專利名稱：：在胞內(nèi)環(huán)境中表現(xiàn)出增強(qiáng)的穩(wěn)定性的免疫球蛋白構(gòu)架及其鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)化學(xué)、分子生物學(xué)以及免疫學(xué)。相關(guān)
技術(shù)領(lǐng)域：
背景抗體能以高度的特異性和親和力識(shí)別并靶向幾乎任何分子。這個(gè)特點(diǎn)已被開發(fā)，以便將這些天然蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)橛糜谠\斷和治療應(yīng)用的強(qiáng)有力的工具。重組DNA技術(shù)的進(jìn)展已推動(dòng)了抗體基因在廣泛種類的非淋巴細(xì)胞中的操作、克隆和表達(dá)(Skerra，1988；Martineau，1998；Verma，1998)。已經(jīng)構(gòu)建了許多不同的抗體片段，以便最佳地滿足各種應(yīng)用。保留整個(gè)母體免疫球蛋白全部抗原結(jié)合能力的最小實(shí)體是單鏈Fv片段(scFv)(Bird，1988)。該抗體片段包含由柔性肽接頭連接起來的重鏈和輕鏈可變區(qū)，這使得該蛋白能夠由單個(gè)基因表達(dá)。抗體片段較之于完整免疫球蛋白分子具有若干重要的優(yōu)勢(shì)。由于分子小，它們?cè)诙喾N表達(dá)宿主細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)得以易化、且產(chǎn)量得以提高(Plückthun，1996)。而且，抗體片段允許在體內(nèi)應(yīng)用中改善腫瘤穿透力(Yokota，1992)，并且它們能夠與多種用于治療途徑的效應(yīng)分子共價(jià)連接。天然存在的抗體是由漿細(xì)胞分泌的，已進(jìn)化至能夠在胞外氧化環(huán)境中行使功能。為獲得其功能性折疊結(jié)構(gòu)，它們通常需要在不同結(jié)構(gòu)域內(nèi)形成二硫鍵，這對(duì)于免疫球蛋白折疊是至關(guān)重要的。與全長(zhǎng)抗體形成對(duì)照，scFv或Fab抗體片段原則上能夠在任何細(xì)胞內(nèi)部的還原環(huán)境中功能性地表達(dá)，并定向到任何區(qū)室，以靶向胞內(nèi)蛋白，從而引發(fā)特定的生物學(xué)效應(yīng)(Biocca，1991)。的確，有些稱之為內(nèi)體(intrabodies)的胞內(nèi)單鏈抗體片段，已被成功地用于調(diào)節(jié)不同的生物系統(tǒng)中胞內(nèi)靶蛋白的功能。從而，針對(duì)病毒侵染的抗性已在植物生物技術(shù)中得到展示(Tavladoraki，1993；Benvenuto，1995)，內(nèi)體與HIV蛋白的結(jié)合業(yè)已證明(Rondon，1997)，并且與癌基因產(chǎn)物的結(jié)合(Biocca，1993；Cochet，1998；Lener，2000)也已有描述。而且胞內(nèi)抗體在表征目前通過人類基因組測(cè)序鑒定到的大量基因的功能方面有希望成為有價(jià)值的工具(Richardson，1995；Marasco，1997)。例如，它們可在功能基因組途徑中用于封閉或調(diào)節(jié)新近鑒定的蛋白的活性，由此促成對(duì)其功能的了解。最后，內(nèi)體具有診斷和治療應(yīng)用的潛力，例如在基因治療環(huán)境中。盡管存在極大的前景，功能性內(nèi)體的產(chǎn)生仍然受限于其不穩(wěn)定性和不可溶性或者聚集的傾向。胞漿的還原環(huán)境防止形成保守的鏈內(nèi)二硫橋，從而使得高百分比的抗體片段不穩(wěn)定，因此在細(xì)胞內(nèi)無功能(Biocca，1995；Proba，1997)?？贵w片段的穩(wěn)定性和可溶性因此構(gòu)成了內(nèi)體在體內(nèi)作為潛在的蛋白功能調(diào)解劑的應(yīng)用的主要障礙。迄今為止，尚不可預(yù)言使得抗體片段在胞內(nèi)環(huán)境中具備功能的序列要求。因此，急需在廣范圍的不同細(xì)胞類型中性能良好的抗體片段，從而可作為用于多種結(jié)合特異性的構(gòu)架。此類構(gòu)架可用于構(gòu)建用于胞內(nèi)篩選的文庫，或者可作為既有抗體結(jié)合部分的受體。除了獨(dú)特地滿足胞內(nèi)應(yīng)用之外，在眾多的胞外和體外應(yīng)用中，基于極為穩(wěn)定的可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架的此類抗體片段或完整抗體相比于其它抗體也具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)此類構(gòu)架在氧化環(huán)境中產(chǎn)生時(shí)，其二硫橋能夠形成，進(jìn)一步增強(qiáng)其穩(wěn)定性，并使得它們高度抵抗聚集和蛋白酶降解。體內(nèi)半衰期(及針對(duì)聚集和血清蛋白酶降解的抗性)是除了親和力和特異性之外的、使抗體在治療或診斷應(yīng)用中成功的唯一最為重要的因素(Willuda，1999)?？贵w片段的半衰期可通過共價(jià)連接聚合物分子如聚乙二醇(PEG)而進(jìn)一步得以提高(Weir，2002)。這類穩(wěn)定分子代表了抗體應(yīng)用的顯著進(jìn)步，尤其但并不僅當(dāng)不期望FC功能時(shí)。抗體片段文庫極大的實(shí)踐重要性激發(fā)了該領(lǐng)域的研究。Winter(EP0368684)提供了抗體可變區(qū)基因的初始克隆和表達(dá)。由這些基因出發(fā)，他建立了在互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)以及構(gòu)架區(qū)具有高度多樣性的巨大抗體文庫。不過，Winter未披露不同構(gòu)架用于文庫構(gòu)建的用途。另一方面，Plückthun(EP0859841)教導(dǎo)試圖通過將構(gòu)架限于有限數(shù)目的合成共有序列而改進(jìn)文庫設(shè)計(jì)。包括引入大量合理設(shè)計(jì)的突變的蛋白質(zhì)工程的努力以前就提示針對(duì)相應(yīng)共有序列的突變是提高分離的可變免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定性的合適手段(Ohage1999；Ohage1999以及US5,854,027，特此并入作為參考)。Plückthun(EP0859841)公開了基于這些共有序列進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)合親和力的方法。Plückthun專利也承認(rèn)正在發(fā)生著的有關(guān)抗體的知識(shí)的增長(zhǎng)，因此意欲包括此類文庫設(shè)計(jì)的遠(yuǎn)景發(fā)現(xiàn)。然而，未建議合成共有構(gòu)架可能的進(jìn)一步改善。因而Winter、Plückthun及他人(如Soderlind，WO0175091)的教導(dǎo)試圖以CDR的高度多樣性為焦點(diǎn)建立巨大的抗體文庫，用于選擇并在氧化條件下應(yīng)用所選scFv。然而，所有這些文庫未進(jìn)行胞內(nèi)應(yīng)用優(yōu)化，因而不能用于還原環(huán)境或?qū)λ磉_(dá)的抗體片段的穩(wěn)定性和可溶性提出特殊要求的其它條件下的選擇和應(yīng)用?？贵w片段在還原環(huán)境如原核和真核細(xì)胞的胞漿中表現(xiàn)良好所需的性質(zhì)尚不清楚。因此胞內(nèi)抗體或“內(nèi)體”的應(yīng)用目前受限于其在還原條件下(可影響其穩(wěn)定性和可溶性能)不可預(yù)測(cè)的行為(Biocca，1995；Wrn，2000)?，F(xiàn)有專利申請(qǐng)(EP1040201、EP1166121和WO0200729)及出版物(Visintin，1999)涉及以篩選技術(shù)為焦點(diǎn)的內(nèi)體的胞內(nèi)篩選，但是未公開在真核細(xì)胞特別是酵母中有功能、從而可用于本上下文的文庫構(gòu)建的具體抗體序列。Visintin和Tse獨(dú)立地描述了所謂的胞內(nèi)共有序列(ICS)的分離(Visintin，2002；Tse，2002)。該序列來自于已從酵母抗原-抗體相互作用篩選中分離出的許多序列。然而，由于現(xiàn)有噬菌體展示選擇，胞內(nèi)篩選的輸入是有嚴(yán)重偏差的。因而，在Visintin等的例子中，只有一個(gè)輸入序列屬于VH3亞群。公開的共有序列ICS與由Knappik(2000)和EP0859841描述的人類VH3亞群的共有序列完全相同。ICS的62個(gè)氨基酸中的60個(gè)也與由Steipe以構(gòu)建具有增強(qiáng)的穩(wěn)定性的可變結(jié)構(gòu)域?yàn)榛A(chǔ)而提出的一般人類VH-結(jié)構(gòu)域共有序列相同(美國(guó)專利號(hào)No.6,262,238，特此并入作為參考)。這些工作依次建立在早期的序列收集(即Kabat，1991)和可變結(jié)構(gòu)域亞群及結(jié)構(gòu)決定簇的定義(Tomlinson，1992；Williams，1996；Chothia，1989和Chothia，1987)的基礎(chǔ)上。然而，由于所述內(nèi)體選擇的輸入是有嚴(yán)重偏差的(即在Visintin等例子中，只有一個(gè)VH結(jié)構(gòu)域?yàn)閂H3)，由胞內(nèi)篩選分離VH3序列并不是特別令人驚訝。由于其輸入文庫的嚴(yán)重偏差，Tse等和Visintin等的工作未能提供對(duì)人類可變結(jié)構(gòu)域所有組成部分的全面評(píng)價(jià)，而這將會(huì)由無偏差的查詢提供，并且這是鑒定存在于人類所有組成部分中的有用內(nèi)體構(gòu)架所必需的。我們以前曾描述過不依賴于其抗體-結(jié)合特異性而允許在酵母中選擇穩(wěn)定且可溶的內(nèi)體的系統(tǒng)(AufderMaur(2001)，WO0148017)。這個(gè)途徑允許有效地篩選scFv文庫和分離特定構(gòu)架，它們?cè)诮湍讣?xì)胞的還原環(huán)境中是穩(wěn)定且可溶的。目的仍然是實(shí)際分離構(gòu)架序列，并且使用的模式是，第一步中預(yù)測(cè)何種序列類型將會(huì)在還原環(huán)境中最穩(wěn)定，而第二步中通過分析、重組以及進(jìn)一步的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)鑒定最佳序列。發(fā)明的簡(jiǎn)要概述本發(fā)明填補(bǔ)了抗體產(chǎn)生領(lǐng)域缺失的環(huán)節(jié)。它提供了就穩(wěn)定性和可溶性而言具有優(yōu)異特性的抗體可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架序列。這些對(duì)許多相關(guān)應(yīng)用，例如在診斷、治療或研究中是關(guān)鍵特點(diǎn)。這些構(gòu)架可用于移植既有的結(jié)合特異性或者用于產(chǎn)生具有高穩(wěn)定性和可溶性的抗體文庫。ScFv文庫被用來分離在酵母細(xì)胞的還原環(huán)境中穩(wěn)定且可溶的構(gòu)架。分離構(gòu)架的性能隨后在人類細(xì)胞系和體外實(shí)驗(yàn)中表征。所述構(gòu)架可直接作為既有結(jié)合特異性的受體主鏈，或者通過一個(gè)或多個(gè)高變環(huán)的隨機(jī)化構(gòu)建CDR文庫用于還原或其它挑戰(zhàn)性的環(huán)境。分離的可變結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)一步通過對(duì)比進(jìn)行分析，以鑒定優(yōu)選的序列家族。從那些優(yōu)選的可變結(jié)構(gòu)域序列家族中，根據(jù)結(jié)構(gòu)分析選擇最佳序列，該結(jié)構(gòu)分析可排除含干擾免疫球蛋白折疊的構(gòu)架殘基的序列。