專利名稱：抑制蛋白質和酶活性的具有配位的雙(二苯基膦)二茂鐵配體的環鈀化合物和相關的疾病 ...的制作方法
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本發明涉及含有雙二苯基膦-二茂鐵配位配體的環鈀化合物和其類似物，其作為肽和酶的活性抑制劑，這些肽和酶包括絲氨酸肽酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和肽鏈內切酶家族，其中的一些是惡性腫瘤生長和轉移路線所必需的。通過作用于這些酶并參與DNA分子的插入，這些化合物調控免疫系統。
本發明的基礎在制藥領域，研究者特別關注無機化學的研究，因為其在治療一系列疾病方面的用途比傳統藥物具有明顯的優點。
得到最佳研究的無機藥物是順鉑，一種臨床用來治療許多種腫瘤的藥物。人們相信，其是以與DNA發生相互作用而抑制腫瘤細胞的增生的方式而發揮作用的(Lippard，Science 2181075-1082(1982)；Rosenberg，Nature 222385(1969)；Cleare等，Bioinorg.Chem.2187(1973))。這種化合物能有效地對抗不同種腫瘤，具有高細胞毒性，并廣泛地作用于正常細胞(Ebert，U.，Loffler，H.，Kirch，W.，Pharmacology & Therapeutics，74(2)207-2201997；Spencer C.M.，Goa K.L.，Drugs，50(6)1001-1031 DEC 1995)。
基于金的復合體已用于治療關節炎，其作用路徑包括與蛋白質硫醇基團連接，從而抑制使其變性的二硫鍵橋(disulphite bridges)出現。
鈷的金屬復合體也已指出具有抗病毒、抗腫瘤和抗微生物活性及抗炎癥屬性。
能夠改變或連接蛋白質的功能性位點，從而使其生物活性喪失的金屬化合物在美國專利No.5,880,149中有描述。該文獻公開了一些鈀復合體(屬于配位化合物)，作為半胱氨酸蛋白酶的不可逆性抑制劑，作為有效的抗腫瘤藥物和作為對大量感染過程非常有效的藥物，其中涉及到半胱氨酸蛋白酶的作用路徑。例如，我們提到鈀復合體對組織蛋白酶(Cathepsins)B、H、J、L、N、S、T和C及對白介素轉化酶(白介素Converter Enzyme，ICE)的酶抑制作用，從而組成對抗阿米巴病、錐蟲病和利什曼病的活性藥物。該美國專利是已發表的關于抗腫瘤藥物，包括化學元素鈀化合物的作用的產生和路徑的最新成果。
本發明的公開本發明提供了改良了的鈀復合體(屬于有機金屬化合物家族)，其含有δC-PD鍵和配位鍵Y→Pd，形成有機環，因而將這些化合物命名為環鈀，也稱為鈀環。
本發明所涵蓋的上述化合物可以用如下示意
圖1的通式A、B或C定義
示意圖1 其中-X代表選自下列的元素鹵素(Cl、F、Br、I)；擬鹵素(N3、NCO、NCS、SCN)；或乙酸根；和-Y代表選自元素周期表V或VI族的元素，如N、P、As、Sb、Bi、O、S、Se、Te；-C代表sp2或sp3雜化的碳原子，其與鈀原子共價連接。含有C、Y和D的所示的環可以由三到八個原子組成。
-C和Y之間，用曲線表示，具有連續的原子形成環鈀的環，由三到八個原子組成，包括鈀原子。典型地，非限制性地，所述原子選自碳、氮、氧或硫。另一方面，構成該環的每一個原子與其它原子或基團相連，形成該環的可變外部結構，線狀或環狀，本申請人對此不作特別限制。
-L代表配位配體，其是來源于元素周期表V組(N、P、As、Sb、Bi)的供體原子(donating atom)，位于雙二苯基膦-二茂鐵化合物中，具體如下示意圖2所示，所示存在的L-L表明在所述的雙二苯基膦-二茂鐵化合物中存在兩個連接子L，而R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12分別代表了下列基團，可以任何順序出現氫(H)、烷基、芳基、二烯基、烷氧基、硅氧基、羥基(OH)、氨基(-NH2)、亞胺基、鹵素(F、Cl、Br、I)、亞氨基、硝基(-NO2)。
示意圖2 依據用于合成的雙二苯基膦-二茂鐵配體的比例及溶劑的比例，可以產生單核分子化合物(結構1A，單齒環鈀化合物)、單核離子(結構1B，鰲合的雙齒環鈀化合物)和雙核分子(結構1C，橋狀的雙齒環鈀化合物)。當使用2mol的雙齒(bidentade)配體L-L與1mol的起始復合物時產生結構1A和1B的化合物，當使用的比例是1∶1時，獲得結構1C所示的化合物。
在本申請中，[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)Cl]代表示意圖1A的具有單齒dppf配體的單核分子鈀復合物，[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)Cl]代表示意圖1B的以dppf連接子作為雙齒鰲合劑的離子型單核鈀復合物，[Pd2(C2，N-R+dmpa)2(μ-dppf)Cl2]顯示了以dppf連接子作為橋狀雙齒連接子的雙核分子鈀復合物。
在本發明的特定具體實施方案中，所獲得環鈀化合物如示意圖3和4所示，分別來源于N，N-二甲基-芐胺(示意圖3)和炔，即嘧啶基-苯基-乙炔(示意圖4A)和1-苯基-3-N，N二甲胺-丙炔(propine)(示意圖4B)。
示意圖3 示意圖4
本發明的更特定的具體實施方案是N，N-二甲基-1-苯乙胺(dmpa)，下面的示意圖5由N，N-二甲基-1-苯乙胺(dmpa)-對映異構體R(+)和對映異構體S(-)形成的環金屬環。
示意圖5 僅作為說明，上文示意圖3至5所示顯示了環鈀環，其應該理解為下面示意圖6所解釋的構象(以示意圖3的結構為例)示意圖6
在這個圖中，所述環鈀環含有5個原子，如A1至A5所示，如前文所述方式連接，即-碳原子(A1)通過δ鍵與鈀(A5)連接；-氮原子(A4，在通式中一般定義為Y)通過共價的供體成鍵與鈀(A5)連接；-原子A2是碳，其還與A1一起是環鈀環“外部”苯環的一部分；-氮原子A4與環鈀環“外部”的兩個乙基連接；-原子A3是另一碳原子，其與環鈀環“外部”的兩個氫原子連接；-鈀，即原子A5，與雙二苯基膦-二茂鐵連接，其中R1至R12是氫原子；-示意圖6的點部分表明了與鈀一起形成環鈀環的原子。
作為對所述例子的補充，所述的環鈀化合物與1，1’-雙二苯基膦-二茂鐵配體一起在某一情況下可以產生如下所示的復合結構。
根據本發明獲得大量的環鈀化合物，特別是來源于用(dmpa)表示的有機化合物N，N-二甲基-1-苯乙胺(三乙胺)的對映異構體R(+)和S(-)的化合物，其在其結構中含有配位的配體1，1’-雙二苯基膦-二茂鐵。這些化合物作為用來治療許多疾病的藥物具有許多優點。
這是因為所述的化合物具有抑制酶和蛋白質的能力，該酶和蛋白質包括屬于半胱氨酸蛋白酶(組織蛋白酶B)和絲氨酸肽酶(脯氨酰基寡肽酶)家族的酶和蛋白質以及血管緊張素轉化酶(ACE)和組織蛋白酶D。環鈀復合體形式的這些酶和蛋白質的抑制劑以前沒有描述，雖然該復合物是用已知的方法合成，但是含有雙二苯基膦-二茂鐵配體的這種化合物是全新的。
本發明的所述化合物對酶或蛋白質的作用路徑主要以可逆的形式發生，尤其是對酶底物復合體。這種可逆性意味著給藥時的低毒性和不良副作用的減少，而不會影響其藥物效果。
所述環鈀復合體對大量酶都表現出抑制效果，如屬于組織蛋白酶B、脯氨酰基寡肽酶家族、組織蛋白酶D和血管緊張素轉化酶(ACE)的酶，因而這些化合物具有免疫調節屬性。抑制和免疫調節效果使待研究的環鈀化合物具有抗轉移、抗血管生成的屬性并參與細胞的凋亡，從而使它們成為藥物，特別是治療與這些蛋白有關的疾病，更特別地是治療實體或腹水惡性腫瘤(血液和淋巴系統)的藥物。
對甲狀腺癌至今還沒有特別的化學治療藥物，本發明的環鈀化合物是對抗甲狀腺癌、成神經細胞瘤的藥物。這主要是因為環鈀化合物與免疫系統間的干擾，導致抑制組織蛋白酶D和保護骨髓細胞的能力喪失。這些性質使本發明所述的化合物具有免疫學保護作用以對抗放射療法治療中產生的不需要的次級效果。
附圖的簡要說明圖1顯示了所述環鈀化合物對組織蛋白酶B的活性的影響；圖2A和2B分別顯示了CD光譜/與DNA分子相互作用；圖3顯示了在未接受治療測試動物中的Walker’s腫瘤(10天)；圖4顯示了沒有腫瘤痕跡(Walker’s腫瘤)的接受治療的測試動物(10天)；圖5顯示了具有Walker’s腫瘤(10天)的測試動物，其中右邊的沒有接受治療(12g腫瘤塊)，左邊的接受了局部治療(2g腫瘤塊)；圖6顯示了具有Ehrlich腹水瘤的動物的壽命，其中該動物用1mg/kg化合物[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)Cl]或[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)(N3)2]連續治療4天。用腫瘤細胞(1×106細胞/ml)接種該動物，并在所述步驟后72小時開始用所研究的化合物治療(p＜0.05Kaplan-Meier，Cox-Mantel)；圖7顯示了粘附在長時間培養物上清中的細胞數目，該培養物加入1mg/kg的環鈀化合物[Pd(C2N-(S-dmpa)(dppf)Cl]。除去非粘附細胞并每周計數(P＜0.05 ANOVA，Tukey)；圖8顯示了粒細胞/巨噬細胞(CFU-GM)的造血細胞前體的數量，其從來自正常動物的骨髓細胞的長時間培養物的上清中獲得，該動物用1mg/kg的環鈀化合物[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)Cl)]處理。每周除去非粘附細胞，測定CFU-GM的數量(P＜0.05 ANOVA，Tukey)；
圖9顯示了來自正常動物的骨髓細胞的長時間培養物的粘附細胞的數量，該動物每周用1mg/kg的環鈀化合物[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)Cl)]處理。在培養的最后(第9周)除去粘附細胞(P＜0.05-Wilcoxon)；圖10顯示了HL60細胞的細胞壽命延長百分率，其用不同環鈀化合物培養72小時；圖11顯示了K-562細胞的細胞壽命延長百分率，其用不同環鈀化合物培養72小時；圖12顯示了HL60細胞的形態，其與環鈀化合物[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)Cl)]一起培養72小時。有可能可以清楚地觀察到凋亡細胞，如核片斷和形成固縮核(picnotic nuclei)(著色Harry’shematoxyline-400×放大率)；圖13顯示了所述環鈀化合物的細胞毒性作用；圖14顯示了10uM環鈀化合物的體內抗腫瘤活性；圖15顯示了30uM環鈀化合物的體內抗腫瘤活性；圖16顯示了藥品1的化合物類似物的體內抗腫瘤活性，其如今含有功能炔作為環狀金屬。
對半胱氨酸蛋白酶的抑制效果組織蛋白酶B半胱氨酸蛋白酶包括在其活性位點具有巰基(-SH)的酶家族，它們夠通過活性位點中的特定半胱氨酸和組氨酸間的協同交互反應而以已知的方式切斷酰胺鍵(美國專利No.5,880,149)。在具有四個或多個超級家族的細菌、病毒、真核微生物、植物和動物中能發現這些蛋白。本發明所述的環鈀化合物對組織蛋白酶B的抑制作用被首先指出是這些化合物顯示出抗腫瘤活性的主要原因。但是，本發明化合物的活性并不限于這種半胱氨酸蛋白酶，他們作為藥物的用途也不限于對抗癌癥。
本說明書所描述的環鈀化合物是下列半胱氨酸蛋白酶的活性抑制劑組織蛋白酶B、H、J、L、N、S、T和C(二肽基-肽酶-I)，白介素轉化酶(ICE)，由鈣激活的中性蛋白酶，鈣蛋白酶I和II，病毒半胱氨酸蛋白酶，如心病毒肽鏈內切酶、腺病毒肽鏈內切酶和口瘡病毒(aphthovirus)肽鏈內切酶，和寄生蟲生命周期所必須的蛋白酶，如來自變形蟲、阿米巴、盤尾絲蟲、利什曼原蟲、線蟲、網柄菌、Therilerium、血吸蟲和錐蟲種(克氏錐蟲，這些酶也稱作cruzain或cruzipain)的蛋白酶。Rawlings等(J.Biochem.290205-218，1993)和Sajid M.等(Molecular and Biochem.Parasitology，120(1)1-21，2002)給出了這些化合物可以抑制的所有半胱氨酸蛋白酶。
因此，環鈀化合物作為藥物的用途涉及很大的范圍。具體來說，其作為抑制劑對組織蛋白酶B、L、S、Cruzaine和白介素-1β轉化酶發揮作用。這些酶是溶酶體蛋白酶，與組織退化所導致的許多疾病過程有關。這些疾病包括關節炎、肌肉萎縮、腫瘤入侵、腎小球腎炎(glomeronephritis)、寄生蟲造成的骨質感染、牙周疾病和腫瘤轉移等。
JBC中公開的Schotte等的工作(VOL.276，N°24，Issue of June15，pp.21153-21157，2001)證實了組織蛋白酶B抑制劑在轉錄水平防止白介素-1α、白介素-1β和腫瘤壞死因子的產生。由于基因表達，其也與核因子κB(NF-κB)的轉錄激活潛能的抑制有關。因此，對組織蛋白酶B和NF-κB表現出抑制活性的環鈀化合物形成治療大量炎性疾病如支氣管炎、關節炎、風濕、骨質疏松、急性胰腺炎和癌擴散的藥物。
