專利名稱：注射用人胎盤核糖核酸的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種核糖核酸的制備方法，特別是涉及一種注射用人胎盤核糖核酸的制備方法，包括從人體胎盤提取核糖核酸的方法和配制注射用人胎盤核糖核酸的方法。
背景技術：
核糖核酸RNA具有很高的生物活性作用，它能激活T淋巴細胞，產生大量淋巴因子和殺傷細胞，以增強人體細胞免疫功能，還能激活B淋巴細胞，以增強人體體液免疫水平。可用于治療免疫功能低下有關的疾病對慢性支氣管炎有顯著的療效，并可作為治療惡性腫瘤的輔助用藥。同時核糖核酸RNA能增進肝細胞蛋白質合成，調節氨基酸代謝，促進病變肝細胞恢復正常，降低血清谷丙轉氨酶水平，改善肝炎患者血清蛋白電泳。臨床用于慢性遷延性肝炎、慢性活動性肝炎及肝硬變的治療。
長期以來，核糖核酸RNA從人體的健康脾臟提取，由于脾臟為人體重要器官，而被禁止。因此人類開始從動物的淋巴結、脾臟、肝臟、胎盤等器官中或從植物中提取核糖核酸RNA，近年來還開始利用微生物、酵母發酵法生產核糖核酸。從動物的器官或從植物中提取核糖核酸RNA的方法，一般是先將組織勻漿、離心后分離出的細胞核經裂解后用酚、氯仿、異戊醇除蛋白、鈍化，乙醇沉淀最后制得的。這種提取方法普遍存在收率較低且RNA純品的活性較低；提取設備較復雜；使用的試劑苯酚、氯仿、異戊醇等毒性較大；需消耗大量的有機溶劑等缺陷。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是，克服現有技術存在的缺陷，提供一種注射用人胎盤核糖核酸的制備方法，制備的核糖核酸RNA活性高、純度高、毒性小，更容易被人體吸收。
本發明解決上述問題所采用的技術方案是該注射用人胎盤核糖核酸的制備方法，其特點是所述的制備方法包括從人體胎盤提取核糖核酸的方法和配制注射用人胎盤核糖核酸的方法，從人體胎盤提取核糖核酸的方法包含以下步驟A、配制試劑步驟
配制0.1mol/l醋酸鹽緩沖液、酚飽和緩沖液、緩沖液飽和酚、0.3mol/l醋酸鹽緩沖液、0.1mol/l醋酸鹽洗液和生理鹽水；B、破碎粗提步驟a、取新鮮或冰凍人體胎盤，用去離子水洗凈，去除羊膜、臍帶、大血管；b、將清洗后的胎盤組織剪碎，加4～6倍重量的酚飽和緩沖液和4～6倍重量的緩沖液飽和酚后，破碎得胎盤組織勻漿液；c、進行熱酚處理，將勻漿液置于50～80℃水浴中攪拌10～20分鐘后，迅速移入-20～-10℃鹽水浴中速冷至0～10℃；C、精提分離步驟a、將經熱酚處理后的勻漿液進行離心分離，吸取上清液放入冰箱0～10℃保存，并收集離心分離出來的酚和蛋白層；b、加入酚和蛋白層重量的1/2～2/3倍量的酚飽和緩沖液，攪拌10～15分鐘后，進行離心分離，吸取上清液與前“a”操作的清液合并存放，并收集分離出來的酚和蛋白層；c、加入合并清液重量的1/2～2/3倍量的緩沖液飽和酚，攪拌10～15分鐘后，進行離心分離，吸取上清液，重復此操作，直至上清液和酚層之間無蛋白或極小量蛋白，收集上清液；d、取收集的上清液，按上清液重量的5％～8％的量加入醋酸鉀，待醋酸鉀溶解后加其重量的2～3倍量的-10～-20℃無水乙醇，靜置于-20℃環境下8～14小時；e、進行離心分離，棄去上清液，收集沉淀即核糖核酸RNA粗制品；D、純化步驟a、將RNA粗制品按每100克加50～80ml的0.3mol/l醋酸鹽緩沖液，使其溶解，進行離心分離，棄去沉淀物，收集上清RNA溶液，加上清RNA溶液重量的2～3倍量的-10～-20℃無水乙醇，置于-20℃環境中1～2小時；b、進行離心分離，棄去上清液，收集沉淀物，先加入等重量的0.1mol/l醋酸鹽洗液攪成糊狀后，再加入沉淀物重量的6～8倍量的0.1mol/l醋酸鹽洗液攪勻；c、再次進行離心分離，棄去上清液，收集沉淀物，先加入等重量的0.1mol/l醋酸鹽洗液攪成糊狀后，再加入沉淀物重量的6～8倍量的0.1mol/l醋酸鹽洗液攪勻，進行離心分離，棄去上清液，得RNA純品后加等重量的0.1mol/l醋酸鹽洗液保存在-20℃環境中；d、將保存的RNA進行離心分離，棄上清液，收集沉淀物即RNA純品，吹干后，保存-20℃環境中。
本發明所述的配制注射用人胎盤核糖核酸的方法包含以下步驟a、先將保存在-20℃環境中的RNA純品用生理鹽水溶解，檢測并調整好濃度，按核糖核酸10mg～50mg、甘露醇100mg～400mg、右旋糖苷0mg～50mg組分配制注射用人胎盤核糖核酸；b、再將配制好的人胎盤核糖核酸經無菌過濾后分裝于西林瓶內，進行真空冷凍干燥；c、將真空冷凍干燥后的人胎盤核糖核酸進行封裝。
本發明所述的破碎粗提步驟的“b”操作中的搗碎采用膠磨機磨漿方式，選用200目粒度進料進行搗碎。
本發明所述的破碎粗提步驟的“b”操作中的搗碎采用電動組織搗碎機，轉速10000～12000轉/分鐘，按搗碎1～2分鐘、停2～5分鐘的周期進行2～3次搗碎。
本發明所述的破碎粗提步驟的“c”操作為冷酚處理，將勻漿液置于室溫下攪拌30～40分鐘。
本發明所述的精提分離步驟的“a”操作的離心分離轉速4000轉/分、分離30分鐘，“b”操作和“c”操作的離心分離轉速4000轉/分、分離20分鐘，“e”操作和純化步驟的“b”操作、“c”操作的離心分離轉速3000轉/分、分離10分鐘，純化步驟的“d”操作的離心分離轉速2000轉/分、分離10分鐘。
本發明所述的配置試劑步驟包括a、配置0.1mol/l醋酸鹽緩沖液，在0.1mol/l醋酸鹽溶液中包含重量比0.4％～0.6％的十二烷基硫酸鈉、0.1％～0.3％的聚乙烯硫酸酯、0.1％～0.3％的乙二胺四乙酸二鈉，用醋酸調節其PH值到PH 5.0；b、配置酚飽和緩沖液，將0.1％的分析純8-羥基喹啉苯酚與“a”操作中配置的0.1mol/l醋酸鹽緩沖液等體積混合在分液漏斗中，振搖200～400次，避光靜置8～14小時，取其上層液體；c、配置緩沖液飽和酚，取“b”操作中的下層液體；d、配置0.3mol/l醋酸鹽緩沖液，在0.3mol/l醋酸鹽溶液中包含重量比6％～8％的醋酸鉀，用醋酸調節其PH值到PH 5.0；e、配置0.1mol/l醋酸鹽洗液，在0.1mol/l醋酸鹽溶液中包含重量比2％～4％醋酸鉀、0.1％～0.3％聚乙烯硫酸酯、75％乙醇，用醋酸調節其PH值到PH 5.0；f、配置生理鹽水，用雙蒸水配置含0.9％NaCl生理鹽水。
本發明與現有技術相比具有以下效果和優點1、人體胎盤具有很高的營養價值，核糖核酸含量高。本發明的核糖核酸從健康產婦的胎盤提取，具有健康母親體內的一些免疫功能，對受用者來言無特異性，相比從其它的動物、植物提取的核糖核酸，更易被人體吸收，產生效果。2、該提取方法使用十二烷基硫酸鈉、8-羥基喹啉苯酚等試劑，不同于現有技術所用的胍類、氯仿等毒性小，使用安全可靠。3、該制備方法制備的RNA活性高，其玫瑰花結細胞形成試驗即E.RF證明生物活性在38％左右，而現有技術所制備的RNA生物活性只有15％左右。4、該制備方法制備的RNA含量高、雜質少，經測試其蛋白含量、脫氧核糖核酸DNA含量均不超過RNA含量的10％。5、該制備方法操作簡便，不需消耗大量的有機溶劑，制備周期短。
