專利名稱：富集和檢測病理學改變的朊病毒蛋白質(PrP的制作方法
技術領域：
本發明涉及檢測活生物體的病理學改變的朊病毒蛋白質的方法。
背景技術：
可傳播的海綿樣腦病(Transmissible Spongiform Encephalopathies)(TSE)是傳染性的，通常是致命的，中樞神經系統的退行性病變。這些疾病中出現的腦內組織病理學改變與病理學改變的朊病毒蛋白質(PrPSc)(其是天然存在的細胞朊病毒蛋白質(PrPC)的構象異構體)的累積有關。出現在病程中的朊病毒的復制，是PrPSc和PrPC之間直接相互作用的結果，其中病理性PrPSc的構象被強加到PrPC上。通過與PrPc進行對比，PrPSc的特征為β折疊的含量增加以及對蛋白酶(例如蛋白酶K)的高度抗性。
PrPSc的這種抗性目前用于檢測牛海棉樣腦病(BSE)的體外診斷中。目前的檢驗系統的原則是將來自腦干(腦閂區)的組織部分進行勻漿，并且用蛋白酶K進行處理。蛋白酶處理將正常PrPC完全分解，但來自感染了BSE的動物的PrPSc只縮短了幾個氨基酸，從而將其相對分子量從33-35kDa降低到27-30kDa。隨后，通過Western印跡或者ELISA技術用單克隆抗體顯示保留的PrP。
這一檢驗系統的重要缺點是其低敏感性。在感染BSE的牛中PrPSc的濃度的高度僅高到使得在檢驗系統只能存在中樞神經系統(CNS)中，并因此，目前診斷只限于死亡后檢查，并依賴于感染生物體的至少18個月到幾年的潛伏期(incubaion period)。
除了上述檢測PrPSc，診斷TSE還有兩種方法在CNS中檢測典型的海綿樣變的組織病理學方法，和一種生物試驗，其顯示了小鼠模型中樣品的感染力。這兩種方法也都有重要的缺點。該組織病理學方法不適于臨床前診斷，因為腦內的結構改變只出現在潛伏晚期，即在臨床期前不久。此外，用這種方法進行診斷是在死亡后進行的，這是因為必需的腦組織不能從活生物體中獲得。在理論上，生物試驗能夠檢測單個感染單元，但這種方法需要至少幾個月或者甚至幾年。
為了在可能的感染之后和/或在仍存活的生物體中盡快進行診斷，前一檢測方法的敏感性必須在實質上得到提高，而且除在CNS中可以進行檢測以外，必須還有可能在組織/體液中進行檢測。
病理性PrPSc與人血清蛋白例如纖溶酶原(plamsinogen)的結合已經由Fischer等描述[Fischer，MB；Roeckl，C；Parizek，P；Schwarz，HP；Aguzzi，A(2000)；“Binding of disease-associated prion proteins to plasminogen”.Nature，408479-483]。朊病毒蛋白質與纖溶酶原的結合有賴于所述蛋白的構像，因為PrPC不能進行結合。血纖維蛋白原也能和PrPSc結合，但是缺乏Ca2+離子時則不能。
根據WO 02/00713，PrPSc與人纖溶酶原的特異性結合用于將PrPSc從CNS物質中分離出來。為此，將人纖溶酶原固定在磁性顆粒上。然而，這種方法僅適合檢測體液和組織(不含纖溶酶原)中的PrPSc，但不適合，例如，檢測血清中的PrPSc。這一方法的其它缺點是其費用昂貴以及載有纖溶酶原(plasminogen-loaded)的磁性顆粒的蛋白結合能力有限。
本發明的目的因此為提供一種可增加敏感性并使得能在活生物體中診斷TSE的方法。
本發明的目的通過專利權利要求中限定的主題實現。
圖1圖示了本發明使用固相偶聯的β-折疊結合分子進行PrPSc的富集和檢測的方法原理。
