專利名稱：制備酰化肽的方法
技術領域：
本發明涉及一種用于酰化肽和蛋白質的方法。更具體的，本發明涉及一種用于將一個或多個酰基導入肽或蛋白質的方法。
背景技術：
業已有大量肽被證實用于醫療實踐，所述肽可通過重組DNA技術在適當的宿主細胞中產生，或其可通過現有的肽合成技術合成性制備。但是，天然肽及其類似物傾向于顯示高清除率，這對許多臨床需要長期高血漿濃度的肽之癥狀是不可接受的。呈天然形式的具有高清除率的肽的例子有ACTH、促(腎上腺)皮質(激素)釋放因子、加壓素、降鈣素、胰島素、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)、胰島素樣生長因子-1、胰島素樣生長因子-2、抑胃肽、生長激素釋放因子、垂體腺苷酸環化酶激活肽、分泌素、腸抑胃素(enterogastrin)，生長抑素、促生長素、生長介素、甲狀旁腺激素、血小板生成素、促紅細胞生成素、下丘腦釋放因子、催乳素、甲狀腺刺激激素、內啡肽、腦啡肽、后葉加壓素、催產素、 阿片及其類似物、超氧化物歧化酶、干擾素、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脫氨酶和核糖核酸酶。
已發現肽和肽類似物的多種衍生化用于以有利的方向影響肽的清除速率。一種這樣的衍生化是親脂性酰基向治療性肽的導入，引起相對于非酰化肽而言所期望之延長的作用曲線。因此，治療性蛋白質不甚頻繁的施用改善了患者對規定治療的順應性，且降低了待施用的肽的量。在WO98/08871(其中，尤其是公開了GLP-1及其類似物的酰化)、WO98/08872(其中，尤其是公開了GLP-2及其類似物的酰化)和WO99/43708(其中，尤其是公開了exendin及其類似物的酰化)中業已描述和證實。在肽和酰基之間的單或二肽間隔基，如天冬氨酸和谷氨酸被證實是期望的。
包括自由羧酸基的間隔基必須在酰化前被保護，隨后去保護。EP1227107公開了人胰島素ε-氨基的酰化。WO00/55119公開了用于酰化肽(如GLP-1)的方法和新的酰化劑。
為了使治療性肽經濟上有益，制備肽的成本以及肽的治療性劑量非常重要。治療性肽的制備的主要成本是需要將目標蛋白質與和目標蛋白質緊密相關的雜質(例如異構體，脫氨形式)等分離的純化步驟。這些純化步驟通常通過層析進行，提示需要昂貴的層析基質和溶劑以及總產率較低。
本發明的目的在于提供一種有效、經濟的方法，用于通過α-氨基-α，ω-二羧酸間隔基向肽導入親脂性基團。所述方法更具有特異性，因此有較高的產率且形成較少的密切相關雜質。實現了酰化肽生產成本的明顯降低。對于最大化可接受治療病人的數目以及對于利用通過比皮下注射具有較低生物利用度的其他遞送方案(例如經皮和肺遞送)的有利性而言，非常希望不甚昂貴的酰化肽。
發明概述本發明提供了一種酰化肽或蛋白質的一個或多個氨基的方法，所述方法包括步驟a)在堿性條件下水性混合物中將具有至少一個自由氨基的肽與通式I的酰化劑反應 其中n是0-8；R1是COOR4；
R2是親脂性部分；R3與R3所連接的羧基一起稱為活性酯或活性N-羥基酰亞胺酯；且R4選自氫、C1-12-烷基和芐基；b)如果R4不是氫，在堿性條件下皂化酰化肽的酯基(COOR4)；c)分離N-酰化肽，其特征在于，所述步驟a)中的水性混合物中含有低于10％w/w的非質子極性溶劑。
在所述方法的一個實施方案中，所述步驟a)中的反應在含有低于8％w/w，優選低于5％w/w，甚至更優選低于3％w/w的非質子極性溶劑的水性混合物中進行。
在所述方法的另一實施方案中，酰化劑作為固體加入反應混合物中。
在所述方法的另一實施方案中，酰化劑作為通過加入酸穩定化的非質子性極性溶劑中的溶液加入反應混合物中。
發明詳述肽和蛋白質本發明用于向任一肽(或蛋白質)導入親脂性酰基以降低體內清除率。所述肽和蛋白質的實例有ACTH、促(腎上腺)皮質(激素)釋放因子、加壓素、降鈣素、exendin及其類似物、胰島素及其類似物、胰高血糖素及其類似物、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)及其類似物、胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)及其類似物、胰島素樣生長因子-1、胰島素樣生長因子-2、抑胃肽、生長激素釋放因子、垂體腺苷酸環化酶激活肽、分泌素、腸抑胃素，生長抑素、促生長素、生長介素、甲狀旁腺激素、血小板生成素、促紅細胞生成素、下丘腦釋放因子、催乳素、甲狀腺刺激激素、內啡肽、腦啡肽、后葉加壓素、催產素、阿片及其類似物、超氧化物歧化酶、干擾素、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脫氨酶和核糖核酸酶。
應當理解肽(或蛋白質)應當帶有至少一個自由的氨基，所述氨基是N-末端氨基或側鏈氨基。肽或蛋白質可含有不是由遺傳密碼編碼的氨基酸，如D-氨基酸、3-羥基脯氨酸、鳥氨酸和戊基甘氨酸。特別感興趣的是賴氨酸和鳥氨酸氨基酸殘基的氨基。本發明的方法特別與賴氨酸殘基ε-氨基的N-酰化相關。也應當理解目標肽或蛋白質可含有兩個或多個側基氨基，其均可根據本發明被N-酰化。
