專利名稱：納米磁性顆粒分離純化鏈酶親合素的方法
技術領域：
本發明涉及一種分離純化鏈酶親合素的方法，具體是一種納米磁性顆粒分離純化鏈酶親合素的方法。屬于生物分離技術領域。
背景技術：
生物素-親合素系統(Biotin-Avidin System簡稱BAS)是近幾年來發展很迅速的一門生物學技術。應用這技術就須要解決生物素和親合素的原料，生物素又稱維生素H為小分子物質，現已能人工合成。親合素包括卵白親合合素、鏈霉親合素、卵黃親合素及類親合素，后兩種因其親和力低，研究不多，前兩種是目前主要應用的。經文獻檢索發現，劉麗等人在《河北醫科大學學報》(Vol.2，No.5，P42，2001)發表的“分泌鏈霉親合素菌株的篩選及其鏈霉親合素性質的研究”，該文中分離純化方法是先用飽和硫酸銨沉淀、透析后，再用亞胺生物素化的瓊脂糖或CM-纖維素進行柱層析分離，得到鏈霉親合素純品。由于受色譜柱層析技術的限制，要求分離用的填料具有松散的多孔網絡和顆粒均勻的球形，并具剛性，一方面要便于生物大分子能均勻地進出，另一方面在液體流過色譜柱時所施加的靜壓下，要保證顆粒不致變形，故載體制作時技術含量高，國內用的柱層析分離填料幾乎都是國外產品，價格昂貴，用于規模化生產成本高，且操作復雜要通過鹽析、透析、柱層析分離，時間長。
發明內容
本發明針對現有技術的上述不足和缺陷，提供一種納米磁性顆粒分離純化鏈酶親合素的方法，通過應用表面帶有親和配基的磁性顆粒直接從細菌發酵液中分離出鏈霉親合素，使其具有操作簡單，不需要鹽析、透析、柱層析，分離速度快，成本低等特點，可用于少量或大批量的分離純化。
本發明是通過以下技術方案實現的，本發明以表面帶有功能基團的納米磁性顆粒為載體，借助于磁性分離裝置，對目標生物分子進行負載、運載和卸載等分離操作，實現目標生物分子的磁性分離過程，運用生物分子特異性親合作用原理，將亞胺生物素、生物素或生物胞素配基偶聯在磁性顆粒載體表面，在外加磁場的定向控制下，通過親和吸附、清洗和解吸等操作，從而一步從復雜的原始細菌發酵液中直接分離純化鏈霉親合素。
以下對本發明方法作進一步的限定，方法包括如下步驟(1)制備表面帶有功能基團(羧基、氨基、醛基、巰基等)的磁性顆粒；①采用共沉淀法、沉淀氧化法制備超順磁性納米Fe3O4，或少量摻入過渡金屬Mn、Cu、Zn、Co、Mg等，提高磁顆粒的飽和磁化強度。
②采用有機分子處理納米Fe3O4粒子使其表面帶有功能基團，新制備的納米Fe3O4表面帶有很多羥基，在酸性介質中，可用硅烷偶聯劑修飾，如γ-氨丙基三乙氧基硅烷、γ-縮水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷、γ-巰丙基三甲氧基硅烷等，使其表面帶有氨基、環氧基、巰基等兩種以上的功能基團；也可采用能高分子材料包覆納米Fe3O4粒子，通過對納米Fe3O4表面化學改性，使納米Fe3O4與聚合單體具有良好的相容性和穩定性，在聚合過程中納米Fe3O4均勻分布于聚合物微球內部，利用分散聚合法、乳液聚合法和懸浮聚合法制備高分子磁性微球，并引入兩種以上的功能基團(羧基、氨基、醛基、巰基等)。
(2)以磁性顆粒為載體偶聯與鏈霉親合素有親和作用的亞胺生物素、生物素或生物胞素配基；①亞胺生物素化的磁性顆粒的制備表面帶有醛基、巰基、羥基的磁顆粒在弱堿性溶液中與肼化亞胺生物素反應生成亞胺生物素化的磁性顆粒；表面帶有氨基的磁顆粒同樣在弱堿性溶液中與亞胺生物素-N-羥基琥珀酰亞胺酯反應生成亞胺生物素化的磁性顆粒。反應方程式如下 ②生物素化的磁性顆粒的制備采用表面帶有醛基、巰基、羥基的磁顆粒在弱堿性溶液中與生物素肼反應生成生物素化的磁性顆粒；表面帶有氨基的磁顆粒同樣在弱堿性溶液中與生物素-N-羥基琥珀酰亞胺酯反應生成生物素化的磁性顆粒。
