前列腺素e2受體亞型ep4的拮抗肽的制作方法

專利名稱：前列腺素e2受體亞型ep4的拮抗肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及前列腺素E2受體亞型EP4的拮抗肽。更加具體地講，本發明涉及前列腺素E2受體亞型EP4的肽拮抗劑，以及在治療與少尿腎病、骨再吸收、腸隱窩細胞異常增殖或動脈導管未閉相關的疾病中這些肽拮抗劑的用途。
背景技術：
前列腺素來源于前列腺素(PG)合酶對花生四烯酸的氧化作用。前列腺素介導廣泛的生理作用，例如血管舒縮、睡眠/覺醒周期、腸分泌、脂肪分解、腎小球濾過作用、肥大細胞脫顆粒作用、神經傳遞、血小板聚集、leuteolysis、子宮肌層收縮和分娩、炎癥反應和關節炎、動脈導管未閉、細胞生長和分化。前列腺素類激素通過結合到屬于視紫紅質樣七次跨膜螺旋受體超家族的不同受體上，而介導前列腺素的作用。這些受體偶聯于含有α、β和γ亞基的異三聚體G蛋白上，當激活時會引起細胞內鈣的改變、啟動磷酸肌醇水解作用、或者促進或抑制環腺苷一磷酸合成(Narumiya，S.等，1999；Physiol.Rev.791193-1226.)。
在5種藥理學各不相同的前列腺素類激素受體PGE2、PGI2、PGD2，PGF2α和TxA2中，對PGE2受體的4個亞型進行了描述(Ichikawa等，1996)。它們是EP1、EP2、EP3和EP4，其中EP1、EP2和EP3具有幾種不同剪接的變體。所克隆的人EP4(也就是已知的前列腺素E2受體亞型EP4)是具有488個氨基酸的糖蛋白，連接于Gαs亞基，并且參與對腺苷酸環化酶的刺激作用和cAMP合成(美國專利號5,759,789和5,605,814)。EP4受體在小腸中高水平表達，但在肺、腎、胸腺、子宮和腦中表達水平非常低(Bastien，Y.等，1994，J.Biol.Chem.269(16)11873-77)。EP4受體參與腎內液體濾過作用、單核細胞/巨噬細胞前體細胞分化為破骨細胞、腸隱窩細胞增殖和哺乳動物胎兒中的動脈導管未閉。
PGE2在腎中大量產生并參與腎微循環的調控、鹽和水運輸以及腎素釋放(Breyer，M.D.等，1998；Kidney Int.54(Suppl.67)S88-94)。所有EP受體在腎結構中呈區域性分布(Morath，R.等，1999；J.Am.Soc.Nephrol.101851-60)并且與特異的功能相關。所有關于EP受體在腎中分布的研究已經表明EP4受體僅特異性地在腎小球中表達(Breyer，M.D.等，1996；Am.J.Physio.270F912-918.Morath，R.等，1999；J.Am.Soc.Nephrol.101851-60)。然而，也有個別報道表明EP4受體存在于腎單位其它結構，如收集管(Breyer，M.D.等，1998；Kidney Int.54(Suppl.67)S88-94)、腎動脈中層和直小血管(Morath，R.等，1999；J.Am.Soc.Nephrol.101851-60)。已經在腎小管旁的顆粒細胞中發現了EP4轉錄本，這與在這些細胞中PGE2誘導的cAMP合成作用相一致。因此EP4在腎素分泌中也具有作用。
人們認為腎小球前列腺素影響濾過作用(Schlondoff，D.等，1987；Kidney Int.29108-19)和腎素釋放。在分離的腎小球中PGE2增加cAMP水平(Freidlander，G.等，1983；Mol.Cell.Endocrinol.30201-214)。這表明與cAMP合成作用偶聯的EP4受體可以調節腎小球濾過作用(Sugimoto，Y.等，1994；Am.J.Physio.266(5 Pt 2)F823-8)。利用小分子拮抗劑(Kohno，Y.等，WO 00/16760)和肽拮抗劑(Peri，K.G.等，WO00/01445)，已經證明EP4受體對于調節腎濾過作用和尿排泄量具有直接作用。
骨經歷持續不斷的重塑，其中骨形成是由成骨細胞執行的，而骨吸收是由破骨細胞實現的。這些過程由幾種體液因子所控制，如甲狀旁腺激素、雌二醇、維生素D、細胞因子、生長因子和前列腺素。已經證明阿司匹林樣藥物抑制通過白介素-1(IL-1)誘導的破骨細胞作用(Tai，H.等，1997)。具有EP4受體激動活性的PGE2類似物(迄今為止無該受體的特異性激動劑或拮抗劑)在小鼠成骨細胞和骨髓細胞共培養物中促進破骨細胞形成。利用來自EP4敲除小鼠的細胞的類似實驗導致破骨細胞形成降低，表明EP4受體在小鼠破骨細胞形成中具有作用(Narumiya等，1999)。
動脈導管是胎兒體內一個通常寬大、低阻力、分流性的導管，可以促進流向肺的血的分流。由于胎兒不使用其肺(氧通過母親的胎盤提供)，胎兒的肺是萎陷的，并且對血流具有高的阻力。因此，血流從右心室通過導管進入主動脈降支。高水平的循環前列腺素，特別是PGE2，維持腳中的導管開放。當嬰兒出生時，肺擴張，肺的阻力下降，PGE2水平降低，導管開始關閉，因此血液從肺動脈進入肺。在大多數情況下24小時之內新生兒體內高水平的氧通常使導管關閉。動脈導管未閉(PDA)是指其中導管沒有關閉的情況。對于PDA，發病率和致死率直接歸因于通過動脈導管的血流量。大部分PDA可以引起肺性高血壓、水腫、復發感染，并且如果長期未得到治療，可以導致充血性心力衰竭。也可以發展形成肺血管梗阻疾病。據估計，如果不治療，死亡率在20歲時為20％、45歲時為42％，且60歲時為60％。女性比男性形成PDA的比率可能高2-3倍。
PDA可以用藥物治療，如吲哚美辛，它是前列腺素合成阻滯劑，或者可以通過矯正手術治療PDA。然而，吲哚美辛具有腎局部缺血和腎低灌注的副作用，這在早產兒中導致局部缺血性腎衰竭。EP4表達于胎豬(Bhattacharya，M.等，1999；Circulation 100(16)1751-6)、胎羊(Bouayad，A.等，2001；Am.J.Physiol.Heart Cir.c Physiol.280(5)；H2342-9)和胎狒狒(Smith G.C.等，2001；J.Cardiovasc.Pharmacol.37(6)697-704)的動脈導管中。反常的是，EP4敲除小鼠出生后卻死于動脈導管的不完全閉合(Nguyen，M.等，1997；Nature，39078-81)。
EP4受體的一種選擇性肽拮抗劑已經用于胎兒動脈導管的治療(Peri，K.G.等，WO 00/01445和Wright，D.H.等，Am.J Physio.Regul.Integr.Comp.Physio.2001；281(5)R1343-60)。