本發明特別適于GLP-1及其類似物的酰化。可被根據本發明N-酰化的GLP-1及其類似物的實例是GLP-1和截短的類似物，如Arg26-GLP-1(7-37)；Arg34-GLP-1(7-37)；Lys36-GLP-1(7-37)；Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)；Arg26，34Lys38GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys39-GLP-1(7-39)；Arg26，34Lys40-GLP-1(7-40)；Arg34Lys36-GLP-1(7-37)；Arg26Lys39-GLP-1(7-39)；Arg34Lys40-GLP-1(7-40)；Arg26，34Lys36，39-GLP-1(7-39)；Arg26，34Lys36，40-GLP-1(7-40)；Gly8Arg26-GLP-1(7-37)；Gly8Arg34-GLP-1(7-37)；Gly8Lys36-GLP-1(7-37)；Gly8Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)；Gly8Arg26，34Lys39-GLP-1(7-39)；Gly8Arg26，34Lys40-GLP-1(7-40)；Gly8Arg26Lys36-GLP-1(7-37)；Gly8Arg34Lys36-GLP-1(7-37)；Lys36-GLP-1(7-37)；Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)；Arg26，34-GLP-1(7-37)；Arg26，34Lys40-GLP-1(7-37)；Arg26Lys36-GLP-1(7-37)；Arg34Lys36-GLP-1(7-37)；Val8Arg22-GLP-1(7-37)；Met8Arg22-GLP-1(7-37)；Gly8His22-GLP-1(7-37)；Val8His22-GLP-1(7-37)；Met8His22-GLP-1(7-37)；His37-GLP-1(7-37)；Gly8-GLP-1(7-37)；Val8-GLP-1(7-37)；Met8-GLP-1(7-37)；Gly8Asp22-GLP-1(7-37)；Val8Asp22-GLP-1(7-37)；Met8Asp22-GLP-1(7-37)；Gly8Glu22-GLP-1(7-37)；Val8Glu22-GLP-1(7-37)；Met8Glu22-GLp-1(7-37)；Gly8Lys22-GLP-1(7-37)；Val8Lys22-GLP-1(7-37)；Met8Lys22-GLP-1(7-37)；Gly8Arg22-GLP-1(7-37)；Val8Lys22His37-GLP-1(7-37)；Gly8Glu22His37-GLP-1(7-37)；Val8Glu22His37-GLP-1(7-37)；Met8Glu22His37-GLP-1(7-37)；Gly8Lys22His37-GLP-1(7-37)；Met8Lys22His37-GLP-1(7-37)；Gly8Arg22His37-GLP-1(7-37)；Val8Arg22His37-GLP-1(7-37)；Met8Arg22His37-GLP-1(7-37)；Gly8His22His37-GLP-1(7-37)；Val8His22His37-GLP-1(7-37)；Met8His22His37-GLP-1(7-37)；Gly8His37-GLP-1(7-37)；Val8His37-GLP-1(7-37)；Met8His37-GLP-1(7-37)；Gly8Asp22His37-GLP-1(7-37)；Val8Asp22His37-GLP-1(7-37)；Met8Asp22His37-GLP-1(7-37)；Arg26-GLP-1(7-36)-酰胺；Arg34-GLP-1(7-36)-酰胺；Lys36-GLP-1(7-36)-酰胺；Arg26，34Lys36-GLP-1(7-36)-酰胺；Arg26，34-GLP-1(7-36)-酰胺；Arg26，34Lys40-GLP-1(7-36)-酰胺；Arg26Lys36-GLP-1(7-36)-酰胺；Arg34Lys36-GLP-1(7-36)-酰胺；Gly8-GLP-1(7-36)-酰胺；Val8-GLP-1(7-36)-酰胺；Met8-GLP-1(7-36)-酰胺；Gly8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺；Gly8Glu22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Val8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺；Met8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺；Gly8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺；Val8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺；Met8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺；Gly8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺；Val8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺；Met8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺；Gly8His22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Gly8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺；Val8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺；Met8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺；Gly8His22-GLP-1(7-36)-酰胺；Val8His22-GLP-1(7-36)-酰胺；Met8His22-GLP-1(7-36)-酰胺；His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Val8Arg22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Met8Arg22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Gly8His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Val8His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Met8His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Gly8Asp22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Val8Asp22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Met8Asp22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Val8Glu22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Met8Glu22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Gly8Lys22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Val8Lys22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Met8Lys22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Gly8Arg22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Val8His22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Met8His22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；及其衍生物。
所述GLP-1類似物及其截短的類似物中的每一種均構成本發明的另外的實施方案。
本發明也特別適于GLP-2及其類似物的酰化。可被根據本發明N-酰化的GLP-2及其類似物的實例是GLP-2和截短的類似物，如Lys20GLP-2(1-33)；Lys20Arg30GLP-2(1-33)；Arg30Lys34GLP-2(1-34)；Arg30Lys35GLP-2(1-35)；Arg30，35Lys20GLP-2(1-35)；和Arg35GLP-2(1-35)。所述GLP-2類似物及其截短的類似物中的每一種均構成本發明的另外的實施方案。
本發明也適于exendin-3和exendin-4及其類似物的酰化。根據本發明可被N-酰化的exendin類似物的實例公開于例如WO99/43708。所述exendin類似物及其截短的類似物中的每一種均構成本發明的另外的實施方案。
本發明也特別適于胰島素及其類似物的酰化。根據本發明可被N-酰化的胰島素及其類似物的實例是人胰島素和des(B30)-人胰島素。
在本發明的又一實施方案中，N-酰化發生在賴氨酸殘基的ε-氨基。
酰化劑根據本發明的方法，具有至少一個自由氨基的肽(或蛋白質)與通式I的酰化劑反應
式I中的整數n優選為0-8，相應于例如天冬氨酸、谷氨酸等特別是0-6。優選的，n是0-4，如0-2，例如0(天冬氨酸)或1(谷氨酸)。上述整數的每一個及其范圍構成本發明的其他實施方案。