鑒定的可變結(jié)構(gòu)域序列候選物隨后以所有可能的變化重組，并通過分析其在酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和體外的性能挑選最佳的輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域組合。這些優(yōu)化的scFv及組成它們的可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架，以及其它抗體片段或由其衍生的全抗體，舉例來說，可理想地作為既有結(jié)合特異性的受體主鏈，或通過一個(gè)或多個(gè)高變環(huán)的隨機(jī)化構(gòu)建CDR文庫用于還原或其它挑戰(zhàn)性的環(huán)境。適于胞內(nèi)應(yīng)用的抗體從定義上來講更為穩(wěn)定且可溶。從而，它們?cè)诎麅?nèi)環(huán)境外界的應(yīng)用中的用途也將具有優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明提供了包括抗體可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架和單鏈Fv抗體(ScFv)片段的組合物，其可摻入到多種抗體片段或全抗體中。提供了最穩(wěn)定且可溶種類的抗體可變結(jié)構(gòu)域片段，因而最適于胞內(nèi)應(yīng)用。也提供了在胞內(nèi)測(cè)定中表現(xiàn)出最高性能的抗體可變結(jié)構(gòu)域和scFv抗體片段的具體構(gòu)架序列。本發(fā)明也提供了抗體可變結(jié)構(gòu)域和scFv片段中輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的人造組合的具體構(gòu)架序列，舉例來說，它們可最理想地用于胞內(nèi)應(yīng)用，并且就穩(wěn)定性和可溶性而言在體外表現(xiàn)出最佳性能。本發(fā)明提供具有如下通式結(jié)構(gòu)的單鏈構(gòu)架試劑NH2-VL-接頭-VH-COOH或NH2-VH-接頭-VL-COOH。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述單鏈構(gòu)架可融合于第二蛋白成分，以產(chǎn)生具有如下通式結(jié)構(gòu)的融合構(gòu)建體NH2-VL-接頭-VH-第二蛋白-COOHNH2-第二蛋白-VL-接頭-VH-COOH這些融合構(gòu)建體中VH和VL區(qū)的取向可以顛倒。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可變結(jié)構(gòu)域可摻入到Fab片段中，其可融合于第二蛋白成分，以產(chǎn)生具有如下通式結(jié)構(gòu)的融合構(gòu)建體NH2-VH-CH-第二蛋白-COOH及NH2-VL-CL-COOH第二蛋白可融合于重鏈或輕鏈的N-端或C-端。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，單鏈或Fab構(gòu)架融合構(gòu)建體的第二蛋白是直接或通過轉(zhuǎn)錄激活為胞內(nèi)測(cè)定提供讀出的蛋白。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供抗體可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架類型以及可變結(jié)構(gòu)域和scFv序列，舉例來說，它們適于從既有抗體上移植高變環(huán)，以便獲得在還原或者其它挑戰(zhàn)性環(huán)境中具有功能的抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供抗體可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架類型以及可變結(jié)構(gòu)域和scFv序列，舉例來說，通過隨機(jī)化此類構(gòu)架的一個(gè)或多個(gè)高變環(huán)，它們適于建立文庫用在還原或者其它挑戰(zhàn)性環(huán)境中。本發(fā)明的另一個(gè)目的是所公開的序列在鑒定保守殘基和共有序列中的應(yīng)用。因利用所公開的構(gòu)架而得的抗體或抗體片段可用作靶確認(rèn)以及人類、動(dòng)物和植物疾病的治療、預(yù)防和診斷中的試劑。所述抗體可以蛋白或編碼該蛋白的DNA的形式應(yīng)用，而且不限于胞內(nèi)應(yīng)用。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示了通過lacZ表達(dá)的激活而測(cè)定的典型的酵母中的“質(zhì)控”篩選(例如參見實(shí)施例1)。在若干不同的篩選中鑒定到所選的陽性菌落(黑色)，并且陽性菌落的相應(yīng)序列可見于表1和2。所選序列與陽性對(duì)照極為穩(wěn)定的λ-移植物(深灰)進(jìn)行了比較。圖2顯示了通過與極為穩(wěn)定的λ-移植物(深灰)相比的由熒光素酶表達(dá)的激活而測(cè)定的由典型的酵母“質(zhì)控”篩選分離的構(gòu)架(黑色)在人類細(xì)胞系Hela中的性能。陽性對(duì)照Gal4-VP16(白色)給出了該系統(tǒng)最大可能的轉(zhuǎn)錄激活水平。熒光素酶活性已就轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了校正。圖3顯示了在酵母中通過lacZ表達(dá)的激活而測(cè)定的優(yōu)良構(gòu)架組合的體內(nèi)性能。構(gòu)架序列(黑色)與陽性對(duì)照(極為穩(wěn)定的λ-移植物(深灰))進(jìn)行了比較。構(gòu)架的編號(hào)如表5所述。圖4顯示了在人類細(xì)胞系Hela中通過熒光素酶表達(dá)的激活而測(cè)定的優(yōu)良構(gòu)架組合的體內(nèi)性能，并通過與極為穩(wěn)定的λ-移植物(深灰)的比較進(jìn)行圖解說明。陽性對(duì)照Gal4-VP16(白色)給出了該系統(tǒng)最大可能的轉(zhuǎn)錄激活水平。熒光素酶活性已就轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了校正。圖5顯示了通過酵母菌株釀酒酵母(S.cerevisiae)JPY9胞漿中產(chǎn)生的可溶蛋白的量測(cè)定的優(yōu)良構(gòu)架組合的體內(nèi)性能。圖6顯示了所選構(gòu)架組合在大腸桿菌(E.coli)周質(zhì)中的表達(dá)行為。箭頭標(biāo)示對(duì)應(yīng)于這些scFv構(gòu)架的條帶位置。圖7顯示了在三種人類細(xì)胞系(Hela(黑色)、Saos-2(深灰)及HEK293(白色))中通過熒光素酶表達(dá)的激活而測(cè)定的所選優(yōu)良構(gòu)架組合的體內(nèi)性能，并通過與極為穩(wěn)定的λ-移植物的比較進(jìn)行圖解說明。陽性對(duì)照Gal4-VP16給出了該系統(tǒng)最大可能的轉(zhuǎn)錄激活水平。熒光素酶活性已就轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了校正。圖8代表如在PBS-緩沖液中所示的通過溫育前后存在的單體蛋白的量而定量的所選構(gòu)架組合在37℃對(duì)聚集的抗性。圖表A代表構(gòu)架2.4和5.2，而圖表B代表構(gòu)架4.4、6.4和7.3。圖9代表通過延長(zhǎng)溫育前后存在的可溶性全長(zhǎng)蛋白的量而定量的所選構(gòu)架組合在37℃人類血清中對(duì)蛋白酶降解聚集的抗性。圖10顯示了在酵母相互作用測(cè)定中通過lacZ表達(dá)的激活而測(cè)定的兩個(gè)所選結(jié)合物對(duì)Fab-環(huán)境下新構(gòu)架7.3的性能。Fab-鏈的表達(dá)始于位于ars/cen或2微米載體之上的雙向半乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。所述Fab載體的表達(dá)產(chǎn)生抗體輕鏈和VH-CH1-Gal4-AD融合蛋白。結(jié)合物定向于人類球樣激酶1(hPLK1)。與該靶的結(jié)合和與無關(guān)抗原的非特異性結(jié)合以及未隨機(jī)化的構(gòu)架7.3的結(jié)合進(jìn)行了比較。注意作為參照包括在內(nèi)的相應(yīng)scFv是由肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(2微米)表達(dá)的。圖11顯示了通過酵母菌株JPY9胞漿中產(chǎn)生的可溶蛋白的量測(cè)定的所述scFv構(gòu)架在Fab-環(huán)境下的體內(nèi)性能。Gal4-AD-scFv融合子(肌動(dòng)蛋白/2微米)的表達(dá)與相應(yīng)的Fab-構(gòu)建體的表達(dá)并與作為Fab的母體構(gòu)架7.3進(jìn)行了比較，兩者均來自兩個(gè)不同的載體(Gal-誘導(dǎo)型、ars/cen和2微米)。Fab載體的表達(dá)產(chǎn)生抗體輕鏈和VH-CH1-Gal4-AD融合蛋白，它在該印跡中檢測(cè)。表1顯示了由多種酵母“質(zhì)控”篩選挑選出的所有VH-結(jié)構(gòu)域構(gòu)架序列的對(duì)比。表2顯示了由多種酵母“質(zhì)控”篩選挑選出的所有VL-結(jié)構(gòu)域構(gòu)架序列的對(duì)比。表3顯示了從文庫中隨機(jī)挑取的序列的對(duì)比。表4顯示了由“質(zhì)控”系統(tǒng)分離到的序列中VH-和VL-結(jié)構(gòu)域亞類頻率的統(tǒng)計(jì)分析。只考慮隨后在定量酵母測(cè)定中發(fā)現(xiàn)是陽性的那些序列。所選序列與由有限數(shù)目的隨機(jī)序列(表3)確定的未選文庫進(jìn)行了比較。表5顯示了用于進(jìn)一步重組和評(píng)價(jià)最佳scFv組合的序列以及它們各自的縮寫(abb.)、來源和亞家族。發(fā)明詳述除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有如本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員所通常理解的相同的含義。盡管類似于或等同于本文所述那些的方法和材料可用于實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明，合適的方法和材料還是描述于下文。特此將文中提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利及其它參考文獻(xiàn)全文并入作為參考。如有沖突，將以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。另外，所述材料、方法和實(shí)施例僅用于舉例說明，而并非旨在限制。如本文所用，“同一性”是指兩多肽、分子或兩核酸之間的序列相似性。當(dāng)兩相比序列的某位置都被同一堿基或氨基酸單體亞單位占據(jù)時(shí)(例如，兩DNA分子中每一個(gè)的某位置都被腺嘌呤占據(jù)，或者兩多肽中每一個(gè)的某位置都賴氨酸占據(jù))，則相應(yīng)分子在該位置上是一致的。兩序列間的“百分比同一性”是兩序列共有的匹配位置數(shù)目除以比較的位置數(shù)目×100的函數(shù)，例如，如果兩序列10個(gè)位置中有6個(gè)匹配，則這兩個(gè)序列具有60％的同一性。作為離子，DNA序列CTGACT和CAGGTT享有50％的同源性(總共6個(gè)位置上有3個(gè)匹配)。一般而言，當(dāng)兩序列比對(duì)可得出最大同源性時(shí)就進(jìn)行比較。此類對(duì)比可利用例如Needleman等，J.MolBiol.48443-453(1970)的方法提供，通過計(jì)算機(jī)程序例如Alignprogram(DNAstar，Inc.)