前列腺素，特別是PGE2，在腸隱窩細胞增殖中具有重要作用。事實上，在腸息肉中存在可誘導的前列腺素合成酶COX-2，并且存在于結腸瘤中(Shattuck-Brandt，R.L.等，1999；Mol.Carcinog.24(3)177-87)。COX-2選擇性阻滯劑，諸如尼美舒利，用于阻止化學誘導的致結腸癌作用(Jacoby，R.F.等，2000；Cancer Res.60(18)5040-4)。最近，正如來自EP4-/-小鼠結腸息肉低發病率的推斷，由于氧化偶氮甲烷和EP4選擇性拮抗劑ONO-AE2-227在氧化偶氮甲烷處理的模型小鼠體內減少異常隱窩灶的效用，已經顯示PGE2的作用是由EP4受體介導的(Mutoh，M.等，2002；Cancer Res.62(1)28-32)。
因此仍有必要研發前列腺素E2受體亞型EP4的選擇性肽拮抗劑，并且這些藥物對于治療和預防致結腸癌作用是有用的。
同樣也需要治療終末期腎疾病、急性腎衰竭和在骨質疏松癥中阻止骨吸收的其它腎功能不全疾病，以及新生兒中阻止導管閉合疾病(PDA)的方法。
同樣還需要治療諸如骨質疏松、牙疾病以及其它疾病的方法，這些疾病過程中骨丟失是其主要部分。
本發明試圖滿足這些需求及其它需求。
本發明的說明書提到大量文獻，其中的內容此處完全引用作為參考。
發明概述敘述了前列腺素E2受體亞型EP4的選擇性肽拮抗劑。為了治療診斷為急性或進行性腎衰竭、骨質疏松、牙疾病和動脈導管未閉的病人，或者處于發展為此類疾病的危險之中的病人，這些肽拮抗劑能夠用于制備藥物組合物。
本發明涉及選擇性肽或肽模擬物(peptidomimetic)形式的前列腺素E2受體亞型EP4拮抗劑，它們能夠抑制至少一種受體活性的功能性作用。
本發明涉及前列腺素E2受體亞型EP4的選擇性肽拮抗劑。
此外，本發明還涉及能夠用于治療和預防致結腸癌作用的前列腺素E2受體亞型EP4的選擇性肽拮抗劑。
而且，本發明還涉及含有前列腺素E2受體亞型EP4的選擇性肽或肽模擬物拮抗劑的藥物組合物，這些藥物組合物用于治療終末期腎疾病、急性腎衰竭和在骨質疏松癥中阻止骨吸收的其它腎功能不全疾病，以及新生兒中阻止導管閉合疾病(PDA)。
此外，本發明還涉及選擇性EP4拮抗劑，它們用于治療一些疾病，諸如骨質疏松、牙疾病以及其它主要病程為骨丟失的疾病。
在下文中的詳細說明中本發明進一步的范圍和應用將變得更加明白。然而，應該理解該詳細說明及敘述本發明的優選實施方案僅僅是以舉例的方式給出的，但是對于本領域的技術人員，本發明的精髓和范圍之內進行的各種變化和改變是顯而易見的。
附圖簡述由于已經概述了本發明，附圖將作為參考，通過舉例說明的方式列出本發明優選的實施方案，并且其中

圖1A顯示在局部缺血腎病大鼠模型中213.15和相應的衍生物(見表3)對尿流速(表示為μl尿/小時/千克體重)的影響。圖1B和1C顯示在局部缺血腎病大鼠模型中213.15和相應衍生物(見表3)對60分鐘期間內的平均腎小球濾過率(GFR)(從藥物注射后的20分鐘到80分鐘，從去除夾鉗后立即開始計時)的影響；圖2A顯示在正常比格狗(Beagle)中213.29對GFR的劑量效應。圖2B顯示在大鼠、犬和小豬中213.29對腎功能參數的最大效應；圖3顯示213.29對由PGE2在豬的由U46619(血栓烷A2模擬物)前收縮的下隱靜脈環中產生的擴張影響；圖4A顯示人血清中213.29的降解曲線。該肽在羧基末端含有2個對血清蛋白酶敏感的賴氨酸。降解導致形成缺乏一個羧基端賴氨酸[213.291]或2個羧基端賴氨酸[213.292]的肽。在本實驗條件下，羧基端亮氨酸殘基表現出完全抵抗人血清的降解作用。圖4B顯示在基于細胞的測定中213.29及其代謝物的生物活性。在存在或缺乏213.29和其代謝物213.291和213.292時，用100nM PGE2刺激表達EP4的人HEK293細胞。用放射免疫測定法檢測的cAMP水平表示為pmol/105個細胞。
圖5顯示在豬視黃醛微血管收縮性測定中213.29對其它前列腺素類激素受體(布他前列素-EP2；17-苯基PGE2-EP1；PGF2a-FP；U46619-TP；M&B28767-EP3)的選擇性激動劑刺激的收縮反應的影響。
圖6A顯示在腎動脈阻塞(RAO)模型大鼠中對靜脈注射213.29大丸劑(1mg/kg)的反應，通過腎小球濾過率(GFR)、腎血漿流量(RPF)和尿排泄量估計腎功能的改善。作為對照，使用了非諾多泮(0.6μg/kg大丸劑，隨后試驗期間為0.6μg/kg/小時)。圖6B顯示RAO模型大鼠中對213.29和非諾多泮反應引起的血尿素氮(脲)和肌酸酐水平(圖6A中給出了腎功能參數)(Sham是指以假操作大鼠作為對照)；圖7顯示在使用雙側腎動脈鉗夾1小時并且qd(一天一次)靜脈注射1mg/kg的213.29大丸劑的大鼠中，圖形表示的腎組織學(球旁間隙中紅細胞外滲和呈現阻塞的腎小管)。結果表明213.29處理顯著減少球旁紅細胞外滲和腎小管阻塞，這將導致在局部缺血急性腎衰竭大鼠模型中腎功能更好地恢復；圖8顯示在使用雙側腎動脈鉗夾1小時的動物中，qd(一天一次)和bid(一天兩次)施用213.29(靜脈注射1mg/kg大丸劑)所引起的通過RPF、GFR和UV-尿流速評價的腎功能的改善；和圖9A顯示在急性腎小管壞死大鼠模型(在第一天用17.5mg/kg順鉑腹膜內注射大鼠)第5天時的腎功能參數。到第5天，鹽水(Sal)處理大鼠中腎小球濾過率(GFR)、腎血漿流量和尿排泄量降到最低水平；在第5天施用213.29(1mg/kg)改善鹽水處理大鼠的尿參數。然而，在第2天時開始用213.29(5mg/kg一天三次)處理大鼠，到第5天時腎功能所有參數幾乎都變得正常；腎功能的改善與血尿素氮(BUN)和肌酸酐水平的降低具有相關性。圖9B顯示順鉑處理大鼠腎組織學的圖形說明。213.29處理(5mg/kg一天三次)減少肥大性腎小球和含有阻塞的收集管的數量。
當閱讀了下面關于相應附圖的優選實施方案的非限制性描述之后，本發明的其它目的、優點和特點將變得更加明白，優選的實施方案僅作為示例性的例子，并不限制本發明的范圍。
優選實施方案的描述為了提供對用于本說明書的術語的清晰和一致的理解，下面給出了大量定義。
如此處所用的術語“激動劑”，可以理解為一種增強EP4至少一方面生物活性的制劑。例如，通過刺激野生型活性和刺激信號轉導，或者通過使野生型EP4蛋白質更有效地與其它參與信號轉導級聯反應的蛋白質相互作用，能夠增強EP4生物活性。
如此處所用的術語“拮抗劑”，可以理解為一種抑制EP4至少一方面生物活性的制劑。EP4拮抗劑可以是抑制或降低EP4分子與另一種分子之間的相互作用、或者降低EP4多肽的合成和表達、或者抑制EP4分子生物活性的化合物。拮抗劑可以是諸如EP4顯性陰性形式的核酸分子、EP4反義分子、能夠與EP4 mRNA特異性相互作用的核酶，或者結合到EP4多肽上的分子(如肽、肽模擬物、抗體、小分子)。
如此處所用的術語“氨基酸”，可以理解為既包括天然存在氨基酸的L型和D型異構體，同時還包括在肽化學中用于制備合成肽模擬物的其它非蛋白質氨基酸。天然存在氨基酸的例子包括，但不限于甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。非蛋白質氨基酸的例子包括，但不限于正亮氨酸、正纈氨酸、環己基丙氨酸、聯苯基丙氨酸、高苯基丙氨酸、萘基丙氨酸、吡啶基丙氨酸、以及取代的苯基丙氨酸(由一個或多個取代基取代，取代基包括但不限于烷氧基、鹵素和硝基)。β和γ氨基酸也在術語“氨基酸”所包括的范圍之內。這些化合物是肽化學領域的技術人員所熟知的。
