oxford BlackwellScientific Publications，2001，54，第109-116頁]。從這個結(jié)果，推測出PAc中的特異性氨基酸序列，即[NAKATYEAALKQYEADLAAVKKANAA(PAc(361-386))]。詳細(xì)的氨基酸序列顯示在下式中。Asn Ala Lys Ala Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala AspLeu Ala Ala Val Lys Lys Ala Asn Ala Ala結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明者研究發(fā)現(xiàn)齲齒危險性的檢查可以通過利用PAc(361-386)，并測定由人口腔粘膜分泌的分泌型免疫球蛋白抗體A(sIgA)的抗體滴度來準(zhǔn)確地進(jìn)行，所述PAc(361-386)是作為抗原的氨基酸序列，所述sIgA用來抑制致齲變鏈球菌和牙齒表面的附著。
但是，為了測定抗唾液中所分泌PAc(361-386)的分泌型免疫球蛋白抗體A的抗體滴度，不能檢查沒有完整免疫功能小于約6歲的兒童，而且因為唾液分泌量個體之間不同，所以不能準(zhǔn)確反應(yīng)具有大量唾液和具有少量唾液人之間測定的分泌型免疫球蛋白抗體A抗體滴度。另外，也存在上述測定方法不能實施給感染有干燥癥的患者和唾液分泌能力低的老年人的問題，干燥癥患者具有明顯少的唾液分泌量。
因此，本發(fā)明的目的就是提供檢查齲齒危險性的方法，所述方法能夠制備所有人的樣品，而不管年齡和唾液分泌量。
發(fā)明概述為了解決上述問題，本發(fā)明的發(fā)明者進(jìn)行了深入詳細(xì)的研究，結(jié)果，他們將注意力集中到了主要組織相容性復(fù)合體(下文，有時只稱作MHC)用于檢查齲齒危險性，不用考慮年齡和唾液量。雖然，MHC存在于所有高等脊椎動物的細(xì)胞中，但是因為MHC首先是在人白細(xì)胞中被證實的，因此MHC被稱作人組織相容性白細(xì)胞抗原或者人白細(xì)胞抗原(下文，稱作HLA)。已知，HLA基因組在免疫系統(tǒng)中有很重要的作用并作為抗原識別非自身組分。
因為分泌抗所述PAc(361-386)抗體的機(jī)理自然相關(guān)于免疫系統(tǒng)基因，因此分泌在唾液中的分泌型免疫球蛋白抗體A的抗體滴度的區(qū)別通過用和人分泌型免疫球蛋白抗體A分泌相關(guān)的特異性基因型進(jìn)行確定。因此，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)通過個體基因型的分類有可能檢查齲齒危險性，而且如果一個人的基因型預(yù)先被確定成高或者低齲齒危險性，也就是分泌在唾液中的高或者低的分泌型免疫球蛋白抗體A的抗體滴度，僅僅通過鑒定基因就有可能進(jìn)行針對所有人檢查齲齒危險性的方法。
本發(fā)明為檢查齲齒危險性的方法，特征在于鑒定II型HLA基因組DR座位的DRB1*基因型。尤其是，本發(fā)明為檢查齲齒危險性的方法，特征在于鑒定II型HLA基因組中的DRB1*基因型，其中鑒定的基因型和齲齒危險性相比較，所述齲齒危險性事先進(jìn)行鑒定，源于在人唾液中針對抗原的分泌型免疫球蛋白A的抗體滴度，其中具有下式氨基酸序列的合成蛋白用作抗原。Asn Ala Lys Ala Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala AspLeu Ala Ala Val Lys Lys Ala Asn Ala Ala在HLA基因組中，有I型和II型，這些分子的整體結(jié)構(gòu)非常相似。在上述兩種類型中，呈遞在T細(xì)胞上的抗原和氨基酸的末端結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，所述末端結(jié)構(gòu)域具有膜穿透型異源二聚體，并來自細(xì)胞。