在存在內標物的情況下通過用染料標記對閉合膜結構上的細胞表面蛋白的差示分析的制作方法

專利名稱：在存在內標物的情況下通過用染料標記對閉合膜結構上的細胞表面蛋白的差示分析的制作方法
技術領域：
本發明涉及對包含閉合膜結構的樣品的表面膜成分進行差示分析的方法。更特別地該方法涉及利用具有細胞滲透性特征的熒光染料來在體內靶向和標記完整細胞群體，來標記和檢測那些在細胞膜中或在細胞膜上出現或表達的成分。
細胞膜具有重要的功能，這些功能對于細胞的生命是極其重要的。所有的生物膜的特征在于具有共同的常規結構，由主要通過非共價相互作用結合在一起的脂質和蛋白質分子組成。當膜脂質形成透性屏障從而界定細胞邊界時，膜蛋白介導著特殊的細胞過程，例如生物學信號傳送、小分子的轉運和細胞粘附。因此，能夠在各種細胞類型和狀態之間鑒別和區分膜成分、特別是蛋白質和它們的衍生物，對于了解疾病狀態是很重要的。
在2-D電泳分離之前，2-維(2D)差示凝膠電泳(DIGE)使用匹配的、光譜分辯的熒光染料來標記細胞的蛋白質成分(Minden，J.等，Electrophoresis，(1997)，18，2071)。WO 96/33406(Minden，J.和Waggoner，A.S.)描述了一種方法，根據這種方法溶解各種細胞樣品并提取總細胞蛋白質。然后用染料標記各種蛋白質樣品，所述染料按分子質量和電荷進行匹配以在2-DE中得到相等的遷移。該方法使用具有N-羥基琥珀酰亞胺基(NHS)酯活性基團的花青染料來標記胺。對蛋白質樣品的熒光預標記允許多個樣品在同一個凝膠上移動，使得可以通過重疊熒光圖像來容易地鑒別樣品間的數量差別。然而，這個方法不能從其他細胞蛋白質中區分出在細胞膜中出現的蛋白質成分。
已經通過使用生物素標記試劑、增強的化學發光和通過使用熒光標記試劑實現了對完整細胞的標記以靶向和表征細胞表面蛋白。例如，Meier，T.等(Anal.Biochem.，(1992)，204，220-226)描述了一種標記和檢測免疫沉淀的細胞表面分子的過程，該過程使標記了整個細胞的生物素琥珀酰亞胺酯與增強的化學發光物結合，在與鏈霉抗生物素蛋白-HRP復合物結合之后，來檢測硝化纖維轉移的生物素化抗原。然而這種生物素標記方法需要對凝膠進行印跡以將蛋白質轉移到固相的膜支持物上。通常利用鏈霉抗生物素蛋白-酶和底物共軛產生可檢測產物進行生物素化蛋白質的檢測。不能對生物素化的樣品進行倍增以用于直接的比較研究，這降低了獲得精確的定量信息的能力。
Bs，C.等(J.Bacteriol.，(1998)，180(3)，605)描述了使用熒光素馬來酰亞胺來標記E.coli中細胞表面蛋白上的暴露半胱氨酸殘基，和通過流式細胞計和SDS-PAGE分析來研究FhuA膜蛋白在結合鐵色素時的構象變化。
WO 02/099077(Proteologics Inc.)公開了差示顯示膜表面蛋白質的方法，其中被分析的兩個或多個樣品各自用選定的記號部分進行標記，從而成為可區分的。在標記之后，可以混合來自每個樣品的蛋白質，一同進行進一步的分析，例如，通過二維電泳分析。
本發明提供了熒光試劑，并描述了一種方法，用于可再生性地標記膜成分例如那些在細胞表面表達的膜成分，隨后分析該標記的成分來檢測不同細胞類型和狀態之間的差別。此外，當前的方法利用了一種內標物來使跨凝膠的蛋白質模式相匹配，從而避免凝膠-對-凝膠的變異。根據本發明的方法可用于，例如，檢測低豐度的膜蛋白、檢測在細胞膜中表達的受體中的變化，例如，在配體結合或響應刺激時的變化。利用對細胞表面蛋白的熒光標記容許直接在凝膠中檢測標記的蛋白質，并且利用遷移匹配的染料容許倍增以用于差示分析。利用具有各種膜滲透性特征的染料容許靶向細胞的各種蛋白質子集，例如，膜蛋白和細胞質蛋白。
因此，在本發明的第一個方面中，提供了一種檢測來自至少兩個包含閉合膜結構的樣品的表面膜成分之間的差別的方法，所述方法包括i)用選自染料配組的染料接觸每個樣品的獨立等分試樣，其中在所述配組中的每種染料能夠選擇性地標記所述膜成分，并且其中每種染料能夠發出冷光，所述冷光具有可區別性地不同于所述配組中其余染料所發出的冷光的性質；ii)從每個獨立等分試樣中制備染料標記的成分的提取物；iii)分離不同的染料標記的成分；和
iv)檢測所述樣品中不同染料標記的成分之間發光性質的差別；其特征是所述分離步驟iii)在存在內標物的情況下進行，所述內標物包含膜成分提取物，所述膜成分來自所述至少兩個樣品的等分試樣的集中混合物，并且其中使包含膜結構的所述樣品的集中混合物與選自所述染料配組的不同染料接觸。
適當地，染料配組的每種染料相互間根據其電荷和分子量特征來匹配，從而用任何一個所述染料標記的成分的相對遷移，基本上與用該染料配組中任何其他染料標記的所述成分的相對遷移相同。
根據本發明的方法，每個樣品的獨立等分試樣可以與相同的染料接觸，或與選自染料組的不同染料接觸。因而，當與來自任何其他樣品的染料標記的成分的發光性質相比較時，來自一種樣品的染料標記的成分可以具有或不具有同樣的發光性質。
因而，在根據該方法的步驟i)的第一個實施方式中，用選自染料配組的不同染料接觸每個所述樣品的獨立等分試樣，以標記每個樣品中的表面膜成分。附

圖1的流程圖說明了根據第一個實施方式，對兩個不同樣品進行樣品制備(1a，1b)，和分離和分析的方法(1c)。在該方法的一個變體中，如附圖1a所示，進行溶解步驟以從每個樣品、和從集中的混合物獲得染料標記的成分的提取物。作為替代，如附圖1b所示，在溶解樣品混合物之前，將每個染料標記的樣品與標記的集中樣品混合，從而獲得染料標記的提取物的混合物，之后分離和分析標記的成分(附圖1c)。根據附圖1b的替代性程序有以下好處，即在相同凝膠上分析的樣品都將經歷同樣的溶解條件，可以避免可能在樣品制備過程中引入的可能的偽差。在這個實施方式中，該方法在步驟iii)之前包含一個步驟，即，在分離各成分之前，使來自所有樣品的染料標記的成分的提取物的一部分相互混合，并與來自所述集中混合物的染料標記的成分的提取物的一部分混合。
