一種抗稻瘟病基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：一種抗稻瘟病基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物抗病基因及其編碼蛋白與應(yīng)用，特別是涉及一種抗稻瘟病基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物在自然界中往往會(huì)受到細(xì)菌、真菌、病毒及線蟲(chóng)等各種病害的襲擊，表現(xiàn)為抗病(Resistance)或感病(Susceptibility)反應(yīng)。對(duì)植物抗病性和抗病機(jī)制的研究一直是植物病理學(xué)和抗病育種十分關(guān)注的課題。
自1992年從玉米中克隆到植物第一個(gè)抗病基因Hm1以來(lái)，目前已克隆到了40多個(gè)植物抗病(R)基因，這些抗病基因涉及到細(xì)菌、真菌、病毒和線蟲(chóng)等不同病原微生物。這些基因多數(shù)編碼的蛋白產(chǎn)物具有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)特征如NBS(Nucleotidebinding site，核苷酸結(jié)合位點(diǎn))，LRR(Leucine-rich repeat，富亮氨酸重復(fù))，TM(Transmembrane domain，跨膜結(jié)構(gòu)域)，PK(Protein kinase，蛋白激酶)，LZ(Leucine zipper，亮氨酸拉鏈)，CC(Coiled Coil，卷曲螺旋)和TIR(Toll-Interleukin-1 Receptor，Toll白介素-1區(qū)域)等。而且根據(jù)它們是否含有這些結(jié)構(gòu)域，也可將這些抗病基因分為L(zhǎng)Z(CC)-NBS-LRR，TIR-NBS-LRR，TM-LRR，TM-LRR，LRR-TM-STK等5類(lèi)。但是，除了上述5類(lèi)R基因外，目前還克隆了其它特殊類(lèi)型的R基因。如玉米的Hm1基因是屬于代表植物抗病基因中與病原菌親和性因子作用的一類(lèi)基因，其編碼一個(gè)毒素還原酶，由于產(chǎn)生的抗性與病原菌的無(wú)毒基因沒(méi)有關(guān)系，因而其抗病機(jī)制不符合基因?qū)驅(qū)W說(shuō)；甜菜的抗胞囊線蟲(chóng)的Hslpro-1基因所編碼的蛋白含不完全的LRR和跨膜區(qū)；大麥的隱性抗白粉病(Erysiphegraminisf.sp.Hordei)mlo基因編碼一個(gè)至少含有6個(gè)跨膜蛋白螺旋(Membranespanning helices)的膜蛋白，而沒(méi)有其它R基因類(lèi)似的結(jié)構(gòu)域；擬南芥的抗白粉病基因RPW8編碼的蛋白具有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)及胞內(nèi)的卷曲螺旋區(qū)，并包含RPW8.1，RPW8.2兩個(gè)不同的位點(diǎn)，能夠?qū)Σ≡a(chǎn)生廣譜抗性；擬南芥的抗煙草花葉病毒基因Rtm1和Rtm2分別編碼熱激蛋白；擬南芥中的抗病基因RRS1-R雖然也編碼一個(gè)TIR-NBS-LRR蛋白，但其蛋白的羧基末端包含由60個(gè)氨基酸組成的與WRKY家族的轉(zhuǎn)錄激活蛋白具有類(lèi)似結(jié)構(gòu)的核定位信號(hào)結(jié)構(gòu)，而且該基因?qū)Σ≡?，Ralstoniasolanacearum，具有非小種特異性抗性，而且呈隱性遺傳；西紅柿對(duì)病原菌Verticillium alboatrum的抗病基因Ve編碼的是類(lèi)似于參與細(xì)胞內(nèi)吞作用信號(hào)途徑的細(xì)胞表面甘氨酸受體蛋白，另外最近在大麥中克隆的抗莖銹病基因Rpg1編碼的蛋白含兩個(gè)激酶區(qū)及一個(gè)疏水性較弱的跨膜區(qū)。因此，對(duì)于抗病基因的分類(lèi)并不是一個(gè)簡(jiǎn)單的過(guò)程。只有克隆到更多的抗病基因，才可能更加全面地了解植物抗病基因的特征，并解析植物抗病的真正機(jī)制。
水稻是世界上主要的糧食作物之一，供養(yǎng)著全球近1/4的人口。水稻稻瘟病、白葉枯等重大病害一直是影響其產(chǎn)量的重要原因，研究水稻的抗病性及抗性機(jī)制日益熱化，如目前已定位了20多個(gè)稻瘟病抗性基因及10多個(gè)稻瘟病抗性QTLs位點(diǎn)，定位的抗白葉枯病基因也已達(dá)20多個(gè)。但自1995年克隆到第一個(gè)水稻抗白葉枯病基因Xa21以來(lái)，目前僅在水稻中克隆到抗白葉枯病基因Xa1、抗稻瘟病Pi-b及Pi-ta等另外三個(gè)抗病基因。這對(duì)于單子葉的模式植物而言，克隆抗性基因的進(jìn)展的確有些緩慢。而且所克隆的Xa21、Xa1、Pi-b、Pi-ta等四個(gè)抗病基因編碼的蛋白產(chǎn)物都含有NBS及LRR結(jié)構(gòu)，屬于抗病基因的大類(lèi)。而根據(jù)在植物上已克隆到的抗病基因結(jié)構(gòu)特征出發(fā)，推測(cè)水稻中也應(yīng)該存在多種類(lèi)型的抗病基因。因此，克隆數(shù)量更多、種類(lèi)更廣的抗病基因才能更加系統(tǒng)深入地揭示水稻的抗病機(jī)制，也才能更好地用于基因工程改良水稻的抗病性，提高其產(chǎn)量。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種抗稻瘟病基因及其編碼蛋白。
本發(fā)明所提供的抗稻瘟病基因，名稱(chēng)為Pi-d2，來(lái)源于水稻(Oryza sativavar.Lansheng)，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)序列表中的SEQ ID №2；3)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；4)與序列表中的SEQ ID №1或SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中序列1是Pi-d2的基因組DNA序列，由6261個(gè)堿基組成，其讀碼框?yàn)樽?’端第3361到第5835位堿基；序列表中序列2是Pi-d2的全長(zhǎng)cDNA序列，由2935個(gè)堿基組成，其讀碼框?yàn)樽?’端第125到第2599位堿基；序列表中序列3是Pi-d2編碼的蛋白質(zhì)Pi-d2的氨基酸序列。Pi-d2的表達(dá)為組成型表達(dá)。