③生物胞素化的磁性顆粒的制備采用表面帶有羧基的磁顆粒在N，N-二甲基甲酰胺溶液中，加入碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺，搖動反應過夜，在磁場下分離，再與生物胞素反應生成生物胞素化的磁性顆粒。
(3)用亞胺生物素化的磁性顆粒、生物素化的磁性顆粒或生物胞素化的磁性顆粒通過親和反應直接從細菌發酵液中分離純化鏈霉親合素。
①用亞胺生物素化的磁性顆粒分離時首先發酵液過濾，濾液用NaON調至PH9.5～11，加入亞胺生物素化的磁性顆粒，搖動反應0.5小時，在外加磁場作用下除去上清夜，用PH10～11的碳酸緩沖液洗磁性顆粒3-4次后，除去上清液，磁性顆粒用PH4.0緩沖液洗下鏈霉親合素，用重蒸水4℃透析，得純化的鏈霉親合素。
②當用生物素化的磁性顆粒或生物胞素化的磁性顆粒分離時首先發酵液過濾，濾液中加入生物素化(或生物胞素化)的磁性顆粒，搖動反應0.5小時在外加磁場作用下除去上清液，用1M NaCl洗磁性顆粒3-4次后，除去上清夜，磁性顆粒用PH2.5 HCl-甘氨酸緩沖液，或5M尿素，或6M鹽酸胍洗下鏈霉親合素，用0.05M磷酸緩沖液PH7.0 4℃透析，再用重蒸水4℃透析，得純化的鏈霉親合素(SA)。
本發明以納米磁性顆粒為核，表面通過有機小分子或高分子包覆修飾使其帶有功能基團(羧基、氨基、醛基、巰基等)，這些功能基團可偶聯生物素衍生物，制得亞胺生物素化、生物素化或生物胞素化的磁性顆粒，用于分離純化親合素。它是利用磁性顆粒在納米尺度上表現出來的新穎的物理、化學特性，即納米磁性粒子的超順磁性，以及粒子小、表面積大、吸附容量大的特點，在純化洗脫過程中它們可以完全懸浮，不會發生阻塞現象，外加磁場能快速分離；同時利用生物分子特異的親和作用原理，通過鏈霉親合素與偶聯亞胺生物素、生物素或生物胞素配基的磁性顆粒親和吸附、清洗和解吸等操作，可以一步從復雜的原始細菌發酵液中直接分離純化鏈霉親合素，分離簡單、快速、高效。純化得到的鏈霉親合素純度大于98％，活性15.56ug/mg，分子量為58000Da。
具體實施例方式
結合本發明的內容提供以下實施例，對本發明技術方案作進一步理解。
實施例一稱取FeSO4·7H2O(分析純)4.12克，FeCl3·6H2O(分析純)8.03克，加雙蒸水150mL，在氮氣的保護下溶解，并加入300mL 5M NaOH(分析純)溶液，劇烈攪拌，80℃反應60分鐘，制備了磁性納米Fe3O4，在外加磁場下，用去離子水洗滌至中性，再用甲醇洗，在甲醇溶液中(用醋酸調PH＝3)，加入3.5克硅烷化試劑γ-氨丙基三乙氧基硅烷(Si(OC2H5)3C3H7NH2)，60℃水浴中反應4小時，冷卻，用去離子水洗滌，得到的磁性粒子表面帶有氨基。透射電鏡檢測顆粒的大小，粒子20nm；紅外檢測表面硅烷化修飾后的顆粒，得氨基(-NH2)的特征吸收在3300cm-1，N-H彎曲振動在1600cm-1，表明磁顆粒表面帶有氨基；用電感耦合等離子體發射光譜儀測元素鐵和硅的含量(重量百分比)得Fe68.83；Si1.316，計算得每克磁性顆粒所帶氨基量0.47mmol。