圖2圖示了微量滴定板模型(microtitre-plate format)(MTP)中的PrPSc結合實驗的結構(實施例1)。各種β-折疊分解物(breaker)(BSB)肽被固定在載體上作為有效的β-折疊結合分子以及PrPSc捕獲物；與樣品物質共同溫育后，結合的PrPSc使用單克隆抗-PrP抗體顯示。
圖3顯示來自BSE陽性牛的腦勻漿中的PrPSc與KLVFF瓊脂糖結合以后，各級分(fraction)中所含PrPSc的洗脫曲線。各級分中所含PrPSc的量是以半定量的方式，使用PlateliaBSE檢測試劑盒測定的，并表示為光密度[OD]值。
圖4顯示對來自BSE陽性牛的房水和腦脊液樣品中的PrPSc的檢測的評估。在該實例中，肽KLVFF用于ELISA模型中作為PrPSc的捕獲分子。所述檢驗是用針對PrPSc的單克隆抗體VB52(r-Biopharm，Darmstadt)和多克隆過氧化物酶偶聯的山羊抗小鼠IgG抗體進行的。
發明內容
本文術語“β-折疊結合分子(β-pleated-sheet-binding molecule)”描述了一種有機分子，因其三維結構和/或其物理性質，所述分子能夠與蛋白質中的β-折疊結構，例如病理學改變的單體/寡聚體朊病毒蛋白質中的β-折疊結構相互作用，并且能夠基于這種相互作用與它們結合。示例性β-折疊結合分子顯示在SEQ ID NO1-10中。
本文術語“β-折疊分解物(BSB)”描述了短肽，其不僅與β-淀粉樣蛋白(Alzheimer’s病中的蛋白聚集物)的β-折疊結構結合，而且還與淀粉樣蛋白樣結構結合，但也可阻斷或逆轉它們的異常折疊。
本文術語“病理學改變的朊病毒蛋白質”指PrPSc。PrPSc可以以單體和/或寡聚體的形式存在，也可以以原纖維狀的(fibrillary)，淀粉樣蛋白聚集體的形式存在。
于死后檢測其腦干組織中的蛋白酶K-抗性PrPSc的牛在本文定義為“BSE陽性牛”。
本發明涉及檢測病理學改變的朊病毒蛋白質(PrPSc)的方法，包括以下步驟a)將樣品和固相載體一同溫育，其中所述固相載體與β-折疊結合分子偶聯；b)除去沒有和β-折疊結合分子結合的樣品組分；和c)檢測與β-折疊結合分子結合的病理學改變的朊病毒蛋白質(PrPSc)。
根據本發明的方法，體液、細胞裂解物或身體組織中所含的單體和/或寡聚體病理學改變的朊病毒蛋白質被富集，使得可以顯示甚至是最小的、至今不可檢測的濃度的PrPSc。結果，活的動物或人在即使感染了激發TSE(TSE-triggering)的朊病毒后不久，就可定為感染。這在以前是不可能的，因為無法獲得這樣敏感的檢驗，且此外，所述檢測只能在死后對腦組織進行，其中PrPSc的濃度足夠高。此外，由于其高敏感性，該方法在身體組織例如腦勻漿中出現感染以后基本上較早的時間提供了結果，而現有的檢測方法只有在感染已經進展到明顯程度時才顯示結果。
待研究的樣品可以是體液，例如血液，血清，血漿，腦脊液，房水，淚液，尿液，唾液，淋巴液，乳汁，或細胞裂解物，例如來自白細胞或者來自淋巴組織的細胞的裂解物)，或組織勻漿(例如來自中樞神經系統組織，或來自淋巴組織(例如脾，扁桃體，淋巴結)或其它器官。
溫育以前，樣品可選地經過樣品準備階段。這對組織樣品而言尤其必要。這些樣品可以在加入適當的緩沖溶液(例如50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.5)之后，例如使用超聲或者核糖裂解物(ribolyser)處理，進行機械粉碎，然后進行勻漿，從而將其組分轉變成溶液或者懸液。為了分離通過機械處理所得的組織或者細胞懸液中的固體組分，或者存在于體液中的固體組分，所述樣品也可通過離心和/或過濾階段。