抗稻瘟病基因Pi-d2的編碼蛋白Pi-d2，是具有序列表中SEQ ID №3氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №3的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №3衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列3是由825個(gè)氨基酸殘基組成的一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白受體類(lèi)激酶。序列3中，自氨基端第12-34位氨基酸殘基序列為一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)，是具有信號(hào)肽功能的結(jié)構(gòu)域；自氨基端第48-165位氨基酸殘基序列是一個(gè)與外源凝集素蛋白相似的異體識(shí)別結(jié)構(gòu)域(B-Lectin)，參與病原物的識(shí)別；自氨基端第436-458位氨基酸殘基序列是一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)，是將上述識(shí)別信號(hào)傳遞給羧基端的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(STYK)結(jié)構(gòu)域的中介；自氨基端第501-771位氨基酸殘基序列是一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(STYK)結(jié)構(gòu)域，其磷酸化作用能將信號(hào)傳導(dǎo)給抗病防衛(wèi)反應(yīng)系統(tǒng)。推測(cè)信號(hào)肽與異體識(shí)別結(jié)構(gòu)域一起參與對(duì)稻瘟病病原菌ZB15無(wú)毒蛋白的識(shí)別，然后激發(fā)STYK區(qū)域。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體及細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增Pi-d2中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的抗稻瘟病基因Pi-d2導(dǎo)入植物細(xì)胞，可獲得抗病的或抗病增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種一般性啟動(dòng)子、增強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所使用的載體進(jìn)行加工，如加入植物可選擇性標(biāo)記(GUS基因、熒光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素，卡那霉素等)。為了轉(zhuǎn)基因植物釋放的安全性，在構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)也可不攜帶任何標(biāo)記基因，在苗期直接用稻瘟病菌接種進(jìn)行篩選。本發(fā)明Pi-d2的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹(shù)、草坪草、苜宿等。本發(fā)明的基因?qū)ε嘤共≈参锲贩N，擴(kuò)大作物種植范圍，提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。


圖1A為Pi-d2的精細(xì)定位示意1B為Pi-d2所在染色體區(qū)域的跨疊群示意2為GENSCAN對(duì)180kb的DNA序列的基因預(yù)測(cè)結(jié)果圖3為Pi-d2編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域分析圖4A為Pi-d2與Pto和Xa21絲氨酸/蘇氨酸激酶區(qū)的聚類(lèi)分析圖4B為Pi-d2與Pto和Xa21絲氨酸/蘇氨酸激酶區(qū)的序列相似性比較圖5為Pi-d2全長(zhǎng)基因在水稻基因組中的拷貝數(shù)的Southern雜交結(jié)果圖6A為互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表達(dá)載體pZH01/Pi-d2圖6B為Pi-d2轉(zhuǎn)基因T0代分子檢測(cè)結(jié)果圖6C為對(duì)部分轉(zhuǎn)基因株系T1代抗性鑒定結(jié)果圖6D為轉(zhuǎn)基因株系T0-10的T2代分子檢測(cè)結(jié)果圖7A為Pi-d2在轉(zhuǎn)錄水平上的RT-PCR分析結(jié)果圖7B為Pi-d2在轉(zhuǎn)錄水平上的Northern分析結(jié)果具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、地谷抗稻瘟病基因的發(fā)現(xiàn)及鑒定應(yīng)用我國(guó)南方稻區(qū)致病力較強(qiáng)的稻瘟病生理小種ZB15對(duì)地谷和感病的水稻品種麗江新團(tuán)黑谷(LTH)、江南香糯(JNXN)以及雜交獲得的F1、BC1F1、F2群體進(jìn)行接種鑒定，結(jié)果如表1所示，地谷對(duì)ZB15表現(xiàn)為抗病，麗江新團(tuán)黑谷、江南香糯均表現(xiàn)為感病，地谷與麗江新團(tuán)黑谷、江南香糯雜交獲得的F1植株對(duì)ZB15也都表現(xiàn)為抗病，而地谷與麗江新團(tuán)黑谷、江南香糯雜交，進(jìn)一步回交獲得的群體B1F1中的抗病單株與感病單株符合1∶1，而且各F2群體的抗病感病的分離比均符合3∶1。這些結(jié)果表明水稻品種地谷對(duì)稻瘟病小種ZB15的抗性受細(xì)胞核內(nèi)的單基因控制，并呈完全顯性遺傳，定名為Pi-d2。