在第二個和優選的實施方式中，使所述樣品的每個獨立等分試樣與選自配組的相同染料接觸。根據第二實施方式的方法通過附圖2(2a，2b和2c)的流程圖關于兩個不同樣品來說明。在這個實施方式中，可以進行溶解步驟(如附圖2a所示)來從每個樣品和從集中混合物獲得染料標記的成分的提取物，然后將如此獲得的染料標記的提取物與標記的集中提取物混合。做為選擇，(如附圖2b所示)，可以在溶解步驟前進行染料標記的樣品與集中混合物的混合。在這個實施方式中，該方法在步驟iii)之前包含一個步驟，即，在分離各成分之前，提供與來自每個獨立樣品的染料標記的成分的提取物的一部分混合了的來自所述集中提取物的染料標記的成分的提取物的一部分。
適當地，內標物包含來自集中混合物的成分的提取物，所述集中混合物包含近似相等的每個所述膜結構樣品的等分試樣。使集中混合物與選自染料配組的不同染料接觸，亦即，該染料擁有的發光性質不同于被選用于標記每個獨立樣品的染料(或多個染料)。被選用于標記集中混合物的染料應具有與配組中其余所有染料相同的遷移率和電荷特征，并且該染料應能選擇性地標記膜成分。然而，來自集中提取物的染料標記的成分擁有的發光性質將不同于來自每個獨立樣品提取物的染料標記的成分的發光性質。
因而，本發明涉及匹配的熒光染料，和涉及標記和檢測來自不同樣品的膜結構的表面膜成分之間的差別的方法。適當地，膜可以是整個細胞的成分。做為選擇，膜可以形成內部細胞結構的一部分，例如細胞器、線粒體和細胞核。特別地，本發明涉及對蛋白質成分，例如膜蛋白或其片段的差示分析方法。做為選擇，該方法可被用于分析細胞樣品之間碳水化合物成分的差別。
根據本發明，使用具有特殊細胞滲透性特征的反應性熒光染料來靶向和標記在細胞膜的不同部分中表達的蛋白質，以用來進行蛋白質表達和蛋白質成分的差示分析。在此定義的蛋白質包括翻譯后修飾的蛋白質和蛋白質片段，例如，肽。翻譯后修飾的蛋白質的實例包括磷酸化蛋白質(磷蛋白)和糖蛋白。該方法允許在不同的目標樣品(例如，對照組織與患病組織；對照組織或細胞與藥物處理過的組織或細胞)中比較完整細胞群體或生物組織的膜蛋白。
在優選的實施方式中，配對使用染料來標記膜蛋白。參考根據本發明方法的附圖2a和2b的流程圖，將每個細胞或組織樣品的獨立等分試樣與選自染料配對的第一個染料一同反應。在配對中的每個染料能夠選擇性地標記膜蛋白成分，并且每個染料都具有一些特征，從而使得用染料配對中的任一個染料標記的蛋白質在分離介質中的相對遷移，與用另一個染料標記的該成分在分離介質中的相對遷移相同。此外，每個染料發出的光具有的性質可區別性地不同于另一個染料發出的光的性質。
在差示蛋白質分析中對樣品的倍增已經極大地改善了對不同樣品間蛋白水平的檢測。然而，由于實驗因素例如在樣品進入凝膠條時的蛋白質損失或凝膠-對-凝膠的差異產生的斑點強度方面的差異，可能是實驗設計中的主要誤差來源。因而，為了避免由判讀凝膠產生的錯誤生物學結論，適當地，在每個凝膠中包括標準樣品(內標物)，與每次分離一同移動。早先已經描述了利用DIGE方法使用內標物來量化總蛋白差別，參見Alban，A.等，Proteomics，(2003)，3，36-44。樣品中的每個蛋白質斑點可以與其在內標物中的樣本相比較，以產生相對表達的比例。基于樣品與其凝膠中的內標物的相對變化，進行凝膠間的樣品定量比較。這個方法有效地去除了系統(凝膠-對-凝膠)差異，允許對樣品之間被誘發的生物學改變進行精確的定量。也克服了進行凝膠重復實驗的需要，從而減少了每次實驗所需的凝膠數量。使用在凝膠之間相匹配的內標物也更為直觀。由于在實驗中的所有凝膠之間內標物的圖像是共同的，可以在內標物圖像之間進行匹配。常規的2-D電泳需要在不同凝膠上的不同樣品間進行匹配，由于樣品-對-樣品和凝膠-對-凝膠的差異，這在斑點模式中引入了差別。內標物間的匹配允許相同樣品間的匹配；因而斑點模式的差別僅由電泳差別產生。
在根據本發明的優選實施方式中，參考附圖2a和2b，用染料配對中的第二染料標記所有細胞樣品的集中物。來自待研究的所有樣品的每一個表面膜成分都將被表現在內標物中，樣品中的每個成分都可與內標物中的自身相比較，從而允許對細胞樣品之間細胞表面成分方面的差別進行精確的定量。使用兩種染料確保了在樣品間不會引入標記偽差，因為每個獨立樣品是用相同的染料標記，并且內標物總是用第二染料來標記。根據優選的方法使用兩種染料，因而提供了染料設計特征的更簡單的匹配，以確保標記的成分的相等的遷移。
本發明提供了適合于在根據本發明的優選方法中使用的試劑。優選的，使用一對熒光染料，染料根據它們的電荷和分子量特征進行相互匹配。因而，染料優選有近似相等的分子量，但這不是必須的。此外，根據電荷對染料進行匹配，以使得在一維或二維上電泳分離之后標記不同的蛋白質遷移到相同位置。維持蛋白質的天然電荷的染料是特別優選的，因為用這種染料標記的蛋白不產生p1變化。當賴氨酸是蛋白質的目標基團時，染料應具有+1的凈電荷；對于靶向蛋白質中半胱氨酸殘基的染料，凈電荷應當是不帶電的。
適當地，根據本發明的方法使用的染料被設計為具有滲透性特征以靶向細胞的特殊區域，例如外部暴露的蛋白質。示范性的特定標記試劑基本上是膜不滲透性的，因而能選擇性地標記表面膜成分，優選的，能選擇性地標記具有在細胞表面表達的暴露區域的目標膜蛋白。這種試劑通過是膜不滲透性的而對表面蛋白是選擇性的，從而避免標記內部蛋白質。適合于標記細胞表面蛋白用于隨后的檢測和分析的試劑是那些理想地擁有以下性質的試劑a)該試劑不能透過細胞膜。因而，通常，染料應具有總電荷，其增強染料的親水性并阻止染料分子穿過細胞膜的疏水脂質核心。因而，該染料可含有共價連接到染料發色團的一個或多個取代基，賦予染料親水特性。適合的取代基包括磺酸鹽、磺酸和季銨，其可以直接連接到染料結構上，或做為選擇，通過連接基團例如C1到C6烷基鏈連接。直接連接到染料結構的一個或多個磺酸鹽或磺酸基團是特別優選的。
