專利名稱：一種抑制白細胞介素-4，刺激g干擾素的免疫調節劑及制備方法
技術領域：
本發明屬于免疫學、化學和免疫藥理學的交叉研究領域，更具體涉及一種抑制白細胞介素-4刺激γ干擾素的免疫調節劑，在臨床上增強細胞免疫的抗胞內菌，抗病毒和寄生蟲的感染的藥物或作為抗移植排斥反應藥物。同時涉及該免疫調節劑的制備方法。
背景技術：
N-五氟芐基-1-脫氧野尻霉素(5F-DNM)是一種結構清楚的小分子免疫調節劑，與當今使用的抗排斥反應藥物和免疫調節劑在結構上無任何相似性。目前現有的免疫調節劑或是化學合成的，或是微生物制劑，生物制劑或中草藥等成分提取物，成分復雜，機制不清楚。按照WHO的標準，選擇一種化合物作為免疫調節劑的基本條件是①化學成分明確；②易于降解；③無致癌或制突變性；④免疫調節作用適中；⑤無毒副作用。已知現有的免疫抑制劑環孢素A(cyclosporinA，CYA)(一種真菌提取物)相比，環孢素A有較大的毒副作用。
發明內容
本發明的目的是在于提供一種抑制白細胞介素-4刺激γ干擾素的免疫調節劑，此調節劑分子量小(MW342.25)，具有對細胞無毒，能有效地降低免疫分子白細胞介素-4的分泌，刺激γ干擾素的分泌，對CD8T淋巴細胞有一定增強作用和對CD4T淋巴細胞有一定抑制作用。
本發明的另一目的涉及該免疫調節劑的制備方法。
為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案本發明的小分子免疫調節劑的合成方法是將5mg～18mg的脫氧野尻霉素(DNM，1-deoxynojirimycin)與25～35mg的五氟芐基溴(N-pentafluorobenzyl)混合于DMF4～9mL試劑中。此混合物于20-30℃下攪拌20分鐘至50分鐘，然后加于10～30mg，碳酸銫(CsCO3)。將混合物于25～35℃攪伴16至25小時，用TLC/紫外線監測。混合物靜置反應40分鐘至90分鐘，待出現白色沉淀，過濾去除沉淀，真空抽干母液，得到白色固體。進一步用C-18柱子純化，溶劑為異丙醇/H2O/NH3.H2O＝190/10/1，20-30℃蒸干溶劑，即得到純化的產品。采用該化合物的結構式是
本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果其結構清楚，分子量小，對細胞無毒。效果是可抑制白細胞介素-4的分泌，增強γ干擾素的產生，因而能用作臨床上增強細胞免疫的抗胞內菌，抗病毒和寄生蟲的感染和抗移植物的排斥的藥物。
圖1新型小分子免疫調節劑(5F-DNM)對小鼠脾臟細胞分泌白細胞介素-4(IL-4)的抑制，并且隨著藥物濃度的增大，抑制能力增強，呈劑量依賴關系。分離小鼠脾臟細胞，調整至5×106/ml。以每孔加5×105細胞至96孔板中，然后加不同濃度的5F-DNM藥物至每空孔中，于37℃下，5％CO2溫育72h。收集上清，2000g離心5min，檢測上清，用IL-4試劑盒檢測(晶酶公司)。
圖2新型小分子免疫調節劑(5F-DNM)刺激小鼠脾臟細胞分泌γ干擾素，并且隨著藥物濃度的增大，刺激能力增強，呈劑量依賴關系。分離小鼠脾臟細胞，調整至5×106/ml。以每孔加5×105細胞至96孔板中，然后加不同濃度的5F-DNM藥物至每空孔中，于37℃下，5％CO2溫育72h。收集上清，2000g離心5min，檢測上清，用γ干擾素試劑盒檢測(晶酶公司)。
圖3流式細胞儀分析藥物5F-DNM與環孢素A，以及陰性對照分別對正常人淋巴細胞CD4T和CD8T的作用比較。新鮮分離的人外周血單個核細胞100μl(1×106/ml)經用藥不同處理，與5μlFITC-CD4抗體與5μlPE-CD8抗體在室溫暗處反應20分鐘，上樣檢測，收集2000個細胞分析。流式細胞儀為ALTRA EPICS(COULTER)。
其中圖3A對照組正常人淋巴細胞圖3B 10μM 5F-DNM作用后的人淋巴細胞圖3C 10μM環孢素A作用后的淋巴細胞具體實施方式
根據化合物結構式，其具體步驟如下將10mg的脫氧野尻霉素DNM(1-deoxynojirimycin)與32mg的五氟芐基溴(N-pentafluorobenzyl)混合于DMF(5mL)試劑中。此混合物于30℃下攪拌30分鐘，然后加于21mg碳酸銫(CsC03)。將混合物于30℃攪伴18小時，用TLC/紫外線監測。混合物靜置反應60分鐘，待出現白色沉淀，過濾去除沉淀，真空抽干母液，得到白色固體。進一步用C-18柱子(溶劑為異丙醇/H2O/NH3.H2O＝190/10/1)純化，25℃蒸干溶劑，即得到純化的產品。合成免疫調節劑的化合物，稱為5-氟地恩們，或化學名稱N-五氟芐基-1-脫氧野尻霉素(5F-DNM)。