II型存在于有限的細(xì)胞中，諸如B細(xì)胞或者抗原呈遞細(xì)胞，并且具有通過T細(xì)胞促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的機(jī)制。在本發(fā)明中，HLA基因組的II型基因被優(yōu)選采用。作為II型HLA，多種HLA-DR，DQ，DP等等已經(jīng)眾所周知，而且進(jìn)一步，所述HLA由4個結(jié)構(gòu)域α1，α2，β1和β2組成。HLA由在第六條染色體單臂上的HLA基因分型，并具有高度多態(tài)性。尤其是，已知II型DR基因的β鏈(DRB1，DRB3，DRB4，DRB5)在多態(tài)性中更突出，并且近來已知這些多態(tài)性基因和多種疾病相關(guān)。
根據(jù)本發(fā)明檢查齲齒危險性的方法，首先，收集受試者的細(xì)胞，然后提取上述細(xì)胞的DNA將位于第六條染色體單臂上的HLA基因組分型。通過將分型的HLA基因組和另一種HLA基因組進(jìn)行比較評價齲齒的危險性，后者通過研究已事先知曉，在唾液中分泌針對PAc(361-386)的分泌型免疫球蛋白抗體A具有高(或低)的抗體滴度。
因為HLA基因組存在于人的所有細(xì)胞中，人體任何部位的細(xì)胞都可作為樣品。在所述細(xì)胞中，為了在牙科診室簡單檢查齲齒的危險性，最容易收集的人口腔粘膜細(xì)胞被優(yōu)選采用。作為收集口腔粘膜細(xì)胞的方法，可以通過用藥勺刮取口腔粘膜收集細(xì)胞。
作為從收集細(xì)胞提取DNA的方法，可以利用從動物細(xì)胞提取DNA的通用方法。例如，優(yōu)選酚氯仿法，而且也可采用多種市售試劑盒。
作為基因型的分型方法，可以利用PCR-RFLP(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性)，PCR-SSO(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-序列特異性寡核苷酸)，PCR-SSP(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-序列特異性引物)等等。但是，作為基因分型的方法，其在本發(fā)明檢查齲齒危險性的方法中被采用，除上述方法外的任何合適方法都可采用。
通過將分型的HLA基因組和另一種HLA基因組進(jìn)行比較評價齲齒的危險性，后者通過研究已事先知曉，在唾液中分泌針對PAc(361-386)的分泌型免疫球蛋白抗體A具有高(或低)的抗體滴度。例如，在目前已經(jīng)鑒定的基因型中，作為具有高齲齒危險性的基因型，也就是具有低抗體滴度的分泌型免疫球蛋白抗體A的基因型，已經(jīng)鑒定了在二聚體一側(cè)具有DRB1*0101，DRB1*0405，DRB1*0803，DRB1*1302，DRB1*1502和DRB1*0410基因型的例子。另外，作為具有低齲齒危險性的基因型，也就是具有高抗體滴度的分泌型免疫球蛋白抗體A的基因型，已經(jīng)鑒定了在二聚體一側(cè)具有DRB1*0403，DRB1*0406，DRB1*0401，DRB1*0802，DRB1*0901，DRB1*1202，DRB1*1401，DRB1*1405，DRB1*1501和DRB1*1602基因型的例子。此外，如果所有二聚體的組合情況能通過未來的研究加以解決，則可以更準(zhǔn)確評價齲齒的危險性。
為了獲得本發(fā)明使用的PAc(361-386)，如果所述PAc(361-386)的氨基酸序列可以通過所述方法獲得，雖然并不限于此方法，但是通常方便采用氨基酸合成儀。