具體實施例方式
實施例1該注射用人胎盤核糖核酸的制備方法包括從人體胎盤提取核糖核酸的方法和配制注射用人胎盤核糖核酸的方法。本實施例從人體胎盤提取核糖核酸的方法采用熱酚法。該制備方法含有以下步驟1、配置試劑步驟a、配置0.1mol/l醋酸鹽緩沖液，在0.1mol/l醋酸鹽溶液中包含重量比0.5％的十二烷基硫酸鈉、0.2％的聚乙烯硫酸酯、0.2％的乙二胺四乙酸二鈉，用醋酸調節其PH值到PH 5.0。
b、配置酚飽和緩沖液，將0.1％的分析純8-羥基喹啉苯酚與“a”操作中配置的0.1mol/l醋酸鹽緩沖液等體積混合在分液漏斗中，振搖300次，避光靜置11小時，取其上層液體。
c、配置緩沖液飽和酚，取“b”操作中的下層液體。
d、配置0.3mol/l醋酸鹽緩沖液，在0.3mol/l醋酸鹽溶液中包含重量比7％的醋酸鉀，用醋酸調節其PH值到PH 5.0。
e、配置0.1mol/l醋酸鹽洗液，在0.1mol/l醋酸鹽溶液中包含重量比3％醋酸鉀、0.2％聚乙烯硫酸酯、75％乙醇，用醋酸調節其PH值到PH 5.0。
f、配置生理鹽水，用雙蒸水配置含0.9％NaCl生理鹽水。
2、破碎粗提步驟a、取新鮮或冰凍人體胎盤，用去離子水洗凈，去除羊膜、臍帶、大血管。
b、將清洗后的胎盤組織剪碎，加5倍重量的酚飽和緩沖液和5倍重量的緩沖液飽和酚后，破碎得胎盤組織勻漿液。工業生產中搗碎采用膠磨機磨漿方式，選用200目粒度進料進行搗碎。實驗室試驗采用電動組織搗碎機，轉速11000轉/分鐘，按搗碎1.5分鐘、停3.5分鐘的周期進行2次搗碎。
c、進行熱酚處理，將勻漿液置于65℃水浴中攪拌15分鐘后，迅速移入-15℃鹽水浴中速冷至5℃。
3、精提分離步驟a、將經熱酚處理后的勻漿液進行離心分離，轉速4000轉/分、分離30分鐘。吸取上清液放入冰箱5℃保存，并收集離心分離出來的酚和蛋白層。
b、加入酚和蛋白層重量的3/5倍量的酚飽和緩沖液，攪拌13分鐘后，進行離心分離，轉速4000轉/分、分離20分鐘，吸取上清液與前“a”操作的清液合并存放，并收集分離出來的酚和蛋白層。
c、加入合并清液重量的3/5倍量的緩沖液飽和酚，攪拌13分鐘后，進行離心分離，轉速4000轉/分、分離20分鐘，吸取上清液，重復此操作，直至上清液和酚層之間無蛋白或極小量蛋白，收集上清液。
d、取收集的上清液，按上清液重量的6.5％的量加入分析純醋酸鉀，待醋酸鉀溶解后加其重量的2.5倍量的-15℃無水乙醇，靜置于-20℃環境下11小時。
e、進行離心分離，轉速3000轉/分、分離10分鐘，棄去上清液，收集沉淀即核糖核酸RNA粗制品。
4、純化步驟a、將RNA粗制品按每100克加65ml的0.3mol/l醋酸鹽緩沖液，使其溶解，進行離心分離，棄去沉淀物，收集上清RNA溶液，加上清RNA溶液重量的2.5倍量的-15℃無水乙醇，置于-20℃環境中1.5小時。
b、進行離心分離，轉速3000轉/分、分離10分鐘，棄去上清液，收集沉淀物，先加入等重量的0.1mol/l醋酸鹽洗液攪成糊狀后，再加入沉淀物重量的7倍量的0.1mol/l醋酸鹽洗液攪勻。