式I中的R1代表自由酸基(COOH)或酯基(COOR4)。當R1為酯基時，R4選自在堿性條件下通過水解可被移除的基團(作為相應的醇)。所述基團的實例為C1-12-烷基，例如甲基、乙基、丙-1-基、丙-2-基、丁-1-基、丁-2-基、2-甲基-丙-1-基、2-甲基-丙-2-基(叔丁基)、己-1-基等和芐基。所述基團的每一個均構成本發明的其他實施方案。
式I中的R2代表待摻入肽或蛋白質的親脂性部分。所述親脂性部分通常選自C3-39-烷基、C3-39-鏈烯基、C3-39-鏈二烯基和甾族殘基。C3-39-烷基的具體實例為庚基、壬基、十一烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基和十九烷基。所述親脂性部分的每一個均構成本發明的其他實施方案。
所述親脂性取代基(或部分)的特征在于在20℃下具有水中的溶解度范圍從約0.1mg/100ml水-約250mg/100ml水，優選的范圍從約0.3mg/100ml水-約75mg/100ml水。例如，辛酸(C8)在20℃具有水中溶解度68mg/100ml，癸酸(C10)在20℃具有水中溶解度15mg/100ml，十八酸(C18)在20℃具有水中溶解度0.3mg/100ml。所述親脂性取代基范圍中的每一個均構成本發明的其他實施方案。
術語″C3-39-烷基″，″C3-39-鏈烯基″和″C3-39-鏈二烯基″意在包括直鏈和分支的，優選直鏈，分別為飽和的、單不飽和的和雙不飽和的3-39個碳原子的烴基。C3-39-烷基的具體實例為為庚基、壬基、十一烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基和十九烷基。
如此處所用，術語″甾族殘基″是指一種親脂基，其與和R2連接的羰基一起衍生自甾族(steroide)羧酸，即三、四和五環、完全飽和或部分未飽和的C16-36-烴。所述基團R2-C(＝O)-的實例為石膽酰基(lithocholoyl)、脫氧膽酰基(deoxycholoyl)和膽酰基(choloyl)。
在上述親脂性基團中，C7-25-烷基、C7-25-鏈烯基、C7-25-鏈二烯基和甾族殘基尤其相關。特別感興趣的實例是庚基、壬基、十一烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基、十九烷基、石膽酰基、脫氧膽酰基和膽酰基。所述親脂性基團中的每一個均構成本發明的其他實施方案。
式I中的R3與R3所連接的羧基一起稱為活性酯，或活性N-羥基酰亞胺酯。所述酯中的每一個均構成本發明的其他實施方案。活性酯和活性N-羥基酰亞胺酯均為有機化學領域(特別是肽化學)公知，作為用于氨基、巰基和羥基的酰化中的官能團。在本發明中，術語″活性酯或活性N-羥基酰亞胺酯″是指適于酰化胺(優選是伯胺)的羧基基團的酯官能化形式。因此，應當理解對伯胺酰化的選擇性比對羥基和巰基的酰化選擇性更優選。活性N-羥基酰亞胺酯尤其優選。
活性酯的實例是1-羥基苯并三唑酯和衍生物。已知許多用于形成這類羧酸的活性酯的高效試劑，例如2-(1H-苯并三唑-1基)-1，1，3，3-四甲基尿鎓四氟硼酸。所述活性酯通常在堿，例如有機堿(如三烷胺)存在下原位形成。
活性N-羥基酰亞胺酯的酰亞胺部分的實例在EP 0511600 A2，第3-7頁有具體描述。其中特別感興趣的酰亞胺部分的實例是琥珀酰亞胺、鄰苯二甲酰亞胺等。所述酰亞胺部分的每一個均構成本發明的其他實施方案。
式I的活性N-羥基酰亞胺酯可如WO00/55119和WO98/02460所述制備。
在其中式I的酰化劑被用作自由α-羧酸(R4＝氫)時，其中R4是一個可被選擇性除去的基團之式I化合物被轉化成相應的其中R4是氫的化合物。羧酸保護基團可以是能夠被催化氫化移除的芐基或能夠被選擇性除去的烯丙基。芐基保護基團可以通過催化氫化在非質子極性溶劑(例如丙酮)中室溫下利用披鈀木炭和氫被去除。反應可以在氫氣氛(通常0.1-10atm)的密閉容器中劇烈攪拌條件下進行。根據鈀催化劑的質量，反應一般在0.5-12小時內完成。可采用常規技術。
反應條件式I的酰化劑與肽或蛋白質之間的反應在堿性條件下在含有低于10％w/w非質子極性溶劑的水性溶液中進行。
在本發明的一個實施方案中，步驟a)中的反應在含有0％w/w-10％w/w非質子極性溶劑的水性溶液中進行。
在本發明的一個實施方案中，步驟a)中的反應在含有1％w/w-10％w/w非質子極性溶劑的水性溶液中進行。
在本發明的一個實施方案中，步驟a)中的反應在含有1％w/w-8％w/w非質子極性溶劑的水性溶液中進行。
式I的酰化劑一般以相對于待酰化的肽之氨基數目略微過量的量使用。根據肽中的氨基數目，一般是1∶1-1∶20，優選地1∶1.2-1∶5過量的酰化劑比例。酰化劑可以作為固體加入反應混合物，或其可以作為溶液加入反應混合物。當作為溶液加入酰化劑時，其溶解在非質子極性溶劑中，且優選地通過加入酸穩定化。通常，用于穩定化的酸是無機酸，例如硫酸。
應當知曉，根據所用酰化劑的量和反應條件，肽可以被完全N-酰化或僅僅部分N-酰化。優選的，N-酰化反應基本上是化學計量式的。
