苦杏仁苷的制備方法和苦杏仁苷在制備促進心腦胰及傷口血液循環的苦杏仁苷制劑中的應用的制作方法

專利名稱：苦杏仁苷的制備方法和苦杏仁苷在制備促進心腦胰及傷口血液循環的苦杏仁苷制劑中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及含有機有效成分的醫藥配制品的醫藥用途，具體是一種苦杏仁苷的制備方法和苦杏仁苷在制備促進心腦胰及傷口血液循環的苦杏仁苷制劑中的應用。
背景技術：
桃仁、苦杏仁均為中國藥典收錄的品種，資源豐富。
杏仁(苦杏仁)，屬薔薇科(Rosaceae)味苦，微溫，有小毒。具有止咳平喘，潤腸通便的功能。治療劑量的本品經口服后，其有效成分苦杏仁苷在體內緩慢水解，逐漸生成微量氫氰酸，后者對呼吸中樞呈鎮靜作用，使呼吸運動趨于安靜而呈現鎮咳和平喘的作用。為常用的止咳、平喘中藥。其化學成分含苦杏仁苷(amygdalin)、脂肪油、苦杏仁酶(emulsin)、苦杏仁苷酶(amygdalase)、櫻葉酶(prunase)、雌酮、α-雌二醇、鏈甾醇等。
臨床上常將苦杏仁做成丸劑、片劑、糖漿劑等劑型應用。
桃仁，屬薔薇科(Rosaceae)，味苦甘平。功能主治破血行瘀，潤燥滑腸。治經閉，熱病蓄血，風痹，瘧疾，跌打損傷，瘀血腫痛，血燥便秘。其化學成分含苦杏仁苷(amygdalin)、苦杏仁酶(emulsin)、脂肪油等。
桃仁在中成藥制劑中也是常用的原料之一。
中國專利1319431公開了一種“含苦杏仁苷物質抗腫瘤活性的增進方法機組和物和評價方法”，系通過紅外焙烤、清酒曲發酵和涂布油增進含苦杏仁苷枇杷種子等抗癌功效。在添加和增加含苦杏仁苷的經處理過的產物的濃度條件下，通過紫外線照射二碳六烯酸在體系中增加過氧化物脂質的形成。過氧化物脂質形成得越多，評價和預測口服途徑中的抗癌功效越強。用此方法來評價含苦杏仁苷物質的功效。
中國專利1365979公開了一種“有效成分苦杏仁苷的提取分離及精制方法”系將苦杏仁壓榨去油，加3-6倍量的乙醇提取3次，減壓過濾，合并濾液，減壓回收乙醇，放置、析出苦杏仁苷，過濾得粗品；苦杏仁苷粗品經乙醇溶解、過濾、冷藏、放置、析出白色簇狀結晶，減壓過濾，用少量乙醚與乙醇洗滌，得純度為99％以上的苦杏仁苷定量對照品。該發明解決了長期以來苦杏仁苷以苦杏仁酶酶解或水解而使有效成分被破壞、療效降低的難題。對照品得純度高，具有廣泛應用價值。

發明內容
本發明是為了解決中藥桃仁中有效成分所具有的醫藥效果，而提供一種藥源更為廣泛的苦杏仁苷在制備促進心腦胰及傷口血液循環的苦杏仁苷制劑中的應用；同時還提供了一種苦杏仁苷的制備方法。
本發明原理桃仁、杏仁在功能主治方面雖有不同，但是其所含的化學成分有極大的共同性。在通過正交篩選確定桃仁明確的活血化瘀作用后，確定提取桃仁中的主要成分—苦杏仁苷，并進行了定性分析苦杏仁苷及含量測定，由于苦杏仁苷也存在于苦杏仁中，而且苦杏仁作為藥用時已經過壓油的工藝，因此提取處理更為方便，所以在苦杏仁苷的實驗研究中，均使用從苦杏仁餅中提取苦杏仁苷。
苦杏仁的主要有效成分為苦杏仁苷，苦杏仁苷易被同存于苦杏仁中異細胞的苦杏仁酶酶解，其化學性質為易溶于熱乙醇，難溶于乙醇，故選用已壓榨除去絕大部分油的杏仁餅，采用乙醚進一步脫脂，乙醇回流提取的方法，快速、簡單地提制苦杏仁苷。
苦杏仁苷的制備方法壓榨去油后的苦杏仁1Kg加乙醚4000-5000ml分2次加熱回流脫脂，過濾備用；將藥渣揮盡乙醚后加95％乙醇回流提取三次，每次3000-5000ml，趁熱過濾，合并濾液，減壓回收乙醇至生藥量的1-2倍量體積，放置至室溫，再加入1/2量的乙醚，容器底層析出沾壁的油狀沉淀，轉出上清液，放置，析出結晶，抽濾，得苦杏仁苷粗品；將苦杏仁苷粗品加20-40倍乙醇溶解、過濾、放置、析出苦杏仁苷白色片狀結晶，減壓過濾，用100-200mL乙醇洗滌結晶，即得苦杏仁苷純品，收率4％以上，純度達90％以上。
所述的制備方法，其苦杏仁苷粗品可反復處理1-2次，但每次乙醇量須減半。
苦杏仁苷在制備促進心腦胰及傷口血液循環的苦杏仁苷制劑中的應用一.苦杏仁苷對腦血液循環的作用。
1.治療因血粘稠度升高所致的腦缺血。苦杏仁苷靜脈輸入均可增加大鼠軟腦膜及腦實質兩部位的循環血流，說明兩部位的血管擴張反應具有同步性；作用顯現較晚，從靜脈注射后30分鐘開始，作用逐步增加，直至60分鐘時與給藥前有明顯差異。為此，在造成血流降低之前給予苦杏仁苷，能拮抗葡聚糖的致病作用。
2.對腦微循環障礙的影響。用于如注射腎上腺素、垂體后葉素及中腦動脈結扎的預防和治療。
二.苦杏仁苷治療心力衰竭。
苦杏仁干可在較長時間內維持大鼠離體心臟冠脈流量、心縮力及收縮頻率保持不變。應用苦杏仁苷灌流可使離體心臟在較長時間里維持心臟正常功能，對心臟功能衰竭有保護作用。
三.苦杏仁苷治療急性胰腺炎。
苦杏仁苷對胰腺血流及氧耗有較好的影響，能降低重型急性胰腺炎時白細胞滾動及粘附數增加，能增加血液流速及壁切率；通過抑制白細胞內皮細胞過度粘附，減少白細胞在組織內的聚集，從而對胰外臟器起保護作用；對急性胰腺炎時大鼠血清NO的過渡升高有降低作用。