作為本發(fā)明檢查齲齒危險性方法中采用的分泌型免疫球蛋白抗體A的抗體滴度的測定方法，即使采用傳統(tǒng)酶免疫組化方法，即酶聯(lián)免疫吸附檢測，可以獲得足夠可用的敏感性，所述酶聯(lián)免疫吸附檢測下文稱作“ELISA”，是針對致齲變鏈球菌的一種抗體滴度測定技術(shù)。但是，測定時的測定敏感性可以通過傳統(tǒng)用于提高由抗原抗體反應(yīng)獲得的測定值敏感性的技術(shù)加以提高，例如一旦分泌型免疫球蛋白A存在于唾液中就和生物素抗-人免疫球蛋白A反應(yīng)的技術(shù)等。因此，基于通?？乖贵w反應(yīng)的技術(shù)本身可被采用。除了上述技術(shù)，可以適當(dāng)采用免疫-層析，免疫-濃縮，以及乳膠凝聚試驗等技術(shù)。
圖1顯示了5位受試者(A，B，C，D，E)唾液中抗PAC(361-386)免疫球蛋白A抗體滴度的ELISA測定結(jié)果。
優(yōu)選實施方案的詳細(xì)描述下面將根據(jù)實施例詳細(xì)解釋本發(fā)明檢測齲齒危險性的方法，但是并不限于下列實施例。除了特殊說明，在室溫下進(jìn)行操作，pH為20到25℃的值。蛋白濃度根據(jù)280nm波長處的光吸收進(jìn)行計算。
實施例1<細(xì)胞收集方法>
通過使用棉拭(產(chǎn)品名稱為C.E.P.棉拭，由Lifetech Oriental Co.Ltd.生產(chǎn))刮取口腔的部分面頰收集口腔粘膜細(xì)胞。細(xì)胞收集后立即進(jìn)行DNA提取。
<從口腔粘膜細(xì)胞提取DNA>
收集的口腔粘膜細(xì)胞加入到1.5mL的小管中，其中添加了500μL的DNAzol reagent(由Lifetech Oriental Co.Ltd.生產(chǎn))，勻漿后，用乙醇沉淀并清洗。然后，抽提DNA。用在260nm波長處的O.D.吸收鑒定DNA的濃度，提取的純度用O.D.260nm/O.D280nm的比值進(jìn)行鑒定。提取的DNA懸浮在TE緩沖液中，所述緩沖液包括三羥甲基氨基甲烷10mM，乙二胺四乙酸(EDTA)1mM，pH值8.0。然后進(jìn)行如下操作。
<確定DRB1*的基因型>
通過使用如下PCR-RFLP進(jìn)行DRB1*基因型的確定，根據(jù)“PCR-RFLP分型檢測新的HLA-DRB1等位基因DRB1*13022，DRB1*1336和DRB1*1435”(European Journal of Immunogenetics，28，441-447)，Trejaut J.等人。PCR的條件如下。
上述純化的DNA100到500ngMgCl21.5mMdNTPs40μM二甲基亞砜(DMSO) 3％重量下述引物 50pMAmpliTaq酶(PE Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)1單位將所有上述成分混合，共制備50μL。
作為引物，DR3(5’cacgtttcttggagtactc 3’)(Home & Keown，1993)和AmpB(5’ccgctgcactgtgaagctct 3’)(Kimura & Sasazuki，1992)用來擴(kuò)增DRB1*03，08，11，12，13，14。擴(kuò)增后，從外顯子2獲得266bp的擴(kuò)增片段。此外，對DRB1*1122，1410而言，類DR4在5’-端代替引物DR3使用，而對于DRB1*1130而言，類DR4也被使用。(參考Marsh，S.G.E.，II型HLA區(qū)的序列1998，Tissue Antigen51，467-507。)對于制備的樣品，特異性基因序列通過利用熱循環(huán)儀(產(chǎn)品名稱為GeneAmp PCR System 9700熱循環(huán)儀，由PE Biosystems公司生產(chǎn))進(jìn)行擴(kuò)增。至于熱循環(huán)儀程序的操作，在95℃2分鐘，在94℃ 30秒，在60℃ 30秒，和在72℃ 30秒下進(jìn)行，這些操作重復(fù)30次。隨后，在72℃進(jìn)行10分鐘。為了鑒定擴(kuò)增序列，5μL的上述PCR產(chǎn)物使用電泳裝置(產(chǎn)品名稱為Mupid 2，由Cosmobio Co.Ltd.生產(chǎn))在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，所述瓊脂糖凝膠為含有0.2μg/mL溴化乙烯的2％1×TAE(三羥甲基氨基甲烷為0.04M，醋酸為0.04M，EDTA為0.001M)。至于電泳后產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物通過使用UV-透射儀(由Funakoshi Co.Ltd.生產(chǎn))進(jìn)行鑒定。