非質子極性溶劑是具有適當的高介電常數的溶劑，其不含有酸性氫(見，例如Morrison和Boyd，Organic Chemistry，5thed.p 229)。通常非質子極性溶劑選自無水四氫呋喃(THF)、無水二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、二氯甲烷、二甲亞砜(DMSO)，二噁烷、二甲基乙酰胺和N-甲基-2-吡咯烷酮及其混合物，其中二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、二甲基乙酰胺和N-甲基-2-吡咯烷酮是優選的，N-甲基-2-吡咯烷酮是特別優選的。
溫度一般保持在-10-50℃的范圍。
重要的是溶劑混合物的pH值在范圍7-14，例如9-13，優選的在范圍10-12，以順利進行反應。當溶劑混合物的pH值在范圍10-12時，就產率和純度的結果而言一般是最優的。通過加入堿金屬氫氧化物，例如氫氧化鈉和氫氧化鉀，和/或有機堿例如三烷基胺(如三乙胺，N，N-二異丙基乙基胺等)獲得期望的pH值。也可以有利地加入適于在反應起始前保持pH在起始值附近的緩沖液。可用于所述目的的緩沖液的實例是磷酸緩沖液、硼酸緩沖液等。
作為一個典型的實例，利用摩爾比為1∶1-1∶5的蛋白質和式I酰化劑進行步驟(a)中的反應。一般，在-10-30℃(如0-25℃)的水中預先溶解所述肽，使用堿金屬氫氧化物(例如，氫氧化鈉或氫氧化鉀)調節pH至適當的水平。pH值可利用酸(如乙酸)和堿(如三烷基胺)進一步調節，但是溫度優選的在上述范圍內。或者，將肽直接預先溶解在適當量的相關酸或堿的水性溶液中。隨后作為固體或作為在非質子極性溶劑中的溶液加入酰化劑。反應一般允許進行完全(可用HPLC監測)，一般在0.2-4小時，如0.2-1小時實現，然后加入水和酸(如乙酸)至pH 6.5-9.0。產物一般通過HPLC分離和純化，或通過等電點pH沉淀，或在純化前水解(步驟(b))。
當使用其中R4是氫的式I酰化劑時，直接獲得帶有親脂性部分和自由羧基的N-酰化肽或蛋白質。因此，其中R4是氫的變化代表本發明所述方法的優選實施方案。
或者，即當基團R4是C1-12-烷基或芐基，N-酰化肽酯(或蛋白質酯)在堿性條件下被皂化，以獲得N-酰化肽或N-酰化蛋白質。皂化一般地在0.01-4.0M堿金屬氫氧化物溶液(例如氫氧化鈉或氫氧化鉀)中實施。溶液的pH一般為10-14。一般允許反應在0-40℃(例如室溫左右)的溫度下進行0.1-12小時，優選0.5-4小時。反應后，通過在等電點pH沉淀和/或制備性HPLC純化產物。因此，其中R4是C1-12-烷基或芐基的變化代表本發明所述方法的其他優選的實施方案。
在本方法的另一實施方案中，酰化劑作為固體加入反應混合物中。
在本方法的另一實施方案中，步驟a)中的所述反應在含有0％w/w-8％w/w非質子極性溶劑，優選0％w/w-5％w/w非質子極性溶劑，甚至更優選0％w/w-3％w/w非質子極性溶劑的水性混合物中進行。
在本方法的另一實施方案中，步驟a)中的所述反應在存在非質子極性溶劑的條件下進行，所述非質子極性溶劑選自N-甲基-2-吡咯烷酮、四氫呋喃和二甲基亞砜。
在本方法的另一實施方案中，所有的非質子有機溶劑作為酰化劑的溶劑加入反應混合物中。
在本方法的另一實施方案中，酰化劑作為通過加入酸穩定化的溶液加入反應混合物中。
在本方法的另一實施方案中，所述酸以0.01％w/w-1％w/w的濃度，優選以0.05％w/w-0.5％w/w的濃度加入非質子極性溶劑。
在本方法的另一實施方案中，所述酸選自硫酸、甲磺酸和三氟乙酸。
在本方法的另一實施方案中，步驟a)中的反應在不存在非質子極性溶劑的條件下發生。
在本方法的另一實施方案中，式I中的R4是氫。
在本方法的另一實施方案中，R4選自C1-8-烷基和芐基。
在本方法的另一實施方案中，R3與R3所連接的羧基一起稱為活性N-羥基酰亞胺酯。
在本方法的另一實施方案中，酰化肽酯在pH值范圍10-14，優選在pH范圍9-13下被皂化。
在本方法的另一實施方案中，酰化肽酯在pH值范圍9-14，例如pH范圍10-13下被皂化。
在本方法的另一實施方案中，步驟a)中反應混合物的pH從pH9-pH13，優選從pH10-pH12，或更優選的從pH11.0-pH11.5。
在本方法的另一實施方案中，步驟a)中的反應混合物包含適于在反應過程中維持基本上恒定的pH的緩沖液。在本方法的一個實施方案中，所述緩沖液是磷酸緩沖液、硼酸緩沖液或其混合物。
在本方法的另一實施方案中，步驟a)中的反應混合物的溫度范圍為0-50℃，優選為5-40℃，更優選為10-30℃。
在本方法的另一實施方案中，R2選自C3-39-烷基，C3-39-鏈烯基、C3-39-鏈二烯基和甾族殘基。
在本方法的另一實施方案中，R2-C(＝O)-選自石膽酰基和十六烷酰基。
在本方法的另一實施方案中，所述肽用作步驟a)的起始材料，具有如RP-HPLC確定的至少80％，至少90％，至少93％，至少95％或至少97％的肽純度。
在本方法的另一實施方案中，所述肽選自GLP-1、exendin-4、GLP-2，胰高血糖素、胰島素和任一前述的類似物和衍生物。
在本方法的另一實施方案中，所述肽是GLP-1激動劑。
