專利名稱：一種質粒dna提取和純化方法及生產工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種從原核生物中提取和純化質粒DNA的方法及其生產工藝，是分子生物學的最基本的步驟之一，涉及了基因克隆、基因序列分析、核酸疫苗、基因治療和各種基因重組技術等領域。
背景技術：
質粒DNA的提取和純化是分子生物學的最基本的步驟之一，涉及了基因克隆、基因序列分析、核酸疫苗、基因治療和各種基因重組等領域。經典的從原核生物中提取和純化質粒DNA是分為三個步驟菌體裂解、質粒分離和純化。目前菌體裂解最常用的方法有兩個堿裂解法(Bimboim and Doly，Nucleic Acids Res.，71513-1523，1979)和煮沸裂解法。(Holmes and Quigley，Anal.Biochem.，114193-197，1981)。提取規模從小量制備(5毫升培養液)到大量制備(1升培養液)，一般可以得到1ug到1-3毫克的質粒DNA，對滿足實驗室分子克隆工作的需求已足夠。然而，隨著DNA疫苗和基因重組藥物研究和應用的快速發展，對重組質粒的需求量在不斷增加，常規的實驗室制備及其方法已很難滿足；另外一個不足是使用這兩種方法不僅成本高、產量低、質量差外、而且不易擴大規模。從而影響了后期工作的效率，目前稱其為DNA疫苗和基因重組藥物研究和應用瓶頸。目前還有一些大規模提取的方法是用各種類型的親和層析柱，提取效果較好但費用很高，也不易擴大規模。堿裂解法由于提取過程中要加入多種試劑，最終產品中存在試劑污染，產量和質量都不高；而煮沸裂解法雖然產量高，但操作復雜，裂解過程不易掌握，結果不穩定，污染不易去除。所以目前，許多核酸技術發展受制于大量制備質粒DNA技術不足。
發明內容
針對上述存在的問題，我們有針對性的對煮沸大提質粒的方法作了改進，其中改進了菌體裂解溫度、質粒分離和純化各個環節，最終解決了以上提到的問題，并使其可以順利地應用于生產實踐和規模化生產。我們的目的是用簡便的方法制備出大量符合品質要求的質粒DNA。
本發明的技術方案是通過以下措施來達到的1、工程菌進行高密度發酵后，利用中空纖維膜柱進行濃縮，收集濃縮菌液，而不是常規的高速離心來完成；2、使用TE溶液(10mM Tris-HCL，50mM EDTA，pH＝8.0)將濃縮菌液稀釋到OD600＝100后，加入終濃度優選為0.5～2％(重量體積比)的TritonX-100，0.1～0.5M氯化鈉和50～300微克/毫升的溶菌酶。
3、在優選為25～37℃，更優選為35～37℃的溫度下溫育，溫育時間優選為20～60分鐘，更優選為20～30分鐘，使其有效地進行反應；4、上述反應菌體通過在菌體裂解時的溫度從100℃煮沸溫度降低到更易于控制的50～80℃，優選為70～80℃裂解20～60秒，而該改進依然能夠很好地裂解細菌。
5、裂解后的菌液利用優選為400～1000目的濾膜分離上清液和裂解的菌體碎片及細菌染色體；6、在分離后的上清液中加入1/10總體積的3M NaAc(pH5.2)和0.6倍總體積的異丙醇沉淀核酸，并利用優選為100～400目網管中進行過濾分離。
7、并用70％乙醇清洗此沉淀物后。
8、干燥沉淀物后，加TE溶液進行溶解。
本發明是通過利用中空纖維膜柱將發酵后工程菌進行濃縮，收集濃縮菌液，而不是常規的高速離心來完成。也可通過利用切向流濾膜及裝置進行濃縮。
為使上述濃縮菌液的pH適宜裂解反應，本發明通過加入TE溶液(10mMTris-HCL，50mM EDTA，pH＝8.0)到上述濃縮菌液中，使其平衡并抑制其中的DNase活性。
