專利名稱：羔羊皺胃酶超聲提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到從動物組織得到的蛋白酶。
背景技術(shù)：
皺胃酶在干酪生產(chǎn)中的應(yīng)用可追朔到19世紀(jì)以前，起初人們用羊胃盛裝鮮奶時發(fā)現(xiàn)放置一段時間后，奶就凝固，知道羊胃具有凝固作用。此后，人們就將羊胃在乳清中浸泡，利用浸泡過的乳清生產(chǎn)干酪，這便開始了早期皺胃酶的應(yīng)用。到20世紀(jì)20年代，皺胃酶提取技術(shù)得到較大發(fā)展，30年代已進入商業(yè)化生產(chǎn)階段，除了生產(chǎn)液體皺胃酶外，還能生產(chǎn)一些粉劑、片劑，使皺胃酶應(yīng)用范圍進一步擴大。50年代后，皺胃酶提取方法已達數(shù)十種，各國研究人員對提取方法不斷加以改進，并紛紛取得專利，傳統(tǒng)皺胃酶提取方法趨于成熟。目前，全世界有丹麥漢森實驗室、新西蘭皺胃酶公司等九個專業(yè)集團專門生產(chǎn)小牛皺胃酶，其中漢森實驗室規(guī)模最大，年生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)小牛皺胃酶200多噸。由于皺胃酶來自動物胃粘膜，主要用NaCl浸提，在干酪中應(yīng)用不會對人體產(chǎn)生不良影響，聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)于1973年制定的食品添加劑安全評價表中已對皺胃酶作出了安全評價，即皺胃酶人體每日允許攝入量“不需要特殊規(guī)定”，這說明皺胃酶是一種安全無毒的天然食品添加劑。
在干酪生產(chǎn)中，把能夠起凝乳作用的一類蛋白酶統(tǒng)稱為凝乳酶，包括動物凝乳酶，有小牛皺胃酶、羔羊皺胃酶、胃蛋白酶等；植物凝乳酶，有木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶等；微生物凝乳酶，有細菌凝乳酶、毛霉凝乳酶等；重組凝乳酶，主要利用大腸桿菌克隆表達。上述的幾種酶中，皺胃酶是應(yīng)用最早效果最好的凝乳酶。傳統(tǒng)皺胃酶是從哺乳小牛第四胃即皺胃中提取的，在干酪生產(chǎn)中已廣泛應(yīng)用。近年來，隨著世界干酪產(chǎn)量的逐年增加，皺胃酶的需求量也越來越大，致使每年要屠宰3000多萬頭小牛提取小牛皺胃酶，仍不能滿足干酪生產(chǎn)需要。自20世紀(jì)60年代以來，全世界范圍內(nèi)已出現(xiàn)皺胃酶的短缺，導(dǎo)致皺胃酶價格上漲，供不應(yīng)求。世界各國都在尋找皺胃酶的代用品，胃蛋白酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶在干酪生產(chǎn)中都被使用過，但這些代用品大多存在一些缺陷，在正常牛乳pH值中不夠穩(wěn)定，活性較低，易使蛋白水解，干酪出品率低，且易產(chǎn)生苦味。豬胃蛋白酶、牛胃蛋白酶曾被認為是較好的皺胃酶代用品，但單獨使用效果不夠理想，必須與小牛皺胃酶混合使用。植物凝乳酶由于具有較強的蛋白水解活性和較低的凝乳活性，在干酪生產(chǎn)中應(yīng)用較少。微生物凝乳酶是一種具有應(yīng)用前景的皺胃酶代用品，由于具有較高的熱穩(wěn)定性，造成乳清處理困難，這類酶在英美國家使用較多，但在歐洲一些國家被禁止使用。近年來，隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，人們已能從一些微生物如大腸桿菌中克隆生產(chǎn)重組凝乳酶，并證明與天然小牛皺胃酶具有十分相似的功能和特性，但受到一些消費者和一些國家的文明限制。小牛皺胃酶是干酪生產(chǎn)中應(yīng)用最早的蛋白酶，用其生產(chǎn)的干酪在風(fēng)味、質(zhì)量和產(chǎn)量等方面都優(yōu)于其它酶類，至今仍是干酪生產(chǎn)者首選的凝乳酶。羔羊和小牛同屬反芻動物，其皺胃具有相似的特點和功能，用羔羊皺胃提取皺胃酶在干酪生產(chǎn)完全可與小牛皺胃酶相比擬，只是由于羔羊皺胃較小，沒有受到人們的重視。