b)該試劑應在生理條件下起反應以維持表面蛋白的天然狀態。優選的，配組中的每種染料能選擇性地與膜成分反應從而通過共價連接標記膜成分。在優選的實施方式中，染料應與具有互補性目標官能團的蛋白質特異性地反應，從而與蛋白質形成穩定鍵。當下游分析需要利用變性條件時(例如在電泳中)這是很重要的。
c)配組中的每個染料應當是通過檢測手段很容易檢測和分辨的。因而，適當地，每個染料發出的光具有的性質可區別性地不同于該組中其余染料發出的光的性質。優選的，依據其熒光波長和/或其熒光壽命，每個染料是彼此可區分的。因而，發光性質可以是染料的發射波長，每個染料的特征是其不同于配組中任何其他染料的發光波長。做為選擇，染料的發光性質可以是他們的發光壽命，在組中的每個染料以不同的發光壽命為特征。
具有適合的用于本發明的特征約染料可以選自公知的熒光染料種類，包括熒光素、羅丹明、花青染料、吖啶酮染料和喹吖啶酮染料。
用于本發明的優選的染料種類是花青染料?；ㄇ嗳玖媳憩F出強烈的光譜吸收帶特征，其吸收可以通過合成設計在很大的光譜范圍內調整。特別優選的染料選自具有結構(1)的花青染料。
其中n是1到3的整數；X和Y是相同的或不同的，選自＞C(CH3)2、O和S；基團R1和R2之一是基團-E-F，其中E是具有選自線性或分支的C1-20烷基鏈的、1-20個連結原子的鏈的間隔基團，其可任選地含有一個或多個醚鍵、一個或多個酰胺鍵、和一個或多個不飽和基因，F是能與待標記的成分上的互補性基團反應的目標鍵合基團；余下的基團R1或R2選自C1-C6烷基、或基團-(CH2)m-W，其中W選自 和 其中R′、R″和R選自C1-C4烷基，m是1到10的整數；R3和R4的至少一個是磺酸鹽或磺酸基團；和當所述R3和R4基團之一不是磺酸鹽或磺酸基團時，所述余下的R3或R4是氫。
優選的，根據式(1)的花青染料是染料的配對，其中每個染料的n不同并且是1或2；X和Y都是＞C(CH3)2。
用于本發明的可選擇的染料可以選自具有結構(2)的吖啶酮染料
其中基團R1、R2和R3之一是基團-E-F，其中E是選自線性或分支的C1-0烷基鏈的、具有1-20個連結原子的間隔基團，其可任選地含有一個或多個醚鍵、一個或多個酰胺鍵、和一個或多個不飽和基因，F是能與待標記的成分上的互補性基團反應的目標鍵合基團；當R2或R3不是所述基團-E-F時，它們獨立地選自氫、鹵素、酰胺、羥基、氨基、單-或雙-C1-C4烷基取代的氨基、巰基、羧基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、磺酸鹽、磺酸、季銨和基團-(CH2-)n-Z；和當基團R1不是所述基團-E-F時，其選自氫、C1-C6烷基、基團-(CH2)k-Z，其中Z選自磺酸鹽、磺酸、季銨和羧基；k是1到6的整數。
適當地，在式(1)或(2)化合物中的目標鍵合基團F是反應或官能基團。反應基團可以在適當的條件下與待標記的成分的官能基團反應(如表1所示)；而官能基團可在適當的條件下與該成分的反應基團反應，從而該成分被該化合物標記。
表1可能的反應基團和可與之反應的官能基團
優選的，目標鍵合基團F是與羥基、氨基、巰基和醛基反應的反應基團。更優選的，反應基團選自琥珀酰亞胺基酯、磺基-琥珀酰亞胺基酯、異硫氰酸酯、馬來酰亞胺、鹵代乙酰胺和酰肼。
適當地，在式(1)和(2)的化合物中，間隔基團E具有1到20個連結原子，優選的，6到15個原子。
優選的，E是-{(CHRa)p-Q-(CHRa)r}s-，其中Q選自-CHRa-、-NRa-、-O-、-(CH＝CH)-、和-CO-NH-；Ra是氫或C1-C4烷基，p是0-5，r是1-5，s是1或2。特別優選的Q是選自-CHRa、-O-和-CO-NH-，其中Ra如上述定義。
用于標記細胞表面蛋白上的賴氨酸殘基的優選的花青染料對是CyTM3和Cy5的單磺化的NHS酯，化合物I和II。
化合物I 化合物II 賴氨酸作為目標蛋白官能基團時，用花青染料標記導致正電荷的損失。因此，優選的通過利用帶正電荷的染料來補償帶電賴氨酸殘基的這種電荷損失，以維持蛋白質的天然p1。以這種方法，染料標記的蛋白質的遷移位置與未標記的蛋白質相比沒有改變?？梢岳眠B接到染料的帶正電荷的連接基團來實現附加的正電荷，例如通過共價連接吲哚氮原子的方法。
帶正電荷的花青染料的適合的實例是具有季銨連接基團的單磺化花青染料NHS酯，化合物III和IV。
化合物III 化合物IV 進一步的實例是具有吡啶連接基團的單磺化花青染料NHS酯，化合物V和VI。
化合物V
化合物VI 用于標記細胞表面蛋白的半胱氨酸殘基的適合的花青染料對是Cy3和Cy5的單磺化馬來酰亞胺基衍生物，化合物VII和VIII。
化合物VII 化合物VIII
做為選擇，可以使用能靶向蛋白質子集的染料，蛋白質子集例如翻譯后修飾的蛋白質，例如糖蛋白。通過首先將未端糖的鄰位(vicinial)羥基氧化為醛基，然后與帶有酰肼反應基團的染料反應，有可能標記糖蛋白的未端碳水化合物基團(參見Wilchek，M.和Bayer，E.A.，Methods in Enzymology，Volume 138，429-442(1987)。用于標記細胞表面糖蛋白的碳水化合物基團的適合的花青染料對是Cy3和Cy5的單磺化酰肼衍生物，化合物IX和X。對標記碳水化合物基團有用的可選擇反應基團是氨基脲或氨基衍生物。為了維持糖蛋白的總電荷，適合的染料應帶有總的中性電荷?？赏ㄟ^利用適當帶電的連接基團，例如如上述定義的基團W，來獲得總的凈中性電荷。
化合物IX 化合物X
更特別地，該方法包括在用選自染料配對的熒光染料，例如化合物IX和X，標記細胞表面之前，首先用氧化試劑，例如偏高碘酸鈉，短時間處理完整細胞，以將鄰位的二醇氧化為醛基。做為選擇，可以通過用半乳糖氧化酶處理細胞樣品以在末端半乳糖上產生醛基，然后與適合的熒光染料進行反應，來標記細胞表面糖蛋白。