為使上述濃縮菌充分裂解，在裂解前，本發明通過加入的溶菌液其成份為Triton X-100，終濃度優選為0.5～2％(重量體積比)；氯化鈉，終濃度優選為0.1～0.5M；溶菌酶，終濃度優選為50～300微克/毫升，并在適當溫度和反應時間下反應，使其成為原生質體。
本發明將制備原生質體的最適反應溫度和時間優選為25～37℃，更優選為35～37℃的溫度下溫育，反應時間優選為20～60分鐘，更優選為20～30分鐘而得原生質體，使其易于充分裂解。
為使菌體充分裂解，在裂解過程中，本發明通過將菌體裂解時的溫度從100℃煮沸溫度降低到更易于控制的50～80℃，優選為70～80℃。
為達到溫度均勻目的，本發明通過將菌體通過加熱管中，菌體在加熱管中的時間優選為10～60秒，更優選為20～30秒，該改進依然能夠很好地裂解細菌，同時在生產實踐中易于做到。
本發明通過將裂解后的菌液利用優選為200～1000目的濾膜，更優選為400～500目的濾膜，在壓力下分離出上清液，去掉裂解的菌體碎片及細菌染色體。
本發明將裂解后的菌液利用離心機在12000g離心分離出上清液，去掉裂解的菌體碎片及細菌染色體。
本發明通過對分離后的上清液中加入總體積1/10的3M NaAc(pH5.2)和0.6倍體積的異丙醇沉淀核酸，并在100～400目的濾膜，優選為100～200目的濾膜中，進行過濾分離出核酸沉淀物。
本發明通過70％乙醇清洗分離出核酸沉淀物后，進行干燥。
本發明優選通過氯仿和70％乙醇清洗分離出核酸沉淀物后，進行干燥。
本發明通過干燥核酸沉淀物后，加入適量的TE溶液進行溶解，而得到純化的質粒DNA產物。
因此，發明對煮沸大提質粒的方法作重大的改進，其中改進了菌體裂解溫度、質粒分離和純化各個環節，得到高產量和高純度的質粒DNA產品。
本發明利用中空纖維膜柱對發酵后工程菌進行有效的濃縮，而不使用高速離心機，從而避免了工業生產不易放大的問題。
本發明有效對濃縮菌體進行處理產生原生質，使得后一步菌體的裂解溫度降低到更易于控制的范圍，從而避免在工業生產中難于控制的煮沸溫度，也節約了能源。
本發明有效利用加熱管對原生質進行加熱處理，產生溫度均勻，反應充分，有效的克服了常規煮沸法中存在的裂解不充分的不足。
本發明能夠通過兩種不同濾膜對裂解后的菌液和異丙醇沉淀的核酸進行有效的分離，而不使用高速離心機，從而避免了工業生產不易放大的問題，同時提高了提取后質粒的產量和質量。
本發明的技術效果利用本發明提供的生產和使用方法不僅使分離和純化步驟易于控制和操作，同時也提高了提取后質粒的產量和質量，而且避免了分離和純化過程中復雜設備，所以易于實施和生產放大。
圖137℃溫育對細菌裂解的影響不經37℃溫育(第1道)，和經過37℃溫育10(第2道)，20(第3道)，30(第4道)，40分鐘(第5道)，分別在70℃煮30秒裂解XL1-blue細菌，發現37℃溫育20分鐘的裂解效果最好。
圖2不同溫度下裂解細菌獲得質粒比較37℃溫育20分鐘后，在不同的溫度50℃(第1道)，60℃(第2道)，70℃(第3道)，80℃(第4道)，90℃(第5道)，100℃(第6道)分別裂解細胞，經過比較，70℃～80℃之間，細菌已經可以很好地裂解。隨著裂解溫度的提高，細菌裂解后產生的RNA的量逐漸增加。
圖3溶菌酶用量的比較用TE將濃縮液OD600稀釋到100后，按每毫升菌液0.05毫克(第1道)，0.1毫克(第2道)，0.2毫克(第3道)，0.3毫克(第4道)的量加入溶菌酶，發現在OD600為100的情況下，0.05毫克溶菌酶可以對原生質體進行有效的裂解。
圖4利用濾膜洗滌去除RNA效果將分離后的上清加入異丙醇沉淀核酸，并在70％乙醇中，反復震蕩洗滌去除RNA等雜質。經70％乙醇洗滌(第1道)，未經70％乙醇洗滌(第2道)。