<限制酶處理>
電泳后，進(jìn)行限制酶處理。也就是利用BseRI(4單位)，BsaJI(3單位)，RsaI(5單位)和Sau96I(5單位)(均由New England Biolabs公司生產(chǎn))進(jìn)行。對于限制酶處理，在37℃利用上述酶和純化水處理過夜，其中對10μL的PCR產(chǎn)物使用1×緩沖液(連同酶一起提供)。但是，僅對于BsaJI而言，是在60℃進(jìn)行處理過夜。限制酶處理的樣品在500V的條件下，通過利用10％聚丙烯酰胺凝膠電泳1小時，所述聚丙烯酰胺凝膠是用1×TBE(三羥甲基氨基甲烷為0.089M，硼為0.089M，EDTA為0.02M)制備的。至于電泳，100bpDNA(由Takara Shuzo Co.Ltd.生產(chǎn))添加到1個泳道作為大小對照，并鑒定電泳產(chǎn)物。電泳后，從玻璃板上移走凝膠，用如下溶液浸泡和染色，所述溶液中0.8μg/mL的溴化乙烯溶解于1×TBE中。凝膠利用UV-透射儀(由Funakoshi Co.Ltd.生產(chǎn))和凝膠攝像機(jī)(產(chǎn)品名稱為Funaroid Camera FR6000，由Funakoshi Co.Ltd.生產(chǎn))通過照相進(jìn)行鑒定。
<DRB1序列的測定>
根據(jù)上述方法測定DRB1的基因型。
<利用ELISA測定唾液分泌型抗體>
(1)PAc(361-386)的合成具有PAc(361-386)氨基酸序列的肽通過逐步固相肽合成的方法進(jìn)行。350型多肽合成儀(產(chǎn)品名稱為Advanced Chemitech，由Louisville公司生產(chǎn))用作合成儀。合成肽的檢測利用TSK-GEL柱(30×1)通過高效反相液相色譜進(jìn)行，即10-45％的乙腈作為分離柱，梯度為0.1％TFA。最終的純度高于95％。
(2)測定唾液分泌型抗體A)形成固相抗體通過上述過程合成的PAc(361-386)用50mM，pH值為9.6的碳酸鈉緩沖液進(jìn)行稀釋，這種稀釋的PAc(361-386)添加到96孔微孔板(由Sumitomo Bakelite公司生產(chǎn))的每個孔中，體積為1001μL。添加的PAc(361-386)在4℃靜置過夜以和微孔結(jié)合。
B)封閉通過上述過程形成的帶固相的微孔板用液體(以后稱作PBST)利用微孔板沖洗機(jī)(產(chǎn)物名稱為1575型，由Bio-Rat公司生產(chǎn))清洗3次，所述液體中PBS(磷酸鹽緩沖液，pH7.4)含有0.05％重量的中性界面活性劑(產(chǎn)品名稱為TWEEN2O，由SIGMA公司生產(chǎn))。清洗后，每個微孔注射200μL含有1％脫脂乳的PBS，在37℃進(jìn)行封閉反應(yīng)1小時。封閉后，用PEBST進(jìn)行清洗共3次，以去除多余的封閉劑。
C)制備唾液通過咀嚼固體石蠟3分鐘分泌的刺激唾液作為樣品。采集后，將唾液樣本保存在冰中直至開始測定。在試驗中，通過用含有0.5％脫脂乳的PBST稀釋2，4，8，16，32，64，128，256，512和1024倍進(jìn)行唾液制備。添加100μL的每份唾液到所述微孔板。添加后，微孔板在37℃保持靜置1小時，并用PBST清洗。
D)標(biāo)記抗體用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗-人IgA抗體(產(chǎn)品名稱為抗-人-IgA，由Chemicon International公司生產(chǎn))，用含有0.5％重量的脫脂乳進(jìn)行制備，濃度為0.3μg/mL。100μL的制備標(biāo)記添加到每個微孔中并在37℃反應(yīng)1小時。