四.苦杏仁苷促經傷口愈合。
改善皮下組織氧分壓，增加皮膚組織微循環血流，使傷口愈合加快，提高切口斷裂強度，有益于缺血皮膚切口的愈合。
這樣制備的苦杏仁苷產率高、純度高、制備方法簡便。
如上制備的苦杏仁苷經動物實驗表明具有預防和治療因血粘稠度升高所致的腦缺血，對心臟功能衰竭有保護作用，對急性胰腺炎的治療和促進傷口愈合的作用，并具有顯著的效果。因此，本發明為醫學臨床提供了一種新的藥物制劑，并為該制劑提供了新的醫藥用途。


圖1為本發明樣品色譜2為對照品色譜3為生理鹽水對大鼠軟腦膜(上)及腦實質(下)微循環的影響。
圖4為苦杏仁苷對大鼠軟腦膜(上)及腦實質(下)微循環的影響。
圖5為高分子葡聚糖引起的大鼠軟腦膜(上)及腦實質(下)微循環變化。
圖6為苦杏仁苷對高分子葡聚糖引起的大鼠軟腦膜(上)及腦實質(下)微循環障礙的預防作用。
圖7a為YHI+苦杏仁苷對胰組織微循環變化。
圖7b為生理鹽水對胰組織微循環變化。
具體實施例方式
直接取杏仁餅1Kg，適當粉碎后過20目篩，加乙醚4000mL，分2次加熱回流脫脂，過濾，將藥渣揮盡乙醚后加95％乙醇回流提取三次，每次5000mL，趁熱過濾，合并濾液，減壓回收乙醇至1500mL，稍放置至室溫，再加入1/2量的乙醚，放置，容器底層析出沾壁的油狀物質，將上清液轉出，繼續放置，析出結晶，抽濾，得苦杏仁苷粗品61g。將苦杏仁苷粗品加1200mL乙醇加熱溶解、過濾、放置、析出苦杏仁苷白色片狀結晶，減壓過濾，用少量乙醇洗滌結晶，用200mL乙醇洗滌2次，得苦杏仁苷純品41g，純度達90％以上。
藥物劑型注射用粉制劑。
注射用苦杏仁苷粉制劑的推薦臨床使用劑量為2ml/kg/h，輸液劑量與一次注入劑量的換算方法待定。
一.苦杏仁苷定性及定量檢測1.薄層色譜取苦杏仁苷標準品(中國生物制品檢定所，批號820-9401)，用甲醇配制成1mL含2mg的溶液，作為對照品溶液。取本發明提制的苦杏仁苷，同樣用甲醇配制成1mL含2mg的溶液，作為供試品溶液。分別吸取上述兩種溶液10uL，點于同一硅膠GF254薄層板(煙臺市化學工業研究所)上，展開劑為水飽和氯仿∶甲醇(2∶1)，展開、取出、晾干，置紫外燈(UV254)下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的暗斑點。
2.HPLC法測定苦杏仁苷含量色譜條件用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相為含0.1％磷酸的水∶甲醇(80∶20)；檢測波長為210nm，流速為0.9mL/min，理論塔板數按苦杏仁苷計算應不低于5000。
取苦杏仁苷標準品(批號820-9401)，用甲醇配制成1mL含約0.2mg的溶液，作為對照品溶液。再取本發明制得苦杏仁苷用甲醇配制成1mL含約0.2mg的溶液，作為供試品溶液。
標準曲線的繪制按上述色譜條件，分別進樣4ul、8ul、10ul、12ul、16ul，得出面積積分值，以ug為橫坐標，面積為縱坐標，繪制標準曲線圖，為一直線，線性方程為Y＝8.893e-007X+1.686e-002，R＝0.9999按外標法測定供試品，進樣10ul，對照品與供試品的液相色譜圖保留時間一致。苦杏仁苷含量為98.4％。
采用高效液相法的歸一化法進行純度檢查，與上述所測含量基本一致。標準品含量為97.70％，本發明提制的苦杏仁苷含量為99.18％。
二.苦杏仁苷的藥理作用(一)促進腦血液循環，治療因血液粘度升高所致的腦缺血。
1.對腦微循環的影響目的為測定苦杏仁苷靜脈輸入對大鼠軟腦膜及腦實質微循環的影響。
方法健康II級Wistar大鼠40只，分為4組，每組10只。實驗時將大鼠以10％烏拉坦腹腔注射麻醉(1ml/100g體重)，頭頂部矢壯縫兩側顱骨鉆孔后穿破硬腦膜，分別置入激光多普勒微循環電極，測定軟腦膜及腦實質血流。血流穩定后于各組分別靜脈輸入生理鹽水(對照組)和低、中、高劑量苦杏仁苷(1.5％、3％及6％，2ml/h)。觀察兩部位微循環血流變化1小時。
結果生理鹽水無影響，三劑量苦杏仁苷均可增加兩部位血流，以高劑量作用最明顯。