在本方法的另一實施方案中，所述肽選自exendin-3，exendin-4，Arg34-GLP-1(7-37)，Gly8-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8-GLP-1(7-37)，Val8-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8-GLP-1(7-37)，Val8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Asp22-GLP-1(7-37)，Val8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Lys22-GLP-1(7-37)，Val8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Arg22-GLP-1(7-37)，Val8His22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8His22-GLP-1(7-37)，des(B30)人胰島素及其衍生物。
在本方法的另一實施方案中，所述肽選自Val8Trp19Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Glu22Val25-GLP-1(7-37)，Val8Tyr16Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Leu16Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Tyr18Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Glu22His37-GLP-1(7-37)，Val8Glu22Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22Val25-GLP-1(7-37)及其類似物。
在本方法的另一實施方案中，所述肽選自HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2(ZP-10)及其類似物。
在本方法的另一實施方案中，所述肽不是胰島素肽，即其不是胰島素或其類似物。在本方法的另一實施方案中，所述肽僅包含一條多肽鏈。在所述方法的另一實施方案中，所述肽包含兩條多肽鏈，其通過至少一個二硫鍵共價連接。
本發明的另一方面是用于制備如下肽衍生物的酰化方法的用途，所述肽衍生物選自Arg34，Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六烷酰基)))-GLP-1(7-37)和LysB29(Nε-十四烷酰基)des(B30)人胰島素和LysB29(Nε[Nα-石膽酰基-Glu-OH])des(B30)人胰島素。
實施例如WO 00/55119所述進行酰化劑的制備。
在實施例中通過柱層析獲得產物的最終純化。
實施例1在酵母(釀酒酵母(S.cerevisiae))中通過常規重組DNA技術，例如WO 98/08871所述表達Arg34GLP-1(7-37)。發酵液中的Arg34GLP-1(7-37)再通過常規反相層析和隨后在肽的等電點pH(即在pH 5.4)沉淀進行純化。通過離心和冷凍分離沉淀。
將Arg34GLP-17-37(1.47g冷凍等電沉淀肽材料，約0.10mmol)在10-15℃溶于0.1mol/kg三乙基胺(23ml)。溶液的pH調整為11.6。加入N-十六烷酰基谷氨酸γ-N-羥基琥珀酰亞胺酯(63.7mg，0.13mmol)。室溫下20分鐘后加入水(42ml)，通過加入1.0M乙酸調整pH至8.0。
產率根據分析型RP-HPLC，反應混合物顯示含有84％(面積)的Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37和0.5％(面積)的Arg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37。
實施例2Arg34GLP-1(7-37)在酵母(釀酒酵母)中通過常規重組DNA技術表達，例如WO 98/08871中所述。發酵液中的Arg34GLP-1(7-37)然后通過常規反相層析和隨后在肽的等電pH，即在pH5.4下沉淀而純化。通過離心和冷凍分離沉淀。
將Arg34GLP-17-37(1.57g冷凍等電沉淀肽材料，約0.14mmol)在10-15℃溶于0.1mol/kg三乙基胺(23ml)。通過加入三乙胺將溶液的pH調整為11.5。加入溶于N-甲基-2-吡咯烷酮(含有0.105％w/w 1MH2SO4)的1.7ml N-十六烷酰基谷氨酸γ-N-羥基琥珀酰亞胺酯(92.1mg，0.19mmol)。室溫下20分鐘后加入水(42ml)，通過加入1.0M乙酸調整pH至8.0。
產率根據分析型RP-HPLC，反應混合物顯示含有83％(面積)的Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37和0.4％(面積)的Arg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37。