我國土地面積遼闊，羔羊皺胃并不匱乏，傳統(tǒng)養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)中，用于生產(chǎn)羔皮和裘皮的羔羊及一些奶山羊的公羔一般都在30日齡前屠宰，其下角料——皺胃是生產(chǎn)羔羊皺胃酶的優(yōu)質(zhì)原料。近年來，隨著羔羊肉消費量的增加，羔羊屠宰數(shù)量大幅度提高，據(jù)不完全統(tǒng)計，我國每年屠宰的羔羊大約有400～500萬只。利用這些資源提取羔羊皺胃酶，可變廢為寶，增加當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民的經(jīng)濟收入，同時也不會造成環(huán)境污染，不與其它行業(yè)爭奪原料，當(dāng)前可應(yīng)急我國干酪生產(chǎn)所需的皺胃酶，長遠可取代進口，降低干酪生產(chǎn)成本，促進我國干酪生產(chǎn)普及和發(fā)展。
我國是一個后起的乳業(yè)生產(chǎn)大國，干酪規(guī)?；a(chǎn)是近年來才發(fā)展起來的，隨著我國對外交流的進一步擴大和加入WTO后面臨的挑戰(zhàn)，干酪生產(chǎn)和消費逐年上升，但所需的皺胃酶全靠進口，而且對皺胃酶的開發(fā)利用研究起步較晚，報道很少，特別是對羔羊皺胃酶的系統(tǒng)研究還是空白。傳統(tǒng)皺胃酶通常采用犢牛皺胃為原料，在5～10％的鹽溶液中需要浸提2～3天才能完成提取過程，由于提取時間長，提取效率較低，特別是在提取溫度較高的環(huán)境中，微生物污染程度較大，甚至使皺胃原料腐敗變質(zhì)，影響產(chǎn)品質(zhì)量。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種操作簡單、提取效率高、提取時間短、產(chǎn)品質(zhì)量好的羔羊皺胃酶超聲提取方法。
解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是它包括下述工藝步驟1、羔羊皺胃的預(yù)處理羔羊屠宰后，立即取出皺胃，用流水沖洗1～2分鐘除出內(nèi)容物，然后剝除皺胃外部的脂肪及結(jié)締組織，在-24℃下冷凍備用。
2、切碎羔羊皺胃用絞肉機將羔羊皺胃切成0.001～0.01cm3的羔羊皺胃塊。
3、超聲提取在pH值為2.0～5.0的磷酸鹽緩沖液中添加2～10％的NaCl，制備成NaCl浸提緩沖液，將NaCl浸提緩沖液裝入超聲提取儀的容器內(nèi)，然后在該浸提緩沖液中加入切碎后的羔羊皺胃塊，使羔羊皺胃塊與緩沖液的重量比為1∶10～25，在超聲頻率為20KHz、超聲強度為20～45W/cm2下，提取20～50分鐘，并保持提取液溫度20～25℃。
4、離心分離將超聲提取后的混合液裝入離心機中，在3000～4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，去除雜質(zhì)，取上清液。
5、激活經(jīng)離心后的上清液用0.1mol/L HCl調(diào)整pH至4.6，在室溫下激活24小時，得羔羊皺胃酶粗提液。
6、羔羊皺胃酶激活后的羔羊皺胃酶粗提液再裝入離心機中，在3000～4000轉(zhuǎn)/分再離心15～30分鐘，以除去雜蛋白，然后再將其pH調(diào)整至5.3～6.0，即為提取的液態(tài)羔羊皺胃酶。