經過或者不經過上述樣品準備，所述樣品可選地，附加地或者唯一地，可以經過蛋白酶處理以在溫育之前通過蛋白水解分解PrPC。這主要是在待檢測的PrPSc，例如單體和/或寡聚體形式的PrPSc，將是用抗體進行檢測時進行，所述抗體僅能在蛋白酶處理之后從PrPC中分辨PrPSc。為此，使用蛋白酶處理所述樣品物質，例如蛋白酶K。所述蛋白酶消化可以在各蛋白酶的標準條件下進行，或者根據制造商產品說明進行，優選在37℃進行1小時。使用的酶濃度可在大約10μg/ml到大約1mg/ml，這與樣品物質有關，優選用大約50μg/ml的酶處理含有大約0.5到大約10mg/ml蛋白的樣品物質。
固相載體可以是球形聚合物(例如瓊脂糖凝膠，瓊脂糖，或者乳膠)，塑料界面(例如微量滴定板)，硅膠包被的玻璃板(例如薄層層析)，毛細管或者膜。球形聚合物可以用作柱層析或者批量加工中的載體(例如磁性珠)。如果所述聚合物用于柱層析，它們優選用于預裝好的(pre-packed)一次性柱。除了所列出的固相載體，任何可用于偶聯β-折疊結合分子的固相載體都適合。
所述樣品可以和固相載體所述固相載體例如玻璃板，微量滴定板在封閉的容器中一同溫育大約5到約120分鐘，其中溫度范圍從約4℃到約50℃。所述溫育優選在低轉動頻率(例如80rpm)的溫育搖床中在37℃進行1小時。通過將樣品和固相載體一同溫育，樣品中所含PrPSc和固定在所述固相載體上的β-折疊結合分子結合。如果所述固相載體，例如球形聚合物，用于聚合物層析中，溫育可在柱中進行。溫育期根據柱而不同，與柱和儀器之間的連接以及樣品的流通速率有關。
偶聯于固相載體的β-折疊結合分子與PrPSc結合的親合力比與PrPC結合親合力的高得多，并且根據本發明能夠捕獲體液中出現的可溶的以及單體和/或寡聚物形式的PrPSc。根據本發明，β-折疊結合分子是由3到大約30個氨基酸組成的寡肽，優選由4，5或6個氨基酸組成的寡肽。這些肽可以在C末端和/或N末端經過修飾，例如為了獲得改善的溶解性。除了其結合PrPSc的性質，β-折疊結合分子也可提供β-折疊分解物[BSB]的特性。然而，除了這些BSB性質，本發明的β-折疊結合分子提供對PrPSc的結合特性(親合力，結合的可逆性)，使其能夠從溶液中捕獲并富集PrPSc。BSB肽與β-折疊結構結合過緊，或者以不可逆的方式結合，從而阻礙洗脫，所述BSB肽不適合作為β-折疊結合分子。BSB與PrPSc的結合親合力太低，或者以非持久的方式結合(例如β-折疊結構分解后，從BSB中釋放PrPSc)，其也不合適作為β-折疊結合分子。尤其優選的β-折疊結合分子在表1中顯示，并列為SEQ ID NO1-10。B-折疊結合分子也可以是被取代的雜環芳香族，優選類黃酮(flavonoid)，例如硫代黃素(thioflavin)T，黃岑苷(baicalin)或櫟苷(quercitrin)。
B-折疊結合分子優選通過共價鍵固定在固相載體上。β-折疊結合分子上的功能基團，例如氨基，羧基，或羥基用來實現與載體的偶聯。如果β-折疊結合分子是肽，所述偶聯優選通過在N末端的氨基或者C末端的羧基實現。如果寡肽是具有序列KLVFF(SEQ ID NO2)的五肽，所述偶聯優選通過C末端的羧基形成，這是如果通過氨基進行偶聯，多肽也可被固定在賴氨酸殘基的側鏈，從而導致PrPSc結合的位阻現象。
