專利名稱：利用蘇云金芽胞桿菌s－層蛋白為載體在細胞表面展示目標蛋白的方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，具體涉及利用來源于蘇云金芽胞桿菌CTC菌株的S-層蛋白在細胞表面展示目標蛋白，或改善細胞表面結構或增強目標蛋白生物學功能，在眾多領域都具有應用潛力。
背景技術：
細胞表面展示是指通過遺傳操作的手段將外源大分子定位表達在細胞的表面以達到一定的研究和應用目的。多數情況下，表面展示是以構建融合蛋白的方式實現的，即以一定的方式將外源蛋白與菌體的某一表面蛋白相融合，借助后者的表面識別和定位功能將前者攜帶并定位在細胞的表面。將外源蛋白固定在細胞的表面可以直接用重組微生物進行后續的操作，免去了產物的提取，純化和重新折疊等一系列的操作。自80年代興起以來，表面展示工作取得了許多令人矚目的成績。
S-層蛋白是位于細胞外殼最外層的一類表面結構，生物圈中有S層的生物體普遍存在，尤其在古細菌和真細菌中，S層是最常見的表面結構之一。S層是由蛋白質或糖蛋白亞基組成的單分子晶體點陣，它們形成有孔的網格結構覆蓋在細胞表面。
到目前為止，用于表面展示的載體有很多種，但作為細胞表面蛋白的一個重要組成的S-層蛋白還很少被用于表面展示。直到人們對S-層蛋白的一些特點特別是與分揀錨定密切相關的結構有了較為清楚的認識之后，才有人用S-層作為展示的載體。
以S-層蛋白作為運載蛋白的表面展示工作最初也是在G-細菌中完成的。Bingle等人(2000年)利用無致病性的G-細菌——新月柄桿菌的S-層蛋白RsaA作為載體，在細胞表面成功展示了銅綠假單胞菌的表面抗原(Bingle W H，Elizabeth U-N，John F N，LindaG，Glasier，Randall T I and Smit J.Expression and testing of Pseudomonaaeruginosa vaccine candinate proteins prepared with Caulobacter crescentus S-layer protein expression system.Vaccine，2001，191406-1415)。
此外，Bingle等還在新月柄桿菌的S-層蛋白上嘗試了多個融合位點，結果表明有11個位點具有表面展示的能力。Mesnage等(1999)利用G+細菌炭疽芽胞桿菌的S-層蛋白在細胞表面展示了果聚糖蔗糖酶(Mesnage S，Tosi-couture E and Fouet A.Production andcell surface anchoring of functional fusion between the SLH motif of theBacillus anthracis S-layer protein and the Bacillus sbutillis levansucrase.MolMicrobiol，1999a，31927-936)。但由于炭疽芽胞桿菌的致病性限制了其應用，所以開辟一個安全可靠應用領域寬闊的S-層蛋白表面展示系統尤為需要。
孫明等(2001)克隆了世界上首例來自于蘇云金芽胞桿菌CTC菌株的S-層蛋白的基因(孫明，朱晨光，喻子牛.類似S-層蛋白的蘇云金芽胞桿伴胞晶體蛋白基因的克隆，微生物學報，2001，41(2)141-147)，其基因序列已公布在美國國家生物技術信息中心網站上(GeneBank登錄，登錄號AJ012290)。利用蘇云金芽胞桿菌的S-層蛋白進行表面展示有很多優點。首先，S-層蛋白的表達量高，一般可達整個細胞蛋白的10-15％。其次，S-層蛋白具有高效的信號肽和表面定位結構，能夠準確的定位在細胞表面。S-層蛋白容許外源序列的插入，重組的S-層蛋白的生物合成和表面定位都沒有受到明顯的影響。由于蘇云金芽胞桿菌作為傳統的殺蟲生物制劑已在世界各地得到廣泛應用，利用其本身的S-層蛋白進行表面展示或改善細胞表面結構或增強目標蛋白生物學功能，不僅克服了現有同類技術安全性方面的隱憂，而且能拓寬蘇云金芽胞桿菌的應用領域。
發明內容
本發明的目的在于利用蘇云金芽胞桿菌CTC菌株的S-層蛋白作為表面展示載體，并利用S-層蛋白的N-端信號肽以及錨定序列在細胞表面展示目標蛋白，以改善細胞表面結構或增強目標蛋白生物學功能，達到研究和應用的目的。