本發(fā)明的超聲提取工藝步驟中，在pH值的優(yōu)選范圍為3.0～5.0的磷酸鹽緩沖液中添加優(yōu)選配比為5～10％的NaCl，制備成NaCl浸提緩沖液，將NaCl浸提緩沖液裝入超聲提取儀的容器內(nèi)，然后在該浸提緩沖液中加入切碎后的羔羊皺胃塊，使羔羊皺胃塊與緩沖液的優(yōu)選重量比為1∶10～20，在超聲頻率為20KHz、超聲強度的優(yōu)選范圍為30～40W/cm2下，提取的優(yōu)選時間范圍為30～40分鐘，并保持提取液溫度20～25℃。
本發(fā)明的超聲提取工藝步驟中，在pH的最佳值為4.0的磷酸鹽緩沖液中添加最佳配比為8％的NaCl，制備成NaCl浸提緩沖液，將NaCl浸提緩沖液裝入超聲提取儀的容器內(nèi)，然后在該浸提緩沖液中加入切碎后的羔羊皺胃塊，使羔羊皺胃塊與緩沖液的重量比為1∶15，在超聲頻率為20KHz、超聲強度最佳為40W/cm2下，提取的最佳時間為40分鐘，并保持提取液溫度20～25℃。
本發(fā)明采用出生3周內(nèi)的羔羊皺胃為原料，應(yīng)用超聲波在溶液中產(chǎn)生的空化效應(yīng)作用，破壞皺胃細胞結(jié)構(gòu)，加速提取液在溶液中的滲透速度和細胞中酶的溶出速度，大大縮短了提取時間。超聲提取20～50分鐘可達到傳統(tǒng)方法提取2～3天的酶活性產(chǎn)量，且產(chǎn)品微生物污染程度較低。該方法具有操作簡單、提取效率較高、產(chǎn)品質(zhì)量較好等特點，可在食品工業(yè)生產(chǎn)中推廣使用。
圖1是試驗因素與試驗指標(biāo)關(guān)系圖。
圖中試驗因素為橫坐標(biāo)，羔羊皺胃酶活性為縱坐標(biāo)。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步詳細說明，但本發(fā)明不限于這些實施例。
實施例1本實施例的羔羊皺胃酶超聲提取方法的工藝步驟如下1、羔羊皺胃的預(yù)處理羔羊屠宰后，立即取出皺胃，用流水沖洗1～2分鐘除出內(nèi)容物，然后剝除皺胃外部的脂肪及結(jié)締組織，在-24℃下冷凍備用。
2、切碎羔羊皺胃用絞肉機將羔羊皺胃切成0.001～0.01cm3的羔羊皺胃塊。
3、超聲提取在pH值為4的磷酸鹽緩沖液中添加8％的NaCl，制備成NaCl浸提緩沖液，將NaCl浸提緩沖液裝入超聲提取儀的容器內(nèi)，然后在該浸提緩沖液中加入切碎后的羔羊皺胃塊，使羔羊皺胃塊與緩沖液的重量比為1∶15，在超聲頻率為20KHz、超聲強度為40W/cm2下，提取40分鐘，并保持提取液溫度20～25℃。
4、離心分離將超聲提取后的混合液裝入離心機中，在3000～4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，去除雜質(zhì)，取上清液。
5、激活經(jīng)離心后的上清液用0.1mol/L HCl調(diào)整pH至4.6，在室溫下激活24小時，得羔羊皺胃酶粗提液。
6、制備羔羊皺胃酶激活后的羔羊皺胃酶粗提液再裝入離心機中，在3000～4000轉(zhuǎn)/分再離心15～30分鐘，以除去雜蛋白，然后再將其pH調(diào)整至5.3～6.0，即為提取的液態(tài)羔羊皺胃酶。
實施例2本實施例的超聲提取工藝步驟中，在pH值為2.0的磷酸鹽緩沖液中添加2％的NaCl，制備成NaCl浸提緩沖液，將NaCl浸提緩沖液裝入超聲提取儀的容器內(nèi)，然后在該浸提緩沖液中加入切碎后的羔羊皺胃塊，使羔羊皺胃塊與緩沖液的重量比為1∶10，在超聲頻率為20KHz、超聲強度為20W/cm2下，提取20分鐘，并保持提取液溫度20～25℃。本實施例中的其它工藝步驟與實施例1相同。