根據本發明的方法可被用于各種細胞類型，包括所有正常的和轉化的細胞，其源自關于物種(例如，人、嚙齒動物、猿)、組織來源(例如，腦、肝、肺、心臟、腎臟、皮膚、肌肉)和細胞類型(例如，上皮、內皮)的任何已識別的來源。本發明還可被用于比較來自植物，例如，利用培養的植物細胞，的樣品中的細胞表面成分。培養各種細胞類型的已建立的方案是可獲得的。(參見，例如，Freshney，R.I.，Culture of Animal CellsA Manual of Basic Technique，2ndEdition，Alan R.Liss Inc.1987)。另外，用于本發明的方法的樣品可以源自被重組基因轉染然后培養的細胞，或那些已經受到外界刺激(例如熱休克或藥物處理)的細胞。
如果希望靶向細胞器(例如，核、線粒體)中的膜蛋白，可以在該方法中，在標記膜結構之前引入預分級步驟。在這種情況中，可以通過任何公知的方法來富集膜結構。例如，差速離心、密度梯度離心(例如，利用蔗糖梯度)、連續流動電泳或水性兩相分配法。
用熒光染料標記表面膜成分的方法是公知的，一般包括用選定的熒光標記試劑與膜接觸充分的培養時間，以允許試劑的結合以及形成染料和表面膜成分間的穩定連接。
可以利用各種公知的方法和提取試劑從完整的膜中分離染料標記的膜成分來形成提取物。一般地，例如通過勻漿、超聲處理、細胞溶解作用來瓦解來自組織/培養物的細胞，并在存在試劑的情況下提取和溶解蛋白質，所述試劑包括變性劑，例如尿素、硫脲，洗滌劑，例如SDS、CHAPS、Triton X-100、NP-40，還原劑，例如二硫蘇糖醇(DTT)、巰基乙醇，和緩沖液，例如Tris、HEPES。在選擇用于提取的緩沖液和pH時應考慮許多因素，包括所需緩沖能力的程度、溫度和離子強度對pH的影響、與金屬離子的相互作用和與隨后的純化操作的兼容性。一般地，可以在pH范圍5-9進行提取。也可以添加蛋白酶抑制劑，例如甲苯磺?；?PMSF)、乙二胺四乙酸(EDTA)、亮肽素、抑肽酶，來最小化內源蛋白酶導致的降解作用。為了增強檢測的敏感性，可以在分析前利用各種公知的方法，例如，通過利用與染料結合的固相抗體，來在樣品中物理地富集低豐度的染料標記的膜成分。
通過能使樣品分解成分離的成分的分離方法對來自每個細胞樣品的染料標記的成分進行分離。適當地，來自所有樣品的集中混合物的染料標記的成分的提取物的一部分，作為內標物來分離。優選的，在分離前，向標記的膜成分的每個獨立提取物的一部分中添加來自集中混合物的染料標記的提取物的一部分。分離細胞成分，例如碳水化合物、蛋白質和它們的衍生物的技術是公知的。分離步驟一般基于標記的成分的物理性質(例如電荷和分子量)，可以通過電泳方法或色譜方法進行。例如，可以通過一維電泳、二維電泳、毛細管區帶電泳、毛細管凝膠電泳或等電聚焦來分離肽和蛋白質。如果使用色譜法，可以通過親和色譜、尺寸排阻色譜、反相色譜、疏水作用色譜或離子交換色譜來進行。優選的分離標記的成分、特別是標記的細胞表面蛋白的分析方法是2-D凝膠電泳。
通過光學裝置、適當地通過成像儀器，例如CCD照相機、熒光掃描儀或共焦圖像儀來檢測和/或定量分離的蛋白質。通過分析不同的標記成分發出的熒光信號，可以確定樣品中存在的蛋白質之間的差別。比較來自不同樣品的蛋白質之間的相對熒光信號，可以用來量化蛋白質豐度方面的變化，所述變化是誘導的生物學變化產生的結果，例如疾病或藥物治療的結果。一般利用特意為2-DE分析而設計的軟件來進行凝膠圖像的分析。例如，DeCyderTM(Amersham Biosciences)是一種用于斑點檢測、本底扣除、取準、量化、位置匹配和倍增圖像的差異蛋白質表達分析的完全自動化的圖像分析軟件。這允許共同檢測同一凝膠內不同的標記樣品和橫跨一個實驗中所有凝膠的內標物樣品的凝膠間匹配。與內標物相比從而容許確定樣品間的蛋白質豐度比和容許進行統計學測試來確定數據的顯著性。
通常通過在分離步驟之后分離目標蛋白質，用胰蛋白酶降解蛋白質并通過MALDI-MS進行肽質量指紋分析，來獲得樣品中蛋白質的身份。利用MS/MS肽測序也可以來確定單個蛋白質成分的身份。為了清楚地鑒別標記的蛋白質(和因而細胞表面成分)，可以在分離和/或MS分析之前利用各種公知的方法，例如，利用與染料結合的固相抗體，來從未標記的成分富集或純化染料標記的成分。
本發明也可被用于靶向存在于細胞表面或在細胞表面表達的受體，例如那些參與細胞信號發送(例如，激素和生長因子受體，G蛋白偶聯受體)、轉運蛋白質(例如，糖轉運)、離子通道(例如，Na-KATPase、H-ATPase)、換能器(例如，ATP合成酶)、酶、抗原受體、配體結合(例如，胰島素受體)的受體和那些與細胞外蛋白質如細胞骨架連接的受體(例如，整合素)。該方法可被用于直接比較不同的處理例如不同的細胞刺激的影響，或不同的環境效應對膜成分、豐度改變、細胞位置或蛋白質構象(例如，通過比較游離硫醇或其他官能團)和蛋白質的翻譯后修飾(特別是糖基化)的影響。
本發明還提供染料配對，其中每種染料能選擇性地標記細胞表面成分。此外，每種染料發出的光的性質可區別性地不同于另一種染料發出的光。因而在第二個方面，提供染料配對，其中每種所述染料選自具有結構(1)的花青染料 其中n是1到3的整數；X和Y是相同的或不同的，選自＞C(CH3)2、O和S；基團R1和R2之一是基團-E-F，其中E是選自線性或分支的C1-20烴基鏈的、具有1-20個連結原子的間隔基團，其可任選地含有一個或多個醚鍵、一個或多個酰胺鍵、和一個或多個不飽和基因，F是能與待標記的成分上的互補性基團反應的目標鍵合基團；余下的基團R1或R2選自C1-C6烷基、或基團-(CH2)m-W，其中W選自 和 其中R′、R″和R選自C1-C4烷基，m是1到10的整數；R3和R4的至少一個是磺酸鹽或磺酸基團；和當所述R3和R4基團之一不是磺酸鹽或磺酸基團時，所述余下的R3或R4是氫。
優選的，每種所述染料根據其電荷和分子量特征相互匹配，從而用所述染料之一標記的成分在分離介質中的相對遷移與用另一種染料標記的該成分在所述分離介質中的相對遷移相同。