結論苦杏仁苷靜脈輸入可增加大鼠軟腦膜及腦實質微循環血流。(表1、2)表1苦杏仁苷等對大鼠軟腦膜微循環血流(PU)的影響(x±s)給藥后(分)組別給藥前 5153060對照組(7) 216.62±131.73 208.51±139.19 198.05±137.99197.25±136.12207.28±140.61給藥I組(7)143.69±104.28 132.68±69.27138.38±69.30 151.76±89.00 182.93±125.93*給藥II組(10) 180.57±43.25 175.70±44.26179.98±46.34 210.40±62.69 222.40±75.60*給藥III組(9) 151.87±74.24 162.11±90.96168.23±87.85 174.15±100.96188.84±102.41*與給藥前比較*p＜0.05()動物數表2苦杏仁苷等對大鼠腦實質微循環血流(PU)的影響(x±s)給藥后(分)組別 給藥前 515 30 60對照組(7) 130.79±40.11 130.35±32.77 141.30±6.30 134.99±44.55122.94±62.55低劑量組(7)145.19±104.82144.36±109.55146.18±110.16154.53±133.75 161.79±145.62*中劑量組(10) 103.21±26.40 101.88±29.76 103.53±32.90 108.14±33.06112.20±29.76*高劑量I組(9) 110.13±30.46 108.68±31.77 110.41±34.36 115.10±41.04128.09±53.55*與給藥前比較*p＜0.05()動物數
2.對腦微循環障礙的影響目的研究苦杏仁苷對高分子葡聚糖引起的大鼠腦微循環障礙的保護作用。
方法應用10％葡聚糖尾靜脈注射(9ml/kg)引起大鼠腦微循環障礙，與此同時(治療組)或前30min(預防組)尾靜脈輸入苦杏仁苷，觀察其對腦微循環障礙的治療與預防作用。腦血流變化應用激光多普勒血流儀(LDF，瑞典，5001系列)進行測定。
結果高分子葡聚糖使大鼠腦微循環明顯降低，苦杏仁苷未表現明顯治療作用，但有顯著的預防作用。
結論苦杏仁苷對高分子葡聚糖引起的大鼠腦微循環障礙有明顯的預防作用。(表3、4；圖5、6)表3苦杏仁苷對腦微循環障礙大鼠軟腦膜微循環血流(PU)變化(x±s)給藥后(分)組別 給藥前515 30 60對照組(7)216.62±131.73208.51±139.19198.05±137.99 197.25±136.12 207.28±140.61模型組(8)150.77±63.49 122.11±48.77 115.23±64.38 107.60±66.04**90.60±46.79**治療組(11) 141.37±68.52 109.17±74.04 102.78±49.66*87.03±45.86**90.13±55.67**預防組(9)142.36±28.22 144.02±32.85 136.99±33.85 133.44±35.82 142.14±43.81與給藥前比較*p＜0.05；**p＜0.01()動物數表4苦杏仁苷對腦微循環障礙大鼠腦實質微循環血流(PU)變化(x±s)給藥后(分)組別 給藥前5 15 30 60對照組(7)130.79±40.11 130.35±32.77 141.30±6.30 134.99±44.55 122.94±62.55模型組(8)132.37±36.07 106.59±36.36**91.33±30.67**84.60±22.05***84.46±24.63***治療組(11) 143.87±34.58 128.92±41.14 98.75±33.46**89.63±31.52**90.51±36.52**預防組(9)143.87±19.64 151.55±41.59 149.07±63.30 143.64±83.21 159.33±124.44與給藥前比較*p＜0.05；**p＜0.01()動物數(二).治療心力衰竭目的觀察了苦杏仁苷對大鼠離體心臟心縮力、冠脈流量及收縮頻率的影響。
方法應用改良的Langendorff離體心臟灌流法。穩定期后，以含苦杏仁苷的灌流液進行灌流，觀察預定指標變化。
結果對照組(離體心臟灌流液)由于離體灌流標本的條件限制對照組10分鐘后即見冠脈流量下降，苦杏仁苷給藥組(應用含苦杏仁苷的灌流液灌流)至實驗末期(50、60分鐘)冠脈流量才開始下降。若與赤芍提取液合用則可在60分鐘觀察期內維持冠脈流量不變；苦杏仁苷對心臟收縮頻率及收縮力基本無影響。
結論隨灌流時間的延續，心臟冠脈流量逐漸降低，給予苦杏仁苷可在較長時間內維持大鼠離體心臟冠脈流量、心縮力及收縮頻率保持不變。(表5)表5苦杏仁苷等對大鼠離體灌流心臟冠脈流量的影響組 動給給 藥 后物藥別數前510 15 2025 30 405060對照組 84.54 4.88 4.26 4.19 4.00± 4.06± 3.93± 3.95± 3.96± 4.09±± ±±± 1.13**1.02*1.08**1.08*1.24*1.221.17 1.32 1.10*1.10*復方丹參84.46 4.84 4.46 4.24 4.15± 4.08± 4.16±4.04± 3.90± 3.71±注射液 ± ±±±1.17 1.14 1.21 1.08 1.02 1.00*1.51 1.47 1.22 1.17桃仁提取94.78 4.98 4.87 4.76 4.71± 4.66±4.60±4.37± 4.14± 4.12±液 ± ±±±0.88 0.98 0.93 0.93 0.90*0.69*1.05 1.07 0.83 0.79赤芍提取11 5.77 5.70 5.66 5.75 5.91± 5.81± 5.74±5.44± 5.05± 4.73±液 ± ±±±2.42 2.50 2.58 2.28 2.24*2.25**2.35 2.07 2.20 2.27桃仁+赤 95.41 5.67 5.39 5.34 5.37± 5.46± 5.40± 5.23± 5.23± 4.77±芍 ± ±±±3.13 3.20 3.08 2.94 3.91 2.41提取液 3.31 3.20 2.98 3.05注*與給藥前比較P＜0.05**與給藥前比較P＜0.01(三).治療急性胰腺炎1.對家兔實驗性急性胰腺炎的保護作用應用家兔重型急性胰腺炎(SAP)模型證明，抑酶注射液(YHI)及苦杏仁苷合并靜脈注射(1g/kg，溶于10mL生理鹽水中給予)，有增加家兔存活時間、和五天存活率的趨勢(對照組33.3％；治療組83.3％)。藥物使動物血清淀粉酶明顯下降(表6)。胰組織微循環明顯改善(圖7)，并使SAP嚴重性指標IL-6明顯低于對照組(表7)。病理檢查結果也顯示白細胞浸潤、脂肪壞死、出血等指標均較對照組為輕(表8)。實驗提示，YHI與苦杏仁苷聯合應用對家兔SAP有保護作用。
表6抑酶注射液(YHI)及苦杏仁苷對重癥急性胰腺炎家兔血清淀粉酶(U/L)的影響(x±s)AP后(天)組別 AP前 1 3 5治療組 867.67±374.62(6)6320.83±2614.12〔6〕 4774.0±1859.36(5)**1596.6±760.50(5)對照組 838.17±189.12(6)7856.67±3745.03〔5〕**7038.0±3687.41〔4〕**2095.0±1081.87〔2〕***與SAP前比較P＜0.01；*與AP前比較P＜0.02；()動物數〔〕存活數表7YHI及苦杏仁苷對SAP家兔血清IL-6水平的影響(x±s)AP后(天)組別 AP前 1 3 5治療組 32.37±9.11〔6〕69.75±19.18〔5〕72.25±10.14〔4〕 70.25±10.34〔2〕對照組 34.0±16.40〔6〕59.50±17.59〔6〕50.33±16.57〔5〕*46.50±14.94〔5〕*白細胞介素-6單位U/mL〔〕動物數*與對照組比較P＜0.05表8抑酶注射液(YHI)及苦杏仁苷對重癥急性胰腺炎家兔病理變化的影響對照組治療組1小葉結構 完全破壞有較完整的小葉2腺泡 破壞萎縮3胰腺導管小葉內 嚴重破壞存在擴張小葉間 殘存存在4脂肪組織 完全破壞輕-中度破壞5炎性細胞 膿腫形成膿腫少，殘存小葉中有小量白細胞浸潤6出血灶大片灶小而少7間質纖維組織增生 在膿腫及壞死組織周圍量少在膿腫及壞死組織周圍增生較多8胰島 無 存在苦杏仁苷是經正交實驗證明對腸血流及氧耗作用最強的藥物，后經實驗證實對胰腺血流及氧耗亦有較好的影響。本實驗用抑酶注射液與苦杏仁苷合用治療家兔急性重型胰腺炎，獲得滿意的結果，這和它們抑制胰酶，改善胰腺血液循環有關。(表8)2.機制分析(1)對白細胞粘附的影響①苦杏仁苷對大鼠活體微循環的影響目的觀察苦杏仁苷對大鼠腸系膜活體微循環的影響。
方法大鼠麻醉后開腹，找出近結腸部空腸系膜鋪于特制的保溫鼠版上，進行顯微鏡觀察。將觀察到的毛細血管后靜脈微循環記錄于錄像帶留作分析。苦杏仁苷尾靜脈注射(2ml/kg)，重型急性胰腺炎(SAP)應用胰管注射牛磺酸鈉法引起。
結果SAP使微循環各項指標(白細胞滾動數、粘附數、平均血流速度、和壁切率)明顯惡化，于AP造模時給予苦杏仁苷可防止微循環障礙結論苦杏仁苷可降低大鼠SAP時的白細胞滾動及粘附數增加，能增加血液流速及壁切率。(表9)表9苦杏仁苷對SAP大鼠腸系膜活體微循環的影響(x±s)AP+苦杏仁苷后(min)AP前 20 40 6080 100 120粘附(8) 0.13±0.35 0.50±0.76 0.25±0.46 0.25±0.46 0.25±0.460.13±0.15 0.13±0.35滾動(8) 6.88±5.17 8.00±7.62 9.50±11.77 12.50±13.34 13.13±13.96 14.88±16.27 15.25±16.48口徑(8) 25.98±3.18 26.23±2.80 25.95±2.66 26.07±2.80 26.08±2.80 26.08±2.80 26.08±2.80流速(8) 193.79±15.18191.24±24.95 197.42±19.33 194.42±23.54194.02±23.54 196.95±20.90196.95±20.90壁切(8) 38.07±4.21 35.87±4.82 37.08±4.75 36.70±5.01 36.70±5.01 37.15±4.70 37.15±4.70注僅AP后0min及10min壁切與AP前比較，P＜0.05，()動物數②苦杏仁苷對急性重型胰腺炎(SAP)大鼠胰腺、肺白細胞聚集的影響目的對實驗性SAP大鼠胰腺、肺的白細胞聚集進行定量研究。