實施例3本實施例的超聲提取工藝步驟中，在pH值為5.0的磷酸鹽緩沖液中添加10％的NaCl，制備成NaCl浸提緩沖液，將NaCl浸提緩沖液裝入超聲提取儀的容器內(nèi)，然后在該浸提緩沖液中加入切碎后的羔羊皺胃塊，使羔羊皺胃塊與緩沖液的重量比為1∶25，在超聲頻率為20KHz、超聲強度為45W/cm2下，提取50分鐘，并保持提取液溫度20～25℃。本實施例中的其它工藝步驟與實施例1相同。
實施例4本實施例的超聲提取工藝步驟中，在pH值為2.0的磷酸鹽緩沖液中添加2％的NaCl，制備成NaCl浸提緩沖液，將NaCl浸提緩沖液裝入超聲提取儀的容器內(nèi)，然后在該浸提緩沖液中加入切碎后的羔羊皺胃塊，使羔羊皺胃塊與緩沖液的重量比為1∶10，在超聲頻率為20KHz、超聲強度為20W/cm2下，提取50分鐘，并保持提取液溫度20～25℃。本實施例中的其它工藝步驟與實施例1相同。
實施例5本實施例的超聲提取工藝步驟中，在pH值為5.0的磷酸鹽緩沖液中添加2％的NaCl，制備成NaCl浸提緩沖液，將NaCl浸提緩沖液裝入超聲提取儀的容器內(nèi)，然后在該浸提緩沖液中加入切碎后的羔羊皺胃塊，使羔羊皺胃塊與緩沖液的重量比為1∶10，在超聲頻率為20KHz、超聲強度為45W/cm2下，提取20分鐘，并保持提取液溫度20～25℃。本實施例中的其它工藝步驟與實施例1相同。
實施例6本實施例的超聲提取工藝步驟中，在pH值為2.0的磷酸鹽緩沖液中添加10％的NaCl，制備成NaCl浸提緩沖液，將NaCl浸提緩沖液裝入超聲提取儀的容器內(nèi)，然后在該浸提緩沖液中加入切碎后的羔羊皺胃塊，使羔羊皺胃塊與緩沖液的重量比為1∶25，在超聲頻率為20KHz、超聲強度為20W/cm2下，提取20分鐘，并保持提取液溫度20～25℃。本實施例中的其它工藝步驟與實施例1相同。
實施例7本實施例的超聲提取工藝步驟中，在pH值為5.0的磷酸鹽緩沖液中添加10％的NaCl，制備成NaCl浸提緩沖液，將NaCl浸提緩沖液裝入超聲提取儀的容器內(nèi)，然后在該浸提緩沖液中加入切碎后的羔羊皺胃塊，使羔羊皺胃塊與緩沖液的重量比為1∶25，在超聲頻率為20KHz、超聲強度為45W/cm2下，提取20分鐘，并保持提取液溫度20～25℃。本實施例中的其它工藝步驟與實施例1相同。
實施例8本實施例的超聲提取工藝步驟中，在pH值為2.0的磷酸鹽緩沖液中添加10％的NaCl，制備成NaCl浸提緩沖液，將NaCl浸提緩沖液裝入超聲提取儀的容器內(nèi)，然后在該浸提緩沖液中加入切碎后的羔羊皺胃塊，使羔羊皺胃塊與緩沖液的重量比為1∶10，在超聲頻率為20KHz、超聲強度為45W/cm2下，提取50分鐘，并保持提取液溫度20～25℃。本實施例中的其它工藝步驟與實施例1相同。
實施例9本實施例的超聲提取工藝步驟中，在pH值為5.0的磷酸鹽緩沖液中添加2％的NaCl，制備成NaCl浸提緩沖液，將NaCl浸提緩沖液裝入超聲提取儀的容器內(nèi)，然后在該浸提緩沖液中加入切碎后的羔羊皺胃塊，使羔羊皺胃塊與緩沖液的重量比為1∶25，在超聲頻率為20KHz、超聲強度為20W/cm2下，提取50分鐘，并保持提取液溫度20～25℃。
其它工藝步驟與實施例1相同。
為了確定本發(fā)明的工藝步驟的可行性，發(fā)明人進行了超聲處理時間和強度對羔羊皺胃酶提取活性的影響、NaCl濃度對羔羊皺胃酶提取活性的影響、羔羊皺胃與提取液比例對羔羊皺胃酶提取活性的影響、提取液的pH值對羔羊皺胃酶提取活性的影響、超聲提取工藝參數(shù)的優(yōu)化進行了研究試驗，為了驗證本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人采用本發(fā)明實施例1制備的羔羊皺胃酶進行了皺胃酶活性的測定試驗、微生物指標(biāo)的測定、重金屬的測定、酶活性保存率的測定、感官性狀評定測試，各種試驗情況如下1、超聲處理時間和強度對羔羊皺胃酶提取活性的影響在浸提液中加入6％NaCl，以羔羊皺胃與提取液之比為1∶10，在不同超聲強度下進行提取，測定不同提取時間酶活性，試驗結(jié)果見表1。