將制備的表面帶有氨基的磁性粒子30mg，用蒸餾水洗后，加入3mL 0.05M不含氨基的緩沖液(PH4.8～9.5)，以及1.2mL 25％的戊二醛，室溫搖動反應3小時，洗滌后，得到表面帶有醛基的磁顆粒，加入3mL 0.05M NaHCO3和0.5mL10mg/mL溶于二甲亞砜的亞胺生物素肼室溫搖動反應過夜，用0.05M NaHCO3洗滌，得到亞胺生物素化的磁性顆粒。或者將制備的表面帶有氨基的磁性粒子30mg，用0.05M NaHCO3洗后，加入3mL 0.05M NaHCO3溶液，以及6mg亞胺生物素-N-羥基丁二酰亞胺酯溶于0.5mL二甲基甲酰胺的溶液，室溫搖動3小時，用0.05M NaHCO3洗滌，得到亞胺生物素化的磁性顆粒。
取鏈霉菌的發酵液200mL過濾后，用6N的NaOH調濾液PH至9.5～11，加入制備的亞胺生物素化的磁性顆粒30mg，室溫搖動反應15分鐘，外加磁場分離，用0.05M碳酸緩沖液(PH10～11)含1M NaCl洗滌磁顆粒，測上清液OD282值，當上清液OD282≤0.005時，換用0.05M的醋酸緩沖液PH＝4洗脫，外加磁場分離，測上清液OD282值，計算(鏈霉親合素吸光值ε＝3.356ml/mg)得精制的鏈霉親合素為4.16mg。
實施例二稱取FeSO4·7H2O(分析純)4.12克，FeCl3·6H2O(分析純)8.03克，加雙蒸水150mL，在氮氣的保護下溶解，并加入300mL 5M NaOH(分析純)溶液，劇烈攪拌，80℃反應60分鐘，制備了磁性納米Fe3O4，在外加磁場下，用去離子水洗滌至中性，再用甲醇洗，在甲醇溶液中(用醋酸調PH＝3)，加入3.5克硅烷化試劑γ-氨丙基三乙氧基硅烷(Si(OC2H5)3C3H7NH2)，60℃水浴中反應4小時，冷卻，用去離子水洗滌，得到的磁性粒子表面帶有氨基。透射電鏡檢測顆粒的大小，粒子在20nm；紅外檢測表面硅烷化修飾后的顆粒，得氨基(-NH2)的特征吸收在3300cm-1，N-H彎曲振動在1600cm-1，表明磁顆粒表面帶有氨基；用電感耦合等離子體發射光譜儀測元素鐵和硅的含量(重量百分比)得Fe68.83；Si1.316，計算得每克磁性顆粒所帶氨基量0.47mmol。
將制備的表面帶有氨基的磁性粒子30mg，懸于3mL N，N-二甲基甲酰胺中，加入0.5mL 10mg/mL溶于N，N-二甲基甲酰胺的生物素N-羥基丁二酰亞胺酯(BNHS)，室溫搖動反應過夜，用N，N-二甲基甲酰胺洗滌后，再用蒸餾水洗滌，得到生物素化的磁性顆粒。
取鏈霉菌的發酵液200mL過濾后，濾液中加入制備的生物素化的磁性顆粒30mg，室溫搖動反應15分鐘，外加磁場分離，用1M NaCl洗滌磁顆粒，測上清液OD282值，當上清液OD282≤0.005時，換用PH2.5 HCl-甘氨酸緩沖液(或5M尿素，或6M鹽酸胍)洗下鏈霉親合素，用0.05M磷酸緩沖液PH7.0 4℃透析，再用重蒸水4℃透析，測OD282值，計算(鏈霉親合素吸光值ε＝3.356ml/mg)得精制的鏈霉親合素為3.14mg。
實施例三在500mL的燒杯中加入油酸包覆的磁流體15.0g，32mL苯乙烯和0.84mL二乙烯基苯的混合液，以及5％十二烷基硫酸鈉的水溶液240mL，攪拌1小時后，再加入0.6g偶氮二氰基戊酸，然后以4000r/min的速度高速分散30mmin，將混合液轉移到帶有攪拌器、冷凝管和氮氣入口的四口瓶。在氮氣保護下，80℃攪拌反應12小時，乳液呈棕色，用磁場分離洗凈，收集到磨口瓶中。透射電鏡檢測顆粒的大小，粒子在300nm；用紅外檢測微球表面帶有羧基功能團，羧基中(-C＝O)的特征吸收在1720cm-1，(-C-O)伸縮振動的特征吸收在1315cm-1，(-O-H)的非平面變角振動在915cm-1。用電導滴定法，測定磁性微球表面的羧基含量為0.2mmol/g。