對絲氨酸肽酶的抑制效果脯氨酰基-寡肽酶脯氨酰基-寡肽酶組成了一個屬于絲氨酸肽酶集團的酶家族，其不能水解30個以上殘基的肽。這組酶包括二肽基-肽酶IV、酰氨酰基-肽酶和寡肽酶B及原型(prototype)脯氨酰基-寡肽酶。最近測試脯氨酰基-寡肽酶(80kDa)的晶體結構表明該酶具有一個肽酶決定基和折疊的α/β水解酶，其催化三元體由一具有不常見的含有七個側頁(blade)的β折疊結構的中間通道組成，該通道即作為大肽過濾器的決定基。這個家族的酶抑制劑是研制新藥的重要來源，因為脯氨酰基-寡肽酶與大量的失調如健忘癥，調節憂郁癥和血壓有關，并作為重要的分子伴侶發揮跨內質網膜和線粒體膜轉運蛋白的作用(Sharova，E.I.；Russian Joumal of Plant Physiology，49(2)，255，2002)。
二肽基-肽酶IV與糖尿病有關，寡肽酶-B與錐蟲病有關(PolgarL.，Cellular and Molecular Life Sciences，59(2)，349-62，2002and Folop，V.等，Cell，94(2)，161-70，1998)。另外，在Psychoneuroendocrinology，26(1)，17-26，2001中Maes，M.等證實了該酶與食物性失調、暴食癥和厭食癥有關。脯氨酰基-寡肽酶(PEP)和二肽基-肽酶IV(DPP IV)在酒精中毒中的活性也得到證實，對于生產細胞因子和細胞因子受體如白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(INFN-γ)、IL-1拮抗劑受體(IL-1RA)、IL-10和粒細胞-巨噬細胞克隆(GM-CSF)的生長刺激因子，PEP和DPPIV濃度的降低使這些因子的產量增加(Maes，M.等，Alcohol，17(1)，1-6，1999)。這些酶在人體中的高活性還與心理壓力有關，參照Maes，M.和其同伴的Psychoneuroendocrinology，23(5)，485-495，1998。
DPP IV，也稱作CD26、EC 3.4.14.5，是糖蛋白受體，具有多種特征，包括細胞粘附、通過細胞外基質的細胞轉運子和在T細胞激活過程中的潛在的共刺激因子。由于它是肽鏈外切酶，因此其是調節激素肽的代謝的關鍵。其中，這些酶的選擇性抑制已經用于治療II型糖尿病，在其中該酶參與復雜的調控循環，如Hildebrandt與其同伴在Clinical Science，99(2)，93-104，2000中的描述。
一回顧性工作表明了DPP IV的屬性和其抑制劑的藥物潛能(Augustyns，K.；Bal，G.；Thonus，G.；Belyaev，A.等，Current MedicinalChemistry，6(4)，311-327，1999)，證明了其作為白細胞CD26的抗原的特征和其對新底物胰高血糖素化學因子的作用。該工作還討論了其抑制劑對抗HIV病毒(AIDS)感染的藥物學潛能和它們與免疫系統的相互關系。
在另一方面，Joyeau和其同伴證明了特定的脯氨酰基-寡肽酶Tc80是克氏錐蟲代謝所必需的，其抑制劑是對抗查格斯氏病(Chagasdisease)的潛在藥物(European Journal of Medicinal Chemistry，35(2)，257-266，2000)。
寡肽酶B是在革蘭氏陰性細菌和錐體蟲中發現的絲氨酸肽酶新家族中的一員(Juhasz，T.；Szeltner，Z.；Renner，V.；Polgar，L.，Biochemistry，4(12)，4096-4106，2002)。布魯氏錐蟲含有絲氨酸寡肽酶(OP-TB)，在非洲錐體蟲(Tripanosoma africana)感染期間由宿主釋放到血液中(Morty，R.E.；Lonsdale-Eccles，J.D.；Morehead，J.等，Journal of Biological Chemistry，274(37)，26149-156，1999)。
中性肽酶也具有血管緊張素II的調節屬性(Maric，C.；Walther，T.，FASEB JOURNAL，16(4)，A93，Part 1，2002)，此類酶日益明顯地表現出所描述的ACE的性質及其與免疫調節的關系。(Inguimbert，N.等；Journal of Medicinal Chemistry，45(7)，1477，2002)。
組織蛋白酶D組織蛋白酶D是酸性肽鏈內切酶，其是乳癌的先兆因子(Kraimps，J.L.，Metaye，T.，Millet，C.，Margerit，D.，Ingrand，P.，Goujon，J.M.，Levillain，P.，Babin，P.，Begon，F.，Barbier，J.，Surgery1995 Dec.，118(6)1036-40)，在骨髓癌和甲狀腺腫瘤中高濃度表達(Holm，R.，Hoie，J.，Kaalhus，O.，Nesland，J.M.，Virchows Arch1995；427(3)289-94)。組織蛋白酶D位于腫瘤和正常細胞中，分別地，其在癌細胞、腺瘤和嚴重的甲狀腺疾病中比在正常細胞中具有更高的活性(Metaye，T.，Kraimps，J.L.，Goujon，J.M.，Fernandez，B.，Quellard，N.，Ingrand，P.，Barbier，J.，Begon，F.，J.Clin.Endocrinol.Metab.1997 Oct；82(10)3383-8)。組織蛋白酶B和L在皮膚癌(黑素瘤和神經瘤)中活性很高，組織蛋白酶D僅在黑素瘤中高水平表達，相反，組織蛋白酶H與損傷的侵入潛能有關(Frohlich，E.，Schlagenhauff，B.，Mohrle，M.，Weber，E.，Klessen，C.，Rassner，G.，Cancer，2001Mar 1；91(5)972-82)。組織蛋白酶D、nm23、EGFR和LR(通過免疫組織化學方法檢測)是陰性瘤乳癌轉移擴散距離的潛在標記，其中前三個酶的結合是更有把握的方法(Niu，Y.，Fu，X.，Lv，A.，Fan，Y.，Wang，Y.，Int J.Cancer，2002Apr 10；98(5)754-60)。免疫組織化學表明癌細胞表達的組織蛋白酶D與胃和腸腫瘤侵入的深度相關聯(Ikeguchi，M.，Fukuda，K.，Oka，S.，Yamaguchi，K.，Hisamitsu，K.，Tsujitani，S.，Sakatani，T.，Ueda，T.，Kaibara，N.，Oncology 2001；61(1)71-8)。根據免疫組織化學分析，在食道癌細胞中組織蛋白酶D的表達與蛋白p53的表達相關聯。在發聲食道(sound gullet)細胞中檢測不到組織蛋白酶D。很明顯，組織蛋白酶D的高度表達與所述腫瘤的侵入性生長有關系(Ikeguchi，M.，Sakatani，T.，Ueta，T.，Fukuda，K.，Oka，S.，Hisamitsu，K.，Yamaguchi，K.，Tsujitani，S.，Kaibara，N.，J.Clin.Pathol.2002Feb；55(2)121-6)。通過人組織蛋白酶D的表達載體在乳癌中的轉移對大鼠進行檢測表明，組織蛋白酶D與腫瘤的轉移過程直接相關。該酶的抑制劑，其中含有待研究的環鈀化合物，直接影響腫瘤轉移的減少和抑制(Marcel Garcia，Nadine Platet，Emmanuelle Liaudet，Volerie Laurent，Danielle Derocq，Jean-Paul Brouille，HenriRochefort，Stem Cells 1996；14642-650)。
本發明的鈀化合物是組織蛋白酶D的有效抑制劑，在劑量1-10ug時還是甲狀腺腫瘤的有效抑制劑。對這些腫瘤的三個細胞系WRO、NPA、ARO進行研究，結果表明本說明書所描述的化合物可以用于制備抗腫瘤的藥物，所述腫瘤在實踐中不能通過化學治療藥物治療。該環鈀化合物的免疫調節作用、抑制進入細胞分裂(S期)的幼骨髓細胞的作用使這些可能的藥物化合物可以用來聯合治療甲狀腺腫瘤，包括放射治療及抑制不需要的副作用，如白血病。
已經證實用酶抑制劑抑制溶酶體蛋白酶導致神經母細胞瘤細胞死亡(Castino，R.，Pace，D.，Demoz，M.，Gargiulo，M.，Ariatta，C.，Raiteri，E.，Isidoro，C.，Int J.Cancer 2002 Feb 20；97(6)775-9)。在這一方面，本發明的環鈀化合物對于治療這種癌癥提供了一個選擇，主要是在兒童中，在其中，該化合物是非常有效的，不存在使用已知化合物所產生的問題。
對金屬蛋白酶的抑制效果血管緊張素轉化酶(ACE)
血管緊張素轉化酶是金屬蛋白酶組的一部分，在其一個位點中含有鋅，與血管緊張素I向血管緊張素II的轉化有關。該酶有兩個決定基，命名為決定基C和決定基N，即其有兩個活性中心。血管緊張素II誘導造血系統(HPC)中的祖細胞增生，而血管緊張素I抑制該增生。另外，乙酰基-N-Ser-Asp-Lys-Pro(AcSDKP)肽也是該ECA酶的底物，其是造血系統母細胞增生的調節子。
在文獻中我們能找到大量的有關這些底物(血管緊張素I、血管緊張素II和肽AcSDKP)在調節免疫系統方面的效果和路徑的報道，如下文所述 Chisi等(Inhibitory Action of the PeptideAcSDKP...，Stem Cells 1997；15455-460)描述了組合使用AcSDKP與合適的ACE抑制劑來體外調節造血細胞增生。在巰甲脯氨酸(Captopryl)，一種有效的ACE抑制劑存在的情況下，所述肽AcDSKP的作用明顯抑制了該幼細胞的循環，其對該酶的活性位點N產生了作用。
在另一文章中，Chisi(Captopryl Inhibits TheProliferation of Hematopoietic Stem and progenitorCells...，Stem Cells 1999；17339-344)也揭露了用ACE抑制劑治療高血壓可能會導致全血細胞減少(pancitopeny)，但該原因仍不清楚。研究表明巰甲脯氨酸對骨髓細胞并不具有毒性，但其減少S階段巨噬細胞的比例。這些結果表明巰甲脯氨酸導致骨髓抑制(mielosuppression)。
Azizi等(Angiotensin I-converting Enzyme...，Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.2001 Dec；28(12)1066-9)描述了AcSDKP在體外被ACE水解，其是該酶活性位點的N末端的優選底物，但也是天然肽，該肽在體內被ACE活性位點的N末端水解。于是，ACE能通過永久地降解在S階段細胞中循環的天然抑制劑而調節造血。該次瞵酸肽(phosphinic peptide)RXP407(ACE的N決定基的體外選擇性抑制劑)并不影響血壓調節。
Aidoudi和其同伴(The Tetrapeptide AcSDKPReduces...，Int.J.Hematol.1998 Aug；68(2)145-55)測試了在用低劑量的胞核嘧啶阿拉伯糖苷(Ara-C)處理過的鼠中CFU-MK和CFU-GM祖細胞中的AcSDKP保護作用，包括體內和體外。這表明了在開始用Ara-C處理之前給藥AcSDKP，第一次注射Ara-C之后6到8天之間，CFU-GM、CFU-MK和MK成熟細胞數量出現明顯增加。結果表明在Ara-C處理期間AcSDKP對祖細胞具有保護作用。
Rousseau-Plasse(Lisinopryl，an angiotensinI-converting Enzyme Inhibitor...Exp.Hematol.1998 Oct；26(11)1074-9)報道了向人口服給藥ACE抑制劑增加了血漿中的AcSDKP濃度。通過放射對lisinopryl在鼠造血細胞S階段的增生階段的體內效果進行研究，放射后1小時用lisinopryl給藥。由于AcSDKP的內源血漿水平升高，因此100％的ACE鼠血漿活性受到抑制。
Li等(Production and Consumption Of theTetrapeptide AcSDKP...，Exp.Hematol.1997 Feb；25(2)140-6)利用長期骨髓培養(LTMC)分析了在AcSDKP代謝中人細胞微環境的作用。獲得的結果表明巨噬細胞在上清中合成并釋放AcSDKP；基質細胞的該肽遭ACE降解和細胞外基質和LTMC的成分起到儲存該肽的作用。
在檢測本發明的化合物在長效液態培養系統中的效果(延長體外暴露時間)，即檢測該化合物對負責維持幼骨髓細胞(干細胞)的骨髓基質(由成纖維細胞、脂信號細胞和內皮細胞等形成)形成的效果時，發現與對照相比較，延長對這些化合物的暴露時間，特別是含有配位配體1，1’-雙二苯基膦-二茂鐵的化合物，如通式A和B所示，的暴露時間，會明顯增加骨髓基質的粘附細胞。另一方面，發現在液體培養基上清中非粘附細胞數目的減少，且從這些培養基上清中獲得的細胞克隆(CRU-GM)數目減少。使用抑制血管緊張素轉化酶(ACE)的藥物，如巰甲脯氨酸觀察到這種反應標準。上述這些研究表明這種藥物抑制ACE，并增加四肽AcSDKP(ACE的底物)的濃度，該AcSDKP由骨髓基質細胞產生并抑制骨髓中的全能細胞進入細胞循環。這個事實是特別有利的，因為化學治療性藥物在細胞循環的S階段(DNA合成)發生顯著作用，其不僅作用于惡性細胞，而且還作用于來自迅速更新組織，如骨髓的細胞。所述環鈀化合物所產生的該短暫的細胞循環中斷與骨髓細胞的更高保護相關聯，從而對抗常規化學治療的髓毒性作用。