方便地執(zhí)行?！跋嗨啤毙蛄惺悄切┰诒葘?duì)時(shí)享有相同和相似氨基酸殘基的序列，其中相似殘基是比對(duì)的參照序列中相應(yīng)氨基酸殘基的保守取代或者“許可的點(diǎn)突變”。就這點(diǎn)而言，參照序列殘基的“保守取代”是被與對(duì)應(yīng)參照殘基物理上或功能上類似，如具有相似大小、形狀、電荷、化學(xué)特性，包括形成共價(jià)鍵或氫鍵的能力等的殘基取代。因而，“保守取代修飾”的序列是與參照序列或野生型序列的差異在于存在一個(gè)或多個(gè)保守取代或許可的點(diǎn)突變的序列。兩序列間的“陽性百分比”是含兩序列共有的匹配殘基或保守取代的位置數(shù)目除以比較的位置數(shù)目×100的函數(shù)。例如，如果兩序列10個(gè)位置中有6個(gè)匹配，且10個(gè)位置中有2個(gè)含保守取代，則這兩個(gè)序列具有80％的陽性同源。“VH結(jié)構(gòu)域”是指免疫球蛋白分子重鏈的可變部分?！癡L結(jié)構(gòu)域”是指免疫球蛋白分子輕鏈的可變部分。VH或VL“亞型”是指通過如Knappik(2000)中所定義的相應(yīng)共有序列所定義的亞型。術(shù)語“亞家族”或“亞類”作為“亞型”的同義詞使用。如本文所用的術(shù)語“亞型”是指與代表其亞型的相應(yīng)共有序列享有高度同一性和相似性的序列。某一可變結(jié)構(gòu)域序列是否屬于某“亞型”是通過將該序列與相應(yīng)結(jié)構(gòu)域的所有已知人類生殖系區(qū)段、或者定義的共有序列比對(duì)，并隨后鑒定最大同源性確定的。確定同源性和通過利用查詢矩陣?yán)鏐LOSUM(Henikoff1992)對(duì)序列分類的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。如本文所用的“氨基酸共有序列”是指氨基酸序列，它可利用至少兩個(gè)或優(yōu)選更多比對(duì)的氨基酸序列矩陣產(chǎn)生，并且考慮到比對(duì)中的空缺，有可能確定各位置上最頻繁的氨基酸殘基。共有序列是包括了各位置上最頻繁表示的氨基酸的序列。如果在單個(gè)位置上等同地表示兩個(gè)或多個(gè)氨基酸，則共有序列包括兩個(gè)或所有那些氨基酸。蛋白的氨基酸序列可在多種水平分析。例如，保守或變異可表現(xiàn)在單殘基水平、多殘基水平、具有空缺的多殘基水平等。殘基可表現(xiàn)出相同殘基的保守或者可以在分類的水平上保守。氨基酸分類的實(shí)例包括極性但不帶電荷的R基團(tuán)(絲氨酸、蘇氨酸、天門冬酰胺和谷氨酰胺)；帶正電荷的R基團(tuán)(賴氨酸、精氨酸和組氨酸)；帶負(fù)電荷的R基團(tuán)(谷氨酸和天門冬氨酸)；疏水R基團(tuán)(丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸和酪氨酸)；以及特殊氨基酸(半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸)。其它分類是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且可利用結(jié)構(gòu)決定簇或其它數(shù)據(jù)定義，以評(píng)估可取代性。就該意義而言，可取代氨基酸可以指能夠被取代并維持該位置上的功能保守性的任何氨基酸。如本文所用的“多核苷酸共有序列”是指核苷酸序列，它可利用至少兩個(gè)或優(yōu)選更多比對(duì)的核酸序列矩陣產(chǎn)生，并且考慮到對(duì)比中的空缺，有可能確定各位置上最頻繁的核苷酸。共有序列是包括了各位置上最頻繁表示的核苷酸的序列。如果在單個(gè)位置上等同地表示兩個(gè)或多個(gè)核苷酸，則共有序列包括兩個(gè)或所有那些核苷酸。如本文所用的“結(jié)構(gòu)亞-元件”是指蛋白或多肽內(nèi)與該分子限定的結(jié)構(gòu)或功能部分對(duì)應(yīng)的一段氨基酸殘基。這些可以是環(huán)(即抗體的CDR環(huán))或者蛋白或多肽內(nèi)任何其它二級(jí)或功能結(jié)構(gòu)(即結(jié)構(gòu)域、α-螺旋、β-片層、抗體構(gòu)架區(qū)等)。結(jié)構(gòu)亞元件可利用相似或同源多肽的已知結(jié)構(gòu)或者通過利用上文提及的比對(duì)氨基酸序列的矩陣鑒定。這里各位置上的變異是確定屬于某一結(jié)構(gòu)亞元件(如抗體高變區(qū))的一段氨基酸殘基的基礎(chǔ)。如本文所用的“亞序列”是指編碼至少一個(gè)結(jié)構(gòu)亞元件的基因模塊。它未必一定與結(jié)構(gòu)亞元件相同。如本文所用的“抗體CDR”是指抗體的互補(bǔ)決定區(qū)，其由如Kabat等(1991)所定義的抗原結(jié)合環(huán)組成。例如，抗體Fv片段的兩可變結(jié)構(gòu)域中的每一個(gè)都含3個(gè)CDR。如本文所用的“抗體”是“免疫球蛋白”的同義詞。根據(jù)本發(fā)明的抗體可以是完整免疫球蛋白或其片段，包括免疫球蛋白的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，例如單可變結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)v(Skerra，1988)、scFv(Bird，1988；Huston，1988)、Fab、(Fab′)2或本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的其它片段。如本文所用的“抗體構(gòu)架”是指可變結(jié)構(gòu)域VL或VH的一部分，它起著該可變結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合環(huán)的支架的作用(Kabat等，1991)。合理設(shè)計(jì)的scFv片段已證明了scFv片段的熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性與其體內(nèi)性能之間清楚的關(guān)聯(lián)(Wrn，2000；AufderMaur，2001)。利用最近研發(fā)的命名為“質(zhì)控”的系統(tǒng)(AufderMaur，2001)，已分離到適于胞內(nèi)應(yīng)用的特定抗體可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架序列(表1和2)、描述了特征(圖1和2)并進(jìn)一步改善(圖3至9及表3)。如同我們以前的實(shí)驗(yàn)中所觀察到的那樣，在胞內(nèi)測(cè)定中所選的性能良好的構(gòu)架表現(xiàn)出高的體外穩(wěn)定性，如通過其37℃抗聚集和蛋白酶降解所證明的那樣(圖8和9)。而且，形成了允許在更廣基礎(chǔ)上根據(jù)其構(gòu)架亞家族(表4)選擇用于胞內(nèi)應(yīng)用的構(gòu)架的模式。文中公開了可用于胞內(nèi)應(yīng)用的特定抗體可變結(jié)構(gòu)域，還有通用模式。一方面，這允許利用這些序列作為移植實(shí)驗(yàn)的構(gòu)架供體以獲得保留了環(huán)供體的結(jié)合特異性的功能性內(nèi)體。另外，可利用公開的序列作為構(gòu)架構(gòu)建抗體文庫。此類文庫適用于還原條件下的胞內(nèi)選擇系統(tǒng)，例如原核和真核細(xì)胞系統(tǒng)。另外，所公開的序列可用于鑒定例如保守序列或殘基或基序。結(jié)構(gòu)亞元件的移植，例如抗體結(jié)合環(huán)的移植(如Jung，1997)，還有抗體或其片段文庫的制備(如Vaughan，1996；Knappik，2000)已有詳細(xì)描述，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。由于胞內(nèi)應(yīng)用將抗體片段暴露于極為不利的條件下(即升高的溫度、還原環(huán)境)，而本發(fā)明公開的序列獲得了使之抵抗最不利條件的特點(diǎn)。因此，當(dāng)與“普通”序列相比時(shí)，這里公開的序列具有出色的穩(wěn)定性和可溶性，如通過其對(duì)聚集和蛋白酶降解的抗性所證明的那樣(圖8和9)。這些特點(diǎn)，連同其優(yōu)良的表達(dá)產(chǎn)率，使得所公開的抗體構(gòu)架序列獨(dú)特地不僅適于胞內(nèi)應(yīng)用，而且尤其適于所有其中極需關(guān)注長(zhǎng)半衰期、耐用性和制備的容易性的治療和診斷應(yīng)用。本發(fā)明使得可能設(shè)計(jì)包括至少抗體的可變部分、可用于還原或其它挑戰(zhàn)性環(huán)境下的應(yīng)用的多肽序列。在第一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了可用于胞內(nèi)應(yīng)用的抗體構(gòu)架序列集合(表1和2)。在第一步中，利用酵母質(zhì)控系統(tǒng)不依賴于結(jié)合親和力地篩選多種序列的文庫。分離的序列可在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中評(píng)價(jià)其胞內(nèi)性能(圖1和2)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)分離序列的集合通過比對(duì)進(jìn)行分析，以鑒定抗體可變結(jié)構(gòu)域亞類和適用于胞內(nèi)應(yīng)用的共有序列。在本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)上述抗體構(gòu)架序列的集合進(jìn)一步通過相互比對(duì)和亞家族分類進(jìn)行分析。屬于一個(gè)亞型的所有構(gòu)架就其在酵母和在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的胞內(nèi)性能進(jìn)行比較(圖1和2，作為實(shí)例)，并就其氨基酸序列中相對(duì)于各亞型共有序列所發(fā)生的陰性、中性或陽性交換進(jìn)行比較。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域中特定交換殘基的結(jié)構(gòu)環(huán)境區(qū)別陽性、中性和陰性變化。隨后，選擇表現(xiàn)出最佳胞內(nèi)性能的可變抗體結(jié)構(gòu)域構(gòu)架序列，并且其與相應(yīng)亞型共有序列相比沒有陰性交換。優(yōu)選地，挑選進(jìn)一步含有據(jù)認(rèn)為是陽性氨基酸交換的序列。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所選的重鏈和輕鏈抗體可變結(jié)構(gòu)域隨后以所有可能的組合重組為scFv片段，以鑒定具有最高穩(wěn)定性和可溶性的組合。為了這個(gè)目的，對(duì)新的重組scFv片段進(jìn)行有關(guān)在酵母(圖3)和在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(圖4和7)的胞內(nèi)相互作用測(cè)定中還原條件下的性能以及有關(guān)在酵母中的可溶性胞內(nèi)表達(dá)(圖5)的評(píng)價(jià)。對(duì)有希望的組合進(jìn)一步通過分析大腸桿菌中的周質(zhì)表達(dá)(圖6)、升高的溫度下對(duì)聚集的抗性(圖8)以及在人類血清中于37℃延長(zhǎng)溫育后對(duì)聚集和蛋白酶降解的抗性(圖9)進(jìn)行有關(guān)氧化條件下的行為的評(píng)價(jià)。這些數(shù)據(jù)被用來鑒定最適于胞內(nèi)或氧化條件下的任何特定應(yīng)用的scFv構(gòu)架。本文公開的所選且優(yōu)化了的構(gòu)架序列不僅在胞內(nèi)應(yīng)用中，而且在所有可得益于scFv提高的穩(wěn)定性和/或可溶性的應(yīng)用中都具有顯著的優(yōu)勢(shì)。