為了清楚說明的目的，下面給出了通常公認的氨基酸符號
如此處所用的術語“極性氨基酸”，可以理解為是指含有不帶電荷的相對可溶于水的側鏈的任意氨基酸。
如此處所用的術語“疏水氨基酸”，可以理解為是指含有不帶電荷的微溶于水的側鏈的任意氨基酸。
如此處所用的術語“相關氨基酸”，可以理解為是指最初為天然或合成的α、β或γ取代的氨基酸，這些相關氨基酸能夠模仿側鏈的功能性(例如芳香族氨基酸、脂肪族氨基酸、帶電荷氨基酸、極性氨基酸、H-供體氨基酸、H-受體氨基酸)。取代基的例子包括，但不限于表1和2中所提供的基團。
如此處可替換使用的術語“生物學活性”、“生物活性”或“生物學功能”可以理解為是指由EP4多肽或其任意片段直接或間接執行的功能。EP4的生物學活性包括，但不限于結合到另一個分子上、與其它蛋白質相互作用、諸如通過Gα蛋白質的鳥嘌呤核苷酸結合、鈣流動、cAMP合成、磷酸肌醇合成的信號轉導中的變化、EP4多肽的內化、與其它細胞內蛋白質或細胞膜上的內陷小窩相互結合。下面敘述了EP4受體的生物學鑒定。
如此處可替換使用的術語“細胞”、“宿主細胞”或“重組宿主細胞”可以理解為不僅是指特殊的細胞，還指所有它的后代。而且可以認為哺乳動物、兩棲動物、真菌和細菌來源的細胞均處于這些術語所包括的范圍之內。
如此處使用的術語“調節”可以理解為是指上調[即激活作用或刺激作用(如通過激動或增強)]和下調[即抑制或壓制(如拮抗、減少或抑制)]。
如此處可替換使用的術語“蛋白質”、“多肽”可以理解為是指基因產物。
如此處使用的術語“肽”可以理解為是指含有至少2個氨基酸并且最大約為50個氨基酸的線性聚合物。氨基酸可以是天然存在的或合成來源的分子。此類分子的例子包括，但不限于L-氨基酸、D-氨基酸，以及包括但不限于非蛋白質氨基酸的天然氨基酸的合成類似物。
如此處使用的術語“肽模擬物”可以理解為是指模擬肽的結構和/或功能特性的分子。本領域的技術人員使用各種方法衍生特定肽的肽模擬物，方法諸如，但不限于用合成的化學實體、非蛋白質氨基酸類似物取代個別氨基酸、缺失和增加氨基酸、用諸如β轉角模擬物的支架結構，或用已知的藥效基團替換肽中的一個或多個氨基酸。考慮到潛能、效力，以及比親本肽更小并且具有更優化的藥理學和毒理學特性，衍生肽模擬物的目的就是獲得優良的肽分子類似物。
如此處使用的術語“小分子”可以理解為是指其分子量小于大約1kD并且最優選地是小于大約0.4kD的組合物。小分子的例子包括，但不限于核苷酸、氨基酸、肽、肽模擬物、糖類、脂類或其它有機(含碳的)分子。
如此處使用的術語“另一取代基團”可以理解為是指互換表2中所述的5個基團之中的一個。
如此處使用的術語“患者”可以理解為特指人類并包括任意種動物。
本發明涉及包含具有以下通式的肽拮抗劑的組合物
其中X連接于肽的N-末端并且X選自氫原子、1-3個氨基酸序列和諸如氨基甲酸酯和酰基的保護基團。酰基由選自環己基、苯基、苯甲基以及1-8個碳原子的短直鏈或支鏈烷基的疏水部分組成。酰基的具體例子是乙酰基和苯甲酰基；Y連接于肽的羧基端并且選自氫原子、1-5個L-賴氨酸殘基、磷酸鹽、硫酸鹽和乙二醇(1-5個殘基)；n是整數，等于9；R從肽的N-末端開始命名為R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9，其中，R1選自L-(4，4)聯苯基和D-(4，4)聯苯基；R2選自CH3、OH和CH2OH；R3選自CH3、OH和CH2OH；R4選自苯基、酪氨酰基、苯甲酰基，以及相關的芳香基團；R5選自CH2COOH、CH2CH2COOH，以及相關的羧酸基團；R6選自CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3，以及由1-6個碳原子組成的相關短鏈脂肪族烷基；R7選自CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3，以及由1-6個碳原子組成的相關短鏈脂肪族烷基；R8是賴氨酸；并且R9是賴氨酸。
在本發明一個優選的實施方案中，本發明的肽拮抗劑選自213.15(bip)tseyeaI(SEQ ID NO1)；213.19(bip)tseyeaIK(SEQID NO2)；213.20(bip)tseyegIK(SEQ ID NO3)；213.21(bip)tseyeaIKK(SEQID NO4)；213.22(bip)tseyegIKK(SEQ ID NO5)；213.23(bip)tseyesIK(SEQID NO6)；213.24(bip)tseyesIKK(SEQ ID NO7)；213.25(bip)tseyeaK(SEQID NO8)；213.26(bip)tseyesK(SEQ ID NO9)；213.27(Bip)tseyeaIKK(SEQID NO10)；213.28(bip)tseyeaLKK(SEQ ID NO11)；213.29(Bip)tseyeaLKK(SEQ ID NO12)；和213.30(bip)tseyeaIGKK(SEQ ID NO13)，
其中Bip是L-(4，4)-聯苯基丙氨酸，而bip是D-(4，4)-聯苯基丙氨酸，并且其中D-氨基酸用小寫字母表示，而L-氨基酸用大寫字母表示。氨基酸是用它們的單一字母代碼表示的。
本發明還涉及藥物組合物，其含有一種或多種選自所標記的序列SEQID NO1-13及其肽模擬物的肽拮抗劑以及為了增加腎小球濾過作用和尿排泄量而使用的一種或多種可藥用載體或賦形劑。
此外，本發明還涉及含有一種或多種選自所標記的序列SEQ ID NO1-13及其肽模擬物的肽拮抗劑的藥物組合物的用途，用于增加診斷為終末期腎疾病和急性腎衰竭患者的腎小球濾過作用和/或尿排泄量。
此外，本發明還涉及含有一種或多種選自所標記的序列SEQ ID NO1-13及其肽模擬物的肽拮抗劑的藥物組合物的用途，該用途是用于防止患有骨質疏松、牙疾病和癌相關疾病的患者所經歷的骨丟失。
而且，本發明還涉及含有一種或多種選自所標記的序列SEQ ID NO1-13及其肽模擬物的肽拮抗劑的藥物組合物的用途，該用途是用于在存在血管未閉的疾病中有效關閉動脈導管。
另外，本發明還涉及含有一種或多種選自所標記的序列SEQ ID NO1-13及其肽模擬物的肽拮抗劑的藥物組合物的用途，該用途是用于預防和治療診斷為結腸癌或腺瘤息肉的患者。
另外，本發明還涉及在測定中利用本發明的肽或肽模擬物的方法，其包括以下步驟培養天然或重組表達前列腺素E2受體EP4的細胞或組織；當存在或缺乏已知濃度的所述受體的激動劑時，用一定量的權利要求1的化合物處理所培養的細胞或組織；并測量受體生物活性的一個或多個方面，其中所述方面選自通過Gα蛋白質的GTP結合和水解、環腺苷一磷酸合成、細胞內鈣改變、細胞生長和/或分化、改變的基因表達和平滑肌收縮或擴張。