將樣品與固相載體一同溫育之后，去除不與β-折疊結合分子結合的樣品組分，優選在洗滌階段進行。具有適當的嚴謹度漸增的添加物的緩沖溶液用作洗滌溶液。洗滌溶液的pH值在中性范圍以內，優選大約pH7.5。優選，使用50mM的磷酸鹽緩沖液以緩沖所述溶液。另外，可在中性范圍內調節pH值的任何緩沖液都適合。嚴謹度漸增的添加物可以是無機鹽，例如NaCl，清潔劑(detergent)，例如SDS，Triton X 100或Tween 20，或離液劑，例如尿素，鹽酸胍，或異硫氰酸胍。具有1-4M的NaCl的緩沖溶液優選用作洗滌溶液。
根據載體物質表面的性質，與β-折疊結合分子結合的PrPSc可選地從固相載體(例如在柱層析中使用球形聚合物時)洗脫出來。使用其它載體，例如膜或塑料界面，可直接在固相載體上檢測PrPSc。然而，在這種情況下如需要也可進行洗脫。
為將PrPSc從β-折疊結合分子中洗脫，并相應地從所述固體載體上洗脫，使用極小體積的洗脫溶液沖洗所述載體。為了獲得適合所用檢測系統的敏感性的濃度作用，洗脫體積應該比樣品體積小得多。
含有可分解PrPSc和捕獲分子之間的連接的添加物的緩沖溶液用作洗脫溶液。洗脫溶液的pH值在大約pH6到大約pH8.5的范圍內，優選大約7.5。優選使用50mM磷酸鹽緩沖液緩沖所述溶液。或可在上述范圍內，優選在中性范圍內調節pH的任何緩沖液是適合的。所述添加物可以，例如是清潔劑，例如SDS，Triton X 100或Tween 20，離液劑(例如尿素，鹽酸胍，或異硫氰酸胍)，無機鹽例如NaCl。洗脫溶液優選含有清潔劑，例如5％的SDS。
隨后，在前述階段中富集的PrPSc可被檢測。為此，可用免疫化學檢測方法(例如ELISA，Western印跡，免疫沉淀)；生物物理檢測法(例如質譜法，熒光關聯光譜法(fluorescence correlation spectroscopy))；生物化學檢測法(例如生化參數的測定，如相對摩爾質量，N末端或C末端氨基酸序列，結合配偶體的結合和解離常數)；或者生物檢測法(例如細胞毒性實驗)。
優選，所述檢測使用可快速檢測PrPSc的方法進行。所述方法可以是，例如免疫檢測法，優選夾心-ELISA。使用已知的方法進行夾心ELISA。本文中，檢測抗體例如酶(例如辣根過氧化物酶)，可用染過色的化合物，熒光染料(例如熒光素)，金顆粒或者核酸(例如DNA或RNA寡核苷酸)進行標記。
在酶標記的情況下，在底物轉化之后通過光度計記錄染料的強度，并且所述強度與樣品中所含的PrPSc的量成正比。如果抗體標志是染色的化合物或者熒光染料，染料的強度或者其各自的熒光可直接測定。如果抗體標志是核酸，結合的抗體量可通過DNA或RNA標志的吸收而測定，其中所述信號使用PCR進行擴增(例如實時(real-time)PCR)。
本發明還涉及用于檢測體液，細胞裂解物，組織勻漿或者其它液體中的PrPSc的試劑盒。根據本發明，所述檢驗試劑盒含有用于富集PrPSc的固相載體，免疫檢測系統，溶解、洗滌和洗脫緩沖液濃縮物，各種對照，酶標抗PrP抗體，和相應的底物以及終止溶液。
所用固相載體優選是親合力層析物質，例如瓊脂糖凝膠，其可用于一次性柱中，或者塑料界面上(如微量滴定板)，根據本發明所述載體與β-折疊結合分子偶聯。如果固相載體是具有本發明所述偶聯的親合力層析物質，其可包含于懸液中，以干的形式存在，或者已經裝到檢驗試劑盒的一次性柱中。
免疫檢測系統優選是夾心ELISA，其中第二固相載體，例如微量滴定板由PrP的特異性抗體包被，優選由單克隆抗PrP抗體包被，具體為小鼠抗PrP抗體。具體地，檢測試劑盒中的固相載體以真空包裝的形式提供。