實(shí)例有在診斷應(yīng)用中需要以高濃度長(zhǎng)期貯存，以及37℃血清中延長(zhǎng)的功能半衰期(例如象治療應(yīng)用中所需的那樣)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了包括具有如下通式結(jié)構(gòu)的單鏈構(gòu)架的內(nèi)體構(gòu)架NH2-VL-接頭-VH-COOH；或NH2-VH-接頭-VL-COOH其中VH構(gòu)架為1a、1b或3亞型。在另一個(gè)實(shí)施方案中，上述單鏈構(gòu)架中VH和VL區(qū)的取向顛倒。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了包括具有如下通式結(jié)構(gòu)的單鏈構(gòu)架的內(nèi)體構(gòu)架NH2-VL-接頭-VH-COOH；或NH2-VH-接頭-VL-COOH其中VH構(gòu)架為1a、1b或3亞型，且VL構(gòu)架為λ1、λ3或κ1亞型。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了融合于第二蛋白成分的單鏈構(gòu)架，以產(chǎn)生具有如下通式結(jié)構(gòu)的融合構(gòu)建體NH2-VL-接頭-VH-第二蛋白-COOH；或NH2-第二蛋白-VL-接頭-VH-COOH其中VH構(gòu)架為1a、1b或3亞型，且VL構(gòu)架為λ1、λ3或κ1亞型。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些融合構(gòu)建體中VH和VL區(qū)的取向可以顛倒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可變結(jié)構(gòu)域可摻入到Fab片段中，所述片段可另外融合于第二蛋白成分，以產(chǎn)生具有如下通式結(jié)構(gòu)的融合構(gòu)建體NH2-VH-CH-第二蛋白-COOH和NH2-VL-CL-COOH所述第二蛋白可融合于重鏈或輕鏈的N-端或C-端。如本文所公開的，胞內(nèi)應(yīng)用中存在著對(duì)亞型為3及1a和1b的VH構(gòu)架極強(qiáng)的偏好。至于輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，κ1構(gòu)架在數(shù)量上具有清楚的偏好，但λ1和3也被富集。因此，這些構(gòu)架亞型，即與κ1、λ3VL結(jié)構(gòu)域相組合的VH1a、1b和3最適合用于胞內(nèi)應(yīng)用以及需要scFv折疊性質(zhì)的其它應(yīng)用。因此，為了降低還原環(huán)境中無功能分子的數(shù)量，用于胞內(nèi)篩選系統(tǒng)的文庫應(yīng)當(dāng)優(yōu)選由這些構(gòu)架亞型的混合物構(gòu)建。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體片段的VH結(jié)構(gòu)域?yàn)?a、1b或3亞群。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體片段的VL結(jié)構(gòu)域?yàn)棣?、λ1或3亞群。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用作為構(gòu)架的抗體片段選自如表5所示的1.1、2.1、3.1、4.1、5.1、1.2、2.2、3.2、4.2、5.2、1.3、2.3、3.3、4.3、5.3、7.3、1.4、2.4、3.4、4.4、5.4和6.4。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，至少兩個(gè)并且優(yōu)選多個(gè)構(gòu)架被鑒定然后予以分析。當(dāng)?shù)鞍仔蛄斜舜吮葘?duì)時(shí)，可建立蛋白序列的數(shù)據(jù)庫。則該比對(duì)可用于定義例如在序列和結(jié)構(gòu)排列上(如果該信息可用的話)都表現(xiàn)出高度相似性的殘基、亞元件、亞序列或構(gòu)架序列亞群。亞元件的長(zhǎng)度優(yōu)選，但并非僅在1個(gè)氨基酸(例如酶活性位點(diǎn)中的一個(gè)殘基或結(jié)構(gòu)決定殘基)和150個(gè)氨基酸(例如完整蛋白結(jié)構(gòu)域)的范圍之內(nèi)。最優(yōu)選的是，長(zhǎng)度范圍在3和25個(gè)氨基酸之間，例如最常見于抗體CDR環(huán)中的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，合成了由分析推測(cè)的共有核酸序列。這可通過本領(lǐng)域熟練從業(yè)人員眾所周知的多種方法中的任何一種，例如通過全基因合成或通過以PCR為基礎(chǔ)的途徑實(shí)現(xiàn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸序列被克隆到載體中。載體可以是測(cè)序載體、表達(dá)載體或展示(如噬菌體展示)載體，所有這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。載體可包含一個(gè)核酸序列或在不同或同一操縱子中的兩個(gè)或多個(gè)核酸序列。在最后一種情況下，它們可單獨(dú)或作為連續(xù)的序列克隆。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽具有特定物種的模式特征。例如，這可通過由僅僅一個(gè)種類的同源蛋白的集合，優(yōu)選由人類蛋白集合推斷共有序列而實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及通過提供編碼如上所述的多肽和附加成分的DNA序列而得的融合蛋白。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了核酸序列、含所述核酸序列的載體、含所述載體的宿主細(xì)胞以及根據(jù)本文所述方法可獲得的多肽。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了合成或以其它方式在本發(fā)明的核酸序列末端安置限制性位點(diǎn)，以使其能夠克隆到合適的載體中。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與編碼所述多肽的核酸序列相容的載體系統(tǒng)。所述載體包括限制性位點(diǎn)，這將是，舉例來說，在該載體系統(tǒng)中獨(dú)一無二的，并且就摻入到編碼所述多肽的核酸序列中的限制性位點(diǎn)而言基本上是唯一的，除了例如該核酸序列克隆到載體中所必需的限制性位點(diǎn)之外。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒，包括一個(gè)或多個(gè)核酸序列、重組載體、多肽和根據(jù)上述方法的載體，以及例如用于產(chǎn)生所述多肽的合適的宿主細(xì)胞。所有上述本發(fā)明的實(shí)施方案可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)完成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸序列是能夠編碼本發(fā)明的多肽的任何序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸用于基因治療。在另一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈構(gòu)架是(表5)中1.1、2.1、3.1、4.1、5.1、1.2、2.2、3.2、4.2、5.2、1.3、2.3、3.3、4.3、5.3、7.3、1.4、2.4、3.4、4.4、5.4、6.4任一序列的變體，其中如本文所用的“變體”是指表現(xiàn)出90％或更大的同一性、同時(shí)又保持增強(qiáng)的穩(wěn)定性的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈構(gòu)架是(表5)中1.1、2.1、3.1、4.1、5.1、1.2、2.2、3.2、4.2、5.2、1.3、2.3、3.3、4.3、5.3、7.3、1.4、2.4、3.4、4.4、5.4、6.4任一序列的衍生物，其中如本文所用的“衍生物”是指僅保持了對(duì)于該分子功能和穩(wěn)定性至關(guān)重要的那些氨基酸的序列。如實(shí)施例3中所述的構(gòu)架中孤立的中性或陽性交換不被認(rèn)為是與本發(fā)明的抗體構(gòu)架相關(guān)的變化。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單鏈構(gòu)架融合于第二蛋白，其中該蛋白為胞內(nèi)測(cè)定提供了讀出。所述讀出可以是直接的，例如以與可檢測(cè)的蛋白如可通過熒光觀察的GFP(綠色熒光蛋白)、增強(qiáng)的藍(lán)色熒光蛋白、增強(qiáng)的黃色熒光蛋白、增強(qiáng)的青色熒光蛋白或者具有不同檢測(cè)方法的其它融合伴侶融合的形式?；蛘?，所述讀出可通過報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄激活實(shí)現(xiàn)，其中scFv-融合蛋白的融合伴侶是轉(zhuǎn)錄激活劑，例如Gal4激活結(jié)構(gòu)域，或者DNA-結(jié)合蛋白，例如LexA或Gal4DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其激活酶例如β-半乳糖苷酶、熒光素酶、α-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶等報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，這轉(zhuǎn)錄提供了讀出。提供讀出的融合蛋白是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是包括本文所述的構(gòu)架的抗體。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是本發(fā)明抗體的應(yīng)用。本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案是抗體可變結(jié)構(gòu)域的所述構(gòu)架類別以及可變結(jié)構(gòu)域和scFv序列用于從既有抗體上移植高變環(huán)的用途，以獲得在還原或其它挑戰(zhàn)性環(huán)境中有功能的抗體。本發(fā)明另一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案是抗體可變結(jié)構(gòu)域的所述構(gòu)架類別以及可變結(jié)構(gòu)域和scFv序列的用途，例如通過此類構(gòu)架的一個(gè)或多個(gè)高變環(huán)的隨機(jī)化，用于建立文庫，應(yīng)用于還原或或其它挑戰(zhàn)性環(huán)境中。對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)顯而易見的是，文中所述的本發(fā)明的分子可用于診斷和治療應(yīng)用、靶確認(rèn)以及基因治療。本發(fā)明可通過如下實(shí)施例舉例說明，其并不旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。參考文獻(xiàn)Agatep，R.，Kirkpatrick，D.1，.，Parchaliuk，R.A.，Woods和Gietz，R.D.(1998).″TransformationofSaccharomycescerevisiaebylithiumacetate/single-strandedcarrierDNA/polyethyleneglycolprotocol.″Technical.TipsOnline(http//tto.trends.corn).AufderMaur，A.