最后，本發明還涉及在生物測定中一種或多種選自所標記的SEQ IDNO1-13的肽拮抗劑用于鑒定小分子模擬物的用途。
當然應該理解本發明的肽拮抗劑也能夠用于預防前列腺素E2受體EP4拮抗劑被批準使用的醫學病癥或疾病。
EP4拮抗劑在本發明中，基于肽213.15(SEQ ID NO1)的序列，已經合成了一組肽。由于其難溶解性，該種肽作為治療制劑的潛能受到限制。合成了含有肽213.15各種修飾形式的肽文庫，并且以在正常動物和急性腎衰竭大鼠模型中的血清降解性、溶解性和藥理學功效和潛能為特征。基于這些分析，鑒定了幾種肽，更具體地是如Seq.ID No.2-13列出的肽。
EP4拮抗劑213.15(SEQ ID NO1)的優化為了提高本發明肽引導化合物的治療功效，通過用相關的氨基酸取代一個氨基酸或者通過將一個氨基酸加至肽的羧基端進行了肽的幾種修飾。本發明的EP4肽拮抗劑的氨基酸的取代包括但不限于這樣的變體，其中多肽中的至少一個氨基酸殘基已經由一個不同氨基酸，或者結構相關或者側鏈功能性相關(芳香族、脂肪族和帶正電荷或負電荷)的氨基酸代替。此類取代優選地是按照以下對氨基酸之間的關系描述進行的。
表1相關氨基酸的例子
如表2中說明的，本發明EP4肽拮抗劑的另一組取代基包括那些已經去除了其中至少一個氨基酸殘基并用不同的插入其位置內的殘基取代了的基團。
表2氨基酸之間的關系
表2中放在括弧內的三個氨基酸殘基在蛋白質結構中具有特殊的作用。“Gly”是唯一的缺少任何側鏈的殘基并因此使鏈具有柔韌性。然而這容易促進形成二級結構而不是α-螺旋結構。“Pro”由于其幾何學特性能牢固地束縛鏈。Pro通常易于促進形成β轉角樣結構。“Cys”能夠參與二硫鍵形成。
“Tyr”，由于其氫鍵勢能，與“Ser”和“Thr”具有顯著的親緣關系。
本發明EP4肽拮抗劑的任意氨基酸組分都能夠用其相應的對映異構體(同一氨基酸但手性相反)進行取代。因此，天然存在的任意L-構型氨基酸可以用其相應的對映異構體，即具有D-構型的氨基酸，所取代。L-構型氨基酸與D-構型氨基酸具有相同的化學結構類型，但具有相反的手性。L-和D-構型通常也稱為R-或者S-構型。此外，變化還包括提供化學基團不同空間排列的β-和γ-氨基酸。
除了上述的取代基之外，也能夠將提供相似側鏈功能性的合成氨基酸導入肽。例如，芳香族氨基酸可以用以下氨基酸所代替D-或L-萘基丙氨酸、D-或L-苯基甘氨酸、D-或L-2-噻吩基丙氨酸、D-或L- 1-，2-，3-，或4-芘基丙氨酸、D-或L-3-噻吩丙氨酸、D-或L-(2-吡啶基)-丙氨酸、D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸、D-或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸、D-或L-(4-異丙基)-苯基甘氨酸、D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸、D-(三氟甲基)-苯基丙氨酸、D-對氟苯基丙氨酸、D-或L-對聯苯基丙氨酸、D-或L-對甲氧基聯苯基丙氨酸、D-或L-2-吲哚(烷基)丙氨酸、以及D-或L-烷基丙氨酸，其中烷基選自取代的或未取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、異丙基、異丁基和異戊基。
非羧酸酯氨基酸能夠制成帶有負電荷，如由膦酰基或硫酸鹽(如-SO3H)氨基酸提供，這些被認為是非限制性的例子。
其它取代物可包括非天然的烷基化氨基酸，這是通過將烷基與任意天然氨基酸結合而獲得的。諸如賴氨酸和精氨酸的堿性天然氨基酸可以在氨基(NH2)官能團處進行烷基取代。然而其它取代包括天冬酰胺或谷氨酰胺的腈衍生物(如含有代替CONH2官能團的CN-部分)，和蛋氨酸的亞砜衍生物。此外，肽中任意酰胺鍵都可以用酮亞甲基、羥乙基、乙基/還原的酰胺、硫代酰胺或顛倒的酰胺部分(如(-C＝O)-CH2-)、(-CHOH)-CH2-)、(CH2-CH2-)、(-C＝S)-NH-)或(-NH-(-C＝O)為(-C＝O)-NH-))。
因此，肽的共價修飾包括于本發明的范圍之內。通過將能夠與多肽所選擇的側鏈或末端殘基反應的有機衍生劑與多肽的靶向氨基酸殘基反應，可以將此類修飾導入EP4肽拮抗劑。以下化學衍生物的例子僅通過闡述方式提供，并不意味著限制本發明的范圍。將半胱胺酰殘基可以與α-鹵代乙酸鹽(和相應的酰胺)如2-氯乙酸或氯乙酰胺反應，以提供羧甲基和羧酰胺甲基衍生物。組氨酰殘基可以通過與諸如焦碳酸二乙酯化合物反應(如，在pH5.5-7.0時)而衍生化，因為該試劑對組氨酰側鏈相對特異。還可以使用溴化對溴苯甲酰甲酯(例如，當反應優選地在0.1M二甲基申酸鈉中pH6.0時進行)。賴胺酰和氨基末端殘基可以與諸如琥珀酸或其它羧酸酐的化合物反應。用于衍生含α-氨基的殘基的其它適宜的試劑包括以下化合物，如亞氨酸酯(如甲基吡啶亞酰胺)；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氫硼化氯；三硝基苯磺酸；O-甲基異脲；2，4戊二酮；和轉氨酶催化的與乙醛酸的反應。
按照已知的方法步驟，通過與一種或多種常規試劑，如苯乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-環己二酮和茚三酮，反應，可以修飾精氨酰殘基。因為胍官能團的高pKa，精氨酸殘基的衍生化需要在堿性條件下進行反應。而且，這些試劑也可以與賴氨酸的酰胺基反應，同樣也與精氨酸∈-氨基基團反應。
酪氨酰殘基的特異性修飾本身是眾所周知的。具體的且非限制性的例子包括通過與芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反應可以將光譜標記導入到酪氨酰殘基上。N-乙酰咪唑和四硝基甲烷分別可以用于形成O-乙酰酪氨酰和3-硝基衍生物。
通過與碳化二亞胺(R′-N＝C＝N-R′)，如1-環己基-3-(2-嗎啉基-(4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮陽離子-4，4-二甲基戊基)碳化二亞胺，反應，可以選擇性地修飾羧基側鏈基團(天冬氨酰或谷氨酰)。而且，通過與銨離子反應可以將天冬氨酰和谷氨酰殘基轉化為天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰。谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰可以脫去酰胺基形成相應的谷氨酰和天冬氨酰殘基。
本發明的肽的其它修飾可以包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化作用；絲氨酰或蘇氨酰殘基上羥基的磷酸化作用；賴氨酸、精氨酸和組氨酸的α-氨基的甲基化作用；N-末端酰胺的乙酰化作用；主鏈酰胺殘基的甲基化(或用N-甲基氨基酸取代)，以及在某些情況下進行C-末端羧基的酰胺化，以上是按照本領域已知的方法進行的。