取小鼠脾臟浸泡于無血清的RPMI-1640培養基中，并用鋼絲網碾磨。再用200目的尼龍網過濾。濾液2000g離心10min，然后棄上清。沉淀溶于5ml pH7.2 Tris-NH4Cl，并于37℃反應6～10min以裂解細胞，然后離心2000g，10min，將細胞沉淀溶解于含有10μg/ml，10％新生小牛血清的RPMI-1640培養基中。數細胞數，調整細胞濃度至5×106/ml。以每孔加5×105細胞至96孔板中，然后加不同濃度的5F-DNM藥物至每空孔中，于37℃下，5％CO2溫育72h。收集上清，2000g離心5min，上清待檢測。
將上述得到的上清用IL-4和IFN-γ試劑盒檢測(晶酶公司)。按照試劑盒步驟，96孔板用孔板用anti-IL-4或anti-IFN-γ包被，不同濃度的樣品和IL-4或IFN-γ標準品(500、250、125、62.5、31.25、15.63pg/ml)加入至每孔中，20-25℃溫育120min，用磷酸緩沖液洗板5次，加入100μl biotin-標記的anti-IL-4或anti-IFN-γ至每孔中，于20-25℃溫育60min。再洗板5次，加入100μl HRP-streptoavidin至每孔中，于20-25℃溫育30min。再洗板5次，加入HRP酶的底物，并測顏色變化OD450nm。用已知濃度的IL-4或IFN-γ作標準曲線，根據標準曲線確定樣品的濃度。見表1，2和圖1、2。
表1.新型小分子免疫調節劑(5F-DNM)對白細胞介素-4(IL-4)的抑制作用，并且隨著藥物濃度的增大，抑制能力增強，呈劑量依賴關系
**代表藥物與未加藥對照組相比有顯著差異，p＜0.05，各值代表至少三次獨立實驗的平均值表2.新型小分子免疫調節劑(5F-DNM)增強小鼠脾臟細胞IFN-γ的分泌，并且隨著藥物濃度的增大，分泌能力增強，呈劑量依賴關系
**代表藥物與未加藥對照組相比有顯著差異，p＜0.05，各值代表至少三次獨立實驗的平均值5F-DNM的細胞毒性的檢測采用細胞毒性檢測試劑盒(Promega)。按照試劑盒的步驟定量檢測漿膜破損的細胞釋放至培養基上清中細胞質酶LDH(lactate dehydrogenase)。結果證明5F-DNM對細胞無毒性作用。見表3。
表3.藥物5F-DNM對細胞沒有細胞毒作用Drugs(μM) ％Cytotoxicity無藥 0255.66±0504.60±3.29100 3.69±5.03采用流式細胞儀檢測發現10μM 5F-DNM對CD8T具有一定增強作用，對CD8T細胞從正常23％百分率增至31.3％，而10μM環孢素A對CD8T細胞無作用(正常CD8T為23％，10μM環孢素A作用后為25％)；10μM 5F-DNM對CD4T具有一定抑制作用，從正常CD4T 52％百分率降為19％，比環孢素A對CD4T抑制作用弱，10μM環孢素A對CD4T細胞，從正常CD4T 52％百分率降為為3.95％，與已知的對CD4T細胞選擇性的抑制劑環孢素A(cyclosporin A，CYA)相比，免疫調節作用適中。見圖3A、3B、3C。
權利要求
1.化合物的結構式為
2.根據權利要求1所述的化合物，其特征是抑制白細胞介素-4，刺激γ干擾素的分泌，對CD8T淋巴細胞有一定增強作用，而對CD4T淋巴細胞有一定抑制作用，是一種選擇性免疫調節劑，且對細胞無毒。
3.權利要求1所述的化合物，該化合物的制備方法包括下列步驟A、將5mg-18mg的脫氧野尻霉素與25-35mg五氟芐基溴混合于DMF 4-9mL試劑中；B、將上述混合物于20-30℃下攪拌20-50分鐘，加入20-30mg碳酸銫；C、將步驟B的混合物于25-35℃下攪拌16-25小時，用TLC/紫外線監測；D、將混合物靜置反應40-90分鐘，待出現白色沉淀，過濾去除沉淀，真空抽干母液，得白色固體；E、采用C-18柱子純化，溶劑為異丙醇/H2O/NH3.H2O＝190/10/1，20-30℃蒸干溶劑，得到純化產品。
全文摘要
本發明公開了一種抑制白細胞介素－4，刺激γ干擾素的免疫調節劑及其制備方法。將脫氧野尻霉素與五氟芐基溴為原料合成免疫調節劑的化合物，該化合物具有抑制白細胞介素－4的產生，刺激γ干擾素的分泌的功能，對CD8T淋巴細胞有一定增強作用，而對CD4T淋巴細胞有一定抑制作用，是一種選擇性免疫調節劑，且證明對細胞無細胞毒作用。可用作為增強細胞免疫和降低體液免疫的藥物，在臨床上可作為增強細胞免疫的抗胞內菌，抗病毒和寄生蟲的感染和抗移植物的排斥的藥物。化合物結構式如圖。
文檔編號C07D211/40GK1528747SQ20031011125
公開日2004年9月15日 申請日期2003年10月21日 優先權日2003年10月21日
發明者章曉聯, 周翔, 謝鵬, 葉佳濤, 劉敏 申請人:武漢大學