專利名稱：基因的人工合成方法及sars病毒保護性抗原氨基酸序列的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域和免疫學領域，具體地說是基因的合成方法及SARS病毒保護性抗原氨基酸序列。
背景技術：
目前基因工程是生物科學最前沿的領域之一，已經體現了巨大的應用價值。但是，目的基因的獲得依然是一個重要的瓶頸，我們對一般構成蛋白質大小的基因還不能隨心所欲的進行操作。只能從天然的生命體中尋求，進行一些微小的修改都是十分困難的。
冠狀病毒的基因組是由3萬個堿基組成的具有感染性的正鏈RNA，是已知的RNA病毒中最大的。基因組的前三分之二中有2個開放閱讀框(ORF)1a和1b，編碼兩組負責轉錄和轉譯的蛋白質聚合體。ORF 1b的下游是一些編碼結構和幾種非結構蛋白的基因。
SARS病毒擁有4種關鍵的結構蛋白膜(M)蛋白，小包膜(E)蛋白，突出(S)糖蛋白以及核殼體(N)蛋白。N蛋白將RNA基因組包裹成一個核殼體，其外部被含有S，M，E蛋白的脂膜所圍繞。M、E蛋白對于病毒的包膜結構是必不可少的。S蛋白的三聚體組成了病毒脂膜的特殊突起，該突起可與宿主細胞受體連接并使感染細胞融合。
理想的保護性抗原應該能夠產生針對SARS病毒表面結構蛋白的抗體，所以突出(S)糖蛋白和膜(M)蛋白是主要的抗原，尤其是S蛋白。
發明內容
本發明的目的是提供一種可以獲得所需要的任何一個基因序列(任意序列的DNA分子)的方法。不論該序列是天然存在或者是人工設計的序列。可以對天然序列進行隨意修改、組合。甚至完全人工設計全序列。
本發明的另一目的是提供多種作為嚴重急性呼吸綜合癥(severe acute respiratorysyndrome，SARS)病毒保護性抗原的特定氨基酸序列。
本發明的進一步目的是提供多種特定的氨基酸序列在制備治療或預防SARS疾病的藥物中的應用。
本發明是建立在DNA分子的化學合成技術和聚合酶鏈式擴增反應(polymerase chainreaction，PCR)技術基礎上的一種新的方法。目前DNA分子的化學合成可以方便地合成50個核苷酸長度以內的單鏈寡聚核苷酸片段(50核苷酸長度以上的長度得率低、成本高，150個核苷酸長度以上的分子幾乎無法合成)，如圖1顯示，將長的雙鏈DNA分子的一條鏈分割成多個數十個核苷酸長度的片段；另一條鏈也分割成多個數十個核苷酸長度的片段，但分割位點與第一條鏈錯開，錯開的位置盡可能達到最大值。每一條鏈的各個片段可以是相互連續的(不缺失任何一個核苷酸)，也可以是不連續的，但如果是不連續的，那么另一條鏈在此位置的片段必需補齊缺失得核苷酸序列。將這些片段均用化學方法合成，這樣獲得的一系列單鏈寡聚核苷酸片段，可以拼接出完整的或基本保持完整的DNA雙鏈分子。
如圖1所示，除每條鏈中最靠近5’端的一個單鏈寡聚核苷酸片段A1和Bx外，將其他的單鏈寡聚核苷酸片段全部混合在一起，不加入引物進行PCR擴增。這些單鏈寡聚核苷酸片段互為引物和模板，被擴增和延長，其中一部分可以構成全長序列(缺最靠近5’端的一段序列)。將反應混合物取出少許為模板，加入每條鏈中最靠近5’端的一個單鏈寡聚核苷酸片段A1和Bx為引物，再進行一次PCR反應；在第一次PCR反應混合物中，能夠被擴增、延長的只有全長序列(缺最靠近5’端的一段序列)，從而得到真正的全長序列——目的基因。
在每條鏈中最靠近5’端的一個單鏈寡聚核苷酸片段A1和Bx上，可以加入進行基因重組所需要酶切位點、起始密碼、終止密碼等其他必要的堿基序列。這樣獲得的目的基因就可以直接插入載體中，導入到受體細胞中進行表達。
如果每個相鄰片段之間不缺失核苷酸，也可以用DNA連接酶代替第一次PCR反應除每條鏈中最靠近5’端的一個單鏈寡聚核苷酸片段A1和Bx外，將其他的單鏈寡聚核苷酸片段均用磷酸化酶對5’端磷酸化；然后混合在一起，在一定溫度下復性(根據堿基配對的原則形成雙鏈)，生成有多個缺口的雙鏈DNA分子；在DNA連接酶作用下連接所有缺口形成完整的無缺口的雙鏈DNA分子。將反應混合物取出少許為模板，加入最靠近5’端的兩個序列片段A1和Bx為引物，進行PCR反應；得到全長序列——目的基因。
如果目的基因非常巨大，可以將其分割為多個部分，相鄰的每個部分序列有一定長度的重疊。首先如前所述進行兩次PCR反應，完成每個部分；然后將所有部分混合在一起，進行第三次PCR(無引物)，將反應混合物取出少許為模板，加入預先保留的最靠近目的基因5’端的兩個單鏈寡聚核苷酸片段為引物，進行第四次PCR，即可獲得非常完整目的基因，如圖2所示。對于大多數基因如此進行兩輪應該獲得足夠大的基因長度。必要時可以進行多輪。如此可以獲得任意長度的基因。由于所有核苷酸序列是化學合成的，所有堿基序列可以由我們自由確定。所以合成的序列可以是已知的天然序列、可以是根據需要修改的已知天然序列、可以是多種已知序列組合、可以是完全由人工設計的序列。目的基因的獲取就有了極大的自由度。