本發明的所述化合物是免疫調節子，因為骨髓細胞增生(粒細胞和巨噬細胞)的可逆性減少與噬菌細胞的活性降低和巨噬細胞釋放的白介素-1減少及相應的淋巴細胞刺激的減少有關，另外，所述的刺激還參與自體免疫疾病的進程，因此，本發明所述的化合物可以用作免疫抑制劑。
途徑本發明中化合物的作用途徑主要以可逆方式發生，因此具有低細胞毒性且不良副作用減少。
不考慮與之相關的理論方面，酶的抑制途徑可以用包含[Pd(C2，N-dmpa)(dppf)]X型二齒dppf配體的離子化環鈀復合物為例進行解釋。首先，二膦連接中的磷原子與離子Pd(II)間的配位鍵發生斷裂，同時與溶劑分子DMSO配位生成復合物[Pd(C2，N-dmpa)(dppf)(DMSO)]X。同樣地包含DMSO的復合物(或其他配位溶劑，如二甲基甲酰胺、嘧啶、THF及其他)還可以通過[Pd(C2，N-dmpa)(dppf)X]分子型的環鈀復合物形成，其中溶液中的X-離子遷移到金屬配位層的外面。對于含有[Pd2(C2，N-dmpa)2(dppf)2X2]型橋式dpf連接的環鈀復合物，該復合物[Pd(C2，N-dmpa)(dppf)(DMSO)]X很可能是由于環鈀復合物在DMSO溶液中缺乏穩定性而在DMSO/水的混合溶液中發生部分降解形成的。該復合物在DMSO中溶解數分鐘后生成Pd(0)使此事實進一步清晰化。[Pd2(C2，N-dmpa)2(μ-dppf)2(N3)2]的硝基甲烷溶液在加入若干滴DMSO后，其在25℃的摩爾電導率從9.3S.cm2增加到60S.cm2。
接下來，通過斷開配位鍵N-Pd并與新的DMSO分子配位，所述復合物[Pd(C2，N-dmpa)(dppf)(DMSO)]X可能會生成復合物[Pd(C2-dmpa)(dppf)(DMSO)2]X。溶液中最終生成的該有機金屬分子最有可能是酶作用的抑制劑。
鑒于游離的dppf配體和由其它類型的二膦配體形成的其他復合物均不能抑制酶活性的事實，我們可以得出結論酶活抑制現象極大地依賴于dppf二膦配體以及鈀復合物的化學結構。在此方式中，我們認為溶液中產生的有機金屬抑制劑，即復合物[Pd(C2，N-dmpa)(dppf)(DMSO)]X，與四面體中間復合物之間達到動態平衡，該中間復合體由巰基咪唑離子對與底物聚合形成。此反應的發生需要該復合物中存在的兩個金屬中心(Pd、Fe)的參與。在此模型中，高密度的帶負電荷的酰基基團與離子Pd(II)相互作用，同時取代DMSO分子并與半胱氨酸中高度活化的硫原子配位。另一方面，該硫原子與dppf配體中的鐵原子相互作用。溶液中各物質之間的平衡產生可逆抑制途徑。
本發明涉及作為蛋白質活性抑制，特別是酶抑制劑的環鈀化合物，該化合物含有雙二苯基膦-二茂鐵連接或其它由相同的磷基團作為供體原子的類似連接。這些化合物通過對相關酶產生作用以及插入DNA分子而調節免疫系統。
在特定的具體實施方案中，本發明涉及的化合物可抑制屬于絲氨酸肽酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶以及肽鏈內切酶家族的酶的活性。
在本發明的其它具體實施方案中，由本發明所揭露的化合物抑制的半胱氨酸蛋白酶是組織蛋白酶B、H、J、L、N、S、T和C(二肽基肽酶-I)，白介素轉化酶(ICE)，鈣激活的中性蛋白酶，鈣蛋白酶(Calpaine)I和II，病毒半胱氨酸蛋白酶，如心病毒肽鏈內切酶，腺病毒肽鏈內切酶和口瘡病毒肽鏈內切酶，以及寄生蟲生命周期中必需的蛋白酶，如來自變形蟲、阿米巴蟲、盤尾絲蟲、利什曼原蟲、線蟲、網柄菌、Therilerium、血吸蟲和錐蟲(T.cruzi，該酶也被稱為cruzaine或cruzipain)種中的蛋白酶。
在本發明更特定的具體實施方案中，本發明的化合物抑制的半胱氨酸蛋白酶為組織蛋白酶B，Cruzipain和白介素-1β轉化酶。
在更特定的具體實施方案中，本發明的化合物抑制的絲氨酸肽酶包括二肽基肽酶IV，酰氨酰基(acylaminacyl)肽酶，寡肽酶B和脯氨酰基-寡肽酶。
在本發明更特定的具體實施方案中，本發明的化合物抑制的金屬蛋白酶是血管緊張素轉化酶(ACE)。四類基質金屬蛋白酶(MMP)，即膠原酶，基質裂解素(Stromelisines)，膜型(membrane-type)金屬蛋白酶和Genatinases可以由本發明中的化合物抑制。因此，本發明中的化合物可有效地治療引起髓鞘(mieline)退化的中樞神經系統炎癥，包括多發性硬化癥以及自身免疫性腦脊髓炎(Cuzner，M.L.，Opdenakker，G；Journal of Neuroimmunology；94，1-14，1999)。
在另一特定的具體實施方案中，本發明的化合物抑制的肽鏈內切酶是組織蛋白酶D。腦啡肽酶(Encephalinase)或肽鏈內切酶24.11同樣受到所述化合物的抑制。因此，所述化合物可用于與心房利鈉因子(ANF)降解有關的心臟疾病。Varin，J.，Duboc，D.，Weber，S.，Fouchard，J.，Schwartz，J.C.，Muffatjoly，M.，Guerin，F；ArchivesDes Maladies Du Coeur Et Des Vaisseaux；84，1465-1471，1991。
在特定的具體實施方案中，可采用本發明中的化合物治療的疾病包括由于組織退化造成的疾病如關節炎、肌肉萎縮、腫瘤入侵、腎小球腎炎(glomerulonephrithis)、寄生蟲造成的骨質感染、parasitomies、牙周病和腫瘤轉移及其他；心房利鈉因子的降解有關的心臟疾病；炎性疾病如支氣管炎、風濕性關節炎、骨質疏松癥、急性胰腺炎和癌擴散；失調如健忘癥，抑郁癥和血壓的調控；糖尿病，錐蟲病，查格斯氏病，食物性失調，暴食癥和厭食癥；酒精中毒，與細胞因子和細胞因子受體如白介素-6(IL-6)、腫瘤死亡因子α(TNF-α)、干擾素-γ(INFN-γ)、IL-1拮抗劑受體(IL-1RA)、IL-10和粒細胞-巨噬細胞克隆的生長促進因子(GM-CSF)的產生有關的疾病相關的疾病，心理緊張，對抗HIV病毒(AIDS)引起的感染；引起髓鞘(mieline)退化的中樞神經系統炎性疾病，包括多發性硬化癥以及自身免疫性腦脊髓炎(Encephalomielitis)。除了參與與免疫系統調節有關的ACE抑制外，本發明的化合物還調節造血系統母細胞的增殖并顯著抑制幼細胞周期，缺乏骨髓抑制的高血壓。本發明所公開的環鈀化合物的作用可抑制腫瘤的入侵性生長，比如乳房，骨髓，腺瘤，甲狀腺，黑素瘤，胃，腸，食道以及甲狀腺腫瘤。在甲狀腺癌的治療中，當與放射性治療同時運用時，環鈀化合物可抑制不良副作用，比如白血病。環鈀化合物也可用于對抗成神經細胞瘤。所述環鈀化合物在惡性腫瘤的治療中體現出抗血管生長和抗腫瘤轉移的性質。
通過對酶作用和參予插入DNA分子，這些化合物調節免疫系統，因此不僅可以組成有效的主要用以對抗惡性腫瘤的抗腫瘤制劑，也可以作為其他組織退化相關疾病，炎癥過程引起的疾病和/或由病毒、細菌或寄生蟲引起的疾病，自身免疫性疾病，糖尿病，健忘癥，神經和食物性紊亂，壓力過大，酒精中毒和高血壓以及其他疾病治療中的活性成分。除了作為免疫調節劑和免疫抑制劑具有高度有效性外，本發明藥品可在低濃度下發揮作用，細胞毒性低，且在癌癥特定病例的治療中呈現抗血管生長和抗腫瘤轉移的性質。
合成本發明的鈀復合物含有疊氮基團(N3-)，合成復合物以在紅外區構成一個“光譜探針”，用以對復合物的離子或分子特征，其單核或二核性質進行更準確的結構描述。該基團在2040-2060CM-1區間(非對稱性伸展)和1400-1500CM-1區間(對稱性伸展)IV內具有正常的振動模式，，從而實現所述屬性。盡管此類化合物作為抗腫瘤劑和酶抑制劑具有生物效果，但由于它們呈現出的不良細胞毒性和副作用，影響細胞呼吸周期，因此此類化合物不用作藥品的最合適化合物。對于所有合成的含有疊氮基團的復合物，所獲的含氯離子(Cl-)的類似物不呈現所述的次級效應，可組成具有同等活性的藥物。
上述化合物的合成在常溫下進行，所用試劑為從商業供應商處購買的高純度試劑，不需要進一步純化。元素分析在IQ-USP-SP-Brazil分析中心完成。FT-IR光譜用Perkin-Elmer Spectrum-One分光光度計在4000-400cm-1范圍內測定用片狀KBr樣品獲取。1H和31P{1H}NMR譜由多核光譜儀Bruker Avance DPX-300分別于300和81MHz處獲取。質子NMR數據以ppm標記，采用0.00ppm的TMS作為參照。31P{1H}的化學置換以H3PO4為參照測量。所有的NMR測量在溶劑CDCl3中進行。復合物摩爾電導率以硝基甲烷為溶劑，用電導儀Metrohmmod.712測量。實施例1中說明了起始復合物。本發明的特定具體實施方案可在起始復合物的制備和進一步的實施例中得到說明。
用二膦配體制備復合物從實施例1中描述的起始復合物出發，根據本發明的特定具體實施方案，通過與1，1’-雙二苯基膦-二茂鐵(dPPf)進行反應，可合成大量的環鈀復合物。生成的產物決定于所用的化學計量比以及溶劑。分離得到的分子和離子復合物含有1或2個金屬中心，并含有單齒或二齒的與鈀離子(II)配位的二膦配體。
一般流程含有[Pd(C2，N-dmpa)(L)]X(L＝二齒配體)型螯合的二膦配體的離子化合物通過起始環鈀復合物與二膦連接(L-L)反應合成。二膦連接與相應的鈀復合物之間的摩爾比為2∶1。因此，將0.2mmol的環鈀化合物二聚體部分溶解于錐形瓶中的50ml丙酮中。隨后，將0.4mmol(L-L)加入所得到的懸浮液中。在室溫下持續搖晃混合溶液1小時。終溶液的溶劑在近干燥壓力下蒸發，加入正己烷使生成的固體沉淀析出。該固體隨即用乙醚洗滌，在真空中干燥。
含有[Pd(C2，N-dmpa)(L)X](L＝單齒配體)型的二膦單齒配體的分子化合物以二氯甲烷為溶劑，用類似流程合成。
含有[Pd2(C2，N-dmpa)2(μ-L)X2](L＝橋式二膦連接子)型的橋式二膦連接的二核環鈀復合物的合成以二氯甲烷為溶劑，二膦連接子和相應的鈀復合物的摩爾比為1∶1。本發明的所述優選具體實施方案在實施例2至4中予以說明。
化合物和酶的相互作用組織蛋白酶B和木瓜蛋白酶由Calbiochem Co.公司提供，酶活濃度用半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64通過滴定(titulation)來測定。組織蛋白酶B和木瓜蛋白酶于4℃保存于含有10μM的MMTS的50mM醋酸鈉緩沖液(pH5.0)中。熒光底物氨甲基香豆基Z-PHE-ARG-MCA，Tripsin和不可逆木瓜蛋白酶抑制劑E-64由Sigma公司提供。
有機金屬化合物對肽鏈內切酶組織蛋白酶B活性的影響運用熒光底物Z-Phe-Arg-MCA，由熒光分光光度計測定。此肽為組織蛋白酶B的優選底物，Kcat/Ks＝4.5×105M-1.s-1，其中的苯丙氨酸和精氨酸分別落在P2和P1位。該底物覆蓋了與木瓜蛋白酶類似半胱氨酸蛋白酶的主要連接位點S2，S1和S1’(Turk，D.et al，Revised definition ofsubstrate binding sites of papain-like cysteine proteases，J.Biol.Chem.；1998，379，137-147)。
熒光信號的強度由可控溫的熒光分光光度計Hitachi F-2000檢測。校準激發波長為380nm，發射波長為440nm。將酶置于含有200mMNaCl，1mM EDTA和2mM DTT的50mM磷酸鈉緩沖液中(pH6.4)中，于37℃放置5分鐘活化。測量在組織蛋白酶B的相同活化緩沖液中進行，動力學標準通過在不同濃度有機金屬化合物存在或不存在的情況下，測量不同濃度的底物的起始水解速率來確立。其結果采用軟件GraFit 3.01進行非線性回歸分析(Erithacus Software Ltd.)。
圖解1的動力學模型描述了肝磷脂對組織蛋白酶B水解Z-Phe-Arg-MCA的影響。
圖解1 其中，S代表底物Z-Phe-Arg-MCA；I代表環化金屬化合物；E代表組織蛋白酶B；Ks代表底物的解離常數；KI代表有機金屬的表觀解離常數；α是Ks的干擾系數(disturbance standard)；β是Vmax(Kcat)的干擾系數，這些干擾系數與下列等式中的一致