表1 超聲處理時間和強度對羔羊皺胃酶提取活性的影響(SU/g)超聲處理 超聲強度(W/cm2)時間(min)傳統(tǒng)方法 510 20 30 4010 19351h23302e 30372g 30763g 37502f 37502g20 23083g27907d 31581f 32000f 38718ef38713fg30 27274f32436d 33332f 34283e 48000d 46156cd40 28342ef 33334cd 34784f 36923e 53333a 53200a50 28233e33803c 35826ef 34000e 53331a 53103a60 32436d34282c 36363e 43632d 52177ab48977b70 33334cd 34780c 38090d 46156c 51063b 48000cd80 33807c35823bc 40000cd 48000bc50000bc48000cd90 34280b36360a 43645b 50000a 48978c 46155cd120 35219b38707a 48000a 50000a 48000d 43640e2d 53204a------- ------ ------ ------ ------3d 53000a------- ------ ------ ------ ------注表中數(shù)據(jù)系5次測定平均值。相同字母表示P＞0.05，不同字母表示P＜0.01，縱向比較。
由表1可以看出，超聲處理時間和強度對羔羊皺胃酶提取活性有很大的影響。從提取時間看，利用超聲提取可明顯縮短提取時間，傳統(tǒng)提取方法提取2天時，酶提取活性最大為53204SU/g(P＜0.01)，在30W/cm2超聲強度下，僅需40分鐘，提取活性可達53333SU/g，顯著高于30分鐘提取活性(P＜0.01)。當(dāng)超聲強度小于30W/cm2時，皺胃酶提取活性隨提取時間延長逐漸增大；當(dāng)超聲強度大于30W/cm2時，提取活性在較短時間內(nèi)達到最大，提取時間超過50分鐘后，酶活性不僅未升高，反而有下降的趨勢，這可能與超聲處理時間過長、強度過大時，使已提取的酶部分失活有關(guān)。
從超聲處理強度看，在提取時間較短、超聲強度較小時，隨著超聲強度的增加，皺胃酶提取活性逐漸升高，當(dāng)超聲強度大于30W/cm2時，皺胃酶提取活性變化不大，這可能是由于在較高的超聲處理強度下，皺胃中酶的擴散速度加快，在較短時間內(nèi)幾乎完全提出，若繼續(xù)提高超聲強度，不僅不會增加酶的提取活性，反而會造成酶活性損失。
2、NaCl濃度對羔羊皺胃酶提取活性的影響在提取液中加入NaCl，使其濃度為0％、2％、4％、6％、8％、10％、12％，在30W/cm2超聲強度下提取40分鐘。
試驗結(jié)果見表2。
表2 NaCl濃度對羔羊皺胃酶提取活性的影響NaCL濃度(％) 024 68 1012激活前酶活性(SU/g) 6340A9531B12510C16200D19600E22600F24600G激活后酶活性(SU/g) 21030A48201B52343C53402d53135d53276d53315d注數(shù)據(jù)為5次實驗結(jié)果的平均值。
由表2可知，羔羊皺胃酶在激活前后提取活性差別較大，激活后活性比激活前活性明顯提高(P＜0.01)。在較低NaCl濃度下，激活后提取活性隨NaCl濃度增加而提高；當(dāng)NaCl濃度大于4％時，提取后活性變化不大(P＞0.05)。但在激活前羔羊皺胃酶提取活性隨NaCl濃度增加明顯增大(P＜0.01)。說明在NaCl存在下，超聲處理對羔羊皺胃具有一定的激活作用，可使原來無活性酶原轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚缘陌櫸该浮?br>