優選的，每種染料的n不相同并且是1或2，X和Y都是＞C(CH3)2。
適當地，每種染料具有與羥基、氨基、巰基和醛基反應的目標鍵合基團。優選的，目標鍵合基團是選自琥珀酰亞胺基酯、磺基琥珀酰亞胺基酯、異硫氰酸酯、馬來酰亞胺、鹵代乙酰胺和酰肼的反應基團。
在一個實施方式中，基團R1和R2之一是如上述定義的基團-E-F，余下的基團R1或R2選自C1-C6烷基。在另一個實施方式中，余下的基團R1或R2是基團-(CH2)m-W，其中W選自 和 其中R′、R″和R選自C1-C4烷基，m是1到10的整數；本發明也可被用于靶向存在于細胞表面或在細胞表面表達的受體，例如那些參與細胞信號發送(例如，激素和生長因子受體，G蛋白偶聯受體)、轉運蛋白質(例如，糖轉運)、離子通道(例如，Na-KATPase、H-ATPase)、換能器(例如，ATP合成酶)、酶、抗原受體、配體結合(例如，胰島素受體)的受體和那些與細胞外蛋白質如細胞骨架連接的受體(例如，整合素)。該方法可被用于直接比較不同的處理例如不同的細胞刺激的影響，或不同的環境效應對膜成分、豐度改變、細胞位置或蛋白質構象(例如，通過比較游離硫醇或其他官能團)和蛋白質的翻譯后修飾(特別是糖基化)的影響。
通過參考以下的實施例和附圖進一步說明本發明，實施例和附圖在此僅用于說明性的目的，而不應被解釋為限制本發明的范圍，本發明的范圍由附隨的權利要求來定義。
附圖1(a、b和c)是說明利用三個標記染料的兩個可選擇的樣品制備過程(1a和1b)，以及根據本發明的方法的一個實施方式的分離和分析方案(1c)的流程圖。
附圖2(a、b和c)是顯示利用染料配對、根據本發明的方法的優選實施方式的試驗設計的相應流程圖。
附圖3是細胞培養滲透性分析的圖像。這個圖像顯示了存活的U937細胞(灰色細胞)對于PBS中(a)Cy3(化合物I)或(b)Cy5(化合物II)的單磺化NHS酯是不滲透性的。用分開的活/死存活性色斑來說明表現出高染料吸收的細胞(白色細胞)是群體中的非存活細胞。
附圖4顯示了來自分離從U937細胞提取的蛋白質的2-D電泳凝膠的圖像(a)在完整細胞上用Cy3單磺化NHS酯(化合物I)標記細胞表面蛋白，(b)在細胞溶解和蛋白質提取之后用Cy5單磺化NHS酯(化合物II)標記總細胞蛋白質。從每個圖中，選出一個區域并放大以突出細胞表面存在的蛋白質。
附圖5顯示了來自用(a)Cy3單磺化NHS酯(化合物I)或(b)Cy5單磺化NHS酯(化合物II)在完整U937細胞上標記的細胞表面蛋白的2-D電泳凝膠的圖像。提取蛋白質，混合，并在單個凝膠上分離，共同檢測兩種染料。在每個圖像的同樣區域上的網線顯示了用每個染料標記的蛋白質的覆蓋和共遷移。
實施例實施例1染料的合成
i)一般實驗步驟在Jeol JNM-LA300 FT NMR光譜儀上記錄1H NMR(δH)譜。化學位移以δ(ppm)報告。將樣品在適合的氘代溶劑例如d4-甲醇中制備為溶液。利用Unicam UV3 UV/VIS光譜儀進行UV/VIS光譜。三甲氧基丙稀購自Karl Industries Inc.，Ohio，USA。所有其他化學藥品購自Sigma-Aldrich Company Limited，Dorset，England。
ii)2，3，3-三甲基假吲哚-5-磺酸鉀將肼基苯磺酸(20.0g)溶解在乙酸(60ml)中，添加3-甲基-2-丁酮(26.0g)，然后加熱回流3小時。在冰箱中冷卻并刮擦使期望的化合物沉淀，用2-丙醇稀釋灰白色稀漿并過濾(71％)。
將2，3，3-三甲基-5-磺?；?假吲哚(16.45g)加熱溶解在甲醇(160ml)中，添加2-丙醇中的KOH飽和溶液(100ml)。溶液變成黃色，形成固體。冷卻溶液，濾出固體形成灰白色固體(15.9g，98％)，δH(300MHz，CD3OD)7.84(m，2H)，7.46(d，1H)，3.30(s，3H)和1.35(s，6H)。
iii)1，2，3，3-四甲基-5-磺酰基-吲哚碘鹽2，3，3-三甲基假吲哚-5-磺酸鉀(1.0g，3.61mmol)和碘代甲烷(0.25ml，3.97mmol)在氮保護氣氛下與二氯苯(10ml)混合。利用沙浴將溶液加熱到100℃4小時。開始形成固體，但薄層色譜(30％MeOH/70％DCM)分析顯示產物形成不完全，因此添加額外的等量碘代甲烷，在冷卻到室溫之前額外加熱反應2小時。通過過濾收集固體，用二氯苯、二乙醚洗滌，然后真空干燥得到紫色固體(0.89g，98％)，δH(300MHz，CD3OD)8.06(m，1H)，7.94(dd，1H)，7.84(m，1H)，4.02(s，3H)和1.61(s，6H)。
iv)1-乙基-2，3，3-三甲基-5-磺?；?吲哚碘鹽2，3，3-三甲基假吲哚-5-磺酸鉀(10.0g，41.97mmol)和碘乙烷(4.0ml，50.35mmol)在氮保護氣氛下與二氯苯(40ml)混合。利用沙浴在120℃加熱溶液16小時，產生紫色固體。過濾收集固體，然后用二氯苯、氯仿和乙醚洗滌，產生淺粉色固體，(10.2g，91％)。δH(300MHz，CD3OD)7.98(m，3H)，4.55(q，2H)，1.56(s，6H)和1.48(t，3H)。
v)1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基-5-磺?；?吲哚碘鹽將2，3，3-三甲基假吲哚(6.4g，40mmol)溶解在二氯苯(25ml)中，攪動直至溶液勻質化。向其中添加6-溴己酸(15.6g，80mmol)，沙浴110℃加熱6.5小時。在刮擦燒瓶壁的同時將反應冷卻到室溫，然后將燒瓶放入冰箱1小時。此后，在紫色溶液中形成米黃色固體，過濾收集固體然后用二氯苯和乙醚洗滌，得到米黃色固體(7.42g，52％)。δH(300MHz，CD3OD)7.91(m，1H)，7.78(m，1H)，7.62(m，2H)，4.52(t，2H)，2.38(t，2H)，2.04(p，2H)，1.88-2.45(m，4H)和1.61(s，6H)。