將制備的表面帶有基羧的磁性微球400mg懸于10mLN，N-二甲基甲酰胺，加入50mg N-羥基丁二酰亞胺(HO-SU)和60mg二環己基碳二亞胺(DCC)，室溫搖動反應過夜，用乙醚洗3次后，改用二甲基甲酰胺洗滌，加入10mL3mg/mL溶于N，N-二甲基甲酰胺的生物胞素，室溫搖動反應過夜，用N，N-二甲基甲酰胺洗滌后，再用蒸餾水洗滌，得到生物胞素化的磁性微球。
取鏈霉菌的發酵液200mL過濾后，濾液中加入生物胞素化的磁性顆粒300mg，室溫搖動反應15分鐘，外加磁場分離，用1MNaCl洗滌磁顆粒，測上清液OD282值，當上清液OD282≤0.005時，換用PH2.5 HCl-甘氨酸緩沖液(或5M尿素，或6M鹽酸胍)洗下鏈霉親合素，用0.05M磷酸緩沖液PH7.0 4℃透析，再用重蒸水4℃透析，測OD282值，計算(鏈霉親合素吸光值ε＝3.356ml/mg)得精制的鏈霉親合素為3.80mg。
鏈霉親合素活性測定取實施例一、實施例二、實施例三純化得到的鏈霉親合素1.16mg(282nm定量)，在233nm測OD值，加入10uL生物素(1mg/ml)233nm測OD233值，再加入2uL生物素測OD233值，當OD233值不再增加時，加入生物素的量就是鏈霉親合素的活性，共加入生物素的量為18mg，純化得到鏈霉親合素的活性為15.52ug/mg。
鏈霉親合素分子量和純度的測定實施例一、實施例二、實施例三純化得到的鏈霉親合素用常規SDS-PAGE電泳法(5％濃縮膠和12％分離膠)，分別上樣，同時上樣低分子量的標準蛋白(Sigma公司)，用Bio-Rad MP3型電泳槽走電泳后，凝膠用0.25％考馬斯亮藍R250染色15min，脫色至清晰，純化得到的鏈霉親合素都只有一條帶，純度大于98％，將低分子量標準蛋白的相對分子量取對數，與他們在SDS-PAGE中的遷移距離做線性回歸得亞基的分子量為14500Da，因鏈霉親合素由4個亞基組成，所以鏈霉親合素的分子量為58000Da。
權利要求
1.一種納米磁性顆粒分離純化鏈酶親合素的方法，其特征在于，以表面帶有功能基團的納米磁性顆粒為載體，借助于磁性分離裝置，對目標生物分子進行負載、運載和卸載分離操作，實現目標生物分子的磁性分離過程，運用生物分子特異性親合作用原理，將亞胺生物素、生物素或生物胞素配基偶聯在磁性顆粒載體表面，在外加磁場的定向控制下，通過親和吸附、清洗和解吸操作，從而一步從復雜的原始細菌發酵液中直接分離純化鏈霉親合素。
2.根據權利要求1所述的納米磁性顆粒分離純化鏈酶親合素的方法，其特征是，以下對本發明方法作進一步的限定，方法包括如下步驟(1)制備表面帶有功能基團的磁性顆粒；(2)以磁性顆粒為載體偶聯與鏈霉親合素有親和作用的亞胺生物素、生物素或生物胞素配基；(3)用亞胺生物素化的磁性顆粒、生物素化的磁性顆粒或生物胞素化的磁性顆粒通過親和反應直接從細菌發酵液中分離純化鏈霉親合素。