，Escher，D.和B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白啟動(dòng)子(用于強(qiáng)表達(dá))和GAL11轉(zhuǎn)錄終止序列，兩者由多克隆位點(diǎn)隔開。對(duì)于細(xì)菌系統(tǒng)的操作，它也具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)和amp抗性基因。篩選在酵母菌株釀酒酵母ImmunaLHB(MATαura3-52leu2Δ1trp1d63his3Δ200lys2Δ385)中實(shí)施，該菌株通過在具有六LexA-結(jié)合位點(diǎn)的雙向啟動(dòng)子(整合型報(bào)告質(zhì)粒pDE200，Escher2000)調(diào)控之下將取向相異的LacZ和HIS3報(bào)告基因整合到his3Δ200基因座、并將處于具有八LexA-結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子(來自EGY48)調(diào)控之下的LEU2報(bào)告基因整合到leu2Δ1基因座而衍生自菌株JPY5。該報(bào)告系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄激活是由scFv-融合構(gòu)建體的Gal4-AD部分介導(dǎo)的。篩選基本上如上文所述利用漏失培養(yǎng)基(-Trp/-Leu/-His)和高達(dá)40mM的3-氨基三唑濃度實(shí)施。實(shí)施例2體內(nèi)性能評(píng)價(jià)a)酵母中對(duì)于酵母中所選構(gòu)架性能的定量分析(圖1和3)，釀酒酵母菌株ImmunaLHB用作為pESBA-ACt2載體之上的LexA-Gal4-AD-融合構(gòu)建體的分離的scFvs按照標(biāo)準(zhǔn)醋酸鋰轉(zhuǎn)化方案(Agatep，1998)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后，將細(xì)胞涂布于漏失平板(-Trp)上。平行接種來自數(shù)個(gè)菌落劃線的2ml漏失培養(yǎng)基(-Trp)的過夜培養(yǎng)物，并于30℃培養(yǎng)。將培養(yǎng)物在1ml漏失培養(yǎng)基(-Trp)中稀釋至600nm(OD600)0.7的光密度。它們接著于30℃培養(yǎng)2小時(shí)。對(duì)于測(cè)定，取100μl細(xì)胞培養(yǎng)物，與900μl緩沖液、45μl氯仿和30μl0.1％SDS混合，震蕩并于室溫下溫育5分鐘。顯色通過添加0.2mlONPG(4mg/ml)起始，并由0.5mlNa2CO3(1M)終止?；钚酝ㄟ^考慮所測(cè)培養(yǎng)物的OD600以及顯色的溫育時(shí)間和所用的培養(yǎng)物體積計(jì)算。對(duì)至少等同于或優(yōu)于陽性對(duì)照(以前描述的極為穩(wěn)定的λ-移植物(Wrn，2000；AufderMaur，2001))的菌落進(jìn)行測(cè)序，以鑒定構(gòu)架亞型(構(gòu)架亞型根據(jù)Tomlinson，(1992)，Cox，(1994)和Williams，(1996)定義)。測(cè)序揭示了對(duì)某些構(gòu)架亞型驚人的偏好。對(duì)于重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)，構(gòu)架亞型2和6從未見過，并且亞型4在陽性菌落中顯著減少。分離序列的性能經(jīng)酵母胞內(nèi)測(cè)定校正后，胞內(nèi)應(yīng)用不僅對(duì)亞型3，而且還有1a和1b的VH構(gòu)架都具有極其強(qiáng)烈的偏好。關(guān)于輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，對(duì)κ1、λ1和λ3亞型的構(gòu)架具有清楚的偏好(表4)。這些構(gòu)架亞型，即與κ1、λ1和λ3VL結(jié)構(gòu)域組合的VH1a、1b和3因此最佳地滿足胞內(nèi)用途以及就scFv折疊特性而言具有嚴(yán)格要求的其它應(yīng)用。用于胞內(nèi)篩選系統(tǒng)的文庫應(yīng)當(dāng)，例如，優(yōu)選僅由這些構(gòu)架亞型的混合物構(gòu)件，以減少在還原環(huán)境下無功能分子的數(shù)量。b)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中利用Hela細(xì)胞系進(jìn)行人類細(xì)胞中所選構(gòu)架性能的定量分析(圖2、4和7)。熒光素酶報(bào)告基因由共轉(zhuǎn)染的pGL3(Promega)報(bào)告質(zhì)粒提供，其含有處于天然Gal4UAS調(diào)控之下的熒光素酶。用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體含有Gal4(1-147)，融合于VP16-AD的C-端，處于CMV啟動(dòng)子的調(diào)控之下。分離的scFv以正確的讀碼框克隆到Gal4(1-147)-VP16-融合子的C-端，以便經(jīng)表達(dá)產(chǎn)生Gal4(1-147)-VP16-scFv-融合蛋白。細(xì)胞在DMEM中培養(yǎng)，補(bǔ)充有2.5％FCS和2mM1-谷氨酰胺。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染根據(jù)Polyfect-方案(Qiagen)實(shí)施，在60mm組織培養(yǎng)板中利用0.01-0.1μg含scFv-構(gòu)建體的載體，0.5μgCMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Gal4(1-147)-VP16-scFv表達(dá)質(zhì)粒和0.5μgLacZ表達(dá)載體用作為轉(zhuǎn)染效率的參照。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)收獲，重懸于1000μl緩沖液中，并通過三次凍融循環(huán)裂解。細(xì)胞裂解物離心，對(duì)上清利用熒光素酶測(cè)定液(Promega)進(jìn)行熒光素酶活性測(cè)定，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案測(cè)定LacZ活性。所得的熒光素酶活性由LacZ活性校正，以說明轉(zhuǎn)染效率的變化。實(shí)施例3序列比較的多重比對(duì)和分析為闡明適用于胞內(nèi)應(yīng)用的構(gòu)架序列的通用模式，分離所有陽性菌落(即在質(zhì)控系統(tǒng)的選擇條件下生長(zhǎng)的那些菌落)，并對(duì)編碼scFv的部分進(jìn)行測(cè)序。隨后，scFv以其輕鏈和重鏈組分進(jìn)行劃分，以允許根據(jù)Honegger(2001)結(jié)構(gòu)調(diào)整的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域編號(hào)策略對(duì)各自的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比對(duì)(表1和2)。為允許對(duì)所得的數(shù)據(jù)加以闡述，建立了代表所選文庫的比對(duì)(表3)。為獲得未選的序列，文庫在不表達(dá)scFv基因的大腸桿菌細(xì)胞中轉(zhuǎn)化，并隨機(jī)挑取菌落用于質(zhì)粒分離和scFv-序列的測(cè)序。文庫如期涵蓋了人類抗體的所有組成部分，因而就特定亞型而言沒有偏差，與由通常見于人類的表達(dá)模式所預(yù)期的不同。VH和VL序列根據(jù)其亞群分組。亞群特異性共有序列的改變被突出顯示。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)特定交換殘基的結(jié)構(gòu)環(huán)境來辨別陽性、中性和陰性改變(如Honegger，2001)。屬于特定氨基酸組別的殘基交換為同組的殘基一般確認(rèn)為中性交換。屬于指向蛋白疏水核心的疏水氨基酸組的殘基交換為極性但不帶電荷或者帶正或負(fù)電荷的氨基酸組的氨基酸將會(huì)是非常不利的，因?yàn)椴伙柡偷臍涔w/受體位點(diǎn)干擾疏水核心的密堆積。此種改變因此被認(rèn)為是陰性的。屬于位于免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域表面的極性但不帶電荷組的殘基交換為帶正或負(fù)電荷組的氨基酸是非常有利的，因?yàn)榈鞍椎目扇苄缘靡蕴岣摺４朔N改變因此確認(rèn)是陽性的，而由極性交換為疏水殘基是非常不利的，因?yàn)榈鞍椎目扇苄韵陆?，因此確認(rèn)是陰性的。在具有保守正Φ-角的位置處，任何氨基酸交換為甘氨酸確認(rèn)是陽性的，而甘氨酸交換為任何氨基酸確認(rèn)是陰性的，因?yàn)楦拾彼崾俏ㄒ荒軌蛐纬烧?角的氨基酸。因帶正或負(fù)電荷的殘基組的氨基酸交換為不帶電荷的氨基酸所致的位置45-53、45-100、77-100以及108-137之間保守鹽橋的喪失導(dǎo)致熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性下降，因此認(rèn)為是陰性的。最后，我們挑選了在質(zhì)控期間優(yōu)選的7個(gè)VL結(jié)構(gòu)域和4個(gè)VH結(jié)構(gòu)域(即表現(xiàn)出共有序列的最少陰性和最多陽性交換且涵蓋亞群)，并且每一個(gè)在酵母中都表現(xiàn)出高的體內(nèi)性能。序列總結(jié)于表5，并且包括兩個(gè)Vκ1(kI27(1.x)和kIII25(2.x))、兩個(gè)Vκ3(kIV103(3.x)和kIV135(5.x))、一個(gè)Vλ1(kIV107(4.x))、兩個(gè)Vλ3(a33(7.x)和a43(6.x))、一個(gè)VH1b(a33(x.3))和三個(gè)VH3(afw10(x.2)、a43(x.4)和a44(x.1))。這些VL和VH結(jié)構(gòu)域被改組，給出22個(gè)scFv形式的新組合(1.1、2.1、3.1、4.1、5.1、1.2、2.2、3.2、4.2、5.2、1.3、2.3、3.3、4.3、5.3、7.3、1.4、2.4、3.4、4.4、5.4、6.4)。實(shí)施例4改組的結(jié)構(gòu)域的體內(nèi)性能評(píng)價(jià)a)在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞胞內(nèi)測(cè)定中的性能如實(shí)施例2所述的那樣對(duì)這22個(gè)組合測(cè)試了其在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的體內(nèi)性能(圖3和4)。b)可溶性蛋白在酵母中還原條件下的表達(dá)為比較可溶性蛋白在還原條件下表達(dá)后的產(chǎn)量，所選的構(gòu)架作為與Gal4AD的融合蛋白在酵母釀酒酵母的胞漿中表達(dá)。位于pESBA-Act2載體上的融合構(gòu)建體具有通式結(jié)構(gòu)Gal4AD-scFv。它們被如上所述轉(zhuǎn)化到酵母釀酒酵母菌株JPY9中，并涂布于-Trp漏失平板中。接種來自含數(shù)個(gè)菌落的劃線的5ml漏失培養(yǎng)基(-Trp)過夜培養(yǎng)物，并于30℃培養(yǎng)。將培養(yǎng)物在50ml漏失培養(yǎng)基(-Trp)中稀釋至600nm(OD600)0.5的光密度。它們于30℃培養(yǎng)5小時(shí)。對(duì)于天然細(xì)胞提取物，離心收集2.5ml標(biāo)準(zhǔn)化至OD600為3的細(xì)胞培養(yǎng)物，液氮中冷凍，隨后重懸于含蛋白酶抑制劑(PMSF)的75μlY-PER(Pierce)中。重懸的細(xì)胞沉淀震蕩片刻，并于20℃溫育(輕搖)20分鐘。