vi)1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(1-乙基-3，3-二甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-二氫亞吲哚-2-基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鹽(化合物I)將1-乙基-2，3，3-三甲基-5-磺酰-吲哚碘鹽(2.0g，7.48mmol)，N，N′-二苯基甲脒(1.5g，7.48mmol)和三乙基原甲酸酯(1.1g，7.48mmol)溶解在乙醇(10ml)中，然后加熱回流(100℃)3小時。在反應燒瓶壁上形成固體，UV/VIS顯示在408nm處的新峰。添加二乙醚，過濾收集沉淀物和固體，用乙醚洗滌，在真空中干燥獲得黃色/橙色固體的(1.83g，66％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝408nm。
向無水吡啶(10ml)中的Cy3半染料(1.83g，6.22mmol)溶液中添加乙酸酐(1.0ml)，在氮保護氣氛下攪動反應10分鐘。此后添加1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基吲哚溴鹽(2.2g，6.22mmol)，在室溫下攪動反應16小時。用薄層色譜(20％MeOH/80％DCM)監視反應的進展。減壓移除溶劑，利用快速柱層析(反相硅膠水-50％甲醇梯度)產生299mg期望的Cy3酸產物(9％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝550nm。
在氮保護氣氛下將Cy3酸(50mg，0.09mmol)溶解在無水DMF中，然后在室溫下攪動。添加DIPEA(16μl，0.09mmol)和TSTU(30mg，0.09mmol)，攪動反應2小時直到由薄層色譜(20％MeOH/80％DCM)確定完全成為NHS酯。在真空中除去溶劑，在乙醚存在下研磨殘渣，產生粉紅色粉末(40g，67％)。δH(300MHz，CDCI3)8.35(m，2H)，7.89(m，2H)，7.35-7.10(m，5H)，6.55(m，1H)，4.07(m，4H)，3.69(m，2H)，3.11(m，2H)，2.54(m，2H)，1.75-1.60(m，6H)和1.42(m，15H).ESi+MS 648.3。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝550nm。
vii)1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氫代己基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(1，3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-二氫亞吲哚-2-基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鹽(化合物II)將1，2，3，3-四甲基-5-磺?；?吲哚碘鹽(5.00g，11.90mmol)懸浮在乙酸(40ml)和TFA(2ml，18.0mmol)的混合物中，直到固體溶解。向反應中添加1，3，3-三甲基丙稀(12.5ml，95.0mmol)，在室溫下攪動5小時。將溶液移入500ml二乙醚中，過濾收集沉淀(4.80g，含鹽)。
向甲醇(40ml)中的Cy5半染料(4.80g，14.9mmol)的溶液中添加乙酸鉀(3.00g，34.2mmol)和1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基吲哚溴鹽(3.00g，16.4mmol)。攪動過夜后，將溶液移入二乙醚(500ml)中，過濾收集藍色固體，真空干燥。通過快速柱層析(反相硅膠水-50％甲醇梯度)進行純化，產生2.30g期望的產物(28％)。
在氮保護氣氛下將Cy5酸(50mg，0.09mmol)溶解在無水DMF中，然后在室溫下攪動。添加DIPEA(16μl，0.09mmol)和TS TU(30mg，0.09mmol)，攪動反應2小時直到由薄層色譜(20％MeOH/80％DCM)確定完全成為NHS酯。在真空中除去溶劑，在乙醚存在下研磨殘渣，產生藍色粉末(65g，90％)。δH(300MHz，CD3OD)8.29(m，2H)，7.88(m，2H)，7.32-7.00(m，5H)，6.57(t，J＝13Hz，1H)，6.13(m，2H)，3.97(m，2H)，3.66-3.51(m，3H)，3.08(m，4H)，2.55(m，2H)，1.75(m，2H)，1.64(m，2H)和1.35(m，12H).ESi+MS 660.3。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝642nm。
實施例22.1細胞培養，表面蛋白標記和蛋白質分離最初的實驗在U937細胞(高加索人組織細胞的淋巴瘤細胞)上進行，該細胞由ECACC提供(ECACC No.85011440 CB No.CB2275)。根據提供者推薦的方案培養U937細胞。在RPMI-1640生長培養基(10％胎牛血清)中，在37℃，5％CO2，直立燒瓶中使細胞生長。對細胞計數，每2-3天進行傳代，將細胞濃度維持在2-9×105細胞/毫升。收獲之前一天，將細胞旋下，重懸浮在新鮮培養基中以最小化非存活細胞的水平。
為了在標記過程中維持細胞的生存力和最小化CyDye水解，在即將使用之前將花青染料在PBS中重構，得到80μM的最終濃度。