c、再次進行離心分離，轉速3000轉/分、分離10分鐘，棄去上清液，收集沉淀物，先加入等重量的0.1mol/l醋酸鹽洗液攪成糊狀后，再加入沉淀物重量的7倍量的0.1mol/l醋酸鹽洗液攪勻，進行離心分離，棄去上清液，得RNA純品后加等重量的0.1mol/l醋酸鹽洗液保存在-20℃環境中。
d、將保存的RNA進行離心分離，轉速2000轉/分、分離10分鐘，棄上清液，收集沉淀物即RNA純品，用風扇吹干后，保存-20℃環境中。
5、配制注射用人胎盤核糖核酸的步驟a、先將保存在-20℃環境中的RNA純品用生理鹽水溶解，檢測并調整好濃度，按核糖核酸30mg、甘露醇250mg、右旋糖苷25mg組分配制注射用人胎盤核糖核酸。
b、再將配制好的人胎盤核糖核酸經無菌過濾后分裝于西林瓶內，進行真空冷凍干燥。
c、將真空冷凍干燥后的人胎盤核糖核酸進行封裝。
實施例2本實施例從人體胎盤提取核糖核酸的方法采用冷酚法，該方法的破碎粗提步驟的“c”操作為冷酚處理，即將勻漿液置于室溫下攪拌30～40分鐘。
該制備方法的其它操作步驟同實施例1。
以下所列也是
具體實施例方式
以上實施例的操作步驟同實施例1。
用本發明所述的從人體胎盤提取的核糖核酸RNA二批樣品按質量指標測定結果如下
權利要求
1.一種注射用人胎盤核糖核酸的制備方法，其特征是所述的制備方法包括從人體胎盤提取核糖核酸的方法和配制注射用人胎盤核糖核酸的方法，從人體胎盤提取核糖核酸的方法包含以下步驟A、配制試劑步驟配制0.1mol/l醋酸鹽緩沖液、酚飽和緩沖液、緩沖液飽和酚、0.3mol/l醋酸鹽緩沖液、0.1mol/l醋酸鹽洗液和生理鹽水；B、破碎粗提步驟a、取新鮮或冰凍人體胎盤，用去離子水洗凈，去除羊膜、臍帶、大血管；b、將清洗后的胎盤組織剪碎，加4～6倍重量的酚飽和緩沖液和4～6倍重量的緩沖液飽和酚后，破碎得胎盤組織勻漿液；c、進行熱酚處理，將勻漿液置于50～80℃水浴中攪拌10～20分鐘后，迅速移入-20～-10℃鹽水浴中速冷至0～10℃；C、精提分離步驟a、將經熱酚處理后的勻漿液進行離心分離，吸取上清液放入冰箱0～10℃保存，并收集離心分離出來的酚和蛋白層；b、加入酚和蛋白層重量的1/2～2/3倍量的酚飽和緩沖液，攪拌10～15分鐘后，進行離心分離，吸取上清液與前“a”操作的清液合并存放，并收集分離出來的酚和蛋白層；c、加入合并清液重量的1/2～2/3倍量的緩沖液飽和酚，攪拌10～15分鐘后，進行離心分離，吸取上清液，重復此操作，直至上清液和酚層之間無蛋白或極小量蛋白，收集上清液；d、取收集的上清液，按上清液重量的5％～8％的量加入醋酸鉀，待醋酸鉀溶解后加其重量的2～3倍量的-10～-20℃無水乙醇，靜置于-20℃環境下8～14小時；e、進行離心分離，棄去上清液，收集沉淀即核糖核酸RNA粗制品；D、純化步驟a、將RNA粗制品按每100克加50～80ml的0.3mol/l醋酸鹽緩沖液，使其溶解，進行離心分離，棄去沉淀物，收集上清RNA溶液，加上清RNA溶液重量的2～3倍量的-10～-20℃無水乙醇，置于-20℃環境中1～2小時；b、進行離心分離，棄去上清液，收集沉淀物，先加入等重量的0.1mol/l醋酸鹽洗液攪成糊狀后，再加入沉淀物重量的6～8倍量的0.1mol/l醋酸鹽洗液攪勻；c、再次進行離心分離，棄去上清液，收集沉淀物，先加入等重量的0.1mol/l醋酸鹽洗液攪成糊狀后，再加入沉淀物重量的6～8倍量的0.1mol/l醋酸鹽洗液攪勻，進行離心分離，棄去上清液，得RNA純品后加等重量的0.1mol/l醋酸鹽洗液保存在-20℃環境中；d、將保存的RNA進行離心分離，棄上清液，收集沉淀物即RNA純品，吹干后，保存-20℃環境中。