3、羔羊皺胃與提取液比例對羔羊皺胃酶提取活性的影響在60g羔羊皺胃中加入6％的NaCl提取液，使其比例為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，在30W/cm2超聲強度下提取40分鐘。結(jié)果表明，隨著羔羊皺胃與提取液比例增大，羔羊皺胃酶提取活性逐漸增加，當(dāng)提取比例小于1∶15時，提取活性增加較快(P＜0.01)；提取比例大于1∶15時，提取活性緩慢增加(P＜0.05)；當(dāng)提取比例為1∶15時，提取活性占總活性的92％，說明羔羊皺胃中絕大部分羔羊皺胃酶已被提出。此外，提取比例過大時，雖然提取總活性增加，提取較充分，但單位體積羔羊皺胃酶活性較低，不利于產(chǎn)品的保存及干燥。
試驗結(jié)果見表3。
表3 皺胃與提取液比例對羔羊皺胃酶提取活性的影響提取比例1∶5 1∶10 1∶151∶20 1∶25 1∶30提取活性(SU/g) 53800C58630B69480A71970A73630A74530A注數(shù)據(jù)為5次實驗結(jié)果的平均值(激活后)。
4、提取液的pH值對羔羊皺胃酶提取活性的影響用0.1mol/L HCl和0.1mol/L NaOH將提取液的pH值調(diào)至1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，在30W/cm2超聲強度下提取40分鐘，然后將提取液的pH值調(diào)至4.6，測定酶活性。
試驗結(jié)果見表4。
表4 提取液pH對羔羊皺胃酶提取活性的影響提取液pH 1 2 3 4 567提取活性(SU/g) 47205C50235B54230A51620D47630E42030F38201G注數(shù)據(jù)為5次實驗結(jié)果的平均值(激活后)。
由表4可知，當(dāng)提取液的pH值為3.0時，提取羔羊皺胃酶活性最高為54230SU/g；提取液的pH值小于3時，隨著pH值增大，提取活性逐之提高(P＜0.01)，而當(dāng)提取液的pH值大于3時，提取活性下降較快(P＜0.01)，說明在較低pH下用超聲提取皺胃酶可獲得較高的收率。但pH也不宜過低，否則會引起酶蛋白變性喪失活力。
5、超聲提取工藝參數(shù)的優(yōu)化試驗在以上單因素提取試驗的基礎(chǔ)上，為了考慮多因素的綜合效應(yīng)，以超聲提取時間，超聲強度，NaCl濃度和皺胃與提取液比例為因素，提取活性為試驗指標(biāo)，進行四因素三水平L9(34)正交試驗。
試驗結(jié)果見表5。
表5 超聲提取羔羊皺胃酶正交試驗提取時間超聲強度NaCl濃度(％) 皺胃/提取液 皺胃酶活性試驗號(min)A (W/cm2)B CD(SU/g)1 1(30) 1(20) 1(4) 1(1∶15) 20285±1532 1(30) 2(30) 2(6) 2(1∶20) 39269±1043 1(30) 3(40) 3(8) 3(1∶25) 41358±2014 2(40) 1(20) 2(6) 3(1∶25) 30108±1785 2(40) 2(30) 3(8) 1(1∶15) 62947±2136 2(40) 3(40) 1(4) 2(1∶20) 44723±1097 3(50) 1(20) 3(8) 2(1∶20) 32461±1358 3(50) 2(30) 1(4) 3(1∶25) 34793±1659 3(50) 3(40) 2(6) 1(1∶15) 46822±158k136971 27618 33267 43351k245926 45670 38733 38818k338025 44301 45598 35420R 900918052 12331 7931注①提取液pH為3。②表中數(shù)據(jù)系4次測定平均值。