本發明適用于那些基因序列已知，但來源困難的目的基因。
本發明適用于那些基因序列已知，但在特定的生物中表達困難的目的基因，將異源的基因在特定的生物中進行表達是生物工程的主要工作，不同生物對堿基密碼子的喜好是有很大的不同的，不同來源的基因天然序列可能不適應在特定的生物中環境，而導致表達異常。應有本發明可以合成符合天然基因序列所表示的蛋白質序列，同時又符合特定的生物對堿基密碼子喜好的目的基因，提高表達的效率。
本發明適用于那些天然基因序列已知，需要進行結構與功能的研究和性狀改造，需要對天然序列中某些氨基酸進行修改的情況、增加或減少部分氨基酸序列，對天然基因序列進行改造。
本發明適用于那些已知多個相關的天然基因序列，需要對其進行優化組合，獲得更優秀的性狀，或新的功能。
本發明還適用于根據猜想的結構與功能的關系，設計新的序列，表達這個蛋白質進行驗證研究。
本發明還適用于根據已知的關于蛋白質結構與功能的關系設計新的蛋白質結構，實現新的功能。
目前根據基因組學的研究，我們已經知道某些物種的所有基因序列，但是，我們沒有獲得其中大多數的蛋白質，我們也不知道這些蛋白質的作用和意義，而真核生物的DNA中含有內涵子，不能直接用真核生物的DNA進行PCR獲得目的基因，而且真核生物的密碼子喜好與表達系統的喜好有差異，直接應用天然的基因可能會導致表達困難。應用本發明可以方便的合成已知基因，并適合于選擇的表達系統，通過表達產物，進行性質和功能的研究。
本發明涉及確定的SARS病毒保護性抗原的氨基酸序列、與這個保護性抗原的氨基酸序列對應的核酸堿基序列，包括實質上同源的氨基酸序列、所有密碼子簡并的核酸堿基序列。
本發明包括應用上述的方法制備嚴重急性呼吸綜合癥(severe acute respiratorysyndrome，SARS)病毒的疫苗抗原的人工基因。
SARS病毒極度危險，直接操作SARS病毒獲得基因風險非常大；目前SARS的基因全序列已經公布，同時該病毒的基因密碼子不適合在大腸桿菌和酵母中表達。同時作為抗原，只需要其中的具有保護性抗原作用的一小部分，將免疫資源集中用于保護性抗體的產生，這種人工抗原優于天然抗原。所以使用該方法極為合適。
嚴重急性呼吸綜合癥(severe acute respiratory syndrome，SARS)是新發現的傳染性疾病。根據世界衛生組織(WHO)指出，導致此病的主要病源是新變種的冠狀病毒(Coronavirus)。該種冠狀病毒被命名為SARS冠狀病毒，其全基因組序列已很快被測定并公布。
除了需要應用本發明前面所說的方法外，確定SARS病毒中具有保護性作用的抗原部位和氨基酸序列也是本發明的一個關鍵所在。通過對已知其它種類冠狀病毒的基因組比較，SARS病毒的刺突蛋白(spike protein，S蛋白)基因得到確認。S蛋白是冠狀病毒表面重要的膜蛋白之一，也是病毒的主要表面抗原。對已知的冠狀病毒的研究已經證明，S蛋白和冠狀病毒侵入細胞的過程密切相關。在SARS病毒表面的另一個蛋白質是M蛋白(膜蛋白)。我們根據病毒學、基因組學、分子生物學、基因重組、蛋白質結構與功能、生物信息學、生物化學、免疫學、免疫化學研究成果和我們多年從事激素免疫調控的基因工程疫苗和合成肽疫苗研究經驗，選擇S蛋白和M蛋白中的特異性片段為SARS病毒的保護性抗原。我們選擇的SARS病毒S蛋白中的特異性片段為S蛋白第736位氨基酸殘基至808位氨基酸殘基，即氨基酸序列1
Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser1 5 10 15Gly Ile Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala20 25 30Gln Val Lys Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly35 40 45Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr50 55 60Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val65 