將脂肪酸(C6-C18)共價連接到本發明的肽上賦予肽其它的生物學特性，例如抗蛋白酶水解特性、血漿蛋白結合、血漿半壽期增加，以及細胞內滲透。
上述導向肽的可能的修飾將不應被視為方法范圍的限制，也不應被視為利用諸如213.15的導向肽作為模板而被工程化的可能的修飾的限制。由于肽折疊的復雜特性，無論是肽拮抗劑的受體結合構象，還是修飾肽對EP4生物活性的影響都不能用絕對的確定性來預測。因此，本領域的技術人員將容易理解，為了確定生物學活性，修飾的肽應用本發明中所述的或對于普通的技術人員而言本領域熟知的生物測定方法進行測試。測定法的非限制性例子包括受體結合或對結合相應GPCR的配體的調節。根據體外、離體和體內的測定方法，關于GPCRs，更加具體的是關于EP4受體的特定例子對于本領域技術人員是熟知的，并且以附圖形式描述所選擇的例子并敘述如下。
EP4受體生物測定利用來自組織或細胞得到的EP4純化或粗提的制備物，有許多已公開的測定EP4生物活性的方法(無細胞測定法；見下)，其中所述來自組織或細胞的EP4重組表達于異源的細菌、真菌或哺乳動物表達系統。
無細胞測定法可以用于鑒定能夠與EP4蛋白質相互作用從而修飾EP4蛋白質活性的化合物。例如，此種化合物能夠修飾EP4蛋白質的結構從而影響其活性。無細胞測定法還可以用于鑒定調節EP4蛋白質和EP4結合伴侶之間相互作用的化合物。一個EP4結合伴侶是PGE2。在一個優選的實施方案中，用于鑒定此類化合物的無細胞測定法基本上由含有緩沖溶液、EP4蛋白質、EP4結合伴侶和測試化合物的混合物組成。例如測試化合物可以是肽、肽模擬物、小分子和核酸。為了檢測，可以用諸如放射性核素的特異標記物、熒光化合物或酶標記結合伴侶。在孵育步驟和洗滌步驟之后，通過測定標記物的水平能夠檢測測試化合物與EP4蛋白質之間的相互作用。相對于缺乏測試化合物時的相互作用而言，當存在測試化合物時，EP4和EP4結合蛋白質的相互作用具有統計學意義的顯著改變(增強或抑制)，這表明測試化合物對于EP4生物活性具有潛在的激動作用(模擬物或增效劑)或拮抗作用(抑制劑)。用閃爍分光光度測定法計數用放射性同位素標記的樣本并定量。結合配體能夠被結合于諸如乙酰膽堿酯酶的酶上，并通過酶測定法定量所結合的EP4結合伴侶。
無細胞測定法也能夠用于鑒定與EP4蛋白質相互作用并調節EP4蛋白質活性的化合物。因此，在一個實施方案中，EP4蛋白質與測試化合物相接觸，并監測EP4蛋白質的生物活性。無細胞測定法中EP4蛋白質的生物活性包括，但不限于GTP結合、GTP水解、Gα蛋白質解離、腺苷酸環化酶活化、磷脂酶(A2、β、γ和D同工型)活化、磷脂水解和cAMP合成。測定GPCR蛋白質生物活性改變的方法是本領域技術人員熟知的。
基于細胞的EP4生物活性測定法EP4生物活性也能夠利用完整細菌、真菌、兩棲類動物或哺乳動物細胞進行測定(見下述的基于細胞的測定法)，其中EP4蛋白質作為天然蛋白質或作為融合蛋白質(例如連接于抗體表位標簽、綠色熒光蛋白、Gα或β抑制蛋白的EP4)重組表達。融合蛋白質比天然蛋白質具有某些優點；融合蛋白質能夠提供細胞、組織或有機體內EP4多肽或EP4生物活性的直接檢測。表位(FLAG、HA、多聚HIS、c-myc等)標記的EP4能夠用于通過免疫化學染色法跟蹤細胞和組織內的蛋白質，并且有助于通過免疫親和層析法分離純的或基本上純的EP4蛋白質。綠色熒光蛋白(GFP)融合于EP4蛋白質能夠用于在活的或固定的細胞內定位和跟蹤EP4的運動，例如EP4與其它細胞蛋白質聚合或結合，在內吞小泡中的內化、運輸、降解。EP4與GFP和螢光素酶融合能夠用于研究和監測二聚體和寡聚體的形成以及與其它信號分子的關系。EP4-Gα蛋白質融合能夠用于通過G蛋白對激動劑或拮抗劑的反應來測定GTP結合和水解，并且這些本領域技術人員熟知的方法被用于篩選和/或測試激動劑或拮抗劑活性小分子化合物文庫。這些實例用于進行闡明，但不試圖限制潛在的融合伴侶以及它們在基礎和應用科學研究中的用途。
例如，基于細胞的測定法能夠用于鑒定例如化合物，這些化合物可以調節EP4蛋白質生物活性和EP4基因的表達或那些由于EP4蛋白質生物活性增加或降低而受到誘導或抑制的基因的表達。因此，在一個實施方案中，當存在或缺乏天然或合成EP4激動劑/拮抗劑時，用測試化合物孵育能夠產生EP4的細胞，并測定EP4生物活性。將所得到的EP4生物活性的改變與對照的沒有與測試化合物相接觸的產EP4細胞相比較。這些測定用于評價調節EP4生物活性的測試化合物的潛能、親和性和作用。
治療方法本發明提供了預防和治療診斷為尿排泄量降低和急性或慢性腎功能缺損患者的方法。預防藥劑的施用應先于EP4異常癥狀特性臨床表現的出現，從而預防醫學病癥及其結果或者，作為選擇，延遲其病情發展。一般而言，預防或治療方法包括將治療有效量的EP4拮抗劑施用于需要其的受試者。如本發明中所述，適當的EP4拮抗劑及其衍生物的例子包括，但不限于肽、肽模擬物和小分子模擬物。
對于以尿排泄量降低、血尿素氮(BUN)和肌酸酐水平增加為特征的人腎功能不全性失調的治療，從腎病動物模型獲得了支持本發明EP4拮抗劑及其衍生物的治療用途的數據。由于不良腎臟灌注繼發的局部缺血或者由于放射造影劑、抗腫瘤藥、抗生素、免疫抑制劑和重金屬介導的腎毒性刺激，可以在急性腎衰竭中引起腎功能不全。已經充分描述了通過雙側腎動脈阻塞(局部缺血腎病)或順鉑注射(急性腎小管壞死)產生的腎功能不全的兩個大鼠模型，并且顯示出與人類患者所經歷的腎損傷相似(見綜述Lieberthal，W.，Nigam，S.K.(2000)；Am.J.Physio.Renal.Physiol.278(1)F1-F12)。兩個大鼠模型都用于闡明本發明的EP4拮抗劑及其衍生物對于改善腎損傷和腎功能的有效性。其中關于本發明的EP4拮抗劑及其衍生物的用途提供了幾個例子，在大鼠、犬和豬中顯示出腎小球濾過作用、腎血流量和尿排泄量增加。基于受體序列及其組織分布的相似性，可以期望本發明EP4拮抗劑在不同物種(大鼠、犬和豬)中證明的藥理學功效也可以延伸到人類受試者。
EP4拮抗劑的藥物制品本發明EP4拮抗劑的毒性和治療功效，如LD50(50％種群的致死劑量)和ED50(50％種群中的治療有效劑量)，在實驗動物中能夠通過標準的藥學方法來測定。毒性和治療效應之間的劑量比率已知為治療指數，并且該比率可以表示為LD50/ED50比率。治療指數大的化合物是優選的。此類化合物的劑量優選地為在包括ED50但具有很小或無毒性的循環濃度范圍之內。依賴于所使用的藥劑形式和施用途徑，劑量可以在該范圍之內變化。為了得到包括體外和離體測定法和動物研究中測定的IC50(獲得癥狀50％抑制作用的測試化合物的濃度)的循環血漿濃度范圍，動物模型中的劑量可以公式化。然后此信息能夠用于更精確地決定在人類中的有用劑量。例如，通過高效液相色譜結合質譜(HPLC-MS)，能夠測定EP4拮抗劑的血漿水平。EP4拮抗劑的有效劑量可以是0.01微克-100mg/kg，并且由施用途徑、藥物制劑和遞送模式而決定。