由表5可以看出，超聲處理因素對羔羊皺胃酶提取活性有明顯的影響。超聲強度極差最大為18052，其次為NaCl濃度和提取時間，皺胃與提取液比例影響最小。方差分析表明，超聲強度和NaCl濃度兩因素達到極顯著水平(P＜0.01)，提取時間達到顯著水平(P＜0.05)，皺胃與提取液比例影響不大(P＞0.05)，說明在試驗取值范圍內(nèi)，超聲強度和NaCl濃度是影響羔羊皺胃酶提取的主要因素，其次為提取時間，皺胃與提取液比例應(yīng)取最小值。
為了更直觀地觀察各因素對羔羊皺胃酶提取效果的影響，以試驗因素為橫坐標(biāo)，超聲提取羔羊皺胃酶活性為縱坐標(biāo)作因素與試驗指標(biāo)關(guān)系圖，見圖1。
由圖1可以看出，超聲提取羔羊皺胃酶最優(yōu)組合為A2B2C3D1，即超聲提取時間為40min，超聲強度為30W/cm2，NaCl濃度為8％，皺胃與提取液比例為1∶15時，提取羔羊皺胃酶活性最高，為驗證此結(jié)果，以8％NaCl溶液，皺胃與提取液比例為1∶15，在30W/cm2超聲強度下，提取40分鐘，獲得羔羊皺胃酶活性為63100SU/g，證明提取技術(shù)參數(shù)合理可行，可在實際生產(chǎn)中應(yīng)用。
6、羔羊皺胃酶活性的測定按干酪生產(chǎn)中凝乳活性表示。取10ml10％的脫脂乳液，在35℃下保溫10分鐘，加入0.5ml酶液，迅速混合均勻，準(zhǔn)確記錄從加入酶液到乳液凝固的時間(秒)，把40分鐘凝固1ml10％脫脂乳液的酶量定義為一個索氏單位(Soxhelt unit，SU)，用每克羔羊皺胃提取酶活性單位表示提取酶活性產(chǎn)量，按下式計算酶活性和酶活性產(chǎn)量酶活性(SU)＝(2400/T)×(10/0.5)×D式中T為凝乳時間(秒)，D為稀釋倍數(shù)酶活性產(chǎn)量(SU/g)＝SU/皺胃重量式中皺胃重量單位為g。
7、微生物指標(biāo)的測定細菌總數(shù)按GB4789.2食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗中菌落總數(shù)測定方法進行檢驗，檢驗結(jié)果見表6。
大腸菌群按GB4789.3食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗中大腸菌群測定方法進行檢驗，檢驗結(jié)果見表6。
8、重金屬含量的測定按GB5009.12食品中鉛的含量測定方法進行檢驗，檢驗結(jié)果見表6。
9、酶活性保存率的測定將酶液在0～5℃下保存3個月和6個月后，分別測定其酶活性，然后用下式計算酶活性保存率。
酶活性保存率(％)＝(保存后酶活性/保存前酶活性)×10010、感官性狀評定在自然光下用肉眼觀察酶液的顏色、粘稠度及澄清狀況。
觀察結(jié)果見表6。
表6 羔羊皺胃酶的微生物指標(biāo)檢測結(jié)果表指標(biāo) 傳統(tǒng)方法 超聲提取皺胃酶活性(SU/g) 5320463100細菌總數(shù)(個/ml) 4500013500大腸菌群(個/ml) 25 5重金屬(以Pb計)(％)未檢出 未檢出酶活性保存率(％) 3個月 100 1006個月 95 92顏色 稍黃 微黃粘稠度粘稠 稍粘澄清度稍渾濁 清澈結(jié)論應(yīng)用超聲波可大大縮短提取時間，在超聲瀕率為20KHz，超聲強度為30W/cm2下提取40分鐘獲得的羔羊皺胃酶活性高于傳統(tǒng)方法提取活性的18.60％；應(yīng)用超聲提取羔羊皺胃酶，其微生物污染程度明顯低于傳統(tǒng)方法，細菌總數(shù)和大腸菌群分別由傳統(tǒng)方法的45000個/ml和25個/ml降為13500個/ml和5個/ml；應(yīng)用超聲提取羔羊皺胃酶，其理化指標(biāo)、微生物指標(biāo)和感官指標(biāo)均符合QB1805.3-93工業(yè)用蛋白酶制劑的應(yīng)用指標(biāo)。