表1 親本地谷(Digu)，麗江新團(tuán)黑谷(LTH)，江南香糯(JNXN)及其雜交后代對(duì)稻瘟病原菌小種ZB15的抗病感病情況(R＝抗病，S＝感病)


實(shí)施例2、Pi-d2與其它已知抗稻瘟病基因關(guān)系分析用稻瘟病小種ZB15對(duì)含已知抗病基因的日本鑒別系和ZYQ8及它們與地谷雜交獲得的F1和F2群體進(jìn)行接種鑒定。如表2所示，BL-1、K60、Pi-4號(hào)、K1、福錦、藤坂5號(hào)、梅雨明等7個(gè)品種對(duì)ZB15均表現(xiàn)感病反應(yīng)，而與地谷雜交得到的F1均表現(xiàn)抗病反應(yīng)，與地谷雜交得到的F2的抗病、感病分離比均符合3∶1，表明地谷所含的抗稻瘟病基因Pi-d2與該7個(gè)品種所含的抗稻瘟病基因不同。
表2地谷與各水稻稻瘟病鑒別品種雜交后代F1和F2群體對(duì)稻瘟病原菌ZB15的抗病感病分離情況(R＝抗病，S＝感病)

而水稻品種K59，窄葉青8號(hào)和砦1號(hào)及它們與地谷雜交獲得的F1對(duì)ZB15均表現(xiàn)為抗病反應(yīng)，但其相應(yīng)的F2群體都分離出現(xiàn)了感病單株，其分離比既不符合3∶1，也不符合15∶1，表明K59，窄葉青8號(hào)和砦1號(hào)中可能也含有對(duì)ZB15的抗稻瘟病基因，但與地谷中的Pi-d2不同，而且也不等位。
實(shí)施例3、對(duì)抗稻瘟病基因的定位以地谷和麗江新團(tuán)黑谷為親本，發(fā)展了一個(gè)F2群體，用ZB15對(duì)F2群體進(jìn)行接種處理，鑒定出抗病和感病的單株，并將抗病單株和感病單株進(jìn)行抗、感分群，從抗病和感病植株中分別隨機(jī)選取6個(gè)單株，取等量葉片，并將抗病和感病單株的葉片分別混合提取DNA，形成抗病和感病DNA池，對(duì)ZB15抗病和感病的DNA池分別定名為BR15和BS15。先后用比較平均地分布于水稻12條染色體的127個(gè)RFLP標(biāo)記及322個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)親本地谷和麗江新團(tuán)黑谷進(jìn)行DNA多態(tài)性篩選，發(fā)現(xiàn)其中有72個(gè)RFLP標(biāo)記及119個(gè)SSR標(biāo)記能揭示兩親本DNA的多態(tài)性，進(jìn)而用這191個(gè)分子標(biāo)記對(duì)抗病、感病的DNA池進(jìn)行分析，并進(jìn)一步將該基因定位于水稻第6染色體上。
實(shí)施例4、抗稻瘟病基因的精細(xì)定位在利用地谷和麗江新團(tuán)黑谷為親本構(gòu)建擴(kuò)大的F2群體，并將該F2群體種植于溫室中，在其三葉一芯期，用稻瘟病生理小種ZB15進(jìn)行噴霧接種，并保持100％的濕度及25-28℃的培養(yǎng)環(huán)境，接種10天后對(duì)F2單株進(jìn)行抗感病鑒定。得到約4000株感病特別明顯的F2單株，對(duì)這些F2單株的葉片按5株混合建池提取DNA，獲得約800個(gè)感病DNA池，用于精細(xì)定位。用與Pi-d2定位分析的分子標(biāo)記，并根據(jù)中國(guó)華大基因研究中心(http//btn.genomics.org.cn)和國(guó)際基因組計(jì)劃(http//rgp.dna.affrc.go.jp)提供的序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)800個(gè)感病的DNA池進(jìn)行分析，將其定位于分子標(biāo)記CAPs1和CAPs8之間，其中分子標(biāo)記CAPs1和CAPs8與目標(biāo)基因分別有1個(gè)和3個(gè)交換，而分子標(biāo)記CAPs2，dCAPs1，dCAPs2則與目標(biāo)基因共分離，如圖1A所示。
實(shí)施例5、候選基因的獲得首先對(duì)分子標(biāo)記CAPs1和CAPs8所跨區(qū)域幾附近的PACs序列進(jìn)行分析后構(gòu)建其PAC跨疊群(如圖1B所示)，并發(fā)現(xiàn)這一區(qū)域的染色體交換頻率很低(約500kb/cM)，因此，難以將目標(biāo)基因定位在一個(gè)或兩個(gè)基因的有限范圍。于是用GENSCAN對(duì)CAPs1和CAPs8所跨疊的180KB的物理群進(jìn)行了基因預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果如圖2所示，該區(qū)域共含33個(gè)基因(如表3所示)，其中絲氨酸/蘇氨酸受體激酶蛋白(STK Protein)，DNA結(jié)合蛋白(DNA Binding PROTEIN)，ATP酶蛋白(ATPases)，未知功能蛋白(Unkown function Protein)，剪切相關(guān)蛋白的富脯氨酸結(jié)構(gòu)域(Proline rich domain)各1個(gè)，反轉(zhuǎn)錄酶(Reverse transcriptase)2個(gè)，細(xì)菌中的一類(lèi)運(yùn)動(dòng)蛋白(MviN-like protein)5個(gè)，推測(cè)蛋白(Putative Protein)21個(gè)，推測(cè)其中編碼一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白受體激酶的基因很可能是目標(biāo)基因。于是，根據(jù)其轉(zhuǎn)錄區(qū)域的DNA序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行5’和3’末端擴(kuò)增(RapidAmplification cDNA Ends，RACE)及轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(RT-PCR)獲得其全長(zhǎng)cDNA。