為了最小化蛋白水解，所有使用的緩沖液都是冰冷的，只要可能，所有的步驟都在冰上進行；此外，溶解緩沖液包含PSC-保護物(Roche)和蛋白酶抑制劑混合物(Roche)。一般地，每個標記反應中使用1.5×108細胞，而每次實驗收獲5-10×108細胞。通過在4℃，12,000×g離心10分鐘使細胞團?；?，在Dulbecco的配方PBS pH 7.2中洗滌。除去PBS，將細胞重新懸浮于PBS(3-6ml)中，分成1ml的部分(每個標記實驗1個)。對于每個1ml標記反應，通過離心使細胞團粒化，除去PBS。將細胞重懸浮于50μl含CyDye熒光劑的PBS(80μM)中。為進行標記，每50μg總蛋白使用～45pmole熒光劑。通過在冰上使細胞與熒光劑反應15分鐘來標記細胞表面蛋白。離心使細胞團?；?，盡可能除去未反應的熒光劑(防止標記內部蛋白)。為了淬滅任何殘余的未反應熒光劑，將細胞重懸浮于包含10mM賴氨酸的溶解緩沖液(7M尿素，2M硫脲，4％w/v CHAPS，30mM Tris，pH 7.5)中。通過超聲使細胞溶解(6μm振輻20秒，冰水中冷卻1分鐘，10個循環)。對溶液進行離心使細胞碎片團粒化，保留蛋白質(在上清液中)。
利用Bio-Rad Dc Protein Assay按廠家的描述(Bio-Rad，Hertfordshire，UK)確定U937細胞溶解物的蛋白質濃度。
2.2總蛋白提取和標記為了比較細胞表面表達的蛋白和總蛋白，制備細胞溶解物。如實施例2描述的收獲U937細胞之后，將細胞重新懸浮在溶解緩沖液中。通過超聲使細胞溶解(6μm振輻20秒，冰水中冷卻1分鐘，10個循環)。離心溶液使細胞碎片團?；?，根據標準的CyDye DIGE最小標記方案(Ettan DIGE用戶手冊，Amersham Biosciences，Buckinghamshire，UK)標記蛋白質(在上清液中)。
2.3通過2D電泳分離蛋白質利用標準的Amersham Biosciences 2D PAGE設備和PlusOneTM試劑(Buckinghamshire，UK)進行2-D電泳。在用2.5ml DryStripCover Fluid覆蓋的450μl再水化緩沖液(7M尿素，2M硫脲，4％w/vCHAPS，1％Pharmalytes(pH 3-10)，2mg/ml DTT)中，在ImmobilineDryStrip Reswelling Tray中，使Immobiline DryStrips(pH 3-10 NL，24cm)再水化過夜。利用IPGphor等電聚焦系統使條帶集中。在第二維PAGE之前，每個條帶用10ml平衡緩沖液A(7M尿素，2M硫脲，100mM Tris-HCl pH 6.8，30％v/v甘油，1％w/v SDS，5mg/mlDTT)在搖擺臺上平衡10分鐘，隨后用10ml平衡緩沖液B(7M尿素，2M硫脲，100mM Tris-HCl pH 6.8，30％v/v甘油，1％w/v SDS，45mg/ml碘代乙酰胺)再平衡10分鐘。然后將條帶加載到12.5％恒強度(isochratic)Laemmli SDS-PAGE凝膠上，進行跑膠。
2.4熒光凝膠成像和圖像分析利用Typhoon 9410掃描儀(Amersham Biosciences，Buckinghamshire，UK)按以下設置使標記的蛋白質顯像
對每個獨立的實驗優化曝光時間，以在99,000圖像上得到最高的像素值來避免信號的飽和。對于染料匹配的詳細定量分析，將凝膠圖像輸入到DeCyder(Amersham Biosciences，Buckinghamshire，UK)，一種2D差示分析軟件程序中。
2.5利用IN CellTM分析儀測定細胞膜滲透性為了確定細胞膜對不同熒光劑的滲透性，按實施例2.1的描述制備標記的細胞，用IN Cell分析儀分析完整細胞。這個儀器是一種共焦熒光顯微鏡，能以＞0.5μm的分辨率使細胞可視化，可被用于確定熒光標記的位置。為了最小化蛋白水解，所有使用的緩沖液都是冰冷的，只要可能，所有步驟都在冰上進行。對于每種測試的熒光劑，制備細胞并在冰上建立標記反應(如實施例2.1中所述)。在期望的時間點，取出標記的細胞的雙份等分試樣。
將標記的細胞的等分試樣置于384孔微量滴定平板中，在IN Cell分析儀上讀取。為了檢查細胞的生活力，向孔中添加LIVE/DEAD生活力著色劑(分子探針)，反應10分鐘。在IN Cell分析儀上再次讀取每個孔以確定那些死亡了的細胞。只有那些顯示是活著的細胞被用于評定細胞滲透性，而非存活細胞對于染料是可滲透的。
洗滌標記的細胞的等分試樣以除去未反應的游離染料。用PBS洗滌細胞，然后通過離心使細胞團?；⒓毎匦聭腋∮赑BS中，將等分試樣置于微量滴定平板中，在IN Cell分析儀上讀取。對于其余的量，添加LIVE/DEAD生活力著色劑，在冰上培養細胞10分鐘。將進一步的等分試樣置于微量滴定平板中，在IN Cell分析儀上讀取。
權利要求
1.一種檢測來自至少兩個含有閉合膜結構的樣品的表面膜成分之間的差別的方法，所述方法包括i)用選自染料配組的染料接觸每個樣品的獨立等分試樣，其中在所述配組中的每種染料能夠選擇性地標記所述膜成分，并且其中每種染料能夠發出冷光，所述冷光具有可區別性地不同于所述配組中其余染料所發出的冷光的性質；ii)從每個獨立等分試樣中制備染料標記的成分的提取物；iii)分離不同的染料標記的成分；和iv)檢測所述樣品中不同的染料標記的成分之間發光性質的差別；其特征是所述分離步驟iii)在存在內標物的情況下進行，所述內標物包含膜成分提取物，所述膜成分來自所述至少兩個樣品的等分試樣的集中混合物，并且其中使包含膜結構的樣品的所述集中混合物與選自所述染料配組的不同染料接觸。
2.根據權利要求1的方法，其中用選自染料配組的不同染料接觸所述樣品的每個獨立等分試樣，和其中所述方法在步驟iii)之前包含一個步驟，即，在分離各成分之前，使來自所有樣品的染料標記的成分的提取物的一部分相互混合，并與來自所述集中混合物的染料標記的成分的提取物的一部分混合。