本發明是這樣實現的一種利用S-層蛋白在細胞表面展示目標蛋白的方法，按如下步驟實現1)S-層蛋白來源于蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis，B.t，菌株編號CTC；2)溶合蛋白基因的構建將所說的目標蛋白基因置于S-層蛋白N-末端第210個氨基酸對應的核苷酸序列下游；3)融合蛋白基因在宿主菌中表達，實現方式可以將其置于載體上；4)所說的宿主菌為蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis B.t。
利用S-層蛋白在細胞表面展示目標蛋白的方法，該方法可以在抗胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1方面的應用。
利用S-層蛋白在細胞表面展示目標蛋白的方法，該方法還可以在重金屬的吸附方面的應用。
更詳細技術方案如以下所述能產生S-層蛋白的蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis，B.t，菌株編號CTC；它包括以下特征a、幕蟲亞種；b、產生圓形伴胞晶體，伴胞晶體蛋白為100kDc、能產生S-層蛋白。
蘇云金芽胞桿菌CTC菌株S-層蛋白
a.作為表面展示載體b、S-層蛋白的分子量大小為83kDa，N-末端第34至210氨基酸依次為FPDVPADHWGIDSINYLVEKGAVTGNDKGMFEPGKELTRAEAATMMAQILNLPIDKDAKPSFADSQGQWYTPFIAAVEKAGVIKGTGNGFEPNGKIDRVSMASLLVEAYKLDTKVNGTPATKFKDLETLNWGKEKANILVELGISVGTTADKWEPKKTVTKAEAAQFIAKTDKQFGTC、融合蛋白基因的構建將所說的(被研究的)目標基因置于S-層蛋白N-末端第210個氨基酸對應的核苷酸序列下游，并與下游的Xbal酶切位點連接；d、將融合蛋白基因在宿主菌中表達，實現方式可以將其置于載體上例如pBMB982-304質粒；e、宿主菌蘇云金芽胞桿菌。
利用蘇云金芽胞桿菌的S-層蛋白作為載體，是一種新的表面展示系統，將目標蛋白展示到細胞表面，或優化細胞表面結構或改善和增強目標蛋白生物學功能。本發明與已有技術比較，不僅克服了現有技術安全性方面的隱患，而且拓寬了蘇云金芽胞桿菌的應用領域，例如在抗胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1方面和在重金屬的吸附等方面的應用。
圖1質粒ctc片斷含有S-層蛋白的N-端第34至第210個氨基酸對應的核苷酸序列，選擇上面的Xbal位點為連接位點。目的基因片斷在此處與S-層蛋白基因連接。
圖2質粒ctc是將目標基因6His選用Xbal-HincII位點與pBMB982-304質粒“連接的產物”圖3質粒ctc是將目標基因6His選用Xbal單酶切位點與pBMB982-304質粒[1]正向連接得到的產物。
圖4質粒ctc是將目標基因aii選用Xbal-sphI酶切位點與pBMB982-304質粒[1]連接得到的產物。
圖5是本發明的重組質粒pBMBSM-304的構建流程圖。
圖6含質粒pBMBSHI的重組菌與Ni-NTA-瓊脂糖微球的吸附作用的示意圖。
圖中熒光顯微照片(左)和相應的光學顯微照片(右)。A，171；B，171/pBMBSHI1；C，171/pBMBSHI2；D，171/pBMBSHI3。
圖7顯示Ni-NTA-瓊脂糖微球對重組菌株BMBSMC的吸附作用。
左圖為普通光學顯微照片，右圖為熒光顯微照片。
圖8重組菌BMBSMC對游離Cd2+的吸附。
圖9A，B，C三個平板分別代表SCG1與待測菌株混合培養0.5h、2h、4h。每個平板上1為SCG1+無菌水；2為SCG1+4Q7/pSAII；3為SCG1+4Q7；4為4Q7+無菌水
具體實施例方式
實施例1(一)融合蛋白基因的構建1、選取要研究的對象即目標基因，2、回收目標基因片段從所要研究的對象上回收目標基因片段，采用Sangon公司的回收試劑盒。瓊脂糖凝膠電泳結束后，EB染色，在長波紫外燈上迅速切下目的條帶，裝入Eppendorf管離心估計體積，加入700μl的solutionI和10μl的silver beads，60℃溶膠10分鐘并使silverbeads均勻懸浮，離心(10,000r/min離心10sec)，棄上清，用500μl的solutionII洗滌沉淀3次，離心(10,000rpm離心10sec)，棄上清，用濾紙吸干管壁上殘液。加入5-10μl的Elution buffer于37℃解吸2min，10,000r/min離心半分鐘，上清即含目的片段。可重復解吸兩次，上清合并，電泳檢測回收DNA濃度。