具體過(guò)程如下對(duì)于5’末端擴(kuò)增，先用引物5’(P)TGAATGGGTGAC 3’對(duì)水稻地谷中RNA(已去除DNA)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后以該cDNA為模板，用特異引物A15’CTTGCAGTGGTTCACATGGC 3’和S15’CCAAAGCCAAAGACAGAGCC 3’進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，再以第一獲得的PCR產(chǎn)物為模板，用特引物A25’CAGTCTGGTCTGCCAATCCT 3’和S25’CTTGCAGTGGTTCACATGGC 3’進(jìn)行二輪擴(kuò)增。類(lèi)似的，對(duì)于3’末端擴(kuò)增，先用5’GACTCGAGTCGACATCGA(T)16 3’對(duì)模板RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后用特異引物Con3R5’TCGACCCGCCCATCCTTGT 3’和Adapter5’GACTCGAGTCGACATCGA3’對(duì)反轉(zhuǎn)錄獲得的進(jìn)行擴(kuò)增。對(duì)于5’和3’末端間的區(qū)域，以3’末端擴(kuò)增過(guò)程中的cDNA為模板，用兩對(duì)特異引物S1+CON2R(5’-CCAAAGCCAAAGACAGAGCC-3’，及5’-ATTTGAAGGCGTTTGCGTAGA-3’)和CON2F+CON3R(5’-TTGGCTATCATAGGCGTCC-3’及5’-TCGACCCGCCCATCCTTGT-3’)分別進(jìn)行擴(kuò)增獲得。通過(guò)分析表明該全長(zhǎng)cDNA共編碼825個(gè)氨基酸，如序列表中的序列3所示。同時(shí)以引物GenRF上游5′端5’AGCATCAACATAGACGTAGCGTGG 3’，下游3′端5’CTAGTTACAGATCACTGTGCCAT 3’；利用高保真酶Pfu擴(kuò)增，獲得了該基因?qū)?yīng)的基因組序列，如序列表中的序列1所示，通過(guò)比較其基因組和cDNA序列發(fā)現(xiàn)該基因，僅含一個(gè)開(kāi)放閱讀框，其包含了cDNA編碼的完整區(qū)域，該結(jié)果表明該基因不含有內(nèi)含子。
表3 GENSCAN對(duì)180kb的DNA序列的基因預(yù)測(cè)結(jié)果II

實(shí)施例6、Pi-d2編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析用Simple Modular Architecture Research Tool(SMART)(http//smart.embl-heidelberg.de/)方法對(duì)基因Pi-d2所編碼的蛋白全長(zhǎng)氨基酸序列分析，結(jié)果如圖3所示，該蛋白的氨基最末端即自序列表中序列3的氨基端第1-32位氨基酸殘基序列為一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)，是一個(gè)包含23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)(Signaling domain) 自序列表中序列3的氨基端第48-165位氨基酸殘基序列是一個(gè)與外源凝集素蛋白相似的異體識(shí)別結(jié)構(gòu)域(B-Lectin)，參與病原物的識(shí)別；自序列表中序列3的氨基端第436-458位氨基酸殘基序列是一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)，是將上述識(shí)別信號(hào)傳遞給羧基端的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(STYK)結(jié)構(gòu)域的中介；自序列表中序列3的氨基端第501-771位氨基酸殘基序列是一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(STYK)結(jié)構(gòu)域，其磷酸化作用能將信號(hào)傳導(dǎo)給抗病防衛(wèi)反應(yīng)系統(tǒng)；自序列表中序列3的氨基端第419-431位氨基酸殘基序列和自序列表中序列3的氨基端第797-808位氨基酸殘基序列為low complexity區(qū)域。推測(cè)信號(hào)肽與異體識(shí)別結(jié)構(gòu)域一起參與對(duì)稻瘟病病原菌ZB15無(wú)毒蛋白的識(shí)別，然后激發(fā)STYK區(qū)域的活性，從而激活植物體內(nèi)的抗病防衛(wèi)反應(yīng)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌ZB15的抗病性。
實(shí)施例7、Pi-d2與Pto和Xa21絲氨酸/蘇氨酸激酶區(qū)氨基酸序列的比較由于目前所克隆的植物抗病基因中，僅有西紅柿的Pto和水稻的Xa21具有絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，因此，從NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索到Pto和Xa21相應(yīng)的STYK結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列并與Pi-d2的STYK結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列進(jìn)行比較，結(jié)果如圖4A所示，表明Pi-d2與Pto、Xa21間在某些區(qū)域相對(duì)十分保守，估計(jì)這些區(qū)域是該類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶發(fā)揮活性所必需的。三者相似性比較結(jié)果如圖4B所示，表明Pi-d2與Pto、Xa21的STYK的同源性分別為32.3％，26.2％，而Pto與Xa21間STYK的同源性僅為21.2％。說(shuō)明在進(jìn)化上，Pi-d2與Pto的親緣關(guān)系可能比與Xa21更近。