方法SAP造模方法同①，造模前經頸靜脈注入99mTc標記的白細胞，記錄SAP后胰腺、肺的放射性，測量各臟器髓過氧化物酶(MPO)活性，進行白細胞聚集定量，并觀察組織病理改變。
結果SAP大鼠3小時時胰腺、肺白細胞聚集明顯增加，并逐漸增多。苦杏仁苷能明顯抵制白細胞在胰腺、肺的聚集。
結論苦杏仁苷通過抑制白細胞內皮細胞粘附，減少白細胞在組織的聚集，從而對胰外臟器起保護作用。(表10)表10 SAP大鼠肺組織放射量變化(％ID/G)組別3h 6h 12h 24h假手術組 0.164±0.011**SAP組 0.545±0.010 0.532±0.014 0.529±0.010 0.540±0.011SAP+丹參 0.512±0.014 0.528±0.018 0.537±0.011 0.540±0.024SAP+苦杏仁苷 0.232±0.018*0.240±0.016**0.240±0.015**0.0241±0.020**與SAP組、SAP+丹參組相比*P＜0.05，**P＜0.01，③苦杏仁苷對SAP大鼠CD11b/CD18表達的影響目的研究苦杏仁苷對SAP大鼠CD11b/CD18表達的影響。以探討其調節白細胞募集的機理。
方法將大鼠隨機分為模型組、治療組。治療組在引發SAP后經頸靜脈輸入苦杏仁苷0.1ml/100g，治療后1、3、6及24小時處死動物，取肺及胰腺組織標本，免疫組化法測定CD118/CD18表達。
結果各組胰腺組織中均未測出活性，于模型組動物見SAP后3小時肺表達增加，治療組動物治療后1小時見肺CD11b表達明顯下降，3、6、12小時進一步降低。
結論苦杏仁苷可使SAP大鼠升高的肺CD11b/CD18表達明顯降低。推論認為其調節白細胞在組織中的募集至少與粘附分子CD11b/CD18表達有關(表11、12)。
表11各組動物肺組織CD11b表達(陽性細胞/視野)組別 1h 3h6h 12h24h假手術組3.3±2.5**SAP組 14.2±6.8 26.7±8.1★ 45.7±11.8★★73.7±13.8★★ 79.8±14.9SAP+丹參 12.8±6.4 24.7±8.643.5±12.970.2±13.7 71.9±16.5SAP+苦杏仁苷 4.5±2.3※6.9±4.5※※ 8.3±4.9※※ 11.5±5.8※※ 9.0±5.6※※**與SAP組、SAP+丹參組相比P＜0.01；★與前一時間段相比P＜0.05；★★與前一時間段相比P＜0.01；※與SAP組、SAP+丹參組相比P＜0.05；※※與SAP組、SAP+丹參組相比P＜0.01。
表12各組動物肺組織CD18表達(陽性細胞/視野)組別1h 3h 6h 12h 24h假手術組4.8±2.8**SAP組 17.1±7.330.8±8.6★47.1±14.7★★ 75.7±16.1★★ 82.2±19.4SAP+丹參16.5±5.525.8±7.3 47.4±12.6 71.8±13.7 69.5±20.8SAP+苦杏仁苷4.7±3.0※※ 7.0±3.9※※ 8.2±5.5※※11.9±5.2※※ 9.3±5.2※※同上④苦杏仁苷對大鼠肺微血管內皮與白細胞粘附率的影響目的觀察苦杏仁苷對細胞因子誘發的體外培養大鼠肺微血管內皮與白細胞粘附的影響。
結果表明肺微血管內皮細胞與含腫瘤因子及IL-1β培養基共同孵育后，可顯著增加白細胞與內皮細胞的相互粘附作用。在培養基中加入苦杏仁苷或苦杏仁苷含藥血清后，粘附率明顯下降。
結論抑制白細胞內皮細胞的過度粘附是苦杏仁苷重要的作用機理之一。(表13)表13.大鼠肺微血管內皮與白細胞粘附率組別n粘附率(％)正常對照組 612.72±1.91TNF-α組632.53±3.22**TNF-α+苦杏仁苷(1)組616.27±1.80*△△TNF-α+苦杏仁苷(2)組617.23±2.48*△△TNF-α+丹參組 624.81±2.02**△△▲▲IL-1組 631.89±4.35**IL-1+苦杏仁苷(1)組 617.27±2.05*△△IL-1+苦杏仁苷(2)組 618.22±2.66*△△IL-1+丹參組 624.4±2.63*與正常對照組相比P＜0.05**與正常對照組相比P＜0.01△△與相應模型組相比P＜0.01▲▲與苦杏仁苷組相比P＜0.01(2)對血清一氧化氮的影響目的NO是重要的血管活性因子，但其過度升高也對血運不利。本實驗于急性胰腺炎大鼠觀察了苦杏仁苷對血清一氧化氮(NO)濃度的影響。
方法應用膽管內逆行注射牛磺酸鈉的方法引起大鼠急性胰腺炎，收集血標本并用NO測定試劑盒測定治療前后血清NO濃度。
結果苦杏仁苷能使之明顯降低。