3、將目標基因正向與pBMB982-304質粒(孫明，朱晨光，喻子牛.類似S-層蛋白的蘇云金芽胞桿伴胞晶體蛋白基因的克隆。微生物學報，2001，41(2)141-147)，如圖1所示，可以采用兩種方式(1)將pBMB982-304質粒用XbaI-HincII酶切，將目標基因也用這兩個酶切，回收純化得到含有XbaI-HincII位點目標片斷，將此片斷與切割后的質粒用T4DNA連接酶在37℃連接過夜。
(2)將pBMB982-304質粒用XbaI-sphI酶切，將目標基因也用這兩個酶切，回收純化大片段回收純化得到含有XbaI-sphI位點目標片斷，將此片斷與切割后的質粒用T4DNA連接酶在37℃連接過夜。
4、得到蘇云金芽胞桿菌重組菌接種受體菌于5ml LB培養基1過夜培養，再按1/100轉接50mL LB培養液，于30℃以200r/min振蕩培養至OD650的值為0.2～0.3時，離心收集菌體，并用SG緩沖液(272mmol/L蔗糖，15％(v/v)甘油)洗滌菌體4次，再用適量(2ml)SG緩沖液懸浮菌體，使其菌液濃度為1×1010個細胞/mL。取200μL菌懸液于一個0.2cm的電轉化杯(Bio-Rad公司產品)中，加入一定濃度的供體質粒DNA(一般3～5μL)，混勻后在冰浴上放置10min，用GenepulserTM型電脈沖儀(Bio-Rad公司產品)進行電脈沖。電脈沖參數選定為脈沖場強V＝1.5kV/cm，電容C＝25μF，阻抗R＝200Ω，脈沖時間G＝4.0～4.8ms。電脈沖完畢后，加入1.0mL LB培養液于電擊杯中，并轉進1.5ml epp管在30℃以150r/min恢復培養2h后，涂布LB瓊脂抗性平板，置30℃培養。紅霉素為25ug/ml。
(二)表面展示的檢測1、將上述步驟得到的含有目標基因的重組菌進行融合蛋白的SDS-PAGE檢測菌體蛋白由以下方法制備BHI培養基(Mesnage S，Tosi-couture E and Fouet A.Production and cell surface anchoring of functional fusion between the SLH motilof the Bacillus anthracis S-layer protein and the Bacillus sbutillislevansucrase.Mol Microbiol，1999a，31927-936)培養菌體至營養期，取1mL培養物收集菌體，用1mol/LNaCl洗滌菌體3次，再用雙蒸水洗滌菌體3次，加入50-100μL雙蒸水制成懸液，加等量兩倍體積樣品緩沖液混勻，沸水中煮2-3min，1000rpm離心2min，上清液上樣。
2、SDS-PAGE凝膠的制備取30％凝膠母液(29.2％丙烯酰胺，0.8％甲叉雙丙烯酰胺)4mL，4倍分離膠緩沖液(1.5mol/L Tris·HCl，pH8.8，0.4％SDS)3mL，ddH2O.5mL，10％過硫酸銨100μL，TEMED 10μL，混勻后注入垂直板電泳槽，加封一層水飽和正丁醇，于室溫下聚合3h以上或聚合過夜，即為10％的分離膠。傾去正丁醇，蒸餾水沖洗1-2次，取30％凝膠母液0.5mL，4倍濃縮膠緩沖液(0.5mol/L Tris·HCl，pH6.8，0.4％SDS)1.25mL，ddH2O 3mL，10％過硫酸銨50μL，TEMED 5μL，混勻后注入分離膠上層，插入電泳梳板，于室溫下聚合2～3h。
3、染色及脫色加入電泳緩沖液(0.192mol/L甘氨酸，25mmol/L Tris·HCl，pH8.3，0.1％SDS)拔出電梳板，上樣20-40μL樣品，以30-40V電壓電泳至溴酚藍出上樣孔后，用100V電壓電泳至溴酚藍帶至凝膠底部1cm處停止電泳。卸出凝膠，用染色液(25％(v/v)異丙醇，10％(v/v)冰乙酸，0.1％(w/v)考馬斯亮藍R-250)染色3h以上，用自來水漂洗凝膠1-2次，再用脫色液10％(v/v)冰乙酸和12.5％異丙醇脫色，更換脫色液2～3次，至加入的脫色液脫色后不呈色為止。
4、融合蛋白表面展示的檢測根據目標蛋白的理化及生物學特性作Ni-NTA-瓊脂糖微球吸附實驗實驗和抗病實驗(參見以實施例2)。
實施例2(本發明可應用的領域舉例)利用蘇云金芽胞桿菌的S-層蛋白作為載體，是一種新的表面展示系統，將目標蛋白展示到細胞表面，或優化細胞表面結構或改善和增強目標蛋白生物學功能。本發明與已有技術比較，不僅克服了現有技術安全性方面的隱患，而且拓寬了蘇云金芽胞桿菌的應用領域(例如在抗病方面，在重金屬的吸附方面)，具有巨大的研究與應用前景。