以重組方式生產的PrP和/或PrP肽優選用作對照。辣根過氧化物酶優選用于標記抗體。
本發明的方法和試劑盒允許使用大量樣品進行的大范圍研究，例如用于醫藥和農業。在具有適當設備的實驗室中，檢測方法的自動化是可能的。通過與前述方法進行對比，本發明的方法也適合對活動物或人的TSE診斷。
具體實施例方式
本發明將參考以下實施例具體說明實施例1使用MTP形式的不同肽從腦勻漿中分離PrPSc微量滴定板(MTP)(Nunc-ImmunoTMPlate MaxisorpTMSurface，F96(Nunc，Roskilde，Denmark))，用表1中所列的肽進行包被(見圖2)。所述包被通過每孔與100μl肽溶液(10μg/ml，0.1M碳酸鹽緩沖液中，pH9.6)在4℃共同溫育16小時進行。將液體通過真空吸出，并使用300μl洗滌緩沖液(PBS(10mM磷酸鹽緩沖液，0.15M NaCl，pH7.2)；0.05％ Tween 20))洗滌各孔三次。游離結合位置通過與含0.5％的酪蛋白的洗滌緩沖液在室溫共同溫育1小時而封閉。
經過洗滌階段以后(300μl洗滌緩沖液/每孔)，經包被的MTP用箔覆蓋，并與100μl含PrPSc樣品/每孔(來自BSE陽性動物的腦勻漿，其在Platelia中OD＞4.0；通過腦組織的免疫組織學研究確認為陽性發現)在37℃共同溫育1小時。非結合的樣品物質通過真空吸出，并使用300μl洗滌緩沖液/每孔洗滌3次。根據制造商產品說明，將具有檢測抗體(PlateliaBSE Detection，Kit，Bio-Rad Laboratories，Hercules，USA)的培養物在室溫溫育1小時。通過300μl洗滌緩沖液/每孔洗滌五次以去除多余的檢測抗體。加入底物溶液(N-四甲聯苯胺(Tetramethylbenzidine)[TMB]，PlateliaBSEDetection Kit，Bio-Rad Laboratories，Hercules，USA)后30分鐘時，通過加入1M H2SO4終止染色的進行，并通過在450nm進行消光度測定(對照620nm)記錄染色強度。
測定的消光度和與肽結合的PrPSc的量成正比，并因此可測定捕獲分子的效力。檢測肽的相對結合效率總結在表1中，來自最佳β-折疊結合分子(肽2)的信號設定為100％。
表1各種肽的PrPSc結合效率比較
實施例2與MTP模型中的KLVEF結合的PrPSc的洗脫PrPSc與捕獲分子之間的結合非常強，并且需要相對強烈的條件來從固相載體中洗脫PrPSc。洗脫條件使用MTP模型檢測。
如實施例1，用肽2(KLVEF)包被MTP，并充滿含PrPSc的腦勻漿(Platelia中OD＞3.0)。使用300μl洗滌緩沖液(PBS；0.05％Tween 20)/每孔洗滌3次后，每孔加入100μl強效(potential)洗脫緩沖液(見表2)，并在室溫溫育5分鐘。隨后，去除液體，并使用PlateliaBSE Detection Kit(Bio-RadLaboratories，Hercules，USA)測定洗脫緩沖液中洗脫的PrPSc的量和留在MTP上的PrPSc的量。對比洗脫效率(表2)顯示只有含清洗劑的緩沖液(含5％SDS)適合完全從捕獲分子洗脫PrPSc。在存在離液劑(例如6M尿素)的條件下，PrPSc只部分被洗脫。如果是具有低pH值(例如pH3)或者高離子強度(例如2MNaCl)的洗脫溶液，PrPSc幾乎完全保持與捕獲分子結合。
表2不同洗脫條件的對比