實(shí)施例8、基因組拷貝數(shù)分析對(duì)地谷、麗江新團(tuán)黑谷、臺(tái)北309(TP309)按照SDS法提取的水稻材料基因組DNA經(jīng)ScaI、DraI等酶切后轉(zhuǎn)膜，利用Pi-d2全長(zhǎng)cDNA序列為探針，進(jìn)行Southern雜交，結(jié)果如圖5所示，表明經(jīng)ScaI、DraI酶切后地谷、麗江新團(tuán)黑谷、TP309三個(gè)樣品雜交均顯示一條帶紋，而且雜交帶紋在抗病品種地谷與感病品種麗江新團(tuán)黑谷、TP309間均有差異。表明該基因在水稻基因組中以單拷貝形式存在，并且在抗病材料和感病材料中DNA序列存在差異。圖中1，2，3分別代表水稻地谷、麗江新團(tuán)黑谷、臺(tái)北309的基因組DNA。
實(shí)施例9、功能互補(bǔ)由于該基因不含內(nèi)含子，以水稻地谷cDNA為模板，以5’-TTGGGTCTAGAAGCATCAACATAGACGTAGCGTGG-3’和5’-TTTGCGTCGACCTAGTTACAGATCACTGTGCCAT-3’為引物(其中帶下畫(huà)線的區(qū)域分別為限制性內(nèi)切酶XbaI，SalI的識(shí)別位點(diǎn)，斜體區(qū)域?yàn)槊盖斜Ｗo(hù)堿基)，利用高保真PCR擴(kuò)增得到該基因的全長(zhǎng)，并通過(guò)多次測(cè)序反復(fù)驗(yàn)證其序列正確無(wú)誤后，將其構(gòu)建在含有35S啟動(dòng)子pZH01上作為功能互補(bǔ)的表達(dá)載體，結(jié)果如圖6A所示，表明基因Pi-d2構(gòu)建于表達(dá)載體pZH01的煙草花葉病毒啟動(dòng)子35S的下游，得到功能互補(bǔ)的表達(dá)載體pZH01/Pi-d2，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化感病的水稻品種TP309，獲得了41個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，對(duì)該41個(gè)株系T0代進(jìn)行分子檢測(cè)，所用引物為上游5’端5’TTGGCTATCATAGGCGTCC 3’；下游3’端5’ATTTGAAGGCGTTTGCGTAGA 3’。結(jié)果如圖6B所示，其中3個(gè)株系表現(xiàn)為T(mén)P309的基因型，35個(gè)株系表現(xiàn)為地谷和TP309的雜合型，3個(gè)株系表現(xiàn)近為地谷型，表明有38個(gè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因株系，其中基因型呈地谷型的三個(gè)株系很可能是目標(biāo)基因發(fā)生了多拷貝整合。圖6B中，A為臺(tái)北309；B為地谷；C為麗江新團(tuán)黑谷；1-41為轉(zhuǎn)基因T0代，共41株系三種分子帶型；*為臺(tái)北309型(未轉(zhuǎn)入的株系)，共3個(gè)；#為地谷型(可能是多拷貝株系)，共3個(gè)；雜合型，共35個(gè)。
對(duì)其中獲有種子的20個(gè)株系在T1代苗期及分裂盛期分別進(jìn)行噴霧和注射接種，結(jié)果如圖6C所示，表明第8、10株系在T1代明顯對(duì)ZB15具有抗性，進(jìn)一步對(duì)該兩個(gè)株系在T2代單株接種，并對(duì)各株系的抗病、感病單株進(jìn)行分子檢測(cè)，所用特異引物5’TTGGCTATCATAGGCGTCC 3’和5’ATTTGAAGGCGTTTGCGTAGA 3’，并用限制性內(nèi)切酶MluI對(duì)PCR產(chǎn)物酶切后電泳。結(jié)果如圖6D所示，表明在抗病單株中均能檢測(cè)到目標(biāo)基因，而在感病單株中則未能檢測(cè)到目標(biāo)轉(zhuǎn)基因，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株對(duì)ZB15的抗性確實(shí)是由目標(biāo)抗病基因Pi-d2提供。圖6D中，DL2000是分子量標(biāo)準(zhǔn)；A，B，C依次表示抗病的地谷，感病的麗江新團(tuán)黑谷，感病的臺(tái)北309；1至12分別表示該株系的抗病單株；13至17表示該株系的感病單株。
進(jìn)一步用其他稻瘟病生理小種對(duì)該抗病的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系后代接種，結(jié)果表明該兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系對(duì)稻瘟病小種ZB13，Zhong-10-8-14，Zh2-1，Zk-10-2等是感病的，這一結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了轉(zhuǎn)基因株系對(duì)ZB15的抗病性是由轉(zhuǎn)入的抗病基因Pi-d2所致，而且具有抗病特異性。同時(shí)也證明了該基因就是目標(biāo)抗病基因Pi-d2。
實(shí)施例10、抗病基因的表達(dá)分析用稻瘟病生理小種ZB15對(duì)地谷和麗江新團(tuán)黑谷在苗期進(jìn)行噴霧接種處理，然后按處理后0，12，24，48，96小時(shí)(hr)取樣按常規(guī)方法提取RNA。并對(duì)各樣品RNA進(jìn)行DNA去除后用于RT-PCR分析，引物為基因Pi-d2內(nèi)的一對(duì)特異性擴(kuò)增引物(5’-TTGGCTATCATAGGCGTCC-3’和5’-ATTTGAAGGCGTTTGCGTAGA-3’)，并根據(jù)McElroy等(Plant Mol.Biol.14(2)，163-171(1990))發(fā)表的水稻Actin基因Racl的cDNA序列設(shè)計(jì)Actin引物(5’-CCTCGTCTCGACCTTGCTGGG-3’和5’-GAGAACAAGCAGGAGGACGGC-3’)作為對(duì)照。結(jié)果如圖7A所示，抗病基因Pi-d2并不受ZB15的誘導(dǎo)，而且在水稻根、莖和葉中均有表達(dá)。Northern的結(jié)果如圖7B所示也與RT-PCR的結(jié)果一致。表明該基因如同所克隆的其他多數(shù)植物抗性基因(如Xa21等)一樣，為組成型表達(dá)，其表達(dá)量不是很高，但通過(guò)RT-PCR以及Northern雜交均能檢測(cè)得到。