3.根據權利要求1的方法，其中用選自染料配組的相同染料接觸所述樣品的每個獨立等分試樣，和其中所述方法在步驟iii)之前包含一個步驟，即，在分離各成分之前，提供與來自每個獨立樣品的染料標記的成分的提取物的一部分混合了的來自所述集中提取物的染料標記的成分的提取物的一部分。
4.根據權利要求1到3任何一項的方法，其中每種所述染料根據其電荷和分子量特征相互匹配。
5.根據權利要求1到4任何一項的方法，其中所述染料配組選自熒光素、羅丹明、花青染料和吖啶酮染料。
6.根據權利要求1到5任何一項的方法，其中所述染料配組選自具有以下結構的花青染料 其中n是1到3的整數；X和Y是相同的或不同的，選自＞C(CH3)2、O和S；基團R1和R2之一是基團-E-F，其中E是具有選自線性或分支的C1-20烷基鏈的、1-20個連結原子的鏈的間隔基團，其可任選地含有一個或多個醚鍵、一個或多個酰胺鍵、和一個或多個不飽和基因，F是能與待標記的成分上的互補性基團反應的目標鍵合基團；余下的基團R1或R2選自C1-C6烷基、或基團-(CH2)m-W，其中W選自 和 其中R′、R″和R選自C1-C4烷基，m是1到10的整數；R3和R4的至少一個是磺酸鹽或磺酸基團；和當所述R3和R4基團之一不是磺酸鹽或磺酸基團時，所述余下的基團R3或R4是氫。
7.根據權利要求1到5任何一項的方法，其中所述染料配組選自具有以下結構的吖啶酮染料 其中基團R1、R2和R3之一是基團-E-F，其中E是具有選自線性或分支的C1-20烷基鏈的、1-20個連結原子的鏈的間隔基團，其可任選地含有一個或多個醚鍵、一個或多個酰胺鍵、和一個或多個不飽和基因，F是能與待標記的成分上的互補性基團反應的目標鍵合基團；當R2或R3不是所述基團-E-F時，它們獨立地選自氫、鹵素、酰胺、羥基、氨基、單-或雙-C1-C4烷基取代的氨基、巰基、羧基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、磺酸鹽、磺酸、季銨和基團-(CH2-)n-Z；和當基團R1不是所述基團-E-F時，其選自氫、C1-C6烷基、基團-(CH2)k-Z，其中Z選自磺酸鹽、磺酸、季銨和羧基；k是1到6的整數。
8.根據權利要求6或7的方法，其中所述組的每種染料具有目標鍵合基團F，其是與羥基、氨基、巰基和醛基反應的反應基團。
9.根據權利要求8的方法，其中所述反應基團選自琥珀酰亞胺基酯、磺基琥珀酰亞胺基酯、異硫氰酸酯、馬來酰亞胺、鹵代乙酰胺和酰肼。
10.根據權利要求1到4的方法，其中所述染料配組是二吡咯次甲基二氟化硼染料(dipyrromethine boron difluoride dyes)的衍生物。
11.根據權利要求1的方法，其中每種所述染料根據其熒光波長和/或其熒光壽命是相互可區分的。
12.根據權利要求1到11任何一項的方法，其中所述成分包括膜蛋白或其片段。
13.根據權利要求12的方法，其中所述蛋白質包括磷蛋白。
14.根據權利要求1到11任何一項的方法，其中所述成分包括碳水化合物衍生物。
15.根據權利要求1到14任何一項的方法，其中所述分離步驟是通過電泳法進行的。
16.根據權利要求15的方法，其中所述電泳法包括一維電泳、二維電泳、毛細管區帶電泳、毛細管凝膠電泳或等電聚焦。
17.根據權利要求1到14任何一項的方法，其中所述分離步驟是通過色譜法進行的。
18.根據權利要求17的方法，其中所述色譜法包括親和色譜、尺寸排阻色譜、反相色譜、疏水作用色譜或離子交換色譜。
19.根據權利要求1到18的方法，其中所述檢測發光性質差別的步驟是通過熒光顯微術進行的。
20.根據權利要求1到18的方法，其中所述檢測發光性質差別的步驟是通過光學成像進行的。
21.一種染料配對，其中每種所述染料能夠選擇性地標記細胞表面成分，和其中每種染料發出的冷光具有可區別性地不同于另一種染料發出的冷光的性質，和其中每種染料選自具有結構(1)的花青染料 其中n是1到3的整數；X和Y是相同的或不同的，選自＞C(CH3)2、O和S；基團R1和R2之一是基團-E-F，其中E是具有選自線性或分支的C1-20烷基鏈的、具有1-20個連結原子的鏈的間隔基團，其可任選地含有一個或多個醚鍵、一個或多個酰胺鍵、和一個或多個不飽和基因，F是能與待標記的成分上的互補性基團反應的目標鍵合基團；余下的基團R1或R2選自C1-C6烷基、或基團-(CH2)m-W，其中W選自 和 其中R′、R″和R選自C1-C4烷基，m是1到10的整數；基團R3和R4的至少一個是磺酸鹽或磺酸基團；和當所述R3和R4基團之一不是磺酸鹽或磺酸基團時，所述余下的基團R3或R4是氫。
22.根據權利要求21的染料配對，其中每種染料都具有一些特征，從而用一種所述染料標記的成分在分離介質中的相對遷移，與用另一種染料標記的該成分在所述分離介質中的相對遷移相同。
23.根據權利要求21或22任何一項的染料配對，其中每種染料具有目標鍵合基團，其是與羥基、氨基、巰基和醛基反應的反應基團。
24.根據權利要求23的染料配對，其中每種染料具有選自琥珀酰亞胺基酯、磺基琥珀酰亞胺基酯、異硫氰酸酯、馬來酰亞胺、鹵代乙酰胺和酰肼的反應基團。
全文摘要
本發明公開了匹配的熒光試劑，并描述了一種方法，該方法用于可再生性地標記膜成分例如那些在細胞表面表達的膜成分，隨后差示分析該標記的成分來檢測不同細胞類型和狀態之間的差別。此外，當前的方法利用了一種內標物來使跨凝膠的蛋白質模式相匹配，從而避免凝膠－對－凝膠的變異。根據本發明的方法可特別用于，例如，檢測低豐度的膜蛋白、檢測在細胞膜中表達的受體中的變化，例如，在配體結合或響應刺激時的變化。
文檔編號C07K1/13GK1839316SQ03826856
公開日2006年9月27日 申請日期2003年5月28日 優先權日2003年5月28日
發明者C·科普斯, S·J·福勒, I·霍爾西, A·C·斯維特 申請人:通用電氣醫療集團英國有限公司