不溶和聚集的物質(zhì)在eppendorf離心機(jī)中于4℃以最大速度離心10分鐘沉淀。上清與上樣染料混合，加熱到100℃5分鐘，然后在12％SDS-PAGE上分離?？扇苄訥al4AD-scFv融合構(gòu)建體由蛋白質(zhì)印跡通過用抗-Gal4AD單克隆鼠抗體(SantaCruzBiotechnology)作為一抗、而抗-鼠-過氧化物酶偶聯(lián)物(Sigma)作為二抗、并利用化學(xué)發(fā)光底物(Pierce)檢測(cè)Gal4-部分而顯現(xiàn)(圖5)。SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡操作是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的。c)在大腸桿菌周質(zhì)中的表達(dá)行為為評(píng)價(jià)在大腸桿菌中的周質(zhì)表達(dá)(圖6)，將分離的scFv-構(gòu)架克隆到帶有cam抗性基因(catR)和lacI阻遏基因(Krebber，1997)的細(xì)菌載體上，其中N-端具有pelB-前導(dǎo)序列，而C-端具有his-標(biāo)簽，處于lac啟動(dòng)子/操縱子調(diào)控之下。感受態(tài)大腸桿菌JM83用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。在50ml含35mg/l氯霉素的dYT-培養(yǎng)基搖瓶中以1∶40接種過夜培養(yǎng)物，并于30℃溫育。細(xì)胞在OD600為0.8時(shí)用1mMIPTG誘導(dǎo)，并在誘導(dǎo)3小時(shí)之后通過離心收集。沉淀重懸于50mMTris，pH7.5，500mMNaCl中，并標(biāo)準(zhǔn)化至OD600為10。對(duì)每個(gè)scFv片段樣品或直接(總提取物)分析或在超聲破碎再離心后(可溶性級(jí)分)通過SDS-PAGE進(jìn)行分析?？扇艿鞍椎暮坑煽捡R斯亮蘭染色的凝膠估計(jì)。實(shí)施例5具有優(yōu)良特性的5個(gè)組合用于胞外用途的詳細(xì)評(píng)價(jià)選取五個(gè)組合作為實(shí)例，它們?cè)诮湍负筒溉閯?dòng)物胞內(nèi)測(cè)定中表現(xiàn)出良好性能，在酵母和大腸桿菌表達(dá)期間產(chǎn)生可溶性蛋白，并且涵蓋了在質(zhì)控期間偏好選擇的亞群(2.4、4.4、5.2、6.4和7.3，詳見表5)。我們更為詳細(xì)地分析這些組合，以進(jìn)一步評(píng)價(jià)其在還原以及氧化條件下的用途。a)在不同哺乳動(dòng)物細(xì)胞的胞內(nèi)測(cè)定中的性能五個(gè)組合在人類細(xì)胞中性能的定量分析利用Hela細(xì)胞并且額外利用人骨肉瘤細(xì)胞系Saos-2和人胚腎細(xì)胞系HEK293如實(shí)施例2所進(jìn)行的那樣實(shí)施(圖7)。b)體外表達(dá)和純化的性能為評(píng)價(jià)體外性能，將五個(gè)優(yōu)良組合在大腸桿菌周質(zhì)中表達(dá)(圖6)。在0.1l含35mg/l氯霉素的dYT-培養(yǎng)基搖瓶中以1∶40接種過夜培養(yǎng)物，并于30℃溫育。細(xì)胞在OD550為1.5時(shí)用1mMIPTG誘導(dǎo)，并在誘導(dǎo)2小時(shí)之后通過離心收集。為純化scFv，將細(xì)胞沉淀重懸并通過超聲裂解。在可溶蛋白的含量由考馬斯亮蘭染色的凝膠估計(jì)。在SS34中以20krpm、4℃離心30分鐘之后，將上清以pH7.5施加到Ni-MC-親合柱(Hi-TrapTMChelatingHP，1ml，AmershamPharmacia)上，并利用來自AmershaxnPharmacia的ktaBasic系統(tǒng)由200mM咪唑洗脫。scFv片段的純度大于98％，如通過SDS-PAGE所測(cè)定的(數(shù)據(jù)未顯示)。純化蛋白的濃度利用計(jì)算的280nm處的消光系數(shù)確定。可溶性純化蛋白的產(chǎn)量以O(shè)D600為10的1升培養(yǎng)物體積標(biāo)準(zhǔn)化，并且從8到超過55mg不等。聚集抗性聚集抗性已證明與體外的熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性(Wrn，1999)以及小鼠異種移植腫瘤模型的腫瘤定位效率(Willuda，1999)有關(guān)。為了測(cè)試穩(wěn)定性、聚集抗性以及解折疊可逆性，處于50mMTris，pH7.5，100mMNaCl中濃度為6μM的200μl純化蛋白樣品或于4℃保存4天或37℃4天或4℃3天，緊接著在100℃溫育15或60分鐘，緩慢冷卻至室溫，并于4℃過夜溫育。每個(gè)樣品的寡聚狀態(tài)隨后在由50mMTris，pH7.5，100mMNaCl平衡的凝膠過濾柱上分析，以估計(jì)聚集體相對(duì)于單體物質(zhì)的含量(圖8)。將蛋白以100μl的體積在ktaBasic系統(tǒng)(AmershainPharmacia)中以1ml/分的流速注入Superdex-75柱(AmershamPharmacia)中。蛋白酶降解抗性為確定分離的構(gòu)架就蛋白酶降解而言的穩(wěn)定性(對(duì)于治療應(yīng)用很重要的一個(gè)參數(shù))，我們?cè)谌祟愌逯杏?7℃溫育純化的構(gòu)架(圖9)。將濃度為50μM的純化的his-標(biāo)記的scFv-蛋白(見上文)在人類血清中稀釋10倍，至90％血清中的終濃度5μM。樣品然后在37℃溫育3天或1天，或者直接取來上樣。在上樣前，不溶和聚集的物質(zhì)在eppendorf離心機(jī)中于4℃以最大速度離心10分鐘沉淀。上清由上樣染料稀釋6倍，以降低上樣到凝膠上的血清的量，100℃加熱5分鐘，然后在12％SDS-PAGE上分離。可溶性his-標(biāo)記的scFv片段由蛋白質(zhì)印跡通過用抗-his單克隆鼠抗體(Qiagen)作為一抗、而抗-鼠-過氧化物酶偶聯(lián)物(Sigma)作為二抗、并利用化學(xué)發(fā)光底物(Pierce)檢測(cè)his-標(biāo)簽觀察。SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡操作是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的。實(shí)施例6通過在酵母交互作用篩選系統(tǒng)中在構(gòu)架7.3中篩選隨機(jī)化的CDR-文庫來選擇抗原結(jié)合劑用交互作用系統(tǒng)篩選抗原結(jié)合劑基本上如以前所詳述的那樣進(jìn)行(AufderMaur，2002)。用于表達(dá)scFv-融合構(gòu)建體以在酵母中進(jìn)行篩選的質(zhì)粒衍生自pESBA-Act2。它含有酵母TRP1營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記和2微米復(fù)制起點(diǎn)。而且它具有用于強(qiáng)表達(dá)的組成型肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和GAL11轉(zhuǎn)錄終止序列，兩者由多克隆位點(diǎn)隔開。對(duì)于細(xì)菌系統(tǒng)的操作，它也具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)和amp抗性基因。Gal4激活結(jié)構(gòu)域(AD氨基酸768-881)最初是利用pGAD424(Clontech)作為模板，用包括位于Gal4-ADN-端的SV40T-抗原核定位信號(hào)在內(nèi)的引物通過PCR擴(kuò)增的。scFv文庫利用引物隨機(jī)化VH的CDR3內(nèi)的7個(gè)氨基酸通過PCR擴(kuò)增scFv-構(gòu)架7.3而獲得。所得的PCR產(chǎn)物以正確讀碼框克隆進(jìn)構(gòu)架7.3中，以VL-接頭-VH的取向存在于載體中，作為Gal4-AD的C-端融合物。從而表達(dá)產(chǎn)生具有通式結(jié)構(gòu)Gal4-AD-scFv的融合蛋白。在酵母菌株釀酒酵母ImmunaLHB(MATαura3-52leu2Δ1trp1d63his3Δ200lys2Δ385)中實(shí)施篩選。它通過將處于具有六個(gè)LexA-結(jié)合位點(diǎn)的雙向啟動(dòng)子調(diào)控之下的取向相異的LacZ和HIS3報(bào)告基因(整合型報(bào)告質(zhì)粒pDE200，Escher2000)整合到his3Δ200基因座、并將處于具有八個(gè)LexA-結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子(來自EGY48)調(diào)控之下的LEU2報(bào)告基因整合到leu2Δ1基因座而衍生自菌株JPY5。該報(bào)告系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄激活是繼其scFv部分與誘餌-融合蛋白的抗原部分特異性相互作用之后，由scFv-融合構(gòu)建體的Gal4-AD部分介導(dǎo)的。誘餌-融合蛋白由融合于DNA-結(jié)合LexA蛋白C-端的人類球樣激酶1的激酶結(jié)構(gòu)域(hPlk1-KD)組成。激酶結(jié)構(gòu)域(氨基酸2-332)由hPlk1cDNA利用上游引物5′-tgctctagaagtgctgcagtgactgcag-3′(Seq.Id.No.12)和下游引物5′-ggttgtcgacttacaggctgctgggagcaatcg-3′(Seq.Id.No.13)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所得的PCR產(chǎn)物通過XbaI和SalI被克隆到的誘餌載體中LexA的C-端。誘餌載體含有URA3營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記和ArsCen復(fù)制起點(diǎn)。誘餌-融合蛋白的表達(dá)由組成型活性的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。轉(zhuǎn)錄通過GAL11終止序列終止。誘餌蛋白也攜帶用于在細(xì)菌系統(tǒng)中增殖的細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)和amp抗性基因。對(duì)于篩選，酵母菌株釀酒酵母ImmunaLHB由作為位于載體pESBA-Act2之上Gal4-AD的融合物的scFv-文庫以及提供LexA-hPLK1-KD融合子的誘餌載體按照標(biāo)準(zhǔn)醋酸鋰轉(zhuǎn)化方案(Agatep，1998)共轉(zhuǎn)化。在轉(zhuǎn)化之后，將細(xì)胞涂布于漏失平板(-Trp/-Leu/-Ura)。于30℃溫育3到5天后挑取菌落，并在漏失平板(-Trp/-Leu/-Ura)上重新劃線。重新長(zhǎng)出的菌落通過在含底物X-Gal板的濾紙測(cè)定中的藍(lán)色形成進(jìn)行LacZ-表達(dá)測(cè)試。取陽性菌落用于進(jìn)一步的分析，包括從酵母中分離攜帶scFv的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α、從大腸桿菌單菌落中分離質(zhì)粒、測(cè)序并重新轉(zhuǎn)化到新鮮制備的酵母菌株ImmunaLHB中用于下文所述的測(cè)定。所有方法根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)操作實(shí)施。實(shí)施例7來自新scFv構(gòu)架的Fab構(gòu)建體體內(nèi)性能的評(píng)價(jià)為評(píng)價(jià)在不同抗體形式中使用穩(wěn)定可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架的有益效果，構(gòu)建Fab表達(dá)載體用于酵母相互作用的篩選。