結論苦杏仁苷急性胰腺炎時大鼠血清NO的過度升高有降低作用。(表14)表14苦杏仁苷對急性胰腺炎大鼠血清NO濃度的影響(x±s，μmol/L)n治療前治療后對照組 61.28±0.553.22±0.79**丹參組 41.30±0.673.09±1.28*赤芍組 41.00±0.301.80±1.40苦杏仁苷組 61.18±0.810.41±0.29*苦杏仁苷復合組 62.68±0.551.16±0.33**注與胰腺炎前比較，*p＜0.05，**p＜0.01(四)促進傷口愈合缺血是傷口愈合過程中的重要不利影響因素，本實驗應用兔耳缺血皮膚切口模型對苦杏仁苷對傷口愈合的作用進行了研究。
模型及方法家兔12只，麻醉后將一側兔耳脫毛，按WU氏法制作一側耳部缺血模型。再于該耳側面作一5cm、垂直的、深至軟骨的外科缺口，用5#絲線縫合。術后3、5、7、10、14及28天分別測定緊鄰切口邊緣的皮膚微循環(激光多普勒血流計法)及皮下組織氧分壓(組織測氧計法)，于第28天取切口皮膚，仔細切去脂肪，應用三段8mm寬的皮片以簡易法測定組織段列強度。
結果實驗證明苦杏仁苷可改善皮下組織氧分壓，增加皮膚組織微循環血流，使切口愈合加快，提高切口斷列強度。
1.一般情況，缺血兔耳對照組至12天仍未恢復皮膚正常顏色，而苦杏仁苷組于第10天皮膚由紫轉微紅色。
2.皮下組織氧分壓(PO2)致缺血后對照組明顯降低，10天時稍有恢復。14-28天仍低于操作前，治療組于第7天開始恢復，至10天時基本恢復正常。(表15)
3.微循環檢查兩組致缺血模型后均見皮膚微循環明顯降低，對照組至術后10天仍未恢復，而治療組則于術后10天明顯恢復，至14天時基本恢復正常。(表16)4.切口斷裂強度第28天時治療組切口斷裂強度明顯高于對照組。(表17)結論苦杏仁苷有益于缺血皮膚切口的愈合。
表15皮膚組織氧分壓(PO2)變化(x±s)缺血后(天)組別 缺血前 35710 1428對照組51.6±2.425.0±2.8*24.7±2.7*26.0±3.1*27.2±2.3*34.5±5.1*35.5±5.1*(mmHg)治療組52.0±2.125.2±2.8*24.0±2.9*43.0±4.2*40.5±3.649.0±3.0 49.3±2.8*(mmHg)*與治療前比較P＜0.05表16兔耳皮膚微循環血流變化(x±s)組別缺血前缺血后(天)3 57 10 14 28對照組22.5±1.9 12.5±1.9*13.6±2.8*15.0±2.6*15.2±2.4*14.8±2.9*16.6±2.2*(mmHg)治療組22.6±1.0 13.5±1.9*15.3±2.9*19.8±1.2*21.3±1.421.0±1.6 21.6±1.2(mmHg)*與治療前比較P＜0.05表17皮膚切口斷裂強度(x±s)對照組(克) 治療組(克)10.66±2.5016.0±2.76**與對照組比較P＜0.05本發明制備的苦杏仁苷，經天津市中西醫結合急腹癥研究所病理生理研究室、天津市中西醫結合急腹癥研究所藥物研究室所作的毒性試驗報告如下。
一.苦杏仁苷急性毒性試驗
1.實驗方法預實驗結果顯示，最大濃度苦杏仁苷一般無致死性，故采用最大濃度、最大容積給藥法。并證明苦杏仁苷最大溶解度為19％。
取健康昆明種小鼠20只，雌雄各半。實驗日每只小鼠經尾靜脈注射19％苦杏仁苷0.5ml，連續觀察七天。
藥物由本所藥物研究室制備，臨用前用生理鹽水配制。
2.實驗結果給藥后即刻未見動物有呼吸困難、抽搐、大小便失禁等急性中毒癥狀，動物毛光滑、活動自如，有探究反射。七天觀察過程中動物食欲良好，能自然進食、進水，未見嘔吐、腹瀉現象，七天末動物體重增加(給藥前平均27.05±1.克，給藥后平均30.9±1.91克)。七天全部觀察過程中無任何動物死亡。
3.結論小鼠對苦杏仁苷的最大耐受劑量為19％，0.5ml。按小鼠平均體重為25克/只計算，總給予藥量為3.8g/kg，一次給予(約5秒內注射完畢)。臨床推薦用量為3％、2ml/kg/h，即2.7×10-3ml/kg/5sec，也就是8.3×10-5g/kg。因此本次實驗所得小鼠最大耐受量相當臨床推薦用量的45783.13倍。(以上為粗略計算，未將連續輸入藥物的蓄積作用估計在內。
二.苦杏仁苷長期毒性試驗(一)動物和材料1.動物健康wistar大鼠(清潔級)80只，購自軍事醫學科學院四所，體重250克左右。試驗共分4組，每組20只，雌雄各半。試驗前觀察一周，記錄食量及體重。
2.試驗藥物苦杏仁苷，白色粉末，由本所藥物研究室制備，試驗前以生理鹽水配成溶液。
(二)試驗方法1.試驗分組試驗共分四組，即空白組9(不加處理)、對照組(生理鹽水組)、高劑量組(9％苦杏仁苷)、低劑量組(3％苦杏仁苷)。
2.給藥方法后三組動物每天分別經腹腔注射生理鹽水、苦杏仁苷各1ml，連續兩周。
3.觀察指標每天觀察飲食、二便、毛發及活動情況。隔日測量體重。試驗末將大鼠斷頭處死，取血標本測定肝、腎功能和血象變化，并取心、肝、脾、肺、腎、睪丸及卵巢組織標本進行病理組織檢查，稱重計算臟器系數。