v=Vmax.[S]Ks(1+[I]KI)(1+β.[I]α.KI)+[S](1+[I]α.KI)(1+β.[I]α.KI)]]>動力學研究針對環鈀復合物[Pd(C2，N-(R+dmpa)(dppf)N3]進行。如圖1A所示，在組織蛋白酶B的動力學測試中有機金屬的存在導致Z-Phe-Arg-MCA水解Kcat值減小。另一方面，圖1B顯示化合物同時顯著提高了組織蛋白酶B和底物Z-Phe-Arg-MCA的親和力。該有機金屬對肽鏈內切酶組織蛋白酶B的作用可描述為如圖解1所示的抑制標準的一混合性雙曲線。該底物水解系統的效率可通過改變Ks(參數α)或Vmax(參數β)而改變。數據根據等式1進行非線性回歸處理，計算常數值。結果顯示[Pd(C2，N-(R+dmpa)(dppf)]N3與組織蛋白酶B(E)結合，其解離常數KH＝12±1μM，該化合物與酶-底物復合物(ES)結合，其解離常數為αKH＝2.4±0.3μM。該復合物還誘導組織蛋白酶B和底物Z-Phe-Arg-MCA的親和力提高了5.3倍；在有機金屬化合物存在的情況下，Ks值從110±15降低到21±2μM，α＝0.19±0.02(圖1B)，同時Kcat值在存在[Pd(C2，N-(R+dmpa)(dppf)]N3的情況下也降低了5.6倍，β＝0.18±0.02。該環鈀化合物降低產物形成常數至36(β＝0.18±0.02)，同時以相同比例提高組織蛋白酶B與底物Z-Phe-Arg-MCA的親和力(a＝0.19±0.02)，即a＝β。盡管有機金屬復合物強有力地抑制了組織蛋白酶B(81％抑制率)，但它的存在并不改變酶對底物的催化效率，β/α＝1.1±0.1。二級底物的水解效率在[Pd(C2，N-(R+dmpa)(dppf)]N3存在或不存在的情況下不變，Kcat/Ks＝4.5×105M-1.S-1。
從屬于木瓜蛋白酶超級家族的組織蛋白酶B和其它半胱氨酸蛋白酶有著高度保守的折疊結構(Turk，V.；Bode，W.，Lysosomal cysteineProteinases and their inhibitors cystatins.Innovations inProteases and their Inhibitors.Aviles，F.X.(編)，Walter deGruyter & Co.，Berlin，Germany，1993)。這些酶與肽鏈底物相連通過巰基咪唑離子對實現其蛋白質水解活性。半胱氨酸殘基和組氨酸之間的關聯保證了對半胱氨酸活性位點處的高度親核性(Michaud，S；Gour，B.J.，Cathepsin B inhibitors as potential anti-metastaticagents.Exp.Opin.Patents.，1998，8，645-672)。底物酰氨連接斷裂的同時形成酰基酶中間體。在形成米氏非共價復合物后，活性位點的巰基攻擊肽鏈生成氧化陰離子，該離子在所謂的由谷氨酰胺殘基形成的“氧化陰離子通道”中穩定。該四面體中間體的解體生成酰基酶，釋放出產物。隨后，酰基酶水解生成催化離子對，釋放出新的產物，即羧酸。實施例5以本發明化合物的方式顯示了酶活抑制分析。
這些結果證實了有關本發明化合物的作用的聲明，特別是在酶-底物復合物中的可逆作用。
化合物和DNA的相互作用(插入)
通過運用圓二色性技術進行研究(圖2)表明環鈀化合物引起DNA分子的結構變化，該變化具有時間和藥物濃度依賴性。這表明這些變化與細胞凋亡和細胞周期調控過程有關。
抗腫瘤效應本發明中的化合物在體內模型中進行了測試，采用大鼠作為實驗動物，用Walker-256乳房腫瘤，即″Walker’s腫瘤″作為實體的、入侵的、轉移性的腫瘤的模型，對這些模型上述化合物顯示出了很強的活性。實施例6和圖3、4和5顯示了實驗及所獲得的結果。
我們注意到化合物除了抑制腫瘤生長外，在90％的病例中成功地逆轉了腫瘤的生長。對上述Walker’s腫瘤，在體內模型中，上述化合物體現出對腫瘤細胞的選擇性細胞毒性，而在將藥物施加到正常組織上時未出現任何慢性炎癥信號。該化合物的另一個重要作用是其在細胞培養中對內皮細胞增殖的抑制效應，說明其重要的抗血管生長的作用。該化合物在體內模型中還顯示了對組織蛋白酶B和組織蛋白酶D強大的抑制作用，使其成為有效的抗轉移試劑，避免了腫瘤在骨骼肌中的轉移。
值得強調的是，在所有的動物治療試驗中均未發現任何副作用，這顯示了藥物高度專一性。以下的圖3，4和5顯示了所獲得的一部分實驗結果。
對免疫系統的效果
Ehrlich’s腹水性腫瘤(Ehrlich’s Ascitic Tumor)(EAT)為了觀察本發明的化合物對接受治療的動物可能產生的保護作用，對于接受或未接受治療的患有Ehrlich’s腹水性腫瘤的動物，繪制壽命曲線。
運用Kaplan-Meier壽命曲線對存活率進行分析。組間對比(腫瘤患者vs.腫瘤患者/接受治療)通過Log-Rank法-非常系數程序(non-parametrical procedures)(Cox-Mantel)進行。用ANOVA偏差分析對各組進行分析。差異明顯時，采用Tukey’s測試。對于兩組樣品數目較少的情況，采用Wilcoxon’s非常系數測試。
實施例7和圖6所示的測試顯示用本發明的化合物進行動物治療可延長患有Ehrlich’s腹水性腫瘤的動物壽命，這表明這類藥可以干擾腫瘤的升級。
毒性小鼠骨髓造血細胞前體(CFU-C)的克隆培養按照示意圖C(一般結構)及在實施例8中說明的流程，在對動物骨髓粒細胞和巨噬細胞的造血前體(CFU-GM)連續4天用以1∶2的結構含有1，1’-雙二苯基膦-二茂鐵配體的環鈀化合物治療后，對其數目進行測定，1mg/kg的劑量被證實沒有骨髓毒性。因為和對照組比較，接受治療的動物的骨髓粒細胞和巨噬細胞的造血前體(CFU-GM)的數量沒有顯示出顯著的差異，因而證明該劑量對骨髓沒有毒性。相同的劑量在體外試驗中得到了相似的結果(將所述化合物和正常動物細胞一起培育)。另一方面，當劑量高于5mg/L時，導致劑量依賴性CFU-GM的數量減少，這表明化合物對骨髓效應是劑量依賴的。
在長效液體培養系統中骨髓基質的形成按照示意圖C(一般結構)以及可以用來評估化合物在骨髓基質形成中的效果的實施例9所示的程序，在長效液體培養系統中檢測以1∶2的結構含有1，1’-雙二苯基膦-二茂鐵配體的環鈀化合物的效果，我們證實了延長細胞暴露于化合物的時間可以同時減少液體培養基上清液中的非粘附細胞的數量(圖7)和從這些培養的上清液中可以獲得的細胞克隆數(圖8)。另一方面，和對照相比，在環鈀產物存在的情況下，骨髓基質中的粘附細胞的數量有了顯著的增加(圖9)。此反應標準在使用抑制血管緊張縮素轉化酶(ECA)的藥物，如巰甲脯氨酸時也可觀察到，該藥物抑制骨髓全能細胞(干細胞)進入細胞周期。因此，暫時性地中斷細胞周期可能與更好地保護骨髓細胞免受化療產生的骨髓毒性作用有關系。
考慮到示意圖C(一般結構)的以1∶2的結構含有1，1’-雙二苯基膦-二茂鐵配體的環鈀化合物是一個ECA的抑制劑，以及考慮到在長效液體培養系統中的骨髓基質的形成的相關結果，比如粘附細胞的增加與母細胞克隆CFU-GM的減少的有關聯，這表明藥物即使在低濃度(1mg/kg)下仍具有抑制幼骨髓細胞進入細胞周期的能力。
由于可逆地減少骨髓細胞(粒細胞和噬菌細胞)增殖與降低噬菌細胞活性和減少由噬菌細胞釋放的白介素-1有關，進而與淋巴細胞刺激的減少有關，該淋巴刺激與自身免疫性疾病的升級有關，因而這些結果還說明本發明的化合物是免疫調節劑。因此本發明的化合物可用作免疫抑制劑。
這些結果證實的另一個方面是骨髓基質中的很多群落呈現微紅的特征，意味著所述化合物對微紅系列具有刺激活性，該刺激源于鐵的存在，鐵可以干擾細胞的新陳代謝。
急性毒性的檢測通過進行固定劑量試驗，本研究中使用的本發明的環鈀化合物濃度得以確定。在該試驗中，將待檢測物質以特定劑量施予小鼠，該特定劑量是根據法規部門的分類選擇的預定劑量，其最高濃度不得超過2000mg/kg。相比LD50試驗，該固定劑量試驗的優點在于該試驗中的評估標準并不需要動物死亡，因此用于每次試驗的動物的數量以及其承受的痛苦可以達到最小化(Barros & Davino，1996)。
給藥之后緊接14天的觀察期。在急性毒性的癥狀出現時，如毛發、黏膜和皮膚的變化，以及腹瀉和抽搐的發生，結膜炎，騷動或動作遲緩出現時所用的劑量用來對被測材料進行分級和分類。
依照實施例10所示方案獲得的結果顯示，由對映異構體S(-)dmpa和配體dppf以1∶1或1∶2的比例按照結構A，B和C(一般結構)生成的環鈀化合物分別在劑量增加到500和200mg/kg時仍沒有急性毒性，這標志著它們的低毒潛力以及隨后副作用的較低發生率。由于目前市場上可用藥品的系統毒性時常在個人化療的初始階段致死，因此本結果特別具有意義。
對白血病株HL-60和K-562的體外細胞毒性和原癌基因BCL-2的表達細胞毒性評估采用MTT-四唑還原法進行(二苯基四唑3-(4，5-二甲噻唑-2-基-2，5-溴))，該方法可通過線粒體氧化還原系統對細胞增殖和細胞毒性進行評估。在該方法中，四唑通過活細胞還原，形成甲臢(Formazan)鹽，可溶解該鹽(Mosmman，1983)，以通過ELISA在560nm處讀取。
根據實施例11所示的試驗所得到的結果，我們用兩種相似化合物所獲得的結果(圖10和11)證明了所述環鈀化合物在兩細胞株中都具有細胞毒性。結果顯示這些藥物為抗白血病藥，因為試驗所用的細胞株代表了對目前市場上提供的化學治療性藥物具有很強的耐受性的細胞。此外，其中的一個被測定的化合物，由對映異構體S(-)dmpa和配位配體dppf按照結構A(一般結構)以1∶2的比例合成的環鈀化合物，在12.5μg/ml的劑量下可以減少原癌基因bcl-2在白血病細胞HL60中的表達。鑒于bcl-2的大量表達會干擾細胞程序性死亡或凋亡進而干擾細胞對化療的反應過程，因而該結果表明該藥可誘導白血病細胞凋亡。當測試細胞在接受含疊氮基的化合物治療后其形態學方面的變化時，觀察到大量細胞的死亡(玻片上有破碎的細胞膜和細胞碎片)，這表明含疊氮的化合物會干擾氧化代謝過程。這與急性毒性研究中的結果一致。另一方面，接受環鈀化合物治療的白血病細胞HL60的形態學特征如圖12所示表現為細胞的程序性死亡或細胞凋亡。
黑素瘤的生物學分析在體外生物學分析中，將鼠黑素瘤細胞B16F10-Nex2與環鈀化合物共同培養24小時以證實藥物的細胞毒效應。體內分析在母鼠C57BI/6中進行，在其皮下植入105腫瘤細胞。在腫瘤植入后，用10μM的環鈀化合物每周3次進行腹膜腔內注射治療。
試驗結果見實施例12和圖13、14、15和16。
細胞培養分析甲狀腺腫瘤甲狀腺腫瘤細胞培養物進行分析，該細胞培養物來源于細胞株WRO、NPA和ARO。[Pd(C2，N-(S(-)dmpa)(L)X]型的分子化合物對細胞株WRO、NPA、ARO的抑制劑量(IC50)分別為0.48μg、0.59μg、0.60μg。化合物[Pd2(C2，N-(S(-)dmpa)2(μ-L)X2]呈現相似的抑制劑量(IC50)。由對映異構體R(+)dmpa合成的環鈀化合物類似物得到以下的抑制劑量(IC50)細胞株WRO為5.56μg，NPA為6.04μg，ARO為7.57μg。我們同樣觀察到對于[Pd2(C2，N-(R(+)dmpa)2(μ-L)X2]型化合物抑制劑量沒有顯著變化。所獲的結果清楚地顯示R(+)對映異構體的抑制劑量(IC50)比S(-)對映異構體高出10倍。該事實表明，由該化合物引起的細胞毒性過程具有對映體選擇依賴性，同時顯示結構中含有S(-)dmpa異構體的化合物具有更高的效率。
所得結果顯示這些化合物可成功地用于甲狀腺腫瘤的治療。此類腫瘤屬于過量表達組織蛋白酶D且目前尚沒有專一有效的化學療法對其進行治療的腫瘤。如果我們考慮到本發明的鈀復合物如同所證明的那樣可調節免疫系統，那么這些復合物對所述疾病的對抗能力甚至會更高。這意味著，除了給治療這類腫瘤帶來希望外，在此呈現的環鈀化合物還可以成為放療中的重要輔助藥用以抑制許多不良副作用，如白血病，脫發和對中樞神經系統細胞的破壞。
本發明中的環鈀化合物，特別是由N，N-二甲基-1-苯乙胺(dmpa)和配位配體1，1’-雙二苯基膦-二茂鐵(dppf)合成的R(+)和S(-)對映異體構形式的環鈀化合物，其呈現出顯著的抗癌潛力，特別是對白血病株和一些黑素瘤株，該化合物可以使細胞進入凋亡程序。
本發明中的化合物顯示出低毒潛力和副作用的低發生率。我們證實，和絕大部分具有骨髓毒性的化學療法相反，本發明中的化合物沒有骨髓毒性跡象。結果顯示這些藥物對造血功能具有作用，該作用是劑量依賴性的。在低劑量下，該環鈀化合物比傳統的化學療法對正常細胞產生的毒性低。
在測定此藥對長效液體培養系統的效果時，得到用藥物抑制血管緊張縮素轉化酶(ACE)觀察到的反應標準，因此產生細胞周期的暫時性干擾，于是更好地保護骨髓細胞對抗由傳統化療造成的骨髓毒性效應。
這些結果還顯示出了本發明的化合物作為免疫調節劑和免疫抑制劑的活性。
在同樣的測定中，我們證實了骨髓基質細胞群微紅系列呈現出的特征，這表明藥物對微紅系列可能存在刺激活性。
劑量與配方為實現本發明的目的，所述受體是動物或人，特別是人。
本發明中的環鈀化合物和含有至少一種本發明的化合物的組合物可以通過口服方式，注射方式，特別是腹膜腔注射方式，以本領域公知的藥物學上可接受的劑量給藥。在特定的具體實施方案中，該化合物以及含有本發明的化合物的組合物作為注射劑提供，其不會被消化系統改變。
該活性成分可以以固態劑型提供，如干粉，顆粒，片劑或膠囊，或以液態劑型提供，如糖漿或水懸浮劑。本發明的化合物的給藥還可以通過但不局限于諸如口服、皮下、靜脈內，鼻腔、跨皮膚、腹腔內、局部、肌肉內、肺內、陰道、直腸、眼部或舌下方式進行。在某些情況下，該化合物可以局部地應用，如通過噴霧或溶液應用。
該活性成分可以以獨立的形式給藥，但通常與藥物載體一同給藥。本發明的目標包括含有至少一種當前所揭示的環鈀化合物的組合物。Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing中提供了檢測藥物劑型有用方法。