70其中第752位氨基酸殘基至765位氨基酸殘基尤為重要，即氨基酸序列2Ile Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala1 5 10我們選擇的SARS病毒M蛋白中的特異性片段為M蛋白第1位氨基酸殘基至第46位殘基，即氨基酸序列3Met Ala Asp Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Gln Leu1 5 10 15Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Ala Trp20 25 30Ile Met Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ser Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr35 40 45上述蛋白質片段中的氨基酸殘基使用的是國際通用的氨基酸的三字母代號。
本專利中所述的“實質上的同源的序列”，是與上述片段中的氨基酸序列之間具有至少大約70％的同源性；優選的至少大約80％的同源性；更優選的至少大約90％的同源性。
相對應的人工合成DNA堿基(選擇生物體嗜好的密碼子)序列為大腸桿菌適用S蛋白片段(氨基酸序列1)對應的堿基序列CTG CAG TAC GGT TCT TTC TGC ACC CAG CTG AAC CGT GCT CTG TCT GGT ATC GCT GCT GAA CAGGAC CGT AAC ACC CGT GAA GTT TTC GCT CAG GTT AAA CAG ATG TAC AAA ACC CCG ACC CTG AAATAC TTC GGT GGT TTC AAC TTC TCT CAG ATC CTG CCG GAC CCG CTG AAA CCG ACC AAA CGT TCTTTC ATC GAA GAC CTG CTG TTC AAC AAA GTT氨基酸序列2對應的堿基序列ATC GCT GCT GAA CAG GAC CGT AAC ACC CGT GAA GTT TTC GCTM蛋白片段(氨基酸序列3)對應的堿基序列ATG GCT GAC AAC GGT ACC ATC ACC GTT GAA GAA CTG AAA CAG CTG CTG GAA CAG TGG AAC CTGGTT ATC GGT TTC CTG TTC CTG GCT TGG ATC ATG CTG CTG CAG TTC GCT TAC TCT AAC CGT AACCGT TTC CTG TAC
酵母菌適用S蛋白片段(氨基酸序列1)對應的堿基序列TTG CAA TAC GGT TCC TTC TGT ACT CAA TTG AAC AGA GCT TTG TCC GGT ATC GCT GCT GAA CAAGAC AGA AAC ACT AGA GAA GTT TTC GCT CAA GTT AAG CAA ATG TAC AAG ACT CCA ACT TTG AAGTAC TTC GGT GGT TTC AAC TTC TCC CAA ATC TTG CCA GAC CCA TTG AAG CCA ACT AAG AGA TCCTTC ATC GAA GAC TTG TTG TTC AAC AAG GTT氨基酸序列2對應的堿基序列ATC GCT GCT GAA CAA GAC AGA AAC ACT AGA GAA GTT TTC GCTM蛋白片段(氨基酸序列3)對應的堿基序列ATG GCT GAC AAC GGT ACT ATC ACT GTT GAA GAA TTG AAG CAA TTG TTG GAA CAA TGG AAC TTGGTT ATC GGT TTC TTG TTC TTG GCT TGG ATC ATG TTG TTG CAA TTC GCT TAC TCC AAC AGA AACAGA TTC TTG TAC氨基酸序列1、氨基酸序列2、氨基酸序列3包括所有實質上的同源序列，對應的堿基序列包括所有簡并的序列。
根據抗原最優化結構的原則，我們重新設計幾個片段(氨基酸殘基使用國際通用的氨基酸的單字母代號表示)多肽鏈片段I LQYGSFCTQL NRALSGIAAE QDRNTREVFA QVKQMYKTPT LKYFGGFNFSQILPDPLKPT KRSFIEDLLF NKV。即上述的“氨基酸序列1”。
多肽鏈片段I’ IAAEQDRNTREVFA。即上述的“氨基酸序列2”。