1)、多聚組氨酸肽的表面展示引物設計HisupGATATCTCTAGAGTCGACCCAAGCGGAACATCACCATCATCACCATHisdownAGCCAATCTAGAGTCAGCTGTCTCGAGCCAGAATGGTGATGATGGTGATG反應條件為94℃30s，56℃30s，72℃30s，共10個循環；94℃30s，68℃30s，72℃30s，共20個循環；72℃5min。
設計引物，并在引物的兩段引入合適的酶切位點。通過交疊PCR擴增得到編碼(6His)的寡核苷酸片段命名為6His。本發明采用兩種不同的插入位點構建融合基因。第一種方式是選用XbaI-HincII位點去掉pBMB982上S-層基因C-端的一部分，而以編碼一個(6His)的寡核苷酸片段取代，構建得到攜帶一個六聚組氨酸的重組質粒pSHI1P。然后用EcoRI和SphI將pSHI1P上包含S-層與一個(6His)的融合基因部分插入穿梭載體pHT304上，得到重組質粒pBMB-SHAI(圖2)，同樣的方法依次獲得了帶有(6His)2，(6His)3的質粒pBMBSHI2，pBMBSHI3。第二種融合方式是將一個6His的寡核苷酸片段從pBMB982-304上S-層基因內的XbaI位點處插入，挑選到一個正向插入的重組質粒pBMB-SHBI(圖3)。將這些重組質粒分別導入171/pCSA和4Q7/pCSA中，SDS-PAGE電泳結果表明pSHI1、pSHII1、pSHII2在受體菌中都得到了一定的表達。同時對重組菌進行了Ni-NTA-瓊脂糖微球吸附實驗(如圖6所示)。
2)、Aii抗病蛋白表面展示N-乙酰高絲氨酸內酯(N-acyl-homoserine lactones，AHLs)，是一類數量感知(quorum-sensing)系統中的信號分子，它參與誘導調控許多植物病原菌致病基因的表達。2002年Dong等和Lee等相繼報道了在蘇云金芽胞桿菌中廣泛存在著aiiA基因(Dong Y H，Gusti A R，Zhang Q，et al.Identification of Quorum-Quenching N-acyl homoserinelactonases from Bacillus species.Appl Environ Microbiol，2002，68(4)1754-1759；Lee S J，Park S Y，Lee J J，et al.Genes encoding the N-acyl homoserinelactone-degrading enzyme are widespread in many subspecies of Bacillusthuringiensis.Appl Environ Microbiol，2002，68(8)3919-3924)，其表達蛋白可使AHLs分子失活，從而使胡蘿卜軟腐歐文氏菌對植物產生的軟腐病害得以減弱(MesnageS，Tosi-couture E and Fouet A.Production and cell surface anchoring offunctional fusion between the SLH motif of the Bacillus anthracis S-layerprotein and the Bacillus sbutillis levansucrase.Mol Microbiol，1999a，31927-936；J薩姆布魯克，E F弗里奇，T曼尼阿蒂斯著。分子克隆實驗指南，第二版，北京，科學出版社，1995年)。但是Aii抗病蛋是一種胞內蛋白不分泌到細胞外，本發明利用利用S-層蛋白將Aii抗菌蛋白帶到胞外并錨定在細胞表面，進而有利于與AHLs分子接觸，更有效的降解，起到更好的抗病效果(圖9)引物設計aii-upCGGCTGTAGACATGACCGTAAAGAAGCTTTAaii-downAGCTGCATGCCTATGTATACTCCGGGAACA反應條件為94℃5min；94℃1min，62℃1min，72℃1min，共30個循環；72℃5min設計引物，以質粒pGEMT-aii為模板，PCR擴增得到了Aii蛋白的編碼基因，利用兩端的XbaI和SphI位點將它插入pBMB982-304S-層基因C-端的相應位點內，得到重組質粒pBMB-SAII(圖4)。將pBMB-SAII轉進4Q7/pBMB-CSA中。SDS-PAGE結果顯示表達了預期的蛋白條帶。在CTC-Aii融合蛋白對蔬菜軟腐病的抑制實驗中，4Q7/pBMB-SAII與軟腐病致病菌胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1混合作用0.5小時，軟腐病仍有一定程度的發生；混合作用2小時，能夠較好的抑制軟腐病的發生，抑菌效果明顯優于出發菌株4Q7/pBMB-CSA。