本發明中的化合物和基于這些化合物的組合物可以以口服劑型給藥，如片劑、膠囊(每種分別包括定時釋放或延遲釋放配方)、丸劑、粉末、顆粒、西也劑、香精、懸浮劑、糖漿和乳劑。以同樣的方式，其給藥可以通過靜脈內(以混合液或灌輸液)、腹腔內，皮下或肌肉內進行。所有方式均采用制藥領域專家所熟知的劑型。使化合物產生理想效應的有效但非毒性的劑量可用于腫瘤的避免或治療，主要用于抵抗惡性腫瘤，與組織退化相關的疾病，由炎癥過程引起的和/或源自病毒、細菌或寄生蟲的疾病，自身免疫性疾病，糖尿病，健忘癥，精神和食物性疾病，緊張，酒精中毒和高血壓等。
本發明中的化合物的給藥方案自然地根據已知因素變動，比如特定制劑的藥效特征及其給藥的方式和途徑；物種，年齡，性別，健康狀況，醫療條件以及受體體重；癥狀的性質和范圍；正在進行的治療的類型；治療的頻率；給藥的途徑；受體的一般狀態以及需要達到的效果。具有常識的醫生或獸醫可以容易地根據預防，抵抗或延緩病情升級的需要決定藥物的有效用量，并開出處方。
本發明中的化合物可以方便地進行給藥，每日一次，或者每日的全藥量通過每日兩次、三次、四次或多次而部分地給予。在有些情況下，隔日給藥是合適的，循環或非循環給藥。
本發明中的化合物可以通過局部使用合適的鼻內載體的方式鼻內給藥，或者通過該領域專家熟知的各種跨皮膚路徑給藥。當采用跨皮膚路徑給藥系統時，按照給藥方案的給藥劑量應該是連續的而不是間斷性的。
對于以片劑或膠囊口服給藥，例如，可以將上述藥物活性成分與藥物學上可接受的口服惰性載體結合，該載體如乳糖，淀粉，蔗糖，葡萄糖，甲基纖維素，硬脂酸鎂，磷酸二鈣，硫酸鈣，甘露醇，山梨醇和類似物。對于以液態劑型口服給藥，口腔藥物成分可以與任何一種藥物學上可接受的口服惰性載體結合，該載體比如乙醇，甘油，水及類似物。此外，如果希望或需要，合適的膠合劑，潤滑劑，裂解劑和著色劑可以加入到混合物中。合適的膠合劑包括淀粉，凝膠，天然糖如葡萄糖或β-乳糖，玉米甜料，天然或合成的膠如阿拉伯樹膠，黃芪膠或藻酸鈉，羧甲基纖維素，聚乙二醇，蠟及類似物。在這些劑型中可以使用的潤滑劑包括油酸鈉，硬脂酸鈉，硬脂酸鎂，苯甲酸鈉，醋酸鈉，氯化鈉及類似物。裂解劑包括但于限于淀粉，甲基纖維素，瓊脂，皂土，黃原膠及類似物。
本發明中的化合物也可以通過脂質體給藥系統給藥，該系統如小的單層膜囊泡，大的單層膜囊泡和多層膜囊泡。脂質體也可以由一系列磷脂組成，如膽固醇，硬脂胺或卵磷脂。
本發明中的化合物也可以與可作為藥物載體的可溶性多聚體偶合。這些多聚體可以包括聚乙烯吡咯烷酮，吡喃(piran)共聚體，聚羥丙基甲基丙烯酰胺苯酚，聚羥乙基天冬酰胺苯酚或棕櫚酸基取代的聚乙烯氧化聚賴氨酸。此外，本發明的化合物可以與生物可降解類多聚體偶合從而實現藥物的可控釋放，如聚乳酸，聚葡糖酸，聚乳酸與聚葡糖酸的共聚體，聚ε-己內酯，聚羥基丁酸，聚原酸酯，聚縮醛，聚二氫吡喃(polydi-hydropirans)，聚氰基丙烯酸酯和交聯的或兩性分子阻斷(amphypathic block)的水凝膠共聚體。
明膠膠囊可以含有粉狀的活性成分和載體，比如乳糖，淀粉，纖維素衍生物，硬脂酸鎂，硬脂酸及類似物。類似的稀釋液可以用于制作壓片。片劑和膠囊均可制成緩釋產品的形式，以實現在數小時內藥物的連續釋放。壓片可在表面覆蓋糖或薄膜以掩蓋其不良味道并保護藥片不受空氣影響，或者可以以腸膜覆裹以實現在胃腸系統中的選擇性裂解。
口服給藥的液態劑型可含有著色劑和風味劑以提高受體的接受性。通常，除了DMSO或其他包括水在內的配位溶劑外，水，合適的油，鹽溶液，水溶的右旋糖(葡萄糖)，糖相關溶液和二元醇，如丙二醇或聚乙二醇，磷酸鹽緩沖液均是用于液態劑型，腸胃外給藥溶液或腹膜腔內給藥的合適載體。
特別地，用于腸胃外給藥的溶液包含活性成分的水溶性鹽和DMSO，或另一配位溶劑，如需要，還包含合適的穩定劑和緩沖物質。抗氧化劑，如亞硫酸氫鈉，亞硫酸鈉或抗壞血酸，分離或混合形式的，均是合適的穩定劑。檸檬酸和檸檬酸鹽以及EDTA鈉鹽也用作穩定劑。此外，腸胃外溶液可含有防腐劑，如殺藻胺，甲基丙基對羥基苯甲酸酯和氯丁醇。
用于腹膜內應用的組合物特定地包含水，鹽溶液和/或pH7.4的磷酸鹽緩沖液和0.1到30％的DMSO，如果需要，更特定地包含重量占該組合物1到10％的穩定劑或防腐劑。
合適的藥物載體在Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company中有所描述，該書為本領域內的標準參考文獻，其內容在此引為參考。
活性成分的每日劑量約為0.0001到500mg/kg體重，特定地約為0.0001到100mg/kg體重，更特定地約為0.0001到30mg/kg體重。每日劑量也可以依據受藥患者血藥終濃度來計算，該終濃度應為0.01到200μM，特定地為0.1到50μM，更特定地為10到25μM。
用于合適組合物給藥的劑型每單位可包含0.0001到250mg，更特定地為0.1到100mg活性成分。在這些藥物組合物中，該活性成分的含量通常為配方總重量的0.001到99％，特定地為0.1到70％，更特定地為0.1到40％。該組合物還可包含至少一種藥物學上可接受的載體。該活性成分可以以固態劑型口服給藥，如膠囊，片劑或粉末，也可以采用諸如西也劑，糖漿，溶液和懸浮劑的液態劑型給藥。該活性成分還可采用消毒的液態劑型腸胃外或腹膜內給藥。
本發明的優選藥物劑型是用于注射給藥，特別是腹膜內給藥的液態組合物。合適的用于腸胃外注射給藥的組合物可用如下方法制備，如將質量百分比為1.5％的活性成分在含有體積百分比為10％ DMSO的pH 7.4磷酸鹽緩沖液中搖勻。該溶液采用慣常方法消毒。
本發明的復合產物劑型可以是片劑，其中的一種活性成分用腸膜覆蓋，于是用腸膜覆蓋的成分和其他活性成分就不會混合在一起，然后壓制成片劑或類似物。因此，用腸膜覆蓋的成分壓在一個片劑層中，而其它活性成分壓在另一片劑層中。可選擇性地，為了進一步分離這兩層，可加入一層或多層隔離層(placebo)，使隔離層存在于活性物質層之間。此外，本發明中的藥物劑型可以以膠囊的形式存在，其中一種活性成分壓成片劑或許多微小片劑，顆粒，丸劑或非球狀顆粒，然后用腸膜覆蓋。這些用腸膜覆蓋的微小片劑，顆粒，丸劑或非球狀顆粒和其他活性成分顆粒一起被裝入或壓入膠囊中。
在以單一劑型或獨立劑型同時給藥或同時同一方式給藥時，為了盡可能減少本發明的復合產物各組分之間的接觸，根據本說明書，本領域的專業人員可以清楚容易地決定各種劑型。
定義“造血系統”指與血細胞形成相關的系統。
“免疫系統”指由白細胞形成的生物體的防御細胞系統，其通過產生抗體直接或間接地幫助生物體抵抗陌生化學或生物源。
“蛋白質抑制劑”指能夠抑制蛋白質行使其生物學功能的制劑，通常通過對蛋白質活性位點的二級或三級結構的破壞實現抑制作用。
“選擇性抑制劑”指在大量分子(如蛋白質)中只抑制特定分子和/或擁有相似活性位點的特定家族的抑制劑。
“幼細胞周期”指在細胞快速生長如組織培養中發生的循環結構和生化過程。該循環可分為Go期，間歇期1(G1)，合成期(S)，間歇期2(G2)和有絲分裂期(M)。當其產生如粒細胞系列的幼細胞，骨髓單核細胞時，該周期被稱為幼細胞周期。
“骨髓抑制(Myelosuppression)”指對髓細胞，即粒細胞系列的幼細胞的生成的抑制，通常發生在骨髓中，而不發生在循環血液中(某些疾病除外)。
“骨髓毒性”指制劑能夠對骨髓細胞產生毒性作用。
“自身免疫性疾病”指各種由于生物體免疫系統的防御細胞不能識別自身的生物體組成器官和/或組織的正常細胞而引起的各種疾病。
“免疫抑制劑”指各種能夠引起免疫抑制的制劑，即阻止或干擾免疫應答的進程；其可以是缺乏免疫應答(耐受)的結果，可以由化學，生物或物理制劑人工誘導或由疾病引起。
“免疫調節劑”指在免疫系統細胞應答細胞環境狀況變化時能引起其功能和形態波動的各種試劑。
″螯合的二膦配體″指各種含有兩個磷原子的有機連接，磷原子帶有自由電子對，通過提供配位鍵和同一金屬中心連接。
“DNA插入”指化學分子在形成DNA分子雙螺旋的堿基對間的插入。
“類似連接”指所有的同構連接，即具有相似的空間結構。本發明中指以化學元素周期表第V族的任何元素替代磷原子與1，1’-雙二苯基膦-二茂鐵的環戊二烯環連接，該元素可以是N，As，Sb或Bi。
“受體血液總量”指接受藥物的生物體循環血液的總體積。就人體而言，該體積在6到8升范圍間變動。
本領域的普通技術人員能夠理解，根據以上指導，可以對本發明進行大量的改進和變化。因此應該清楚，在所附權利要求書的范圍之內，本發明除了本說明書所作的具體描述外還可以通過其他途徑實施。
以下僅提供了本發明的特定具體實施方案的解釋性實施例，這些實施例對所附權利要求書范圍不產生任何限定。
實施例1起始復合物的制備2；dmpa＝依據Ryabov等(Reaction paths inthe cyclopalladated NN-dialkylbenzylamine-substituted styrenesystem in acetic acid as solvent.The structure of palladated2-dialkylaminomethylstilbenes.J.Chem.Soc.，Perkin Trans；1983，2，1503-1509)和(Enantioselective cleavage of activatedamino acid esters promoted by chiralpalladacycles.Inorg.Chim.Acta；1988，280，57-61)制備的N，N-二甲基-1-苯乙胺(dmpa)的R(+)和S(-)對映異構體。百分比分析(calcd.C20H28N2Cl2Pd2)a)R(+)C，40.4(40.6)；H，4.8(4.7)；N，4.8(4.4)。b)S(-)C，40.4(40.9)；H，4.8(4.2)；N，4.8(4.3)。2-這些化合物通過離子交換反應用[Pd(C2，N-dmpa)μ-Cl]2的R(+)和S(-)對映異構二聚體制備。在含有[Pd(C2，N-dmpa)μ-Cl]2(1.740g，3.0mmol)的THF(100mL)溶液中加入含有NaN3(0.390g，6.00mmol)的甲醇(20mL)。所獲的黃色固體經過過濾，用乙醚洗滌之后在真空中干燥。從甲苯中重結晶獲得微晶體產物(95％R(+)；87％S(-))。百分比分析(Calcd.C20H28N8Pd2)a)R(+)C，40.6(40.2)；H，4.7(4.4)；N，18.9(18.3).IRvasN32066cm-1，vsimN31447cm-1；B)S(-)C，40.6(41.1)；H，4.7(4.5)；N，18.9(18.4).IRvasN32058cm-1，vsimN31443cm-1。
實施例2含有PD(C2，N-DMPA)(L)]X(X＝Cl，N3，L＝二齒配體)型螯合二膦配體的離子化合物說明這些化合物有時用文字描述為PdR(+)或S(-)dmpa dppf 1:2(帶有N3或Cl)。
(2a)[Pd(C2，N-(R+dmpa)(dppf)]N3百分比分析(calcd.)C，60.9(62.1)；H，4.8(5.0)，N，6.1(6.6)。1H-NMR(ppm)-CH-CH3*(6H，d，1.55)；-N(CH3)2(3H，s，2.16)；Cp(5H，m，3.99)Cp(5H，m，4.25)-CH*-CH3(2H，q，3.99)；H-芳香環35)。31P{1H}-NMR(ppm)2個信號23.0，32.1.ΛM＝44.5S.cm2.mol-1。Cl(相同)。
(2b)[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)N3百分比分析(calcd.)C，61.9(62.1)；H，5.5(5.0)，N，5.9(6.6)。1H-NMR(ppm)-CH-CH3*(6H，D，1.55)；-N(CH3)2(3H，S，2.16)；Cp(5H，M，4.21)Cp(5H，M，4.49)-CH*-CH3(2H，q，3.97)；H-芳香環(24，m，7.25-7.32。31P{1H)-NMR(ppm)2個信號23.0，32.1.ΛM＝51.1S.cm2.mol-1。Cl(相同)。
實施例3含有[PD(C2，N-DMPA)(L)]X(X＝Cl，N3，L＝二齒配體)型螯合二膦配體的分子化合物說明這些化合物有時以文字描述為PdR(+)或S(-)dmpa dppf 1:2(帶有N3或Cl)。
(3a)[Pd(C2，N-(R+dmpa)(dppf)N3]百分比分析(calcd.)C，61.3(62.1)；H，4.9(5.0)，N，6.1(6.6)。1H-NMR(ppm)-CH-CH3*(6H，D，1.55)；-N(CH3)2(3H，S，2.16)；Cp(5H，Q，3.99)Cp(5H，t，4.25)-CH*-CH3(2H，Q，3.77)；H-芳香環(24，m，7.25-7.32。31P{1H}-NMR(ppm)2個信號31.9；-16.0.ΛM＝15.5S.cm2.mol-1。(相同)。