本發明將通過以下非限制性實施例進行更加詳細的說明。
實施例1肽的化學合成基于213.15(SEQ ID NO1)的結構，利用F-moc化學和固相多肽合成法合成了幾條肽。這些肽的結構列于表3(SEQ ID NO2-13)。通過HPLC和質譜估計這些肽三氟乙酸鹽的純度。通過參考以下的論文“固相肽合成”，Stewart和Young，W.H.Freeman Co.San Francisco，1969；“蛋白質”Erikson和Merrifield，Vol.2.(Neurath和Hill編輯)，Academic Press，New York.1976，將會更好地理解常規合成方法。肽在水中的溶解度也列于表3。
實施例2在局部缺血腎病大鼠模型中213.15衍生物對腎小球濾過作用和尿排泄量的影響腎動脈雙側鉗夾30-60分鐘導致腎的重灌注和相關的后遺癥，如腎小球濾過率、尿排泄量急劇降低和腎小管細胞死亡。該模型再現了人類少尿性腎衰竭的一些重要后果。測定了各種213.15衍生物在恢復腎損傷方面的功效。
局部缺血腎病模型將斯普拉格-道利(Sprague-Dawley)大鼠(250-300g)麻痹并頸靜脈插管用肽或鹽水輸注。此外，頸動脈也進行插管以用血壓傳感器(Gould)測定動脈血壓并收集血樣。膀胱插管以收集尿液。導管插入后，開始輸注(1.6ml/小時)[3H]菊粉(8μCi/小時)、[14C]對氨基馬尿酸(0.8μCi/小時)和麻醉劑(氯胺酮和甲苯噻嗪；9∶1 w∶w；0.095ml/ml)的混合物。允許動物繼續安定40分鐘。在10分鐘的期間內收集2份尿樣，(40-50分鐘，和50-60分鐘)以估計基礎GFR的穩定性。分別在45和55分鐘時收集血樣。然后將左側和右側腎動脈鉗夾60分鐘以誘導急性腎缺血。缺血期之后，用肽213.19-213.30(1mg/kg靜脈注射大丸劑)或鹽水，通過頸靜脈處理動物。然后在接下來的2小時期間內每20分鐘收集一次血和尿樣本。在不同的時間檢測腎小球濾過率(GFR)和尿流速(通過[3H]菊粉法測定)，以及腎血漿流量(通過[14C]對氨基馬尿酸法測定)，并且將60分鐘(藥物施用后20-80分鐘)期間內的數值進行平均。
表3基于213.15結構合成的肽庫
§大寫字母表示L-氨基酸；小寫字母表示D-氨基酸；bipD-(4，4)聯苯基丙氨酸；BipL-(4，4)聯苯基丙氨酸。*溶解度是在水中測定的。
尿流速(圖1A)和GFR(圖1B)的結果表示為藥物施用20分鐘后開始的60分鐘期間內的平均尿流速和平均GFR。尿排泄量功效的順序測定為213.15＞213.19≥213.21；其它肽功效與213.15相似。同樣，213.19和213.21還表現出GFR增加。而其它肽沒有觀察到GFR增加。在引起GFR、尿流速和腎血漿流量增加方面，肽213.19和213.21始終優于其它肽。
基于213.21的結構，合成了另外4個類似物，213.27-213.30，并在腎動脈阻塞大鼠模型中進行測試。GFR的結果(注射藥物20分鐘后開始并在60分鐘期間內平均)顯示于圖1C。為了比較，213.15和213.21也包括于該圖中。與213.15相比，松開腎動脈鉗夾后40分鐘的期間，213.28和213.29增加GFR 4和5倍。所測試的化合物中，發現更加易溶的213.28和213.29(表3)比親本化合物213.15更加有效。
實施例3在正常大鼠、犬和小豬中213.29對腎功能的劑量效應在麻痹的雌性比格狗(Beagle)中測試的213.29(1、2、3、4、5、10mg/kg靜脈注射丸劑)的劑量效應。馴化至少一周之后，禁食一整夜，通過靜脈注射硫噴妥(5mg/Kg)麻醉每只動物；在存在異氟烷條件下維持感覺缺失狀態。保持動物溫暖并每15分鐘監測一次體溫。安裝了用于監測血壓的頸動脈導管和收集尿液的尿道導管。開始持續輸注含有總劑量為0.05mCi[3H]菊粉和0.005mCi[14C]對氨基馬尿酸(PAH)的鹽水(10mL/kg/h)，充分輸注5小時。每10分鐘收集一次尿樣。在每個10分鐘期間的中間，收集血樣。用放射性同位素標記物平衡60分鐘后，通過頭靜脈靜脈內注射漸增劑量的213.29。
用閃爍光譜測定法檢測血和尿樣本(n＝30/犬)中的放射性。研究的結果顯示于圖2A。在正常犬中存在4mg/kg 213.29時觀察到急劇和最大的GFR和尿流量增加。圖2B另外顯示了在大鼠和小豬中進行的相似研究的結果。觀察到GFR、尿流量和腎血漿流量最大效應的劑量顯示于圖2B(n＝動物數)的插圖中。結果表明213.29以非物種依賴方式引起增加的腎灌注、提高的GFR和增加的尿排泄量。這些結果暗示213.29在增加人類腎灌注、GFR和尿流量方面將是有效的。
實施例4213.29對PGE2誘導的豬下隱靜脈環擴張的影響動物按照St.-Justine醫院研究中心的動物保護委員會認可的協議，約克郡小豬(2-4天齡)用于本研究。簡而言之，用氟烷(1.5％)麻醉動物，取出低位外部隱靜脈并放置于冷的三羧酸循環緩沖液(pH7.4)中，緩沖液中含有以下成分(mM)NaCl 120、KCl 4.5、CaCl22.5、MgSO41.0、NaHCO327、KH2PO41.0、葡萄糖10，其中加入了1.5U/ml肝素。
器官浴測定法將隱靜脈的無關組織去除干凈并將其切成4mm的環，這些環被放置于含有三羧酸循環緩沖液的不同的套管器官浴池(15ml；Radnoti Glass，Monrovia，CA)中并維持在37℃。用O2/CO2混合物(95/5)使溶液起泡。在每組實驗中，使用8個環(每組使用隱靜脈4個)并且用頻繁洗滌和張力調整使得在2.0克被動張力下平衡60分鐘。通過壓力置換傳感器測量張力并使用Work Bench軟件將其記錄于計算機化的數據采集系統(兩者均來自Kent Scientific，Litchfield，CT)。
實驗步驟低位外部隱靜脈對PGE2的血管擴張反應顯示出是由EP2(30％)和EP4(70％)的刺激引起的。最初用U46619(2×10-7M)(血栓烷A2模擬物)誘發組織，它可誘導張力增加1.5-2.0克。去除不反應的環。當對U46619的反應達到穩態，加入制劑。當沒有觀察到對制劑的反應時，允許30分鐘的期間以確保制劑在組織中完全地分布。然后，當存在或缺乏每種測試藥物時，得到對PGE2(10-10-10-6M)的劑量反應曲線。
結果，2-8組實驗的平均值，顯示于圖3。結果表示為當存在1μM肽時，在用1μM U46619(血栓烷A2模擬物)預處理的豬下隱靜脈環中由1μMPGE2產生的擴張的恢復百分比。在該組織中，213.29恢復大約50％PGE2的擴張效應。