(三)試驗結果1.血象給藥后14天大鼠紅細胞計數(RBC)、白細胞計數(WBC)、血紅蛋白(HGB)、細胞比積(HCT)、平均細胞容積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白量(MCH)及平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)與空白組比較均無明顯差別，唯血小板計數(PLT)有變化，低劑量組明顯升高(827±89.8 vs 670±174×109/μl，p＝0.01)，但生理鹽水組也比空白組升高(805.4±88.92 vs 670±174×109/μl，p＝0.038)，因此可能為偶然變化。(表18、19)2.肝功能腹腔內連續注射苦杏仁苷兩周對大鼠肝功能無毒性作用，試驗末各組可見谷-丙轉氨酶降低，包括生理鹽水組(p＜0.05)、總蛋白及白蛋白升高。總膽紅素無變化。(表20)3.腎功能腹腔內連續注射苦杏仁苷兩周對大鼠腎功能無任何毒性作用，血尿素氮及肌酸酐與空白組動物比較無明顯差別。(表21)4.體重苦杏仁苷腹腔注射兩周后大鼠體重明顯增加，生理鹽水組動物體重也增加，唯對照組不明顯，但也有增加趨勢。(表22)5.臟器重量和臟器系數各組間的各臟器系數無明顯差別。(表23)表21.苦杏仁苷長期注射對大鼠腎功能的影響Urea (mmo/l)Cr (umol/l)空白 NS 高劑量 低劑量空白 NS 高劑量低劑量均值 7.54756.563 5.9555 6.140933.73828.9925.91129.34標準差2.865 0.7498 0.6195 1.04828.83433.7434.04443.4408P值 0.3049 0.086 0.1399 0.13 0.01380.1373注Urea尿素；Cr肌酸酐表22.苦杏仁苷長期注射對大鼠體重的影響(克)組別NS高劑量低劑量對照試驗前試驗后 試驗前 試驗后試驗前 試驗后試驗前 試驗后250.0 271.6247.45 262.09245.4260.17258.3263.3329.51 41.5933.60 38.19 42.9 39.34 43.9840.06p值 0.001 0.0002 0.000360.8P值試驗前后比較表18苦杏仁苷長期注射對大鼠血象的影響RBC (109/L) WBC (1012/L)HGB (g/L) PLT (109/uL)空白 NS 高劑量 低劑量空白 NS 高劑量 低劑量空白 NS 高劑量 低劑量 空白 NS 高劑量 低劑量均值 8.185 8.3718.3055 8.507310.24210.2810.645 10.627153.42155.6156.9158.5670805.4719.6827標準差0.59480.3175 0.2232 0.48341.82782.1431.6473.6598 10.6383.5024.9898.34717488.92103.689.8P值 0.3857 0.5384 0.171 0.9640.5850.7491 0.5430.5430.223 0.0380.4230.01注RBC紅細胞計數；WBC白細胞計數；HGB血紅蛋白；PLT血小板表19苦杏仁苷長期注射對大鼠血象的影響HCT (％) MCV (fL) MCH (pg) MCHC (g/L)空白 NS 高劑量低劑量空白 NS 高劑量低劑量 空白 NS 高劑量 低劑量 空白 NS 高劑量 低劑量均值 46.70848.37 47.97348.44557.14257.7757.78256.955 18.7518.6118.8818.65329 322.1327.1327標準差2.83531.1889 1.37992.81152.13771.2171.40631.4638 0.6245 0.5760.6150.21615.1 8.5696.6256.91P值 0.0998 0.19490.1554 0.42 0.41050.8107 0.5940.6120.604 0.2430.7660.78注HCT血球比積MCV平均細胞容積；MCH平均紅細胞血紅蛋白量MCHC平均紅細胞血紅蛋白濃度表20苦杏仁苷長期注射對大鼠肝功能的影響ALT (U/L) TP(g/l) ALB (g/l) T-BILumol/l)空白 NS高劑量低劑量空白 NS高劑量 低劑量空白 NS 高劑量 低劑量 空白NS 高劑量 低劑量均值 168.5 114.1 98.818100 67.98375.65 75.355 76.27338.82541.2641.7441.1 0.950.6480.5640.84標準差72.39324.78624.62423.2774.91015.609 5.6828 5.45752.53852.8512.9532.7170.760.2910.4790.44P值 0.03510.00640.0069 0.003 0.0031 0.001 0.0470.0190.05 