序列表<160>3<210>1<211>6261<212>DNA<213>水稻屬水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>1agcatcaaca tagacgtagc gtggccgtat ccatttttta atgcatatat aaatttctcc 60atcttttgcg atctctctgt tgctcacagt gtggccgtac acgctaaaca aatactccag120tactactact ccttattata ctcagcgtcc caaaatataa cttctatgct tcaaatttta180tctcgaaatt acactctcct cccaatcaat cacaaccttt caattccacc atttttataa240tcccgtattt aacaaacatt ttatatttca gaatgaaggt agttgtataa tattagtaat300aaataaacta ttcttttttc aaaaaataca ggacgcaatt tgataatgta aagcgtaaat360gcacacttaa ctagcacaac tctactaaat tcctttcaaa attctacacc atgagatctc420tggttctatt tagtgtctgt attgtatttt tttagtatga tatgatctaa acggtaaggt480aataataata acttttacta cctccattcc aaattagtag tcgctttcac ttttttcttt540tttcttgtaa cgtttgacca ttcgtcttat ttaaaaaatt agtgcaaata taaaaataga600gaagtcatac ttaaagtgct tttaataata aagcaaatca taaaaaaaac aaatattaat660tcgagtaaat tgcacccaca gtacaacaac ttgataggtg ggtgcgatat agtgcaagaa720cttgagaatt gaacgttcga gtgcaacaac ttgacaagtg ggtgcgtttt agtacaagaa780cttgacaatt tagtattttg gtgcatcaac taagctaagc atatgctagg tgagtttttc840tcacgatatc aatatgccat tacatagcaa tcatacggat attaccttgt aatattgaat900tttatcttta agaattatac tgcatatccc aatttacaac caattacctt taagaatttt960tgttttcttc acattcctaa atctcaaccg aaatataata atttctacat ctagttaatt 1020gacttttagt tattagttat tagaataaaa atataaatat gcttatatgc aaatccacgc 1080tagtatattg tcaaaataag aacttaaaaa ttgaatatgc ataaaaagtg ctccaaataa 1140ttaagttgtc gcataacttc ttatcttatt gtatcaaaat cgtacgtatc ttacaagttg 1200ttgcatttat acaatcactt ataaaatttt ttagctaaac tgcacatacc tgcgaagttg 1260atgcactaga atgctcgttt ctcaagttat tgcaccaaat tgcacccacc tactaagttg 1320
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gaagctggag gaaggtgatc ttcaggacat cttcgacgcc aagctgaagt acaatgacaa 2340ggatgggcgg gtcgagaccg cgatcaaggt cgcgctctgg tgcatccagg atgatttcta 2400ccagagacca tccatgtcaa aggttgtgca gatgctcgaa ggcgtctgcg aggtgctcca 2460gccaccggtg tcgtcgcaga tcgggtacag gctctacgca aacgccttca aatcgagcag 2520cgaggagggg acttcatcag ggatgtcgga ctacaacagt gatgctctgc tttcagctgt 2580gaggctctct ggtcccagat gatgtgaaga atcccatgta cagtgccttg tctagttagg 2640ttgcaaagtg tgcaaatttt gctgtagttt ccagtgtttt ggtgatcatt tgcttcacac 2700tattgtacat atcttcttgg tcatttctgg tggtagttta tacatatctt gctgattatt 2760tatggtggta gtttatcggt gccattcttt ttttgttgcc cttttgctta tacataaggt 2820ctccaaaacc tttgacaatt accttttgta gttatgtctt ggtaaaaata ataggaaatg 2880caatgataca aaagcctttt tcatcagaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa2935<210>3<211>825<212>PRT<213>水稻屬水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>3Met Glu Ala His Gly Asn Arg Arg Ser Ser Pro Thr Tyr Leu Val Met1 5 10 15Leu Trp Met Ile Ser Val Ala Ser Leu Leu Ile Thr Cys Arg Gly Ser20 25 30Ile Gln Lys Gln Val Leu Phe Pro Gly Phe Thr Ala Ala Gln Met Asp35 40 45Tyr Ile Asp Asn Asp Gly Ile Phe Leu Leu Ser Asn Gly Ser Val Phe50 55 60Gly Phe Gly Phe Val Thr Ser Asn Val Ser Asp Asn Thr Phe Tyr Ile65 70 75 80Leu Ala Val Val His Met Ala Thr Thr Thr Thr Val Trp Ser Ala Asn85 90 95Pro Asn Ser Pro Val Thr His Ser Asp Asp Phe Phe Phe Asp Lys Asp100 105 110