實施例5人血清中213.29的穩定性和代謝物的生物學活性213.29肽含有可能對血清蛋白酶作用敏感的L-氨基酸。為了了解213.29降解產物的特性，37℃時將小等份肽(100μg)在人血清(0.5ml)中孵育不同的時間階段。用三氟醋酸(0.24ml；1M)猝滅反應，額外加入TFA(0.25ml；0.05％)后在冰上孵育10分鐘，并離心沉淀絮狀物。在SepPak C18柱子上通過固相抽提純化上清液。用含80％乙腈的0.05％TFA洗脫肽并將洗脫液冷凍干燥。然后將肽重新溶解于醋酸(400μl 0.1N)并在C18柱子上通過反相HPLC進行分離。收集含有級分的峰并通過MALDI-TOF測定肽片段的質量。
圖4A顯示了213.29隨時間的降解，以及缺乏一個羧基末端賴氨酸的代謝產物之一(213.291)的出現(圖4B)。由于半壽期＜2分鐘，會迅速地清除。在本實驗中沒有觀察到第二個代謝物，213.292(圖4B)，該代謝物是在降解反應中緩慢出現。
為了測試是否代謝物也具有生物學活性，在存在100nM PGE2時，用重組表達人EP4受體的HEK293細胞孵育肽213.29、213.291和213.292。用放射免疫測定法檢測cAMP水平并將結果圖示于圖4B。這些肽自身不引發對受體的刺激作用，但20-30％抑制PGE2刺激的cAMP合成。
實施例6213.29對前列腺素類激素受體EP4拮抗作用的選擇性為了證明213.29不影響其它前列腺素類激素受體的生物學反應，將前列腺素類激素的選擇性配體(布他前列素-EP2；17-苯基PGE2-EP1；PGF2a-FP；U46619-TP；M和B28767-EP3)用于以前已敘述并驗證了的豬視網膜血管縮窄的離體測定(Li，D.Y.，Abran，D.，Peri，K.G.，Varma，D.R.，Chemtob，S.(1996)；J.Pharmacol.Exp.Ther.278(1)370-7)。由于在圍產期高水平循環前列腺素的下調作用，在新生兒脈管系統中前列腺素類激素受體密度最低，因此用前列腺素合酶阻斷劑，布洛芬(30mg/Kg體重/8小時到24小時)處理新生豬以增加受體的密度及其血管收縮作用。
方法為了制備視杯(eyecup)，在鋸狀緣后面3-4mm處切一個環狀切口，通過視網膜極微操作去除里面的部分和玻璃體。用針將剩余的視杯固定于含有20ml三羧酸循環緩沖液(pH7.35-7.45)的20ml組織浴池的蠟基底上，并用21％的氧和5％二氧化碳在37℃平衡。允許標本穩定30分鐘。
在浸浴液中加入213.29(10μM)，5分鐘之后加入0.1μM的配體。用架在解剖顯微鏡(Zeiss M 400)上的電視攝像機記錄外部血管直徑，并且用數字圖像分析器(Sigma掃描軟件，Jandel Scientific，Corte Madera，CA)定量反應。先記錄血管直徑，并且在局部施用激動劑后5分鐘時記錄血管直徑。每個測定重復三次并且顯示＜1％的變化性。如圖5所示，213.29不影響前列腺素類激素受體的受體選擇性激動劑的收縮或擴張反應。因此，213.29表現出對前列腺素類激素受體EP4的高度選擇性。
實施例7局部缺血腎病大鼠模型中213.29與非諾多泮在改善腎功能方面的比較非諾多泮是多巴胺受體亞型1激動劑，并且在有限的臨床和動物研究中已經表明可增加尿排泄量(Singer，I.和Epstein，M.1998；Am.J.KidneyDis.31(5)743-55)。比較了局部缺血腎病大鼠模型(描述于實施例2)中非諾多泮和213.29在改善腎功能方面的功效。213.29以1mg/kg靜脈注射丸劑給藥，而非諾多泮以0.6μg/kg靜脈注射丸劑給藥，然后在試驗期間維持0.6μg/kg/h給藥。如圖6A中所示，非諾多泮和213.29增加尿排泄量到相似的程度，但是僅213.29能夠顯著地提高腎灌注和GFR。72小時之后測量血尿素氮(BUN)和血清肌酸酐水平，并且如圖6B所示，非諾多泮和213.29在降低BUN和肌酸酐水平方面具有相等的效用。
實施例8在患有腎衰竭的大鼠(局部缺血腎病大鼠模型)中施用213.29的保護作用松開腎動脈夾鉗并定量給藥之后24小時或72小時收集用于實施例7的動物的腎。進行切片的組織學檢查。
如圖7所示，作為213.29處理的結果，顯示出球旁外滲的腎小球的數量顯著地降低。同樣，213.29也顯著降低含有細胞碎片的集合管的數量。這些結果表明了213.29在改善腎功能和防止局部缺血刺激引發的超微結構損傷方面的用途。
實施例9由于雙側腎動脈夾鉗引起的患有腎衰竭大鼠中每天一次或兩次施用213.29的作用為了確定是否增加213.29施用頻率在大鼠RAO模型中對于腎功能具有有利的作用，一天一次(qd)或兩次(bid)靜脈注射1mg/kg 213.29，并比較第1天和第5天時的腎功能。所得到的結果顯示于圖8。到第4天時，每天一次(qd)或每天兩次(bid)施用213.29，腎小球濾過率(GFR)、腎血漿流量(RPF)和尿流速(UV)上升至相同的程度。然而，當藥物一天施用兩次而不是一天一次時，在第1天時這些腎功能參數顯示出急劇上升。因此在腎功能不全情況下，結合藥物藥代動力學的213.29頻繁定量給藥可以改善腎功能。
實施例10由于順鉑引起的患有急性腎小管壞死和腎衰竭大鼠中213.29施用的功效急性腎小管壞死和腎衰竭是使用放射性造影劑、致瘤化合物和抗生素的直接結果。順鉑誘導的急性腎小管壞死大鼠模型顯示出可重現人類疾病的許多特征[Lieberthal，W.，Nigam，S.K.(2000)；Am.J Physiol.Renal.Physiol.278(1)F1-F12]。
順鉑誘導的急性腎小管壞死大鼠模型在第1天時，通過給斯普拉格-道利雄性大鼠注射17.5mg/kg順鉑誘導急性腎小管壞死。到第5天時，腎功能參數，即GFR、RPF和UV，急劇下降到可以忽略的量(圖9A中的Sal[鹽水]柱)。這之后在順鉑處理的大鼠中呈現50％死亡率。到第5天時，血尿素氮(BUN)和肌酸酐水平急劇上升。
為了確定在這些情況下213.29是否仍然有用，在第5天時以1mg/kg靜脈注射大鼠后進行腎功能測試。如圖9A中所示，與鹽水處理大鼠相比，GFR、RPF和UV急劇上升。當從第2天開始并持續至第5天以5mg/kg一天三次(tid)注射該化合物時，腎功能參數達到在正常健康大鼠中所見的水平(圖9A)。血尿素氮和肌酸酐水平也都如預期的那樣下降。
在兩個腎功能不全大鼠模型(作為重現由局部缺血和腎毒素引起的人急性腎衰竭重要特征的模型已經被文獻[Lieberthal，W.，Nigam，S.K.(2000)；Am.J.Physiol.Renal.Physiol.278(1)F1-F12]很好地證實并接受)中獲得的結果表明213.29及其衍生物改善腎功能并提供保護以防腎損傷惡化。因此在人急性腎衰竭和慢性腎功能不全病例中，這些化合物能夠用作治療劑。
盡管在上文中通過其優選的實施方案已經敘述了本發明，但可不偏離如后附權利要求中所定義的本主題發明的精髓和本質而對其進行改變。
權利要求