3.根據權利要求2所述的納米磁性顆粒分離純化鏈酶親合素的方法，其特征是，所述的制備表面帶有功能基團的磁性顆粒，具體如下①采用共沉淀法或沉淀氧化法制備超順磁性納米Fe3O4，或少量摻入過渡金屬Mn、Cu、Zn、Co、Mg，提高磁顆粒的飽和磁化強度；②采用有機分子處理納米Fe3O4粒子使其表面帶有功能基團，新制備的納米Fe3O4表面帶有很多羥基，在酸性介質中，用硅烷偶聯劑修飾，使其表面帶有兩種以上的功能基團，或者采用能高分子材料包覆納米Fe3O4粒子，通過對納米Fe3O4表面化學改性，使納米Fe3O4與聚合單體具有良好的相容性和穩定性，在聚合過程中納米Fe3O4均勻分布于聚合物微球內部，利用分散聚合法，或乳液聚合法，或懸浮聚合法制備高分子磁性微球，并引入兩種以上的功能基團。
4.根據權利要求2所述的納米磁性顆粒分離純化鏈酶親合素的方法，其特征是，所述的以磁性顆粒為載體偶聯與鏈霉親合素有親和作用的亞胺生物素、生物素或生物胞素配基，具體如下①亞胺生物素化的磁性顆粒的制備表面帶有醛基、巰基、羥基的磁顆粒在弱堿性溶液中與肼化亞胺生物素反應生成亞胺生物素化的磁性顆粒，表面帶有氨基的磁顆粒同樣在弱堿性溶液中與亞胺生物素-N-羥基琥珀酰亞胺酯反應生成亞胺生物素化的磁性顆粒；②生物素化的磁性顆粒的制備采用表面帶有醛基、巰基、羥基的磁顆粒在弱堿性溶液中與生物素肼反應生成生物素化的磁性顆粒；表面帶有氨基的磁顆粒同樣在弱堿性溶液中與生物素-N-羥基琥珀酰亞胺酯反應生成生物素化的磁性顆粒；③生物胞素化的磁性顆粒的制備采用表面帶有羧基的磁顆粒在N，N-二甲基甲酰胺溶液中，加入碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺，搖動反應過夜，在磁場下分離，再與生物胞素反應生成生物胞素化的磁性顆粒。
5.根據權利要求2所述的納米磁性顆粒分離純化鏈酶親合素的方法，其特征是，所述的用亞胺生物素化的磁性顆粒、生物素化的磁性顆粒或生物胞素化的磁性顆粒通過親和反應直接從細菌發酵液中分離純化鏈霉親合素，具體如下采用亞胺生物素化的磁性顆粒分離，首先發酵液過濾，濾液用NaON調至PH9.5～11，加入亞胺生物素化的磁性顆粒，搖動反應0.5小時，在外加磁場作用下除去上清夜，用PH10～11的碳酸緩沖液洗磁性顆粒3-4次后，除去上清液，磁性顆粒用PH4.0緩沖液洗下鏈霉親合素，用重蒸水4℃透析，得純化的鏈霉親合素；或者，采用生物素化的磁性顆粒或生物胞素化的磁性顆粒分離，首先發酵液過濾，濾液中加入生物素化或生物胞素化的磁性顆粒，搖動反應0.5小時在外加磁場作用下除去上清液，用1M NaCl洗磁性顆粒3-4次后，除去上清夜，磁性顆粒用PH2.5 HCl-甘氨酸緩沖液，或5M尿素，或6M鹽酸胍洗下鏈霉親合素，用0.05M磷酸緩沖液PH7.0 4℃透析，再用重蒸水4℃透析，得純化的鏈霉親合素。
全文摘要
一種納米磁性顆粒分離純化鏈酶親合素的方法。屬于生物分離技術領域。本發明以表面帶有功能基團的納米磁性顆粒為載體，借助于磁性分離裝置，對目標生物分子進行負載、運載和卸載分離操作，實現目標生物分子的磁性分離過程，運用生物分子特異性親合作用原理，將亞胺生物素、生物素或生物胞素配基偶聯在磁性顆粒載體表面，在外加磁場的定向控制下，通過親和吸附、清洗和解吸操作，從而一步從復雜的原始細菌發酵液中直接分離純化鏈霉親合素。本發明利用磁性分離的簡單方便和親和分離的高選擇性雙重優勢，使分離快速、高效、成本低，可用于規模化生產。
文檔編號C07K1/00GK1546520SQ200310109350
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月12日 優先權日2003年12月12日
發明者高峰, 馬勇杰, 古宏晨, 鄭偉明, 張玲, 高 峰 申請人:上海交通大學, 上海奧潤微納新材料科技有限公司