(3b)[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)N3]百分比分析(calcd.)C，61.9(62.1)；H，4.5(5.0)，N，5.9(6.6)。1H-NMR(ppm)-CH-CH3*(6H，D，1.55)；-N(CH3)2(3H，S，2.16)；Cp(5H，Q，3.99)Cp(5H，t，4.25)-CH*-CH3(2H，Q，3.77)；H-芳香環(24，m，7.25-7.32。31P{1H}-NMR(ppm)2個信號31.9；-16.0.ΛM＝15.5S.cm2.mol-1。(相同)。
實施例4含有[Pd2(C2，N-DMPA)2(μ-L)X2](X＝Cl，N3，L＝二齒配體)型螯合二膦配體的分子化合物說明這些化合物有時以文字描述為PdR(+)或S(-)dmpa dppf 1:1(帶有N3或Cl)。
(4a)[Pd2(C2，N-S-dmpa)2(μ-dppf)Cl2]百分比分析(calcd.)C，56.7(57.1)；H，5.2(5.0)，N，2.4(2.5)。1H-NMR(ppm)-CH-CH3*(6H，d，2.60)；-CH-CH3*(6H，d，2.90)；-N(CH3)2(6H，s-br，1.61)；-N(CH3)2(6H，s-br，1.63)；P(CH2)2-P(4H，m，2.57-2.85)；Cp(2H，sr-br，4.23)，Cp(2H，sr-br，4.57)，Cp(3H，m，4.96)，Cp(3H，m，5.00)，-CH*-CH3(2H，q，4.10)；H-芳香環(24，m，6.25-7.57。31P{1H}-NMR(ppm)1個信號32.7.ΛM＝9.3S.cm2.mol-1。(相同)。
(4b)[Pd2(C2，N-R+dmpa)2(μ-dppf)Cl2]百分比分析(calcd.)C，54.3(57.1)；H，4.9(5.0)，N，2.3(2.5)。1H-NMR(ppm)-CH-CH3*(6H，d，2.60)；-CH-CH3*(6H，d，2.90)；-N(CH3)2(6H，s-br，1.61)；-N(CH3)2(6H，s-br，1.63)；P(CH2)2-P(4H，m，2.57-2.85)；Cp(2H，sr-br，4.23)，Cp(2H，sr-br，4.57)，Cp(3H，m，4.96)，Cp(3H，m，5.00)，-CH*-CH3(2H，q，4.10)；H-芳香環(24，m，6.25-7.57。31P{1H}-NMR(ppm)1個信號32.7.ΛM＝2.4S.cm2.mol-1。(相同)(4c)[Pd2(C2，N-S-dmpa)2(μ-dppf)(N3)2]百分比分析(calcd.)C，55.1(55.9)；H，4.0(4.5)，N，9.5(10.0)。1H-NMR(ppm)-CH-CH3*(6H，D，2.70)；-CH-CH3*(6H，D，3.00)；-N(CH3)2(6H，s-br，1.61)；-N(CH3)2(6H，S-BR，1.65)；P(CH2)2-P(4H，m，2.60-2.90)；Cp(2H，sr-br，4.20)，Cp(2H，sr-br，4.61)，Cp(3H，m，4.93)，Cp(3H，m，5.10)，-CH*-CH3(2H，q，4.20)；H-芳香環(24，m，6.05-7.77。31P{1H}-NMR(ppm)1個信號32.7.ΛM＝7.5S.cm2.mol-1。(相同)。
(4d)[Pd2(C2，N-R+dmpa)2(μ-dppf)(N3)2]百分比分析(calcd.)C，54.8(55.9)；H，4.1(4.5)，N，9.7(10.0)。1H-NMR(ppm)-CH-CH3*(6H，D，2.70)；-CH-CH3*(6H，D，3.00)；-N(CH3)2(6H，s-br，1.61)；-N(CH3)2(6H，S-BR，1.65)；P(CH2)2-P(4H，m，2.60-2.90)；Cp(2H，sr-br，4.20)，Cp(2H，sr-br，4.61)，Cp(3H，m，4.93)，Cp(3H，m，5.10)，-CH*-CH3(2H，q，4.20)；H-芳香環(24，m，6.05-7.77。31P{1H}-NMR(ppm)1個信號32.7.ΛM＝4.4S.cm2.mol-1。(相同)實施例5對絲氨酸肽酶，金屬蛋白酶家族的酶抑制分析我們以下包括了用具有A，B和C結構的復合物進行的分析。這些鈀復合物由通過N，N-二甲基-1-苯乙胺(dmpa)的R(+)和S(-)異構體形成的環金屬環和配位配體1’-雙二苯基膦-二茂鐵(dppf)組成。酶抑制常數通過經典方法，熒光光譜測定法和間接計算獲得。在分析中，根據分析需要采用1ml的酶溶液，其中含有已知質量為2-5ng的酶。計算所得的酶抑制常數值陳列如下絲氨酸肽酶脯氨酰基寡肽酶(POP)及兩種變體(一為Cys255，β螺旋第四片的突變體以及功能性突變體Tyr473Phe)。對于POP，緩沖液采用Tris/HCl 20mM，pH7.5。標準底物是Abz-GFSPFRQ-EDDnp(Km 0.38μM)。
(5a)帶有dmpa R(+)異構體的復合物(以1∶1的結構)1/Kiapp＝0.0977//Kiapp＝10.24ng//Ki＝4.51ng，突變體Cys255The。1/Kiapp＝0.1234//Kiapp＝8.10ng//Ki＝3.57ng，突變體Try473Phe。
(5b)帶有dmpa R(+)異構體的復合物(以2∶1的結構)1/Kiapp＝8.7242//Kiapp＝0.1146ng//Ki＝34.01pg，突變體Cys255The。1/Kiapp＝14.1677//Kiapp＝0.0706ng//Ki＝20.94pg，突變體Tyr473Phe。
(5c)帶有dmpa S(-)異構體得到的復合物(以1∶1的結構)1/Kiapp＝6.9164//Kiapp＝0.1496ng//Ki＝42.90pg，突變體Cys255The。1/K，APP＝9.891411app＝0.1011ng//Ki＝30pg，突變體Tyr473Phe。
(5d)帶有dmpa S(-)異構體得到的復合物(以2∶1的結構)1/Kiapp＝180.3018HKLAPP＝0.004982ng//Ki＝1.65pg，突變體Cys255The。1/Kiapp＝4.4990//Kiapp＝0.2223ng//Ki＝65.96pg，突變體Tyr473Phe。
金屬蛋白酶ACE(血管緊張縮素轉化酶)-使用濃度0.1-1.0nM。緩沖液采用0.1M，pH8.0磷酸鈉緩沖液+200mM NaCl。標準底物為Abz-YRK(Dnp)-P-OH(Km7.0μM)。
(5e)帶有dmpa R(+)異構體的復合物(以1∶1的結構)1Kiapp＝18.7138//Kiapp＝0.05344ng//Ki＝22.27pg。
(5f)帶有dmpa R(+)異構體的復合物(以2∶1的結構)1/Kiapp＝1.1578//Kiapp＝0.8637ng//Ki＝0.36ng。
(5g)帶有dmpa S(-)異構體的復合物(以1∶1的結構)1/Kiapp＝2.0989//Kiapp＝0.4764ng//Ki＝198.51pg。
(5h)帶有dmpa S(-)異構體的復合物(以2∶1的結構)1/Kiapp＝3.3136//Kiapp＝0.3018ng//Ki＝112.28pg。
肽鏈內切酶CATD(組織蛋白酶D)-使用濃度0.05-0.5nM.緩沖液采用0.1mM，pH4.0檸檬酸緩沖液。標準底物為Abz-AIAFFSRQ-EDDnp(Km0.17μM)。
(5i)帶有dmpa S(-)異構體的復合物(以1∶1的結構)1/Kiapp＝3.3136//Kiapp＝0.3018ng//Ki＝122.98pg。
(5j)帶有dmpa S(-)異構體的復合物(以2∶1的結構)1/Kiapp＝3.5696//Kiapp＝0.2801ng//KI＝104.22pg。
實施例6抗腫瘤分析-Walker’s腫瘤進行抗腫瘤活性分析時，將化合物分別稀釋在水溶液，鹽溶液和pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液中，所有溶液中均含有1％二甲基亞砜(DMSO)。分析中使用等量的所述化合物，以使得試驗動物血液總體積(約30ml)中的活體藥物濃度達到15μM，該濃度對于動力學步驟非常有利。
試驗包括將本發明中的鈀化合物在腹膜內，皮下和在腫瘤移植部位直接使用以及通過腫瘤細胞進行的腫瘤移植。
據觀察，在90％病例中，腫瘤生長得到逆轉(試驗動物總計60只)。皮下接種106個癌細胞12天后試驗動物體內生長出質量為4.0(+/-)1.0g的實體瘤。通過給藥，腫瘤的質量降低到0.3(+/-)0.1g。除了抑制腫瘤生長，在85％的病例中，化合物逆轉了先前存在的腫瘤。對于上述的Walker’s腫瘤，化合物在體內模型中顯示了對該腫瘤細胞的選擇性細胞毒性，而在對正常組織給藥后沒有任何慢性炎癥癥狀。在這些分析中，連續10天按15μM/大鼠×天的劑量通過注射給藥。另一個重要作用是其在細胞培養中表現出了對內皮細胞增殖的抑制效應，顯示重要的抗血管生長作用。化合物在體內模型中也顯示出巨大的對組織蛋白酶B和組織蛋白酶D的抑制活性，使其成為抗腫瘤轉移的有效試劑，避免腫瘤在骨骼肌中的轉移。
在對所有試驗動物的所有治療中沒有觀察到任何副作用，這顯示了藥物具有極高的專一性。以下圖3、4和5顯示了所得結果。
實施例7為了培育Ehrlich’s腹水性腫瘤，用0.1ml含有106個取自患病小鼠的腹膜內的癌細胞懸浮液對小鼠進行腹膜內接種。在從Ehrlich腫瘤患病小鼠的腹膜中取出腹水液后，細胞的數目和活力在Neubauer盤中用錐蟲藍(Trypan blue)染液確定。
為了觀察化合物[Pd2(C2，N-S-dmpa)2(μ-dppf)Cl2]e[Pd2(C2，N-S-dmpa)2(μ-dppf)(N3)2](根據示意圖C的一般結構)對接受治療動物的保護作用，繪制壽命延長曲線。含有12只動物的三個試驗組如下Ehrlich’s腹水性腫瘤的患病動物；連續接受四次環鈀化合物(1mg/kg)皮下給藥的腫瘤患病動物。
試驗進行如下Ehrlich腫瘤細胞從患病動物的腹膜腔內取出，然后稀釋(1∶100)在錐蟲藍溶液確定細胞活力。將細胞在鹽溶液中的濃度調至1×106細胞/動物。此后，用0.2ml該溶液(包含1×106個細胞)接種被研究動物。腫瘤接種72小時后開始環鈀化合物的治療并持續4天。每天觀察動物以控制死亡率。
在體內分析中，劑量為1mg/kg的化合物[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)Cl]和[Pd2(C2，N-S-dmpa)2(μ-dppf)(N3)2]均延長了Ehrlich腹水性腫瘤患病動物的壽命，標志這些藥能夠干擾腫瘤的升級(圖6)。
實施例8小鼠骨髓細胞造血前體(CFU-C)的克隆培養為了對克隆生成(clogenical)細胞的計數，關鍵要確保培養基中存在的所有全能細胞得到誘導而增殖和調節培養條件，以避免在Petri盤中不會含有過多數量的細胞群落而之后發生重疊，從而使每一個群落能夠得到識別。同樣重要的是使用最高濃度以上的生長刺激因子(GSF)。我們將使用針對粒細胞和巨噬細胞的重組造血生長因子-GM-CSF。此外，由于發現當前市場上供應的不同批次和品牌的胎(phoetal)小牛血清的活性存在差異，對胎小牛血清的選擇應該慎重。
將正常小鼠或連續接受4天用由dmpa和配體dppf以1∶2的比例(按照圖解A和B-一般結構)合成的環鈀化合物進行皮下治療的小鼠通過斷頸法處死，小鼠皮膚用碘酒清潔。將小鼠大腿骨暴露，去除末端孔部軟骨，將骨頭從其上方關節處切斷。骨髓在針頭和注射器的幫助下被轉移至含有培養基或平衡鹽溶液的試管中。懸浮液中的細胞數在將細胞以1∶10稀釋于10％的曙紅中后在血細胞計數皿中計數。隨后，制備更多的瓊脂培養基(bacto-agar，Difco)，其中包含30％的2倍濃縮的IMDM培養基(Sigma)，20％ phoetal小牛血清和50％瓊脂(0.6％)。此后，將適量體積的細胞加入到37℃的該更多瓊脂培養基中。將細胞重懸，以1.0ml的體積分配到每個已經含有合適的刺激因子的Petri盤中。在體外分析中，加入系列濃度的由dmpa和配體dppf以1∶2的比例(按照示意圖A和B-一般結構)合成的環鈀化合物。培養物在Petri盤表面分布形成膠狀。在37℃，含有5％CO2的空氣中連續培養7天后，細胞群落在40×放大的解剖顯微鏡下計數(Metcalf，1984)。
實施例9對通過長效骨髓細胞液體培養過程形成的骨髓基質的評估本培養完全依賴于由骨髓基質細胞衍生出的粘附細胞層的形成。粘附細胞層的形成的發生依賴于造血生長因子的合成和分泌，該因子負責基質細胞胞外基質的形成。因此，更多的非成熟細胞保留在粘附細胞層內并釋放到培養基中以保持造血功能。因此，在外源性造血生長因子存在的情況下，在進行克隆培養之后，對液體培養基中的母細胞數目進行定量。(Spoonceretal，1993)在用斷頸法處死動物(約8只)后，暴露大腿骨，骨頭于上方關節處切開。骨髓和骨髓基質細胞在針頭和注射器的幫助下轉移至含有補充了2mmI-谷氨酰胺，20％馬血清(cult-lab)和10-2M氫化可的松的rpmi-1640(Sigma)培養基的試管中。將細胞及培養基分配到培養瓶(t25)中(每瓶10ml培養基及細胞)。隨后，將該培養瓶在含有5％CO2的空氣的濕培養箱中培養。15天后，由于骨髓基質已經開始群集，將從8只小鼠骨髓中衍生出的新一代細胞加入到培養瓶中誘導母細胞的增殖。在培養瓶中傳代15天后，我們進行克隆培養(cfu-c)，目的在于計算從體外培養骨髓基質衍生出的粘附細胞所生成的造血前體的數目。為了確定非粘附細胞和母細胞的數目，每周移除50％的飽和培養基并加入新鮮培養基，該新鮮培養基已含有1mg/l的由dmpa和配體dppf以1∶2的比例(按照示意圖A和B-一般結構)合成的環鈀化合物。