E)染色用PBST清洗后，100μm含有0.1％重量的六水合對硝基苯酚磷酸二鈉鹽的二乙醇胺緩沖液加入每個微孔后并在37℃保持靜置30分鐘，所述六水合對硝基苯酚磷酸二鈉鹽是堿性磷酸酶的染色底物。然后，測定在405nm波長處的光吸收。這些結(jié)果顯示在表1中。在這種情況下，二乙醇胺緩沖液根據(jù)如下說明進(jìn)行制備。
二乙醇胺48.5mLMgCl2·6H2O50.0mgNa3N100mgH2O400mL，制備最終pH到9.8后，向二乙醇胺緩沖液中補(bǔ)加水到500mL。
利用ELISA測定5個受試者(A，B，C，D，E)唾液中抗PAc(361-386)免疫球蛋白A的抗體滴度，這些結(jié)果顯示在圖1中。結(jié)果，這5個受試者分成兩個小組，即，高抗體滴度小組(在這種情形下為A，C，E)和低抗體滴度小組(在這種情形下為B，D)。此外，檢測齲齒危險性方法的準(zhǔn)確性在口腔中致齲變鏈球菌的實際量和高和低抗體滴度的小組之間進(jìn)行鑒定。
每個人的HLA-DRB1*的基因型通過上述方法利用上述受試者(A，B，C，D，E)口腔粘膜細(xì)胞得以鑒定，并鑒定唾液中抗PAc(361-386)的分泌型免疫球蛋白A的抗體滴度和基因型之間的關(guān)系。這些結(jié)果顯示在表1中。通過設(shè)定這樣的條件，分別相應(yīng)于上述兩組的基因型，即，高抗體滴度組(A，C，E)和低抗體滴度組(B，D)，利用多個受試者的樣品事先進(jìn)行鑒定。此外，鑒定發(fā)現(xiàn)HLA-DRB1*的基因型和抗體滴度相關(guān)。
作為檢測齲齒危險性的實際方法，當(dāng)上述事先被鑒定的PAc(361-386)作為抗原時，通過將和來自人唾液中針對抗原的分泌型免疫球蛋白A的高或者低抗體滴度的高或者低齲齒危險性相關(guān)的基因型與用受試者鑒定的基因型進(jìn)行比較而檢測齲齒危險性。
如上所述，本發(fā)明檢測齲齒危險性的方法是和傳統(tǒng)免疫方法相比不考慮年齡和唾液量，就能夠?qū)λ腥诉M(jìn)行檢查的方法。此外，因為可以通過本發(fā)明更準(zhǔn)確和更廣泛地檢查齲齒的危險性，所以本發(fā)明的方法對于牙科醫(yī)學(xué)有很重要的價值。
權(quán)利要求
1.一種檢測齲齒危險性的方法，其特征在于鑒定II型HLA基因組中DRB1*的基因型。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中鑒定的基因型和齲齒危險性進(jìn)行比較，所述齲齒危險性已在事先得以鑒定，來自人唾液中針對抗原的分泌型免疫球蛋白A的抗體滴度，其中具有下式氨基酸序列的合成蛋白作為抗原，[式1]Asn Ala Lys Ala Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp LeuAla Ala Val Lys Lys Ala Asn Ala Ala。
全文摘要
為了不考慮年齡和唾液量檢測齲齒的危險性，鑒定II型HLA基因組中DRBI的基因型，鑒定的基因型和事先鑒定的基因型進(jìn)行比較，事先鑒定的基因型和來自人唾液中針對抗原的分泌型免疫球蛋白A高和低抗體滴度的高和低齲齒危險性相關(guān)，其中具有如下氨基酸序列的合成蛋白用作抗原Asn Ala Lys Ala Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu AlaAsp Leu Ala Ala Val Lys Lys Ala Asn Ala Ala。
文檔編號C07K14/315GK1504581SQ20031011957
公開日2004年6月16日 申請日期2003年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月4日
發(fā)明者泉福英信, 鱒沢諭美子, 美子 申請人:株式會社Gc