實施例3Arg34GLP-1(7-37)在酵母(釀酒酵母)中通過常規重組DNA技術表達，例如WO 98/08871中所述。發酵液中的Arg34GLP-1(7-37)然后通過常規反相層析和隨后在肽的等電pH，即在pH5.4下沉淀而純化。通過離心和冷凍分離沉淀。
將Arg34GLP-17-37(1.53g冷凍等電沉淀肽材料，約0.13mmol)在室溫下溶于0.05mol/kg三乙胺(25ml)。溶液的pH為10.9。加入溶于N-甲基-2-吡咯烷酮(不含有H2SO4)的1.8ml N-十六烷酰基谷氨酸γ-N-羥基琥珀酰亞胺酯(94.2mg，0.19mmol)。室溫下30分鐘后加入水(48ml)，通過加入1.0M乙酸調整pH至8.0。
產率根據分析型RP-HPLC，反應混合物顯示含有75％(面積)的Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37和4.0％(面積)的Arg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37。
實施例4-對比實施例，非質子極性溶劑含量＞10％w/wArg34GLP-1(7-37)在酵母(釀酒酵母)中通過常規重組DNA技術表達，例如WO 98/08871中所述。發酵液中的Arg34GLP-1(7-37)然后通過常規反相層析和隨后在肽的等電pH，即在pH5.4下沉淀而純化。通過離心和冷凍分離沉淀。
將Arg34GLP-17-37(1.57g冷凍等電沉淀肽材料，約0.14mmol)在10-15℃溶于0.1mol/kg三乙基胺(23ml)。加入N-甲基-2-吡咯烷酮(6.8ml)并通過加入三乙胺將溶液的pH調整為11.5。然后加入溶于1.7ml N-甲基-2-吡咯烷酮(含有0.105％w/w 1M H2SO4)的N-十六烷酰基谷氨酸γ-N-羥基琥珀酰亞胺酯(92.1mg，0.19mmol)。室溫下20分鐘后加入水(54ml)，通過加入1.0M乙酸調整pH至8.0。
產率根據分析型RP-HPLC，反應混合物顯示含有87％(面積)的Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37和0.5％(面積)的Arg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37。
實施例5-對比實施例，非質子極性溶劑含量＞10％w/wArg34GLP-1(7-37)在酵母(釀酒酵母)中通過常規重組DNA技術表達，例如WO 98/08871中所述。發酵液中的Arg34GLP-1(7-37)然后通過常規反相層析和隨后在肽的等電pH，即在pH5.4下沉淀而純化。通過離心和冷凍分離沉淀。
將Arg34GLP-17-37(1.51g冷凍等電沉淀肽材料，約0.13mmol)在10-15℃溶于0.1mol/kg三乙基胺(20ml)和N-甲基-2-吡咯烷酮(100ml)。加入溶于1.4ml N-甲基-2-吡咯烷酮(含有0.105％w/w 1M H2SO4)的N-十六烷酰基谷氨酸γ-N-羥基琥珀酰亞胺酯(74mg，0.15mmol)。室溫下45分鐘后加入水(206ml)，通過加入1.0M乙酸調整pH至8.0。
產率根據分析型RP-HPLC，反應混合物顯示含有57％(面積)的Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37和14％(面積)的Arg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37。
實施例6表1中概述了實施例1-5的實驗中用于酰化Arg34-GLP-17-37的實驗條件，以及列出了所得雜質Arg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37(簡稱為α-glu)的含量。不加入H2SO4作為穩定劑時，顯然較低濃度的非質子極性溶劑在降低α-glu雜質的量上有效。當加入穩定劑時，在明顯較高濃度的非質子極性溶劑，即高于28％w/w開始形成明顯量的α-glu雜質。
表1.當酰化GLP-1肽時非質子極性溶劑在反應混合物中的含量和所得雜質Arg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37(α-glu)的級分。(數據來自實施例1-5)
實施例7鈉結晶的des(B30)-人胰島素(通過等電點沉淀分離的1.74g冷凍肽材料，約0.088mmol)室溫下溶于0.1mol/kg三乙胺(10.85ml)。溶液的pH為10.9。然后，加入溶于N-甲基-2-吡咯烷酮(1.25ml)的甲基(2S)-5-[(2，5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-2-{[(3a，5b)-3-羥基-9-甲基-24-氧代膽-24-基]氨基}-5-氧代戊酸酯(55.1mg，0.089mmol)。室溫下30分鐘后加入水(5℃，85ml)。
產率根據分析型RP-HPLC，反應混合物顯示含有34％(面積)的Nε-(石膽酰基-γ-谷氨酰基)-LysB29-des(B30)-人胰島素。
實施例8.