權(quán)利要求
1.一種羔羊皺胃酶超聲提取方法，其特征在于它包括下述工藝步驟(1)羔羊皺胃的預(yù)處理羔羊屠宰后，立即取出皺胃，用流水沖洗1～2分鐘除出內(nèi)容物，然后剝除皺胃外部的脂肪及結(jié)締組織，在-24℃下冷凍備用。(2)切碎羔羊皺胃用絞肉機將羔羊皺胃切成0.001～0.01cm3的羔羊皺胃塊。(3)超聲提取在pH值為2.0～5.0的磷酸鹽緩沖液中添加2～10％的NaCl，制備成NaCl浸提緩沖液，將NaCl浸提緩沖液裝入超聲提取儀的容器內(nèi)，然后在該浸提緩沖液中加入切碎后的羔羊皺胃塊，使羔羊皺胃塊與緩沖液的重量比為1∶10～25，在超聲頻率為20KHz、超聲強度為20～45W/cm2下，提取20～50分鐘，并保持提取液溫度20～25℃。(4)離心分離將超聲提取后的混合液裝入離心機中，在3000～4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，去除雜質(zhì)，取上清液。(5)激活經(jīng)離心后的上清液用0.1mol/L HCl調(diào)整pH至4.6，在室溫下激活24小時，得羔羊皺胃酶粗提液。(6)制備羔羊皺胃酶激活后的羔羊皺胃酶粗提液再裝入離心機中，在3000～4000轉(zhuǎn)/分再離心15～30分鐘，以除去雜蛋白，然后再將其pH調(diào)整至5.3～6.0，即為提取的液態(tài)羔羊皺胃酶。
2.按照權(quán)利要求1所述的羔羊皺胃酶超聲提取方法，其特征在于其中超聲提取工藝步驟中，在pH值為2.0～5.0的磷酸鹽緩沖液中添加5～10％的NaCl，制備成NaCl浸提緩沖液，將NaCl浸提緩沖液裝入超聲提取儀的容器內(nèi)，然后在該浸提緩沖液中加入切碎后的羔羊皺胃塊，羔羊皺胃塊與緩沖液的重量比為1∶10～20，在超聲頻率為20KHz、超聲強度為30～40W/cm2下，提取30～40分鐘，并保持提取液溫度20～25℃。
3.按照權(quán)利要求1所述的羔羊皺胃酶超聲提取方法，其特征在于其中超聲提取工藝步驟中，在pH值為4.0的磷酸鹽緩沖液中添加8％的NaCl，制備成NaCl浸提緩沖液，將NaCl浸提緩沖液裝入超聲提取儀的容器內(nèi)，然后在該浸提緩沖液中加入切碎后的羔羊皺胃塊，羔羊皺胃塊與緩沖液的重量比為1∶15，在超聲頻率為20KHz、超聲強度為40W/cm2下，提取40分鐘，并保持提取液溫度20～25℃。
全文摘要
一種羔羊皺胃酶超聲提取方法，其工藝步驟為羔羊皺胃預(yù)處理、羔羊皺胃切碎、超聲提取、離心分離、激活、制備羔羊皺胃酶。本發(fā)明采用出生3周內(nèi)的羔羊皺胃為原料，應(yīng)用超聲波在溶液中產(chǎn)生的空化效應(yīng)作用，破壞皺胃細胞結(jié)構(gòu)，加速提取液在溶液中的滲透速度和細胞中酶的溶出速度，大大縮短了提取時間。超聲提取20～50分鐘可達到傳統(tǒng)方法提取2～3天的酶活性產(chǎn)量，且產(chǎn)品微生物污染程度較低。該方法具有操作簡單、提取效率較高、產(chǎn)品質(zhì)量較好等特點，可在食品工業(yè)生產(chǎn)中推廣使用。
文檔編號C07K1/14GK1546659SQ20031011891
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月10日
發(fā)明者張富新, 陳錦屏, 李林強 申請人:陜西師范大學(xué)