2.根據權利要求1所述的注射用人胎盤核糖核酸的制備方法，其特征是所述的配制注射用人胎盤核糖核酸的方法包含以下步驟a、先將保存在-20℃環境中的RNA純品用生理鹽水溶解，檢測并調整好濃度，按核糖核酸10mg～50mg、甘露醇100mg～400mg、右旋糖苷0mg～50mg組分配制注射用人胎盤核糖核酸；b、再將配制好的人胎盤核糖核酸經無菌過濾后分裝于西林瓶內，進行真空冷凍干燥；c、將真空冷凍干燥后的人胎盤核糖核酸進行封裝。
3.根據權利要求1所述的注射用人胎盤核糖核酸的制備方法，其特征是所述的破碎粗提步驟的“b”操作中的搗碎采用膠磨機磨漿方式，選用200目粒度進料進行搗碎。
4.根據權利要求1所述的注射用人胎盤核糖核酸的制備方法，其特征是所述的破碎粗提步驟的“b”操作中的搗碎采用電動組織搗碎機，轉速10000～12000轉/分鐘，按搗碎1～2分鐘、停2～5分鐘的周期進行2～3次搗碎。
5.根據權利要求1所述的注射用人胎盤核糖核酸的制備方法，其特征是所述的破碎粗提步驟的“c”操作為冷酚處理，將勻漿液置于室溫下攪拌30～40分鐘。
6.根據權利要求1所述的注射用人胎盤核糖核酸的制備方法，其特征是所述的精提分離步驟的“a”操作的離心分離轉速4000轉/分、分離30分鐘，“b”操作和“c”操作的離心分離轉速4000轉/分、分離20分鐘，“e”操作和純化步驟的“b”操作、“c”操作的離心分離轉速3000轉/分、分離10分鐘，純化步驟的“d”操作的離心分離轉速2000轉/分、分離10分鐘。
7.根據權利要求1所述的注射用人胎盤核糖核酸的制備方法，其特征是所述的配置試劑步驟包括a、配置0.1mol/l醋酸鹽緩沖液，在0.1mol/l醋酸鹽溶液中包含重量比0.4％～0.6％的十二烷基硫酸鈉、0.1％～0.3％的聚乙烯硫酸酯、0.1％～0.3％的乙二胺四乙酸二鈉，用醋酸調節其PH值，達到PH 5.0；b、配置酚飽和緩沖液，將0.1％的分析純8-羥基喹啉苯酚與“a”操作中配置的0.1mol/l醋酸鹽緩沖液等體積混合在分液漏斗中，振搖200～400次，避光靜置8～14小時，取其上層液體；c、配置緩沖液飽和酚，取“b”操作中的下層液體；d、配置0.3mol/l醋酸鹽緩沖液，在0.3mol/l醋酸鹽溶液中包含重量比6％～8％的醋酸鉀，用醋酸調節其PH值，達到PH 5.0；e、配置0.1mol/l醋酸鹽洗液，在0.1mol/l醋酸鹽溶液中包含重量比2％～4％醋酸鉀、0.1％～0.3％聚乙烯硫酸酯、75％乙醇，用醋酸調節其PH值，達到PH 5.0；f、配置生理鹽水，用雙蒸水配置含0.9％NaCl生理鹽水。
全文摘要
本發明公開了一種注射用人胎盤核糖核酸的制備方法。該制備方法包括從人體胎盤提取核糖核酸的方法和配制注射用人胎盤核糖核酸的方法，從人體胎盤提取核糖核酸的方法包含以下步驟配制試劑步驟；破碎粗提步驟；精提分離步驟和純化步驟。本發明克服了現有技術存在的缺陷，具有制備的核糖核酸RNA活性高、純度高、毒性小、更容易被人體吸收；制備方法操作簡便，不需消耗大量的有機溶劑，制備周期短等優點。
文檔編號C07H21/02GK1580068SQ20031010944
公開日2005年2月16日 申請日期2003年12月16日 優先權日2003年12月16日
發明者倪明敏, 盧東, 周正兵 申請人:杭州華錦藥業有限公司