圖5大提質粒定量及酶切鑒定結果梯度稀釋大提質粒(第1至7道)，用標準Marker定量(M道)，每升發酵液提取質粒約95毫克圖5A。用EcoRI和XhoI對大提的pc3d-N質粒雙酶切，得到1200bp大小的條帶，與N基因大小相同(第2道)，第1道為Marker。用OD260/OD280進行純度測定，測得比值為1.91圖5B。
具體實施例方式
借助以下實施例對本發明作進一步描述，下面這些實施例是示范性的，而不是限制性的，可根據上述本發明的技術方案和實際情況，來確定具體的實施例1工程菌的發酵將質粒pc3d-N轉化XL1-blue感受態細胞，從AMP瓊脂平板上挑取一單菌落于5毫升LB(加適量抗生素)37℃培養至對數生長期。取1.5毫升培養物于150毫升LB(加適量抗生素)37℃培養過夜。將150毫升過夜培養物加入盛有3升LB培養基(加適量抗生素)的發酵罐內37℃發酵培養，發酵至5～6小時后流加補料400毫升。發酵15h后OD600不再有顯著增加時，停止發酵，測得OD600為45。
實施例2菌體收集將發酵液3.5L用蠕動泵泵入中空纖維膜柱中進行濃縮，濃縮后用200毫升TE(10mM Tris-HCL，50mM EDTA，pH＝8.0)沖洗菌體。濃縮后在濃縮液中加入等體積的TE繼續濃縮，3.5L發酵液最終濃縮得到350毫升濃縮液。
實施例3菌體收集將發酵液15L用蠕動泵泵入中空纖維膜柱中進行濃縮，濃縮后用500毫升TE(10mM Tris-HCL，50mM EDTA，pH＝8.0)沖洗菌體。濃縮后在濃縮液中加入等體積的TE繼續濃縮，15L發酵液最終濃縮得到750毫升濃縮液。
實施例4質粒提取與純化濃縮液中加入終濃度為0.1M的NaCl，終濃度為2％的Triton X-100，及每毫升濃縮液加入0.1毫克溶菌酶。
37℃溫箱溫育10～40分鐘，用磁力攪拌子低速攪拌。
用蠕動泵將反應液泵入50～70℃水浴中的加熱金屬管，控制蠕動泵轉速使反應液在加熱金屬管中加熱20～30秒，引出管置于冰浴中，使反應立即終止反應。
將反應液至于400～1000目濾膜過濾細胞裂解后產生的粘稠物。
上清中加入總體積1/10的3M NaAc(pH5.2)，加入0.6倍體積的異丙醇，充分混勻，室溫下放置10分鐘。
將反應液倒入100～400目的濾膜中，濾除上清液，然后放至于燒杯中，加入70％乙醇震蕩洗滌，回收核酸沉淀，室溫下干燥。用2ml～5ml TE(10mMTris-HCL，1mM EDTA，pH＝7.0)溶解核酸沉淀。在1％的瓊脂糖膠中對純化的核酸進行電泳鑒定。
實施例5質粒提取與純化濃縮液中加入終濃度為0.1M的NaCl，終濃度為2％的Triton X-100，每毫升濃縮液加入0.1毫克溶菌酶。
37℃溫箱溫育10～40分鐘，用磁力攪拌子低速攪拌。
用蠕動泵將反應液泵入50～70℃水浴中的加熱金屬管，控制蠕動泵轉速使反應液在加熱金屬管中加熱20～30秒，引出管置于冰浴中，使反應立即終止反應。
將反應液至于400～1000目濾膜過濾細胞裂解后產生的粘稠物。
上清中加入總體積1/10的3M NaAc(pH5.2)，加入0.6倍體積的異丙醇，充分混勻，室溫下放置10分鐘。
將反應液倒入100～400目的濾膜中，濾除上清液，然后放至于燒杯中，加入氯仿和70％乙醇震蕩洗滌，回收核酸沉淀，室溫下干燥。用2ml～5ml TE(10mM Tris-HCL，1mM EDTA，pH＝7.0)溶解核酸沉淀。在1％的瓊脂糖膠中對純化的核酸進行電泳鑒定。
權利要求