由長效液體培養基中獲得的母細胞生成的造血前體(CFU-C)的克隆培養從長效液體培養基中獲得非粘附細胞后，將細胞用培養基RPMI1640(Sigma)清洗并重懸至終濃度為2×105細胞/ml。隨后這些細胞按照之前說明的克隆培養方法(CFU-C)進行培養。
實施例10急性毒性評估將待分析化合物稀釋于含有10％DMSO的鹽溶液中，然后將0.2ml該鹽溶液以腹膜內方式施予動物。因此，每10只動物(5公5母)組成的組接受不同劑量的化合物的治療。對照動物接受只含有10％DMSO的鹽溶液。治療結束之后，動物持續觀察14天。
表1環鈀化合物的急性毒性評估。動物通過腹膜內方式接受一劑下述化合物并在此過程之后觀察14天。
含有疊氮的化合物在10mg/kg的劑量下具有毒性及10％的致死率，表明該藥具有更高的副作用率。
實施例11白血病株HL-60和K-562的體外細胞毒性和原癌基因BCL-2的表達細胞株HL-60和K-562的細胞保存于補充了2mML-谷氨酰胺和20％phoetal小牛血清的培養基RPMI-1640(Sigma)中，細胞此前被清洗(三次)并重懸于RPMI培養基。隨后，它們與九種濃度的被研究化合物(160、80、40、20、10、5、2.5、1.25和0.65μg/ml)共同培養于96孔培養板(1×106細胞/孔)中。之后它們在濕培養箱中培養72小時(含5％CO2的空氣)。在此之后，加入MTT溶液(5mg/ml)(Sigma)，培養板繼續培養4小時。隨后，加入MTT穩定液(0.04N異丙酸(isopropylicacid))，30分鐘后，于560nm處重復3次讀取ELISA值(Mosmann，1983)。在所研究的化合物存在的情況下細胞的存活百分比如下計算活細胞％＝每孔吸收值(給藥)×100/對照吸收值(未給藥)實施例12黑素瘤的生物學分析體外分析體外分析用來證實環鈀化合物對鼠黑素瘤細胞B16F10-Nex2的細胞毒性效應。細胞在不同化合物濃度下培養24小時。細胞活力由MTT分析法確定。如圖13所示，觀察到1.25uM含有乙烷二膦(藥物1，2和3)的藥物具有100％有效率。相同的效率在含有雙二苯基膦-二茂鐵的藥物中也被觀察到，但是在更高濃度下，10μM(藥6)以及含有官能炔的環鈀化合物(藥10)，大約20μM。圖13顯示了所述的細胞毒效應，與未給藥細胞對照組相比其細胞存活百分比的降低以直方圖表示。
體內分析體內分析在母性小鼠C57BI/6上進行。105腫瘤細胞通過皮下植入。植入后4天，動物開始接受治療。一組接受10μM，另一組接受30μM如下最有效的藥物藥物1，2，3，6和10腹膜腔內給藥，一周3次，在這段時期，腫瘤體積被定量。當腫瘤體積達到3000mm3時，動物被處死。在下圖中，(A)中注射藥物的動物和對照動物的死亡曲線，(B)，每組患腫瘤動物腫瘤的體積。
圖14中，給藥濃度為10μM時，從A中觀察到接受藥物1，3，6和10的動物壽命延長了10天。在B中，我們注意到，在所有的藥物中，藥物1和6對于腫瘤的發展具有高出其他藥物60％的抑制效應。
在圖15中，給藥濃度為30μM時，所有藥物均使接受治療的動物壽命延長了7天，同時接受藥物6治療的動物組死亡數更低。在圖B中，我們可看出藥物1最有效地抑制腫瘤發展。藥物6，18天時表現處顯著的抑制效應，但是該效應在23天后出現逆轉。
含有官能炔的藥物按照同樣的方法進行了體外測試(圖16)，在100μM時顯示出100％的細胞毒效應。該效應在下圖中呈現，同時顯示，其中藥物11和14在大約1μM時顯示出40到50％的顯著抑制活性。
結果分析提供了一些重要的化學結構和藥物活性之間的關聯。1.25μM的含有乙烷二膦(藥物1，2和3)的藥物被觀察到100％的有效率。同樣的效率在含有官能炔的環鈀化合物沒有發生，該化合物需要20μM。在所有被測藥物中，我們注意到藥物1和6具有高于其他藥物60％的抑制腫瘤發展的效應。我們可以看到藥物1是最有效的抑制腫瘤發展的藥物，而接受藥物6治療的試驗動物體現出更少的死亡數。對于包含關官能炔的復合物，藥物11和14呈現出顯著的抑制效應，在大約1μM時有40-50％的抑制效應。
應該承認，本說明書對本發明的說明以及所述實施例能夠使本領域的普通技術人員實施本發明，包括在不超出所附的權利書所要求保護的范圍的情況下上運用本領域的常識進行修改。
權利要求
1.環鈀化合物或其藥物學上可接受的鹽或絡合物，該化合物是有機金屬化合物，其含有鈀、δC-PD鍵和配位鍵Y→Pd，形成具有如下結構的有機環 其中-X代表選自下列的元素鹵素(Cl、F、Br、I)；擬鹵素(N3、NCO、NCS、SCN)；或乙酸根(H3C-COO-)；和-Y代表選自元素周期表V或VI族的元素，如N、P、As、Sb、Bi、O、S、Se、Te；-C代表sp2或sp3雜化的碳原子，其與鈀原子共價連接，含有C、Y和D的所示的環可以由三到八個原子組成。-C和Y之間，用曲線表示，具有連續的原子形成環鈀的環，由三到八個原子組成，包括鈀原子；典型地，非限制性地所述原子選自碳、氮、氧或硫；另一方面，構成該環的每一個原子與其它原子或基團相連，形成該環的可變外部結構，線狀或環狀，本申請人對此不作特別限制；-L代表配位配體，其是來源于元素周期表V組(N、P、As、Sb、Bi)的供體原子，位于雙二苯基膦-二茂鐵化合物中，具體如下示意圖2所示，所示存在的L-L表明在所述的雙二苯基膦-二茂鐵化合物中存在兩個連接子L，而R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12分別代表了下列基團，可以以任何順序出現氫(H)、烷基、芳基、二烯基、烷氧基、硅氧基、羥基(OH)、氨基(-NH2)、亞胺基、鹵素(F、Cl、Br、I)、亞氨基、硝基(-NO2)。示意圖2
2.環鈀化合物或其藥物學上可接受的鹽或絡合物，該化合物是有機金屬化合物，其含有鈀、δC-PD鍵和配位鍵Y→Pd，形成具有如下結構的有機環 其中-X代表選自下列的元素鹵素(Cl、F、Br、I)；擬鹵素(N3、NCO、NCS、SCN)；或乙酸根(H3C-COO-)；和-Y代表選自元素周期表V或VI族的元素，如N、P、As、Sb、Bi、O、S、Se、Te；-C代表sp2或sp3雜化的碳原子，其與鈀原子共價連接，含有C、Y和D的所示的環可以由三到八個原子組成。-C和Y之間，用曲線表示，具有連續的原子形成環鈀的環，由三到八個原子組成，包括鈀原子；典型地，非限制性地所述原子選自碳、氮、氧或硫；另一方面，構成該環的每一個原子與其它原子或基團相連，形成該環的可變外部結構，線狀或環狀，本申請人對此不作特別限制；-L代表配位配體，其是來源于元素周期表V組(N、P、As、Sb、Bi)的供體原子，位于雙二苯基膦-二茂鐵化合物中，具體如下示意圖2所示，所示存在的L-L表明在所述的雙二苯基膦-二茂鐵化合物中存在兩個連接子L，而R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12分別代表了下列基團，可以以任何順序出現氫(H)、烷基、芳基、二烯基、烷氧基、硅氧基、羥基(OH)、氨基(-NH2)、亞胺基、鹵素(F、Cl、Br、I)、亞氨基、硝基(-NO2)。示意圖2
3.環鈀化合物或其藥物學上可接受的鹽或絡合物，該化合物是有機金屬化合物，其含有鈀、δC-PD鍵和配位鍵Y→Pd，形成具有如下結構的有機環 其中-X代表選自下列的元素鹵素(Cl、F、Br、I)；擬鹵素(N3、NCO、NCS、SCN)；或乙酸根(H3C-COO-)；和-Y代表選自元素周期表V或VI族的元素，如N、P、As、Sb、Bi、O、S、Se、Te；-C代表sp2或sp3雜化的碳原子，其與鈀原子共價連接，含有C、Y和D的所示的環可以由三到八個原子組成。-C和Y之間，用曲線表示，具有連續的原子形成環鈀的環，由三到八個原子組成，包括鈀原子；典型地，非限制性地所述原子選自碳、氮、氧或硫；另一方面，構成該環的每一個原子與其它原子或基團相連，形成該環的可變外部結構，線狀或環狀，本申請人對此不作特別限制；-L代表配位配體，其是來源于元素周期表V組(N、P、As、Sb、Bi)的供體原子，位于雙二苯基膦-二茂鐵化合物中，具體如下示意圖2所示，所示存在的L-L表明在所述的雙二苯基膦-二茂鐵化合物中存在兩個連接子L，而R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12分別代表了下列基團，可以以任何順序出現氫(H)、烷基、芳基、二烯基、烷氧基、硅氧基、羥基(OH)、氨基(-NH2)、亞胺基、鹵素(F、Cl、Br、I)、亞氨基、硝基(-NO2)。示意圖2
4.如權利要求1-3任一項所述的環鈀化合物或其藥物學上可接受的鹽或絡合物，該化合物選自N，N-二甲基-1-苯乙胺(dmpa)和N，N-二甲基-芐胺衍生物，炔，即嘧啶基-苯基-乙炔或1-苯基-3-N，N二甲胺-丙炔。
5.如權利要求4所述的環鈀化合物，該化合物是N，N-二甲基-1-苯乙胺(dmpa)。
6.如權利要求1-5任一項所述的化合物，該化合物抑制與失調或疾病有關的蛋白的活性。
7.如權利要求6所述的化合物，其中所述的蛋白是酶。
8.如權利要求7所述的化合物，其中所述的酶包括來自半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸肽酶和金屬蛋白酶家族的酶。
9.如權利要求8所述的化合物，其中所述的半胱氨酸蛋白酶包括組織蛋白酶B、H、J、L、N、S、T和C(二肽基-肽酶-I)，白介素轉化酶(ICE)，由鈣激活的中性蛋白酶，鈣蛋白酶I和II，肽鏈內切酶，病毒半胱氨酸蛋白酶，如心病毒肽鏈內切酶、腺病毒肽鏈內切酶和口瘡病毒肽鏈內切酶，和寄生蟲生命周期所必需的蛋白酶，如來自變形蟲、阿米巴蟲、盤尾絲蟲、利什曼原蟲、線蟲、網柄菌、Therilerium、血吸蟲和錐蟲種的蛋白酶。
10.如權利要求9所述的化合物，其中所述的酶是組織蛋白酶B、Cruzaine和白介素-1β轉化酶。
11.如權利要求8所述的化合物，其中絲氨酸肽酶包括二肽基-肽酶IV、酰氨酰基-肽酶和寡肽酶B、脯氨酰基-寡肽酶和組織蛋白酶D。
12.如權利要求11所述的化合物，其中所述的酶是組織蛋白酶D。
13.如權利要求8所述的化合物，其中金屬蛋白酶包括血管緊張素轉化酶、膠原酶、基質裂解素、膜型金屬蛋白酶和genatinases。
14.如權利要求1-3任一項所述的化合物，該化合物可以治療與蛋白質和酶有關的失調與疾病。
15.如權利要求14所述的化合物，其中所述疾病包括由組織退化所導致的疾病如關節炎、肌肉萎縮、腫瘤入侵、腎小球腎炎(glomeronephritis)、寄生蟲造成的骨質感染、parasitomies、牙周疾病和腫瘤轉移；與心房利鈉因子的降解有關的心臟疾病；炎性疾病如支氣管炎、風濕性關節炎、骨質疏松癥、急性胰腺炎和癌擴散；失調如健忘癥、抑郁癥和血壓的調控；糖尿病，錐蟲病，查格斯氏病，食物性失調，暴食癥和厭食癥；酒精中毒，與細胞因子和細胞因子受體如白介素-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(INFN-γ)、IL-1拮抗劑受體(IL-1RA)、IL-10和粒細胞-巨噬細胞克隆(GM-CSF)的生長刺激因子的產生有關的疾病；心理緊張，對抗由HIV病毒(AIDS)引起的感染；引起髓鞘(mieline)退化的中樞神經系統炎性疾病，包括多發性硬化癥和自體免疫性腦脊髓炎；癌腫瘤，自體免疫性疾病，腫瘤包括乳房、骨髓、腺瘤、甲狀腺、黑素瘤、胃、腸、食道和甲狀腺腫瘤和成神經細胞瘤。
16.如權利要求15所要求保護的化合物，其中所述的疾病是腹水和實體腫瘤，特別地是乳房、骨髓、腺瘤、甲狀腺、胃、腸、食道、甲狀腺腫瘤和成神經細胞瘤。
17.如權利要求1-6任一項所述的化合物，該化合物抑制幼骨髓細胞進入細胞分裂(S期)。
18.如權利要求1-6任一項所述的化合物，該化合物是抗血管生成的。
19.如權利要求1-6任一項所述的化合物，該化合物是抗轉移的。
20.如權利要求1-6任一項所述的化合物，該化合物可用于輔助放射治療處理。
21.如權利要求1所述的化合物，該化合物與DNA發生反應。
22.如權利要求1所述的化合物，該化合物是免疫調節子。
23.含有如權利要求1-22任一項所述的化合物的至少一種和其藥物學上可接受的鹽和絡合物的組合物。
24.如權利要求23所述的組合物，該組合物含有約占其總重量0.001-99％的所述化合物或一種其鹽或絡合物，和至少一種藥物學上可接受的載體。
25.如權利要求23所述的組合物，該組合物含有約占其總重量0.01-70％的所述化合物或一種其鹽或絡合物，和至少一種藥物學上可接受的載體。
26.如權利要求23所述的組合物，該組合物含有約占其總重量0.1-40％的所述化合物或一種其鹽或絡合物，和至少一種藥物學上可接受的載體。