Arg34GLP-1(7-37)在酵母(釀酒酵母)中通過常規重組DNA技術表達，例如WO 98/08871中所述。發酵液中的Arg34GLP-1(7-37)然后通過常規反相層析和隨后在肽的等電pH，即在pH5.4下沉淀而純化。通過離心和冷凍分離沉淀。
將含有Arg34GLP-1(7-37)(5.70g冷凍沉淀肽材料，約0.38mmol)的等電沉淀在15℃溶于0.1M二水合磷酸氫二鈉溶液(170mL，用1MNaOH將pH調至11.35)。通過加入1M NaOH將溶液pH再調至11.4。在8分鐘內逐滴加入3mL溶于N-甲基-吡咯烷酮(含有0.105％w/w 1M H2SO4)的N-十六烷酰基谷氨酸γ-N-羥基琥珀酰亞胺酯(248.1mg，0.51mmol)。
在15℃下21.5小時的反應過程中取出(drawn out)樣本，加入含有1mg/mL甘氨酸的0.1M二水合磷酸氫二鈉溶液，pH 7.5。用水(300ml)稀釋終反應混合物，通過加入冰醋酸調整pH至8.0。
產率根據分析型RP-HPLC，反應混合物顯示含有78-80％(面積)的Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37和0.24-1.67％(面積)的Arg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37。
表2.Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37(γ-Glu)和Arg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37(α-Glu)的量對反應時間(數據來自實施例8)
權利要求
1.一種制備N-酰化肽的方法，所述方法包括下列步驟a)在堿性條件下于水性混合物中將具有至少一個自由氨基的肽與通式I的酰化劑反應 其中n是0-8；R1是COOR4；R2是親脂性部分；R3與R3所連接的羧基一起被稱為活性酯或活性N-羥基酰亞胺酯；且R4選自氫、C1-12-烷基和芐基；b)如果R4不是氫，在堿性條件下皂化酰化肽的酯基(COOR4)；c)分離N-酰化肽，其特征在于，所述步驟a)中的水性混合物中含有低于10％w/w的非質子極性溶劑。
2.權利要求1的方法，其中所述步驟a)中的反應在含有低于8％w/w非質子極性溶劑，優選低于5％w/w非質子極性溶劑，甚至更優選低于3％w/w非質子極性溶劑的水性混合物中進行。
3.權利要求1-2中任一項的方法，其中所述酰化劑作為固體加入反應混合物。
4.權利要求1-2中任一項的方法，其中所述步驟a)中的反應在存在非質子極性溶劑的條件下發生，且所述非質子極性溶劑選自N-甲基-2-吡咯烷酮、四氫呋喃和二甲基亞砜.
5.權利要求4的方法，其中所有的非質子有機溶劑作為酰化劑的溶劑加入反應混合物。
6.權利要求4-5中任一項的方法，其中酰化劑作為通過加入酸被穩定化的溶液形式的加入反應混合物。
7.權利要求6的方法，其中所述酸以濃度0.01％w/w-1％w/w，優選以濃度0.05％w/w-0.5％w/w加入非質子極性溶劑。
8.權利要求6-7中任一項的方法，其中所述酸選自硫酸、甲磺酸和三氟乙酸。
9.權利要求1-3中任一項的方法，其中步驟a)中的反應在不存在非質子極性溶劑的條件下進行。
10.權利要求1-9中任一項的方法，其中R4是氫。
11.權利要求1-9中任一項的方法，其中R4選自C1-8-烷基和芐基。
12.權利要求1-11中任一項的方法，其中R3與R3所連接的羧基一起被稱為活性N-羥基酰亞胺酯。
13.權利要求1-9中任一項的方法，其中酰化肽酯在pH值范圍10-14，優選pH范圍9-13中被皂化。
14.權利要求1-13中任一項的方法，其中步驟a)中的反應混合物的pH為pH9-pH13，優選pH10-pH12，或更優選pH11.0-pH11.5。
15.權利要求1-14中任一項的方法，其中步驟a)中的反應混合物的溫度范圍為0-50℃，優選5-40℃，且更優選10-30℃。
16.前述權利要求中任一項的方法，其中R2選自C3-39-烷基、C3-39-鏈烯基、C3-39-鏈二烯基和甾族殘基。
17.權利要求16的方法，其中R2-C(＝O)-選自石膽酰基和十六烷酰基。
18.前述權利要求中任一項的方法，其中用作步驟a)的起始物的所述肽具有以RP-HPLC測定的至少80％、至少90％、至少93％、至少95％或至少97％的肽純度。
19.前述權利要求中任一項的方法，其中所述肽選自GLP-1、exendin-4、GLP-2、胰高血糖素、胰島素，前述任一項的類似物和衍生物。
20.前述權利要求中任一項的方法，其中所述肽是GLP-1激動劑。
21.前述權利要求中任一項的方法，其中所述肽選自exendin-3exendin-4、Arg34-GLP-1(7-37)、Gly8-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8-GLP-1(7-37)、Val8-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8-GLP-1(7-37)、Val8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Asp22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Lys22-GLP-1(7-37)、Val8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Arg22-GLP-1(7-37)、Val8His22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8His22-GLP-1(7-37)、des(B30)人胰島素及其類似物。
22.權利要求19的方法，其中所述肽選自HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2(ZP-10)及其類似物。
23.權利要求1-14任一項的方法，其中步驟a)中的反應混合物含有適于在反應過程中維持基本上恒定pH的緩沖液。
24.前述權利要求中任一項的方法，其中所述肽不是胰島素肽，即其不是胰島素或其類似物。
全文摘要
本發明提供了一種用于酰化肽的一個或多個氨基的方法，其中所述酰化反應在含有低于10％w/w非質子極性溶劑的水性混合物中進行。
文檔編號C07K1/107GK1684941SQ03823008
公開日2005年10月19日 申請日期2003年9月25日 優先權日2002年9月25日
發明者D·L·丁韋伯, I·H·延森, L·B·漢森 申請人:諾沃娜第克公司