1.一種將發酵后工程菌進行濃縮、高溫裂解、質粒分離和純化的大規模制備和生產方法，其中包括如下步驟1)對發酵后工程菌進行濃縮，收集濃縮菌液。2)加入溶菌液進行反應。3)上述反應在25～37℃溫育10～60分鐘而得原生質體。4)將上述原生質體溶液通過加熱管使原生質體溫度上升到50～80℃使其原生質徹底裂解。5)將裂解后的菌體通過400～1000目的濾膜分離上清液和裂解液中的菌體碎片及細菌染色體。6)通過對分離后的上清液加入適量的NaAc和異丙醇沉淀其核酸，并在200～400目濾膜中進行過濾分離出核酸沉淀物。7)通過70％乙醇清洗此核酸沉淀物。8)干燥此核酸沉淀物。8)加入適量的TE溶液進行溶解，而得到質粒DNA產物。
2.如權利要求1所述的制備和方法中，濃縮菌通過以下方法得到對體積大于5升發酵后工程菌使用孔徑為0.2～0.4μ的中空纖維膜柱及裝置進行濃縮。
3.如權利要求1所述的制備和方法，濃縮菌通過以下方法得到對體積大于5升發酵后工程菌使用孔徑為0.2～0.4μ的切向流濾膜及裝置進行濃縮。
4.如權利要求1所述的制備和方法，濃縮菌通過以下方法得到對體積大于5升發酵后工程菌使用制備型離心機的進行濃縮。
5.如權利要求1所述的制備和方法中，菌體的裂解通過以下方法得到使用TE溶液(10mM Tris-HCL，50mM EDTA，pH＝8.0)將濃縮菌液稀釋到OD600＝100后，再加入的溶菌液其特征在于含有0.5～2％(重量體積比)的Triton X-100，0.1～0.5M氯化鈉和50～300微克/毫升的溶菌酶進行反應，反應在25～37℃溫育20～60分鐘而得原生質體，通過加熱管使原生質體溫度上升到50～80℃裂解20～60秒，使其原生質徹底裂解。
6.如權利要求1所述的制備和方法中，質粒DNA產物通過以下方法得到徹底裂解原生質體經12000×g下離心分離去除裂解液中的菌體碎片及細菌染色體而得到上清液，加入1/10總體積的3M NaAc(pH5.2)和0.6倍總體積的異丙醇于上清中沉淀其核酸，在100～400目濾膜中過濾分離出核酸沉淀物，并用70％乙醇清洗此沉淀物后，進行干燥，加入適量的TE溶液進行溶解，而得到純化的質粒DNA產物。
7.如權利要求1所述的制備和方法中，質粒DNA產物通過以下方法得到徹底裂解原生質體經400～1000目的濾膜分離去除裂解液中的菌體碎片及細菌染色體而得到上清液，加入1/10總體積的3M NaAc(pH5.2)和0.6倍總體積的異丙醇于上清中沉淀其核酸，在200～400目濾膜中過濾分離出核酸沉淀物，并用70％乙醇清洗此沉淀物后，進行干燥，加入適量的TE溶液進行溶解，而得到純化的質粒DNA產物。
8.如權利要求1所述的制備和方法中，質粒DNA產物通過以下方法得到徹底裂解原生質體經400～1000目的濾膜分離去除裂解液中的菌體碎片及細菌染色體而得到上清液，加入1/10總體積的3M NaAc(pH5.2)和0.6倍總體積的異丙醇于上清中沉淀其核酸，在200～400目濾膜中過濾分離出核酸沉淀物，并分別用氯仿和70％乙醇清洗此沉淀物后，進行干燥，加入適量的TE溶液進行溶解，而得到純化的質粒DNA產物。
全文摘要
一種從原核生物中提取和純化質粒DNA的方法及其生產工藝，其方法含有原核生物菌液濃縮、菌體裂解、質粒DNA分離和質粒DNA純化；其生產工藝是過濾分離法菌體、在溶菌酶作用下熱裂解菌體、膜過濾法分離和純化質粒DNA。本發明的技術效果利用本發明提供的方法及生產工藝不僅能夠有效的提高質粒提取產量和質量，而且制備過程簡單、易于實施。
文檔編號C07H1/06GK1546516SQ20031011715
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月4日 優先權日2003年12月4日
發明者王賓, 俞慶齡, 王 賓 申請人:中國農業大學