27.如權利要求23所述的組合物，該組合物還含有溶劑。
28.如權利要求27所述的組合物，其中所述溶劑是DMSO。
29.如權利要求23所述的組合物，該組合物呈現為固體劑量的形式，如膠囊、片劑或粉末，或液體劑量的形式，如西也劑、糖漿、乳劑、溶液、懸液、混合物和灌輸劑。
30.如權利要求29所述的組合物，其中所述的制劑是預定或延遲釋放的。
31.如權利要求29所述的組合物，其中它們給藥的方式包括口服、皮下、靜脈內、鼻內、跨皮膚、腹膜內、局部、肌肉內、肺內、陰道、直腸、眼內或舌下的方式、系統來提供脂質體。
32.如權利要求31所述的組合物，其中它們給藥的方式是注射，具體地是腹膜內注射。
33.如權利要求32所述的組合物，該組合物特定地包括水、鹽溶液和/或pH7.4的磷酸鹽緩沖液和0.1-30％的DMSO，更特定地，如果需要，該組合物含有占其重量1-10％的穩定劑或防腐劑。
34.如權利要求23所述的組合物，該組合物包括約0.0001-250mg，更特定地約0.1-100mg至少一種如權利要求1-22所述化合物或一種其藥學上接受的鹽或絡合物。
35.如權利要求23所述的組合物，該組合物抑制與紊亂或疾病有關的蛋白質的活性。
36.如權利要求35所述的組合物，其中所述的蛋白質是酶。
37.如權利要求36所述的組合物，其中所述的酶包括來自半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶家族的酶。
38.如權利要求37所述的組合物，其中所述的半胱氨酸蛋白酶包括組織蛋白酶B、H、J、L、N、S、T和C(二肽基-肽酶-I)，白介素轉化酶(ICE)，由鈣激活的中性蛋白酶，鈣蛋白酶I和II，病毒半胱氨酸蛋白酶，如心病毒肽鏈內切酶、腺病毒肽鏈內切酶和口瘡病毒肽鏈內切酶，和寄生蟲生命周期所必須的蛋白酶，如來自變形蟲、阿米巴、盤尾絲蟲、利什曼原蟲、線蟲、網柄菌、Therilerium、血吸蟲和錐蟲種的蛋白酶。
39.如權利要求38所述的組合物，其中所述的酶是組織蛋白酶B、Cruzaine和白介素-1β轉化酶。
40.如權利要求37所述的組合物，其中絲氨酸肽酶包括二肽基-肽酶IV、酰氨酰基-肽酶和寡肽酶B和脯氨酰基-寡肽酶。
41.如權利要求37所述的組合物，其中所述的酶是組織蛋白酶D。
42.如權利要求37所述的組合物，其中金屬蛋白酶包括血管緊張素轉化酶、膠原酶、基質裂解素、膜型金屬蛋白酶和genatinases。
43.如權利要求37所述的組合物，該組合物可以治療與蛋白質和酶有關的失調與疾病。
44.如權利要求43所述的組合物，其中所述的疾病包括由組織退化所導致的疾病如關節炎、肌肉萎縮、腫瘤入侵、腎小球腎炎(glomeronephritis)、寄生蟲造成的骨質感染、Parasitomies、牙周疾病和腫瘤轉移；與心房利鈉因子的退化有關的心臟疾病；炎性疾病如支氣管炎、風濕性關節炎、骨質疏松、急性胰腺炎和癌擴散；失調如健忘癥、憂郁癥和血壓的調控；糖尿病，錐蟲病，查格斯氏病，食物性失調，暴食癥和厭食癥；酒精中毒，與細胞因子和細胞因子受體如白介素-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(INFN-γ)、IL-1拮抗劑受體(IL-1RA)、IL-10和粒細胞-巨噬細胞克隆(GM-CSF)的生長刺激因子的產生有關的疾病；心理緊張，對抗由HIV病毒(AIDS)引起的感染；導致髓鞘(mieline)退化的中樞神經系統炎性疾病，包括多發性硬化癥和自體免疫性腦脊髓炎；癌腫瘤，自體免疫性疾病，腫瘤包括乳房、骨髓、腺瘤、甲狀腺、黑素瘤、胃、腸、食道和甲狀腺腫瘤和成神經細胞瘤。
45.如權利要求44所述的組合物，其中所述的疾病是腹水和實體腫瘤，特別地是乳房、骨髓、腺瘤、甲狀腺、胃、腸、食道、甲狀腺腫瘤和成神經細胞瘤。
46.如權利要求23-37任一項所述的組合物，該組合物抑制幼骨髓細胞進入細胞分裂(S期)。
47.如權利要求23-37任一項所述的組合物，該組合物是抗血管生成的。
48.如權利要求23-37任一項所述的組合物，該組合物是抗轉移的。
49.如權利要求23-37任一項所述的組合物，該組合物可用于輔助放射治療處理。
50.如權利要求23所述的組合物，該組合物與DNA發生反應。
51.如權利要求23所述的組合物，該組合物是免疫調節子。
52.如權利要求23-37任一項所述的組合物，該組合物含有受體的全體積血液和濃度約為0.01-200uM，更特定地0.1-50uM，更特定地10-25uM的活性試劑。
53.含有至少一種如權利要求1-22任一項所述的化合物或一種其藥物學上可接受的鹽或絡合劑的劑量單位。
54.含有至少一種如權利要求23-52任一項所述的組合物的劑量單位。
55.如權利要求53或54所述的劑量單位，其中化合物或組合物的量足夠使受體全體積血液中的活性成分的濃度約為0.01-200uM，特別地為0.1-50uM，更特別地為10-25uM。
56.如權利要求53-55任一項所述的劑量單位，該單位包括固體和液體形式。
57.如權利要求56所述的劑量單位，該單位包括劑量形式，如膠囊、片劑或粉末，或溶于西也劑、糖漿、乳劑、溶液、懸液、混合物和灌輸劑。
58.如權利要求53所述的劑量單位，其中所述的制劑是預定或延遲釋放的。
59.如權利要求53所述的劑量單位，該單位含有至少一覆蓋層。
60.抑制與失調或疾病有關的肽的活性的方法，該方法包括用有效量的如權利要求1-22任一項所述的化合物，如權利要求23-52任一項所述的組合物或如權利要求53-59任一項所述的劑量單位給藥。
61.如權利要求60所述的方法，其中所述蛋白是酶。
62.治療失調和疾病的方法，該方法包括用有效量的如權利要求1-22任一項所述的化合物，如權利要求23-52任一項所述的組合物或如權利要求53-59任一項所述的劑量單位給藥。
63.如權利要求62所述的治療方法，該方法可以用于與蛋白質或酶活性有關的失調和疾病。
64.如權利要求60或62所述的方法，其中所述的酶包括半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶家族的酶。
65.如權利要求64所述的方法，其中所述的半胱氨酸蛋白酶包括組織蛋白酶B、H、J、L、N、S、T和C(二肽基-肽酶-I)，白介素轉化酶(ICE)，由鈣激活的中性蛋白酶，鈣蛋白酶I和II，肽鏈內切酶，病毒半胱氨酸蛋白酶，如心病毒肽鏈內切酶、腺病毒肽鏈內切酶和口瘡病毒肽鏈內切酶，和寄生蟲生命周期所必須的蛋白酶，如來自變形蟲、阿米巴、盤尾絲蟲、利什曼原蟲、線蟲、網柄菌、Therilerium、血吸蟲和錐蟲種的蛋白酶。
66.如權利要求65所述的方法，其中所述的酶是組織蛋白酶B、Cruzaine和白介素-1β轉化酶。
67.如權利要求64所述的方法，其中所述的絲氨酸肽酶包括二肽基-肽酶IV、酰氨酰基-肽酶和寡肽酶B和脯氨酰基-寡肽酶。
68.如權利要求67所述的方法，其中所述的酶是組織蛋白酶D。
69.如權利要求64所述的方法，其中所述的金屬蛋白酶包括血管緊張素轉化酶、膠原酶、基質裂解素、膜型金屬蛋白酶和genatinases。
70.如權利要求63所述的方法，其中所述的疾病包括由組織退化所導致的疾病如關節炎、肌肉萎縮、腫瘤入侵、腎小球腎炎(glomeronephritis)、寄生蟲造成的骨質感染、parasitomies、牙周疾病和腫瘤轉移；與心房利鈉因子的退化有關的心臟疾病；炎性疾病如支氣管炎、風濕性關節炎、骨質疏松、急性胰腺炎和癌擴散；失調如健忘癥、憂郁癥和血壓的調控；糖尿病，錐蟲病，查格斯氏病，食物性失調，暴食癥和厭食癥；酒精中毒，與細胞因子和細胞因子受體如白介素-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(INFN-γ)、IL-1拮抗劑受體(IL-1RA)、IL-10和粒細胞-巨噬細胞克隆(GM-CSF)的生長刺激因子的產生有關的疾病；心理緊張，對抗由HIV病毒(AIDS)引起的感染；導致髓鞘(mieline)退化的中樞神經系統炎性疾病，包括多發性硬化癥和自體免疫性腦脊髓炎；癌腫瘤，自體免疫性疾病，腫瘤包括乳房、骨髓、腺瘤、甲狀腺、黑素瘤、胃腸瘤、食道和甲狀腺腫瘤和成神經細胞瘤。
71.如權利要求70所述的方法，其中所述的疾病是腹水和實體腫瘤，特別地是乳房、骨髓、腺瘤、甲狀腺、胃、腸、食道、甲狀腺腫瘤和成神經細胞瘤。
72.如權利要求60-63任一項所述的方法，該方法抑制幼骨髓細胞進入細胞分裂(S期)。
73.如權利要求60-63任一項所述的方法，其是抗血管生成的。
74.如權利要求60-63任一項所述的方法，其是抗轉移的。
75.如權利要求60-63任一項所述的方法，其可用于輔助放射治療處理。
76.如權利要求60-63任一項所述的方法，該方法包括用活性成分給藥，劑量約為0.0001-500mg/kg體重，特定地為0.0001-100mg/kg體重和更特定地約為0.0001-30mg/kg體重。
77.如權利要求60-63任一項所述的方法，該方法包括用足夠量的活性成分給藥而使受體全體積血液中的活性成分的濃度約為0.01-200uM，特別地為0.1-50uM，更特別地為10-25uM。
78.如權利要求60-63任一項所述的方法，其中所述的給藥是通過如權利要求53-59任一項所述的劑量單位的方式進行的。
79.如權利要求60-63任一項所述的方法，其中所述的給藥是連續的、非連續的或循環的。
80.調節免疫系統的方法，該方法包括用有效量的如權利要求1-22任一項所述的化合物，如權利要求23-52任一項所述的組合物或如權利要求53-59任一項所述的劑量單位給藥。
81.如權利要求1-22任一項所述的化合物用于制備組合物的用途。
82.如權利要求81所述的用于制備藥品以抑制蛋白質和酶活性的用途。
83.如權利要求23-52任一項所述的組合物用于制備藥品以抑制蛋白質和酶活性的用途。
84.如權利要求81-83任一項所述的用途，其中所述的酶包括來自半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸肽酶和金屬蛋白酶家族的酶。
85.如權利要求84所述的用途，其中所述的酶包括組織蛋白酶B、H、J、L、N、S、T和C(二肽基-肽酶-I)，白介素轉化酶(ICE)，由鈣激活的中性蛋白酶，鈣蛋白酶I和II，肽鏈內切酶，病毒半胱氨酸蛋白酶，如心病毒肽鏈內切酶、腺病毒肽鏈內切酶和口瘡病毒肽鏈內切酶，和寄生蟲生命周期所必須的蛋白酶，如來自變形蟲、阿米巴、盤尾絲蟲、利什曼原蟲、線蟲、網柄菌、Therilerium、血吸蟲和錐蟲種的蛋白酶，組織蛋白酶D或腦啡肽酶(Encephalinase)，二肽基-肽酶IV，酰氨酰基-肽酶和寡肽酶B和脯氨酰基-寡肽酶，血管緊張素轉化酶，膠原酶，基質裂解素，膜型金屬蛋白酶和genatinases。
86.如權利要求83所述的用途，其中所述的疾病包括由組織退化所導致的疾病如關節炎、肌肉萎縮、腫瘤入侵、腎小球腎炎(glomeronephritis)、寄生蟲造成的骨質感染、parasitomies、牙周疾病和腫瘤轉移；與心房利鈉因子的退化有關的心臟疾病；炎性疾病如支氣管炎、關節炎、風濕、骨質疏松、急性胰腺炎和癌擴散；失調如健忘癥、憂郁癥和血壓的調控；糖尿病，錐蟲病，查格斯氏病，食物性失調，暴食癥和厭食癥；酒精中毒，與細胞因子和細胞因子受體如白介素-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(INFN-γ)、IL-1拮抗劑受體(IL-1RA)、IL-10和粒細胞-巨噬細胞克隆(GM-CSF)的生長刺激因子的產生有關的疾病；心理緊張，對抗由HIV病毒(AIDS)導致的感染；導致髓鞘(mieline)退化的中樞神經系統炎性疾病，包括多發性硬化癥和自體免疫性腦脊髓炎；癌腫瘤，自體免疫性疾病，腫瘤包括乳房、骨髓、腺瘤、甲狀腺、黑素瘤、胃腸瘤、食道和甲狀腺腫瘤和成神經細胞瘤。
87.如權利要求81或83所述的用于制備藥物以治療與蛋白或酶活性有關的失調和疾病的用途。
88.如權利要求81或83所述的用途，其抑制抑制幼骨髓細胞進入細胞分裂(S期)。
89.如權利要求81或83所述的用途，其是抗血管生成的。
90.如權利要求81或83所述的用途，其是抗轉移的。
91.如權利要求81或83所述的用于輔助放射治療處理的用途。
92.如權利要求81或83所述的用途，其與DNA反應。
93.如權利要求81或83所述的用途，其是免疫調節子。
全文摘要
本發明涉及含有雙二苯基膦－二茂鐵配位配體的環鈀化合物和其類似物，其作為肽和酶的活性抑制劑，如絲氨酸肽酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和肽鏈內切酶家族的酶，這些酶的其中一些與惡性腫瘤，如甲狀腺腫瘤的生長和轉移有關。該化合物的例子如圖所示。通過作用于上述酶并參與DNA分子的插入，這些化合物調控免疫系統。
文檔編號C07F15/00GK1741797SQ03824724
公開日2006年3月1日 申請日期2003年8月22日 優先權日2002年8月30日
發明者安東尼奧·卡洛斯·法韋羅·凱雷斯, 克羅迪婭·賓科萊托·特林達德, 伊瓦爾·路易斯·多斯·桑托斯·泰爾薩瑞爾 申請人:圣保羅國家資助研究基金會