Gly Asn Ala Phe Leu Gln Ser Gly Gly Gly Ser Asn Val Trp Ala Ala115 120 125Asn Ile Ser Gly Lys Gly Thr Ala Thr Ser Met Gln Leu Leu Asp Ser130 135 140Gly Asn Leu Val Val Leu Gly Lys Asp Ala Ser Ser Pro Leu Trp Gln145 150 155 160Ser Phe Ser His Pro Thr Asp Thr Leu Leu Ser Gly Gln Asn Phe Ile165 170 175Glu Gly Met Thr Leu Met Ser Lys Ser Asn Thr Val Gln Asn Met Thr180 185 190Tyr Thr Leu Gln Ile Lys Ser Gly Asn Met Met Leu Tyr Ala Gly Phe195 200 205Glu Thr Pro Gln Pro Tyr Trp Ser Ala Gln Gln Asp Ser Arg Ile Ile210 215 220Val Asn Lys Asn Gly Asp Ser Ile Tyr Ser Ala Asn Leu Ser Ser Ala225 230 235 240Ser Trp Ser Phe Tyr Asp Gln Ser Gly Ser Leu Leu Ser Gln Leu Val245 250 255Ile Ala Gln Glu Asn Ala Asn Ala Thr Leu Ser Ala Val Leu Gly Ser260 265 270Asp Gly Leu Ile Ala Phe Tyr Met Leu Gln Gly Gly Asn Gly Lys Ser275 280 285Lys Phe Ser Ile Thr Val Pro Ala Asp Ser Cys Asp Met Pro Ala Tyr290 295 300Cys Ser Pro Tyr Thr Ile Cys Ser Ser Gly Thr Gly Cys Gln Cys Pro305 310 315 320Ser Ala Leu Gly Ser Phe Ala Asn Cys Asn Pro Gly Val Thr Ser Ala325 330 335Cys Lys Ser Asn Glu Glu Phe Pro Leu Val Gln Leu Asp Ser Gly Val340 345 350Gly Tyr Val Gly Thr Asn Phe Phe Pro Pro Ala Ala Lys Thr Asn Leu355 360 365
Thr Gly Cys Lys Ser Ala Cys Thr Gly Asn Cys Ser Cys Val Ala Val370 375 380Phe Phe Asp Gln Ser Ser Gly Asn Cys Phe Leu Phe Asn Gln Ile Gly385 390 395 400Ser Leu Gln His Lys Gly Gly Asn Thr Thr Arg Phe Ala Ser Phe Ile405 410 415Lys Val Ser Ser Arg Gly Lys Gly Gly Ser Asp Ser Gly Ser Gly Lys420 425 430His Asn Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Leu Gly Thr Leu Ala Ile Ile435 440 445Gly Val Leu Ile Tyr Ile Gly Phe Trp Ile Tyr Lys Arg Lys Arg His450 455 460Pro Pro Pro Ser Gln Asp Asp Ala Gly Ser Ser Glu Asp Asp Gly Phe465 470 475 480Leu Gln Thr Ile Ser Gly Ala Pro Val Arg Phe Thr Tyr Arg Glu Leu485 490 495Gln Asp Ala Thr Ser Asn Phe Cys Asn Lys Leu Gly Gln Gly Gly Phe500 505 510Gly Ser Val Tyr Leu Gly Thr Leu Pro Asp Gly Ser Arg Ile Ala Val515 520 525Lys Lys Leu Glu Gly Ile Gly Gln Gly Lys Lys Glu Phe Arg Ser Glu530 535 540Val Thr Ile Ile Gly Ser Ile His His Ile His Leu Val Lys Leu Arg545 550 555 560Gly Phe Cys Thr Glu Gly Pro His Arg Leu Leu Ala Tyr Glu Tyr Met565 570 575Ala Asn Gly Ser Leu Asp Lys Trp Ile Phe His Ser Lys Glu Asp Asp580 585 590His Leu Leu Asp Trp Asp Thr Arg Phe Asn Ile Ala Leu Gly Thr Ala595 600 605Lys Gly Leu Ala Tyr Leu His Gln Asp Cys Asp Ser Lys Ile Val His610 615 620