1.具有下面通式的前列腺素E2受體EP4的肽拮抗劑 其中，X選自氫原子、1-3個氨基酸序列，和諸如氨基甲酸酯基團和酰基的保護基團；Y選自氫原子、1-5個L-賴氨酸殘基、磷酸鹽、硫酸鹽和1-5個乙二醇殘基；N是等于9的整數；R選自R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9；其中R1選自L-(4，4)聯苯基和D-(4，4)聯苯基；R2選自CH3、OH和CH2OH；R3選自CH3、OH和CH2OH；R4選自苯基、酪氨酰基、苯甲酰基和相關的芳香族基團；R5選自CH2COOH、CH2CH2COOH和相關的羧酸基團；R6選自CH3、CH2CH3和相關的含有1-6個碳原子的短鏈脂肪族基團；R7選自CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3和相關的含有1-6個碳原子的短鏈脂肪族基團；R8是賴氨酸；并且R9是賴氨酸。
2.如權利要求1中所述的肽拮抗劑，其中酰基由選自環己基、苯基、苯甲基以及含有1-8個碳原子的短直鏈和支鏈烷基的疏水部分組成。
3.如權利要求2中所述的肽拮抗劑，其中酰基是乙酰基。
4.如權利要求2中所述的肽拮抗劑，其中酰基是苯甲酰基。
5.如權利要求1-4中所述的肽拮抗劑，其可抑制前列腺素E2受體EP4的生物活性。
6.如權利要求5中所述的肽拮抗劑的肽模擬物，其可抑制前列腺素E2受體EP4的生物活性。
7.藥物組合物，其包含從大約0.1-大約100mg如權利要求5中所述的肽拮抗劑。
8.藥物組合物，其包含從大約0.1-大約100mg如權利要求6中所述的肽模擬物。
9.如權利要求7或8所述的藥物組合物的用途，用于治療診斷患有腎終末期疾病的患者。
10.如權利要求7或8所述的藥物組合物的用途，用于治療診斷患有急性腎衰竭的患者。
11.如權利要求7或8所述的藥物組合物的用途，用于治療診斷患有腎功能不全的患者。
12.如權利要求9-11中任意一項所述的藥物組合物的用途，用于增強腎小球濾過作用。
13.如權利要求12所述的藥物組合物的用途，用于增加尿排泄量。
14.如權利要求7或8所述的藥物組合物的用途，用于治療診斷患有動脈導管未閉的患者。
15.如權利要求14中所述的藥物組合物的用途，用于關閉動脈導管。
16.如權利要求2中所述的肽拮抗劑，其選自213.15(bip)tseyeal(SEQ ID NO1)，213.19(bip)tseyealK(SEQ ID NO2)，213.20(bip)tseyeglK(SEQ ID NO3)，213.21(bip)tseyealKK(SEQ ID NO4)，213.22(bip)tseyeglKK(SEQ ID NO5)，213.23(bip)tseyeslK(SeEQ ID NO6)，213.24(bip)tseyeslKK(SEQ ID NO7)，213.25(bip)tseyeaK(SEQ ID NO8)，213.26(bip)tseyesK(SEQ ID NO9)，213.27(Bip)tseyealKK(SEQ ID NO10)，213.28(bip)tseyeaLKK(SEQ ID NO11)，213.29(Bip)tseyeaLKK(SEQ ID NO12)和213.30(bip)tseyealGKK(SEQ ID NO13)，其中Bip是L-(4，4)聯苯基丙氨酸且bip是D-(4，4)聯苯基丙氨酸，并且其中D-氨基酸用小寫字母表示而L-氨基酸用大寫字母表示。
17.如權利要求16中所述的肽拮抗劑，其可抑制前列腺素E2受體EP4的生物活性。
18.權利要求17的肽拮抗劑的肽模擬物，其可抑制前列腺素E2受體EP4的生物活性。
19.藥物組合物，其包含大約0.1-大約100mg權利要求17的肽拮抗劑。
20.藥物組合物，其包含大約0.1-大約100mg權利要求18的肽模擬物。
21.如權利要求19或20中所述的藥物組合物的用途，用于治療診斷患有腎終末期疾病的患者。
22.如權利要求19或20中所述的藥物組合物的用途，用于治療診斷患有急性腎衰竭的患者。
23.如權利要求19或20中所述的藥物組合物的用途，用于治療診斷患有腎功能不全的患者。
24.如權利要求21至23中任意一項所述的藥物組合物的用途，用于增強腎小球濾過作用。
25.如權利要求24中所述的藥物組合物的用途，用于增加尿排泄量。
26.如權利要求19或20中所述的藥物組合物的用途，用于治療診斷患有動脈導管未閉的患者。
27.如權利要求26中所述的藥物組合物的用途，用于關閉動脈導管。
28.在測定中利用如權利要求5所述的肽的方法，其中所述測定包括步驟a)培養天然或重組表達前列腺素E2受體EP4的細胞或組織；b)當存在或缺乏已知濃度的所述受體激動劑時，用一定量權利要求1的化合物處理所述的培養細胞或組織；c)測定所述受體生物活性的一個或多個方面，其中所述的方面選自通過Gα蛋白質的GTP結合和水解、環腺苷一磷酸合成、細胞內鈣變化、細胞生長和/或分化、基因表達改變以及平滑肌收縮或擴張。
29.在測定中利用如權利要求6所述的肽模擬物的方法，其中所述測定包括步驟a)培養天然或重組表達前列腺素E2受體EP4的細胞或組織；b)當存在或缺乏已知濃度的所述受體激動劑時，用一定量權利要求6的化合物處理所述的培養細胞或組織；c)測定所述受體生物活性的一個或多個方面，其中所述的方面選自通過Gα蛋白質的GTP結合和水解、環腺苷一磷酸合成、細胞內鈣變化、細胞生長和/或分化、基因表達改變以及平滑肌收縮或擴張。
30.含有權利要求2或16所述的肽的用于測定前列腺素E2受體EP4生物活性的試劑盒，其中所述肽是用標記物標記的，所述標記物選自放射性同位素、生物素或酶。
31.含有權利要求6或17所述的肽模擬物的用于測定前列腺素E2受體EP4生物活性的試劑盒，其中所述肽是用標記物標記的，所述標記物選自放射性同位素、生物素或酶。
32.權利要求1的肽拮抗劑用于制備治療腎終末期疾病的藥物的用途，其中所述藥物包含治療有效量的權利要求1所述的肽。
33.權利要求1的肽拮抗劑用于制備治療急性腎衰竭的藥物的用途，其中所述藥物包含治療有效量的權利要求1所述的肽。
34.權利要求1的肽拮抗劑用于制備治療腎功能不全的藥物的用途，其中所述藥物包含治療有效量的權利要求1所述的肽。
35.權利要求1的肽拮抗劑用于制備治療動脈導管未閉的藥物的用途，其中所述藥物包含治療有效量的權利要求1所述的肽。
全文摘要
本說明書提供了前列腺素E2受體亞型EP4的拮抗肽及其用于治療和預防與少尿腎病、骨吸收、異常腸隱窩細胞增殖或動脈導管未閉相關的疾病的用途。本發明的拮抗肽具有通式(I)其中X選自氫原子、1－3個氨基酸序列以及諸如氨基甲酸酯基團和酰基的保護基團；并且其中Y選自氫原子、1－5個L－賴氨酸殘基、磷酸鹽、硫酸鹽和1－5個乙二醇殘基。
文檔編號C07K7/06GK1662551SQ03814685
公開日2005年8月31日 申請日期2003年5月23日 優先權日2002年5月23日
發明者K·G·佩里, S·莫菲特, D·阿布蘭, A·伯杰龍 申請人:瑟瑞技術公司