實施例3肽KLVFF與EAH瓊脂糖凝膠的共價結合如果通過氨基結合，所述肽將固定于N末端和側鏈(Lys)，這樣可破壞三維結構。為此，β-折疊結合分子KLVFF與固相載體的特異性結合可通過所述肽C末端的羧基實現。EAH-瓊脂糖凝膠4B(Amersham PharmaciaBiotech，Uppsala，Sweden)用作載體物質。
為準備結合反應，用0.5M NaCl洗滌EAH-瓊脂糖凝膠，并且完全去除任何多余的液體。配體是具有KLVEF序列的五肽，其溶于水，終濃度為5mg/ml，并用HCl將pH調節到4.5。將凝膠重懸于配體溶液中(1份凝膠+2份配體溶液)，并加入EDC(N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺)使其終濃度為0.1M。結合反應在室溫進行24小時同時輕輕攪動(rotation)。隨后，將上清完全從凝膠沉淀中去除。根據制造商產品說明，存在的任何游離結合位點在存在0.1M EDC的條件下，用1M乙酸封閉。充滿KLVFF的凝膠被置于層析柱中(床體積1ml)，并交替用3×2ml緩沖液A(0.1M乙酸鈉，0.5M NaCl，pH4)和3×2ml緩沖液B(0.1M tris/HCl，0.5M NaCl，pH8)洗滌，最后用10×2ml H2O進行洗滌。
實施例4通過KLVEF瓊脂糖從腦勻漿中分離PrPSc為證明KLVEF-瓊脂糖適合作為β-折疊結合分子，來自BSE陽性牛的腦勻漿的PrPSc與柱物質結合，并隨后再次洗脫。使用BSE純化試劑盒(Bio-RadLaboratories，Hercules，USA)根據產品說明制備腦物質。樣品物質根據制造商產品說明溶解于樣品稀釋緩沖液R6中(PlateliaBSE Detection Kit，Bio-Rad實驗室，Hercules，USA)(Platelia中的OD為6.0)。
使用1ml KLVFF-瓊脂糖如實施例3所述制備drip column，并在室溫用PBS充滿和平衡。加入樣品(250μl)后，用2ml PBS洗滌柱，并分別收集洗出物作為級分。結合的PrPSc隨后由含1.5ml 5％SDS的PBS洗出。每個級分中所得的PrPSc量使用PlateliaBSE檢測試劑盒通過免疫方法進行檢測。
圖3顯示該實驗的洗脫圖線，并記錄KLVFF-瓊脂糖可逆性結合PrPSc，的能力，并從而獲得該基質將從大體積的樣品中選擇性富集PrPSc的能力。在本文中，洗出物中所含的PrPSc是由于加樣超過了該柱的適應能力，因為所用腦樣品具有很高的PrPSc含量(Platelia中的OD為6.0)。洗脫中所得的信號由于洗脫緩沖液中SDS的ELISA中的干擾作用而降低。
實施例5通過MTP模型中的KLVEF從體液中分離PrPSc(朊病毒型體內BSE實驗(Priontype in-vivo BSE-test))MTP(Nunc-ImmunoTMPlate MaxisorpTMSurface，F96(Nunc，Roskilde，Denmark))用肽KLVFF包被(圖2)。所述包被是通過與100μl肽溶液(10μg/ml，0.1M碳酸鹽緩沖液中，pH9.6)/每孔在4℃溫育16小時進行的。隨后，液體用真空吸出，并且用300μl洗滌緩沖液(PBS；0.05％Tween 20；pH7.2)/每孔洗滌3次。游離的結合位置通過與含0.5％的酪蛋白的洗滌緩沖液在室溫溫育1小時而被封閉。洗滌階段(300μl洗滌緩沖液/每孔，3次)后，包被的MTP用箔覆蓋，并與100μl含PrPSc的樣品/每孔在室溫溫育1小時。