0.2480.1620.67注ALT丙氨酸轉氨酶；TP總蛋白ALB白蛋白T-BIL總-膽紅素表23苦杏仁苷長期注射對大鼠心臟系數的影響(x±s)臟器 對照組生理鹽水高劑量 低劑量心臟 0.0034±0.000430.0034±0.000260.0033±0.000240.0035±0.00031肝臟 0.035±0.0023 0.034±0.0023 0.029±0.010.026±0.01脾臟 0.0024±0.0002 0.0024±0.0003 0.0024±0.0003 0.0061±0.0089肺臟 0.0095±0.0023 0.0076±0.0018 0.0053±0.0008 0.0062±0.0013腎臟 0.0065±0.0005 0.0066±0.0003 0.0067±0.0004 0.0066±0.0006睪丸 0.0092±0.0005 0.0096±0.0006 0.0080±0.0039 0.0091±0.0019卵巢 0.0006±0.0001 0.0004±0.0003 0.0006±0.0009 0.0006±0.00016.病理組織檢查結果空白組、生理鹽水組及苦杏仁苷低和高劑量組動物之心、肝、脾、腎和生殖腺(睪丸或卵巢)均無任何病理改變。肺泡內出血(可能系斷頸處死時吸入的結果)、輕度間質細胞增生、肺泡間隔增寬、組織實變等在各組均不同程度地存在，因此認為是動物本身的問題，不是苦杏仁苷的慢性毒性作用。
四.結論苦杏仁苷連續腹腔注射，1ml/d.(3％或9％)，共2周，對大鼠未產生慢性毒性作用*。
*苦杏仁苷推薦臨床使用劑量為2ml/kg/h(目前仍為實驗用劑量，進行臨床試驗治療時還須進一步推敲)本次使用慢性毒性試驗的劑量為1ml一次注入，因此劑量可能偏大。肺病理檢查所見輕微異常或許與此有關。輸液劑量與一次注入劑量的換算方法尚不十分明確。慢性毒性試驗所應用的劑量由于可能偏大，所得試驗結果(無毒性作用)因而更可靠。
權利要求
1.一種苦杏仁苷的制備方法，其特征在于壓榨去油后的苦杏仁1Kg加乙醚4000-5000ml分2次加熱回流脫脂，過濾備用；將藥渣揮盡乙醚后加95％乙醇回流提取三次，每次3000-5000ml，趁熱過濾，合并濾液，減壓回收乙醇至生藥量的1-2倍量體積，放置至室溫，再加入1/2量的乙醚，容器底層析出沾壁的油狀沉淀，轉出上清液，放置，析出結晶，抽濾，得苦杏仁苷粗品；將苦杏仁苷粗品加20-40倍乙醇溶解、過濾、放置、析出苦杏仁苷白色片狀結晶，減壓過濾，用100-200mL乙醇洗滌結晶，即得苦杏仁苷純品，收率4％以上，純度達90％以上。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于必要時苦杏仁苷粗品可反復處理1-2次，但每次乙醇量須減半。
3.一種在制備促進心腦胰及傷口血液循環的苦杏仁苷制劑中的應用，其特征在于a.苦杏仁苷對腦血液循環的作用I.治療及預防因血粘稠度升高所致的腦缺血，苦杏仁苷靜脈輸入均可增加大鼠軟腦膜及腦實質兩部位的循環血流，說明兩部位的血管擴張反應具有同步性，作用顯現較晚，從靜脈注射后30分鐘開始，作用逐步增加，直至60分鐘時與給藥前有明顯差異，為此，在造成血流降低之前給予苦杏仁苷，能拮抗葡聚糖的致病作用；II.對腦微循環障礙的影響，用于如注射腎上腺素、垂體后葉素及中腦動脈結扎的預防和治療；b.苦杏仁苷治療心力衰竭苦杏仁苷可在較長時間內維持大鼠離體心臟冠脈流量、心縮力及收縮頻率保持不變，應用苦杏仁苷灌流可使離體心臟在較長時間里維持心臟正常功能，對心臟功能衰竭有保護作用；c.苦杏仁苷治療急性胰腺炎苦杏仁苷對胰腺血流及氧耗有較好的影響，能降低重型急性胰腺炎時白細胞滾動及粘附數增加，能增加血液流速及壁切率；通過抑制白細胞內皮細胞過度粘附，減少白細胞在組織內的聚集，從而對胰外臟器起保護作用；對急性胰腺炎時大鼠血清NO的過度升高有降低作用；d.苦杏仁苷促進傷口愈合苦杏仁苷改善皮下組織氧分壓，增加皮膚組織微循環血流，使傷口愈合加快，提高切口斷裂強度，有益于缺血皮膚切口的愈合。
全文摘要
本發明公開了一種苦杏仁苷的制備方法和苦杏仁苷在制備促進心腦胰及傷口血液循環的苦杏仁苷制劑中的應用，屬于含有機有效成分的醫藥配制品的醫藥用途。本發明提供了一種使用苦杏仁苷預防和治療因血粘稠度升高所致的腦缺血；對心臟功能衰竭有保護作用；用于治療急性胰腺炎；增加皮膚組織微循環血流，促進傷口愈合的苦杏仁苷注射用粉制劑的醫藥用途，并具有顯著的效果。此外，本發明公開的一種苦杏仁苷的制備方法，使壓榨去油后的苦杏仁經乙醚脫脂，醇提等工藝，得到產率高、純度高、提取、分離簡便的苦杏仁苷純品。
文檔編號C07H15/18GK1631895SQ200310119389
公開日2005年6月29日 申請日期2003年12月24日 優先權日2003年12月24日
發明者吳咸中, 伍孝先, 趙連根, 王興民, 劉俊紅, 陳玉玲, 劉大全, 李棣華 申請人:天津市南開醫院