多肽鏈片段II MADNGTITVEELKQLLEQWNLVIGFLFLAWIMLLQFAYSNRNR FLY。即上述的“氨基酸序列3”。
多肽鏈片段II’MADNGTITVEELKQLLEQWNLVI。
多肽鏈片段I’-II’MADNGTITVEELKQLLEQWNLVIIAAEQDRNTREVFA。
多肽鏈片段I’-II MADNGTITVEELKQLLEQWNLVIGFLFLAWIMLLQFAYSNRNRFLYIAAEQDRNTREVFA
圖1是基因分割合成示意圖。
圖2是大基因的合成示意圖。
具體實施例方式
實施例1選擇pGEX質粒為載體，在大腸桿菌中表達選定的S蛋白中的特異性片段氨基酸序列1作為SARS病毒的保護性抗原，準備用于制備SARS病毒疫苗。
第一部分抗原表達步驟1.選定的S蛋白中的特異性片段氨基酸序列1共73個氨基酸殘基，考慮到大腸桿菌的密碼子喜好，加上酶切位點和終止密碼后核酸序列為 CAAGACAGAA ACACTAGAGA AGTTTTCGCT CAAGTTAAGC AAATGTACAA GACTCCAACT TTGAAGTACTTCGGTGGTTT CAACTTCTCC CAAATCTTGC CAGACCCATT GAAGCCAACT AAGAGATCCT TCATCGAAGA 其中 和 是酶切位點和終止密碼。
步驟2.將上述核酸序列分割成下列片段片斷1 GAATTCCTGCAGTACG GTTCTTTCTG CACCCAGCTG片斷2 GTTCTTTCTG CACCCAGCTG AACCGTGCTC TGTCTGGTAT CGCTGCTGAA CAGGACCGTA片斷3 ACACCCGTGA AGTTTTCGCT CAGGTTAAAC AGATGTACAA AACCC片斷4 CGACCCTGAA ATACTTCGGT GGTTTCAACT TCTCTCAGAT CCTGC片斷5 CGGACCCGCT GAAACCGACC AAACGTTCTT TCATCGAAGA步驟3.將上述核酸序列的互補鏈分割成下列片段片斷6 AGCGAAAACT TCACGGGTGT TACGGTCCTG TTCAGCAGCG AT片斷7 AAACCACCGA AGTATTTCAG GGTCGGGGTT TTGTACATCT GTTTAACCTG片斷8 GGTCGGTTTC AGCGGGTCCG GCAGGATCTG AGAGAAGTTG片斷9 AACTTTGTTG AACAGCAGGT CTTCGATGAA AGAACGTTT片斷10 GCGGCCGC TCA TCA AACTTTGTT GAACAGCAGG步驟4.將片段2-9混合在一起，進行PCR反應。
步驟5.將步驟4的反應產物少許為模板，片段1和片段10為引物，進行PCR反應。
步驟6.測定步驟5產物的序列，顯示與設計序列相同。
步驟7.導入感受細胞中，表達重組蛋白。
步驟8.純化表達產物第二部分重組蛋白的抗原性分析步驟1.重組蛋白對康復血清的抗原性。
用酶聯免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)檢測表達產物與SARS病人康復血清的抗原抗體反應，發現1mg/ml蛋白質濃度的重組蛋白工程菌裂解液，稀釋819200倍以后，與SARS病人康復血清的ELISA光密度值依然可以達到0.380；與此同時健康人血清對照光密度值＝0.034，2mg/ml蛋白質濃度的空載菌裂解液稀釋200倍光密度值＝0.077。表明康復血清對S蛋白中的特異性的73個氨基酸殘基片段有強烈的免疫反應。
步驟2.抗重組蛋白抗體制備1mg/ml蛋白質濃度的重組蛋白工程菌裂解液加弗氏佐劑皮內注射，免疫新西蘭兔；20日后耳緣靜脈采血，ELISA法檢測血清分別對重組蛋白工程菌裂解液、純化的S蛋白中的特異性的73個氨基酸殘基片段的抗原性；以及用空載菌裂解液中和血清后，檢測血清對重組蛋白工程菌裂解液。結果為對10μg/ml蛋白質濃度的重組蛋白工程菌裂解液，血清效價為10000倍；對空載菌裂解液中和血清后10μg/ml蛋白質濃度的重組蛋白工程菌裂解液，血清效價為1000倍。表明重組蛋白有良好的抗原性，能夠產生這個針對S蛋白中的特異性的73個氨基酸殘基片段的抗體。
實施例2選擇pGEX質粒為載體，在大腸桿菌中表達選定的多肽鏈片段I’-IIMADNGTITVEELKQLLEQWNLVIGFLFLAWIMLLQFAYSNRNR FLYIAAEQDRNTREVFA，準備用于制備SARS病毒疫苗。