在該實驗中，研究了來自9只BSE陽性牛和5只BSE陰性牛的房水樣品，以及來自6只BSE陽性牛和13只BSE陰性牛的腦脊液樣品。所有樣品已經經過BSE純化試劑盒(Bio-Rad Laboratories，Hercules，USA)準備。非結合的樣品物質通過真空吸出，并且使用300μl洗滌緩沖液/每孔洗滌MTP三次。在室溫與檢測抗體(含5μg/ml V5B2的洗滌緩沖液，r-Biopharm，Darmstadt)溫育1小時。隨后，再次用300μl洗滌緩沖液洗滌該板三次，并在室溫和山羊抗小鼠IgG過氧化物酶偶聯物(1∶20000，洗滌緩沖液中，Jackson，USA)溫育一小時。通過用300μl洗滌緩沖液/每孔洗滌5次去除多余的偶聯物。加入底物溶液(TMB)后15分鐘，通過加入1M H2SO4終止染色，并通過測定450nm的消光度(以620nm為對照)記錄染色強度。測定的消光度與和肽結合的PrPSc的量成正比。如圖4所示，與BSE陰性動物相比，從BSE陽性動物所得的值(t-檢驗)明顯升高。房水樣品中的陽性和陰性樣品的之間的差異基本上比腦脊液樣品之間的差異明顯。這可以通過存在于相應體液中的PrPSc濃度解釋。根據這些結果，房水比腦脊液更優選作為檢測活動物體液內的PrPSc樣品物質。
序列表<110>普里昂泰普兩合公司(Priontype GmbH & Co.KG)凱瑟琳.施勒斯納(SCHLEUSSNER，Cathrin)<120>富集和檢測病理學改變的朊病毒蛋白質(PrPSc)的方法<130>LAB-001 PCT<140>PCT/DE 03/02249<141>2003-07-04<150>102 30 141.7<151>2002-07-04<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>β-折疊結合肽<400>10Arg Arg Ala Phe Phe Val1 權利要求
1.檢測病理學改變的朊病毒蛋白質(PrPSc)的方法，包括以下步驟a)將樣品和固相載體一同溫育，其中所述固相載體與β-折疊結合分子偶聯；b)去除不與β-折疊結合分子結合的樣品成分；和c)檢測與β-折疊結合分子結合的樣品成分。
2.權利要求1的方法，其中在步驟a)前對所述樣品進行蛋白酶處理。
3.前述權利要求之一的方法，其中所述固相載體是球形聚合物，塑料界面，硅膠包被的載玻片，毛細管或膜。
4.前述權利要求之一的方法，其中所述β-折疊結合分子是具有3-30個氨基酸殘基的寡肽或者經過取代的雜環芳香族。
5.權利要求4的方法，其中所述寡肽提供根據SEQ ID NO1-10的氨基酸序列。
6.前述權利要求之一的方法，其中所述檢測通過免疫檢測法進行。
7.檢測病理學改變的朊病毒蛋白質(PrPSc)的試劑盒，包括至少一種與β-折疊結合分子偶聯的固相載體，洗滌溶液，洗脫溶液和檢測系統。
8.權利要求7的試劑盒，其中所述檢測系統是免疫檢測系統，并包含用抗PrP抗體包被的第二固相載體，酶標記的第二抗體，底物溶液和終止溶液。
9.權利要求7或8的試劑盒，其中一種固相載體包裝在一次性柱中，并且所述第二固相載體是微量滴定板。
全文摘要
本發明涉及富集和檢測活生物體的病理學改變的朊病毒蛋白質(PrP
文檔編號C07K7/02GK1666106SQ03815590
公開日2005年9月7日 申請日期2003年7月4日 優先權日2002年7月4日
發明者克勞迪婭·恩格曼, 卡特加·霍施勒, 喬爾格·萊曼, 喬爾格·加伯特, 烏爾里克·克魯姆萊 申請人:普里昂泰普兩合公司, 凱瑟琳·施勒斯納