Cys Asp Ile Lys Pro Glu Asn Val Leu Leu Asp Asp Asn Phe Ile Ala625 630 635 640Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Met Thr Arg Glu Gln Ser645 650 655His Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Thr Arg Gly Tyr Leu Ala Pro Glu660 665 670Trp Leu Thr Asn Tyr Ala Ile Ser Glu Lys Ser Asp Val Tyr Ser Tyr675 680 685Gly Met Val Leu Leu Glu Ile Ile Gly Gly Arg Lys Ser Tyr Asp Pro690 695 700Ser Glu Ile Ser Glu Lys Ala His Phe Pro Ser Phe Ala Phe Lys Lys705 710 715 720Leu Glu Glu Gly Asp Leu Gln Asp Ile Phe Asp Ala Lys Leu Lys Tyr725 730 735Asn Asp Lys Asp Gly Arg Val Glu Thr Ala Ile Lys Val Ala Leu Trp740 745 750Cys Ile Gln Asp Asp Phe Tyr Gln Arg Pro Ser Met Ser Lys Val Val755 760 765Gln Met Leu Glu Gly Val Cys Glu Val Leu Gln Pro Pro Val Ser Ser770 775 780Gln Ile Gly Tyr Arg Leu Tyr Ala Asn Ala Phe Lys Ser Ser Ser Glu785 790 795 800Glu Gly Thr Ser Ser Gly Met Sar Asp Tyr Asn Ser Asp Ala Leu Leu805 810 815Ser Ala Val Arg Leu Ser Gly Pro Arg820 82權(quán)利要求
1.一種抗稻瘟病基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)序列表中的SEQ ID №2；3)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；4)與序列表中的SEQ ID №1或SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于所述抗稻瘟病基因是序列表中的SEQ ID №1或SEQ ID №2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述抗稻瘟病基因的讀碼框?yàn)樾蛄斜碇蠸EQ ID №1的自5’端第3361到第5835位堿基或序列表中SEQ ID №2的自5’端第125到第2599位堿基。
4.抗稻瘟病基因的編碼蛋白，是具有序列表中SEQ ID №3氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №3的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №3衍生的蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述抗稻瘟病基因的編碼蛋白是序列表中的SEQ ID №3。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述序列表中SEQ ID №3的自氨基端第12-34位氨基酸殘基序列為一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域；自氨基端第48-165位氨基酸殘基序列是一個(gè)與外源凝集素蛋白相似的異體識(shí)別結(jié)構(gòu)域；自氨基端第436-458位氨基酸殘基序列是一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域；自氨基端第501-771位氨基酸殘基序列是一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。
7.含有權(quán)利要求1所述抗稻瘟病基因的表達(dá)載體和細(xì)胞系。
8.擴(kuò)增權(quán)利要求1所述抗稻瘟病基因中任一片段的引物。
9.權(quán)利要求1所述抗稻瘟病基因在培育抗病植物品種中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述抗稻瘟病基因中的15個(gè)或15個(gè)以上連續(xù)堿基的寡聚核苷酸在植物抗病相關(guān)分析中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種抗稻瘟病基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的抗稻瘟病基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)序列表中的SEQ ID №2；3)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；4)與序列表中的SEQ ID №1或SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。抗稻瘟病基因的編碼蛋白，是具有序列表中SEQ ID №3氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №3的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQID №3衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的基因?qū)ε嘤共≈参锲贩N，提高農(nóng)作物產(chǎn)量，擴(kuò)大作物種植面積具有重要意義。
文檔編號(hào)C07K14/405GK1629293SQ20031011843
公開(kāi)日2005年6月22日 申請(qǐng)日期2003年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月16日
發(fā)明者朱立煌, 陳學(xué)偉, 李仕貴, 徐吉臣 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所