第一部分抗原表達步驟1.選定的多肽鏈片段I’-II共43氨基酸殘基，考慮到大腸桿菌的密碼子喜好，加上酶切位點和終止密碼后核酸序列為 ATC GGT TTC CTG TTC CTG GCT TGG ATC ATG CTG CTG CAG TTC GCT TAC TCT AAC CGT AAC CGT TTC CTG TAC 其中 和 是酶切位點和終止密碼。
步驟2.將上述核酸序列分割成下列片段片斷11 GAATTC GCTGACAACG GTACCATCAC片斷12 GCTGACAACG GTACCATCAC CGTTGAAGAA CTGAAACAGC片斷13 TGCTGGAACA GTGGAACCTG GTTATCGGTT TCCTGTTCCT GG片斷14 CTTGGATCAT GCTGCTGCAG TTCGCTTACT CTAACCGT片斷15 AACCGTTTCC TGTACATCGC TGCTGAACAG GACCG步驟3.將上述核酸序列的互補鏈分割成下列片段片斷16 GATAACCAGG TTCCACTGTT CCAGCAGCTG TTTCAGTTCT TCAACG片斷17 CTGCAGCAGC ATGATCCAAG CCAGGAACAG GAAACC片斷18 GTACAGGAAA CGGTTACGGT TAGAGTAAGC GAA片斷19 AGCGAAAACT TCACGGGTGT TACGGTCCTG TTCAGCAGCG AT片斷20 GCGGCCGC TCA TCA AGCGAAAACT TCACGGGTGT步驟4.將片段12-19混合在一起，進行PCR反應。
步驟5.將步驟4的反應產物少許為模板，片段11和片段20為引物，進行PCR反應。
步驟6.測定步驟5產物的序列，顯示與設計序列相同。
步驟7.導入感受細胞中，表達重組蛋白。
步驟8.純化表達產物第二部分重組蛋白的抗原性分析步驟3.重組蛋白對康復血清的抗原性。
用酶聯免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)檢測表達產物與SARS病人康復血清的抗原抗體反應，發現1mg/ml蛋白質濃度的重組蛋白工程菌裂解液，稀釋10000倍以后，與SARS病人康復血清的ELISA光密度值依然可以達到0.135；與此同時健康人血清對照光密度值＝0.033，2mg/ml蛋白質濃度的空載菌裂解液稀釋200倍光密度值＝0.077。表明康復血清對多肽鏈片段I’-II有免疫反應。
步驟4.抗重組蛋白抗體制備1mg/ml蛋白質濃度的重組蛋白工程菌裂解液加弗氏佐劑皮內注射，免疫新西蘭兔；20日后耳緣靜脈采血，ELISA法檢測血清分別對重組蛋白工程菌裂解液、純化的多肽鏈片段I’-II的抗原性；以及用空載菌裂解液中和血清后，檢測血清對重組蛋白工程菌裂解液。結果為對10μg/ml蛋白質濃度的重組蛋白工程菌裂解液，血清效價為1000倍；對空載菌裂解液中和血清后10μg/ml蛋白質濃度的重組蛋白工程菌裂解液，血清效價為100倍。表明重組蛋白有良好的抗原性，能夠產生這個針對多肽鏈片段I’-II的抗體。
序列表<110>張益民成都瑞盛高科技有限責任公司<120>基因的人工合成方法及SARS病毒保護性抗原氨基酸序列<160>3<210>1<211>73<212>PRT<213>SARS coronavirus<400>1Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser15 10 15Gly Ile Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala20 25 30Gln Val Lys Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly35 40 45Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr50 55 60Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe AsnLys Val65 70<210>2<211>14<212>PRT<213>SARS coronavirus<400>2Ile Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala1 5 10<210>3<211>46<212>PRT