3).金屬硫蛋白的表面展示金屬硫蛋白(Metallothionein)，1957年，美國哈佛大學Margoshes和Vallee首次從馬腎中發現了一種能結合Cd2+的小分子量蛋白(Margoshes M，Vallee B.A cadmium proteinfrom equine kidney cortex.J Am Chem Soc，1957，794813-4814)，因富含半胱氨酸，有大量能結合重金屬離子(如Zn2+，Cd2+，Cu2+，Hg2+和Ag+)的巰基，所以稱為金屬硫蛋白，簡稱MT(Dong Y H，Gusti A R，Zhang Q，et al.Identification of Quorum-Quenching N-acyl homoserine lactonases from Bacillus species. Appl EnvironMicrobiol，2002，68(4)1754-1759)。S-層蛋白與MT的融合蛋白在細胞表面展示有望開發全細胞吸附劑，用作礦物質的富集和重金屬廢水的凈化。
引物設計smtA的上游引物5’GAGATCTAGATATGACCTCAACA 3’smtA的下游引物T7終止子序列，即5’GCTAGTTATTGCTCAGCGG 3’以克隆有藍細菌金屬硫蛋白基因smtA(GenBank登錄號為X64585)的質粒pET-29a-smtA為模板，PCR擴增引入了XbaI位點的smtA結構基因，獲得符合預期大小(0.32Kb)的特異性擴增產物。回收該產物，通過XbaI和HincII位點直接克隆到pBMB982-304上，得到含融合基因slh/smtA的重組質粒pBMBSM-3049(如圖5所示)。金屬硫蛋白含有豐富的巰基，因而能螯合大量的金屬離子。通過MT與Ni2+間的螯合作用，表面展示金屬硫蛋白的重組菌就可以被Ni2+標記了的Ni-NTA-瓊脂糖微球顆粒所吸附。受體菌BMB171、重組菌BMBSMC分別接種于BHI、BHI+Em/Tc的液體培養基中，30℃搖床培養約12h。樣品處理后經熒光染色鏡檢。結果如圖6。受體菌BMB171中，只能看到零散的發光菌體，而無法看到瓊脂糖微球；而重組菌BMBSMC的樣品中，瓊脂糖微球的輪廓依稀可辨，表明絕大部分菌體已被吸附于瓊脂糖微球的表面(如圖7、8所示)。
為了翔實表現重組菌BMBSMC對重金屬離子的吸附能力，又以游離的鎘離子為底物進行了測試。結果見表1及圖7。表面展示金屬硫蛋白的重組菌能吸附6.58×107個鎘離子/每個細胞，而受體菌BMB171僅能吸附1.57×107個鎘離子/每個細胞，重組菌的吸附能力約為受體菌的4倍(如圖8所示)。
權利要求
1.一種利用S-層蛋白在細胞表面展示目標蛋白的方法，按如下步驟實現1)S-層蛋白來源于蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis，B.t，菌株編號CTC；2)融合蛋白基因的構建將所說的目標蛋白基因置于S-層蛋白N-末端第210個氨基酸對應的核苷酸序列下游；3)融合蛋白基因在宿主菌中表達，實現方式可以將其置于載體上；4)所說的宿主菌為蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis，B.t。
2.權利要求1所述方法的應用，其特征在于在抗胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1方面的應用。
3.權利要求2所述的應用，其特征在于在重金屬的吸附方面的應用。
全文摘要
本發明屬于分子生物學領域，具體涉及利用來源于蘇云金芽胞桿菌CTC菌株的S－層蛋白在細胞表面展示目標蛋白的方法，本發明用以改善細胞表面結構或增強目標蛋白生物學功能，在眾多領域都具有應用潛力。發明的具體步驟包括將所說的目標蛋白基因置于S－層蛋白N－末端第210個氨基酸對應的核苷酸序列下游；融合蛋白基因在宿主菌如蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis B.t中表達，實現方式可以將其置于載體上。與已有技術比較，本發明不僅克服了現有技術安全性方面的隱患，而且拓寬了蘇云金芽胞桿菌的應用領域，例如在抗病方面，在重金屬的吸附方面，具有重要的研究與應用前景。
文檔編號C07K14/195GK1618977SQ20031011141
公開日2005年5月25日 申請日期2003年11月19日 優先權日2003年11月19日
發明者孫明, 喻子牛, 李林, 陳守文, 王莉, 劉欣, 吳懷光 申請人:華中農業大學