a)用于酵母胞內(nèi)篩選的Fab構(gòu)建體構(gòu)建了兩個(gè)不同的表達(dá)載體以允許不同的表達(dá)水平。所述載體以yEplac112(2微米)或yCplac22(ars/cen)主鏈(Gietz，1988)為基礎(chǔ)。兩者都含有酵母TRP1營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記、可誘導(dǎo)的雙向Gal1/Gal10啟動(dòng)子、用于細(xì)菌系統(tǒng)操作的細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)以及amp抗性基因。在一個(gè)方向上，構(gòu)架7.3的VH結(jié)構(gòu)域被克隆到包括C-端半胱氨酸的IgG1的CH1-結(jié)構(gòu)域的N-端，緊接著是接頭和包括SV40T-抗原在內(nèi)的Gal4激活結(jié)構(gòu)域(AD氨基酸768-881)。在另一側(cè)，構(gòu)架7.3的VL結(jié)構(gòu)域被克隆到包括C-端半胱氨酸的CL(λ)結(jié)構(gòu)域的N-端。終止子為重鏈側(cè)的Gal11終止子以及輕鏈側(cè)的Cyclin1終止子。b)酵母胞內(nèi)測(cè)定中的性能為定量分析酵母中scFv和Fab形式的抗原結(jié)合劑的性能(圖1和3)，釀酒酵母菌株ImmunaLHB由作為載體pESBA-Act2上的Gal4-AD-融合物構(gòu)建體的分離的scFv以及含LexA-hPLK-KD融合子的誘餌載體按照標(biāo)準(zhǔn)醋酸鋰轉(zhuǎn)化方案(Agatep，1998)共轉(zhuǎn)化。在轉(zhuǎn)化之后，將細(xì)胞涂布于漏失平板(-Trp，-Ura，Glc)。平行接種來自數(shù)個(gè)菌落劃線的2ml漏失培養(yǎng)基(-Trp，-Ura，Glc)過夜培養(yǎng)物，并于30℃培養(yǎng)。將培養(yǎng)物在1ml漏失培養(yǎng)基(-Trp，-Ura，Glc)中稀釋至600nm(OD600)0.7的光密度。它們于30℃培養(yǎng)5小時(shí)。測(cè)定如上文所述進(jìn)行。C)酵母中還原條件下可溶性蛋白的表達(dá)為比較可溶性蛋白在還原條件下表達(dá)后的產(chǎn)量，scFv和Fab構(gòu)建體、連同hPLK1-KD-誘餌載體，如上文所述在酵母菌釀酒酵母的胞漿中表達(dá)。它們?nèi)缟衔乃霰晦D(zhuǎn)化到酵母菌株YDE173中，并涂布于含葡萄糖的-Trp、-Ura漏失平板上。接種來自含數(shù)個(gè)菌落的劃線的5ml漏失培養(yǎng)基(-Trp，-Ura，Glc)過夜培養(yǎng)物，并于30℃培養(yǎng)。將培養(yǎng)物在YPAG中稀釋至600nm(OD600)0.5的光密度。它們于30℃培養(yǎng)7.5小時(shí)。測(cè)定如上文所述進(jìn)行。對(duì)于天然細(xì)胞提取物，離心收集2.5ml標(biāo)準(zhǔn)化至OD600為3的細(xì)胞培養(yǎng)物，液氮中冷凍，隨后重懸于75μlY-PER(Pierce)中。重懸的細(xì)胞沉淀震蕩片刻，并于20℃輕搖溫育20分鐘。隨后不溶和聚集的物質(zhì)在eppendorf離心機(jī)中于4℃以最大速度離心10分鐘沉淀。上清與上樣染料混合，100℃加熱5分鐘，并在12％SDS-PAGE上分離。可溶性Gal4AD-scFv融合物和融合于Gal4-AD的Fab重鏈部分由蛋白質(zhì)印跡通過用抗-Gal4-AD單克隆鼠抗體(SantaCruzBiotechnology)作為一抗、而抗-鼠-過氧化物酶偶聯(lián)物(Sigma)作為二抗、并利用化學(xué)發(fā)光底物(Pierce)檢測(cè)Gal4-成分的顯現(xiàn)(圖11)。SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡操作是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的。序列表<110>ESBATECHAG<120>在胞內(nèi)環(huán)境中表現(xiàn)出增強(qiáng)的穩(wěn)定性的免疫球蛋白構(gòu)架及其鑒定方法<130>08420PC<150>US60/382,649<151>2002-05-22<150>US60/438,246<151>2003-01-03<160>13<170>PatentInversion3.1<210>1<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗體構(gòu)架<400>1GluIleValMetThrGlnSerProSerThrLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValIleIleThrCysArgAlaSerGlnSerIleSerSerTrp202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIle354045TyrLysAlaSerSerLeuGluSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyAlaGluPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580AspAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnTyrLysSerTyrTrpThr859095PheGlyGlnGlyThrLysLeuThrValLeuGly100105<210>2<211>108<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗體構(gòu)架<400>2GluIleValLeuThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrLeuThrCysArgAlaSerGlnGlyIleArgAsnGlu202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnArgProGlyLysAlaProLysArgLeuIle354045TyrAlaGlySerIleLeuGlnSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrGluPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580GluAspValAlaValTyrTyrCysGlnGlnTyrTyrSerLeuProTyr859095MetPheGlyGlnGlyThrLysValAspIleLysArg100105<210>3<211>109<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗體構(gòu)架<400>3GluIleValMetThrGlnSerProAlaThrLeuSerValSerProGly151015GluSerAlaAlaLeuSerCysArgAlaSerGlnGlyValSerThrAsn202530ValAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeuIle354045TyrGlyAlaThrThrArgAlaSerGlyValProAlaArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrGluPheThrLeuThrIleAsnSerLeuGlnSer65707580GluAspPheAlaAlaTyrTyrCysGlnGlnTyrLysHisTrpProPro859095TrpThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLysArg100105<210>4<211>111<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗體構(gòu)架<400>4GlnSerValLeuThrGlnProProSerValSerAlaAlaProGlyGln151015LysValThrIleSerCysSerGlySerThrSerAsnIleGlyAspAsn202530TyrValSerTrpTyrGlnGlnLeuProGlyThrAlaProGlnLeuLeu354045IleTyrAspAsnThrLysArgProSerGlyIleProAspArgPheSer505560GlySerLysSerGlyThrSerAlaThrLeuGlyIleThrGlyLeuGln65707580ThrGlyAspGluAlaAspTyrTyrCysGlyThrTrpAspSerSerLeu859095SerGlyValValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeuGly100105110<210>5<211>108<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗體構(gòu)架<400>5GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerGlnThrLeuThrHisTyr202530LeuAlaTrpThrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeuIle354045TyrAspThrSerLysArgAlaThrGlyValProAlaArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluPro65707580GluAspSerAlaLeuTyrTyrCysGlnGlnArgAsnSerTrpProHis859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLysArg100105<210>6<211>109<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗體構(gòu)架<400>6SerTyrValLeuThrGlnProProSerValSerValAlaProGlyGln151015ThrAlaThrValThrCysGlyGlyAsnAsnIleGlySerLysSerVal202530HisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProValLeuValValTyr354045AspAspSerAspArgProSerGlyIleProGluArgPheSerGlySer505560AsnSerGlyAsnThrAlaThrLeuThrIleArgArgValGluAlaGly65707580AspGluAlaAspTyrTyrCysGlnValTrpAspSerSerSerAspHis859095AsnValPheGlySerGlyThrLysValGluIleLysArg100105<210>7<211>109<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗體構(gòu)架<400>7LeuProValLeuThrGlnProProSerValSerValAlaProGlyGln151015ThrAlaArgIleSerCysGlyGlyAsnAsnIleGluThrIleSerVal202530HisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProValLeuVa1ValSer354045AspAspSerValArgProSerGlyIleProGluArgPheSerGlySer505560AsnSerGlyAsnThrAlaThrLeuThrIleSerArgValGluAlaGly65707580AspGluAlaAspTyrTyrCysGlnValTrpAspSerSerSerAspTyr859095ValValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeuGly100105<210>8<211>124<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗體構(gòu)架<400>8GlnValGlnLeuValGlnSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlaIleSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaAlaHisValLeuArgPheLeuGluTrpLeuProAspAlaPheAsp100105110IleTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>9<211>108<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗體構(gòu)架<400>9GluIleValLeuThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerLeuGly151015AspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGlnSerIleSerSerTyr202530LeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIle354045TyrAlaAlaSerSerSerGlnSerGlyValProSerArgPheArgGly505560SerGluSerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerAsnLeuGlnPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnSerTyrArgThrProPhe859095ThrPheGlyProGlyThrLysValGluIleLysArg100105<210>10<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗體構(gòu)架<400>10ValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAlaSer151015ValLysValSerCysThrAlaSerGlyTyrSerPheThrGlyTyrPhe202530LeuHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMetGly354045ArgIleAsnProAspSerGlyAspThrIleTyrAlaGlnLysPheGln505560AspArgValThrLeuThrArgAspThrSerIleGlyThrValTyrMet65707580GluLeuThrSerLeuThrSerAspAspThrAlaValTyrTyrCysAla859095ArgValProArgGlyThrTyrLeuAspProTrpAspTyrPheAspTyr100105110TrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>11<211>122<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗體構(gòu)架<400>11GluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlaIleSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysAspAlaGlyIleAlaValAlaGlyThrGlyPheAspTyrTrp100105110GlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>12<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>12tgctctagaagtgctgcagtgactgcag28<210>13<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>13ggttgtcgacttacaggctgctgggagcaatcg3權(quán)利要求1.單鏈構(gòu)架，具有如下通式結(jié)構(gòu)NH2-VL-接頭-VH-COOH；或NH2-VH-接頭-VL-COOH其中VH構(gòu)架為1a、1b或3亞型。2.融合于第二蛋白成分的單鏈構(gòu)架，以產(chǎn)生具有如下通式結(jié)構(gòu)的融合構(gòu)建體NH2-VL-接頭-VH-第二蛋白-COOH；或NH2-第二蛋白-VL-接頭-VH-COOH其中VH構(gòu)架為1a、1b或3亞型。3.權(quán)利要求1或2的單鏈構(gòu)架，其中VH和VL區(qū)的取向顛倒。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3的單鏈構(gòu)架，其中VL構(gòu)架為κ1、λ1或3型。5.根據(jù)權(quán)利要求2的單鏈構(gòu)架，其中第二蛋白為胞內(nèi)測(cè)定提供讀出信息。6.單鏈構(gòu)架，選自下組AH、BH、CH、DH、EH、FH、GH、AI、BI、CI、DI、EI、FI、GI、AJ、BJ、CJ、DJ、EJ、FJ、GJ、AK、BK、CK、DK、EK、FK及GK其中A為氨基酸序列(Seq.Id.No.1)EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYKSYWTFGQGTKLTVLG；B為氨基酸序列(Seq.Id.No.2)EIVLTQSPSSLSASVGDRVTLTCRASQGIRNELAWYQQRPGKAPKRLIYAGSILQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDVAVYYCQQYYSLPYMFGQGTKVDIKR；C為氨基酸序列(Seq.Id.No.3)EIVMTQSPATLSVSPGESAALSCRASQGVSTNVAWYQQKPGQAPRLLIYGATTRASGVPARFSGSGSGTEFTLTINSLQSEDFAAYYCQQYKHWPPWTFGQGTKVEIKR；D為氨基酸序列(Seq.Id.No.4)QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGDNYVSWYQQLPGTAPQLLIYDNTKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSGVVFGGGTKLTVLG；E為氨基酸序列(Seq.Id.No.5)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQTLTHYLAWYQQKPGQAPRLLIYDTSKRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDSALYYCQQRNSWPHTFGGGTKLEIKR；F為氨基酸序列(Seq.Id.No.6)SYVLTQPPSVSVAPGQTATVTCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTIRRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHNVFGSGTKVEIKR；G為氨基酸序列(Seq.Id.No.7)LPVLTQPPSVSVAPGQTARISCGGNNIETISVHWYQQKPGQAPVLVVSDDSVRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDYVVFGGGTKLTVLG；H為氨基酸序列(Seq.Id.No.8)QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAHVLRFLEWLPDAFDIWGQGTLVTVSS；I為氨基酸序列(Seq.Id.No.9)EIVLTQSPSSLSASLGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSSQSGVPSRFRGSESGTDFTLTISNLQPEDFATYYCQQSYRTPFTFGPGTKVEIKR；J為氨基酸序列(Seq.Id.No.10)VQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYSFTGYFLHWVRQAPGQGLEWMGRINPDSGDTIYAQKFQDRVTLTRDTSIGTVYMELTSLTSDDTAVYYCARVPRGTYLDPWDYFDYWGQGTLVTVSS；且K為氨基酸序列(Seq.Id.No.11)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDAGIAVAGTGFDYWGQGTLVTVSS。7.單鏈構(gòu)架，選自根據(jù)權(quán)利要求6的單鏈構(gòu)架的變體。8.單鏈構(gòu)架，選自根據(jù)權(quán)利要求6的單鏈構(gòu)架的衍生物。9.根據(jù)權(quán)利要求1-7或17-18中任一項(xiàng)的單鏈構(gòu)架、抗體或抗體片段在靶確認(rèn)、診斷應(yīng)用、文庫構(gòu)建或治療應(yīng)用中的用途。10.至少兩個(gè)構(gòu)架序列在鑒定保守構(gòu)架殘基種類中的用途。11.根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中保守構(gòu)架殘基種類選自下組極性但不帶電荷的R基團(tuán)；帶正電荷的R基團(tuán)；帶負(fù)電荷的R基團(tuán)；疏水R基團(tuán)；及特定氨基酸。12.至少兩個(gè)構(gòu)架序列在鑒定至少一個(gè)保守構(gòu)架序列中的用途。13.根據(jù)權(quán)利要求12的用途，其中保守構(gòu)架序列為2-5個(gè)殘基。14.根據(jù)權(quán)利要求12的用途，其中保守構(gòu)架序列為5-10個(gè)殘基。15.根據(jù)權(quán)利要求12的用途，其中保守構(gòu)架序列為10-25個(gè)殘基。16.根據(jù)權(quán)利要求12-15的用途，其中保守構(gòu)架序列具有缺口。17.抗體，包括來自根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的單鏈構(gòu)架的VL或VH或兩者兼而有之。18.抗體片段，包括來自根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的單鏈構(gòu)架的VL或VH或兩者兼而有之。19.核酸，能夠編碼根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的單鏈構(gòu)架。20.載體，包含根據(jù)權(quán)利要求19的核酸。21.宿主細(xì)胞，包含根據(jù)權(quán)利要求19的核酸。22.根據(jù)權(quán)利要求19的核酸在基因治療中的用途。全文摘要本發(fā)明提供了組合物，其可作為用于創(chuàng)建極為穩(wěn)定且可溶的單鏈Fv抗體片段的構(gòu)架。這些構(gòu)架經(jīng)胞內(nèi)性能選擇，因而可理想地適用于創(chuàng)建scFv抗體片段或scFv抗體文庫，以用于其中穩(wěn)定性和可溶性為抗體片段性能的限制因素的應(yīng)用，例如在細(xì)胞的還原環(huán)境中。此類構(gòu)架也可用于鑒定表現(xiàn)出增強(qiáng)的可溶性和穩(wěn)定性的高度保守殘基及共有序列。文檔編號(hào)C07K16/18GK1662556SQ03814626公開日2005年8月31日申請(qǐng)日期2003年5月21日優(yōu)先權(quán)日2002年5月22日發(fā)明者K·緹索特,S·艾沃特,A·奧弗德爾茂爾,A·巴伯里斯,D·艾施爾申請(qǐng)人:艾斯巴技術(shù)股份公司