<213>SARS coronavirus<400>3Met Ala Asp Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Gln Leu1 5 10 15Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Ala Trp20 25 30Ile Met Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ser Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr35 40 4權利要求
1.基因的人工合成方法，其特征是應用化學法人工合成基因分子的一條鏈的多個寡聚核苷酸片段，同時依次交錯合成另一條鏈的寡聚核苷酸片段，第一次將除每條鏈的最靠近5’端的一個寡聚核苷酸片段以外，所有的寡聚核苷酸片段混合在一起進行PCR擴增、延長，第二次用第一次產物為模板，以保留的每條鏈的最靠近5’端的一個寡聚核苷酸片段為引物進行PCR擴增、延長，擴增、延長的產物就是需要的基因。
2.根據權利要求1所述的基因人工合成方法，其特征是基因可以是天然存在的基因，也可以是人工設計的基因序列。
3.根據權利要求1所述的基因合成方法，其特征是基因可以是一個完整的目的基因，也可以是一個完整的目的基因的多個部分相互重疊的片段，當獲得這多個部分相互重疊的片段后，可再一次采用權利要求1所述方法，獲得完整的目的基因。
4.根據權利要求1所述的基因合成方法，其特征是5’端的最后一個序列片段可以包括為便于進行基因重組而加入的酶切位點、起始密碼、終止密碼堿基序列。
5.SARS病毒保護性抗原，其特征是選擇的蛋白質片段的氨基酸序列是氨基酸序列1Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser1 5 10 15Gly Ile Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala20 25 30Gln Val Lys Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly35 40 45Gly Phe Ash Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr50 55 60Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val65 70或氨基酸序列2Ile Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala1 5 10或氨基酸序列3Met Ala Asp Asn Gly Thr I1e Thr Val Glu Glu Leu Lys Gln Leu1 5 10 15Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val I1e Gly Phe Leu Phe Leu Ala Trp20 25 30Ile Met Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ser Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr35 40 45
6.根據權利要求5所述的SARS病毒保護性抗原，其特征是選擇的蛋白質片段的氨基酸序列包括與它們實質上的同源的序列。
7.根據權利要求5所述的SARS病毒保護性抗原，其特征是包括它們部分片段和重新組合的序列。
8.根據權利要求5所述的SARS病毒保護性抗原，其特征是蛋白質片段的氨基酸序列對應的核酸序列，包括所有密碼子簡并的堿基序列。
9.權利要求5所述的SARS病毒保護性抗原，其特征是蛋白質片段的氨基酸序列在制備治療或預防SARS疾病的藥物中的應用。
全文摘要
提供一種建立在DNA分子的化學合成的技術和聚合酶鏈式擴增反應技術基礎上的，可以獲得所需要的任何一個基因序列的方法。不論該序列是天然存在或者是人工設計的序列；而且可以對天然序列進行隨意修改、組合；甚至完全人工設計全序列。同時提供多種作為嚴重急性呼吸綜合癥(severe acute respiratory syndrome，SARS)病毒保護性抗原的特定氨基酸序列，及其在治療或預防SARS疾病的藥物中的應用。
文檔編號C07K14/005GK1614030SQ20031010618
公開日2005年5月11日 申請日期2003年11月4日 優先權日2003年11月4日
發明者張益民, 柳寧, 杜念興 申請人:張益民, 成都瑞盛高科技有限責任公司