專利名稱：使用ctla－4抗體的治療方法
技術領域：
本發明一般涉及分子免疫學和人類疾病的治療。具體地，本發明涉及使用抗人CTLA-4抗體的新的治療方法。
背景技術：
脊椎動物免疫系統需要多種信號以實現最優的免疫活化(見，例如，Janeway，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.1989；541-14；PaulWilliam E.，ed.Raven Press，N.Y.，Fundamental Immunology，第4版(1998)，尤其是12和13章，411-478頁)。T淋巴細胞(T細胞)和抗原呈遞細胞(APC)的相互作用是免疫應答所必需的。在免疫應答過程中T細胞和APC上存在的許多粘著分子的水平增加(Springer等，A.Rev.Immunol.1987；5223-252；Shaw和Shimuzu，Current Opinion in Immunology，1988Eds.Kindt和Long，192-97；和Hemler，Immunology Today 1988；9109-113)。這些分子的水平增加可能有助于解釋為什么活化的APC比靜息的APC對刺激抗原特異性T細胞增殖更有效(Kaiuchi等，J.Immunol.1983；131109-114；Kreiger等，J.Immunol.1985；1352937-2945；McKenzie，J.Immunol.1988；1412907-2911；和Hawrylowicz和Unanue，J.Immunol..1988；1414083-4088)。
T細胞免疫應答是一個復雜過程，其包括細胞-細胞相互作用(Springer等，A.Rev.Immunol.1987；5223-252)，尤其是T細胞和輔助細胞如APC之間的相互作用，和可溶性免疫介質(細胞因子或淋巴因子)的產生(Dinarello，New Engl.J.Med 1987；317940-945；Sallusto，J.Exp.Med.1997；1791109-1118)。該應答被幾種T細胞表面受體，包括T細胞受體復合物(Weiss，Ann.Rev.Immunol.1986；4593-619)和其他“輔助”表面分子所調節(Allison，Curr.Opin.Immunol.1994；6414-419；Springer，1987，如前引文)。這些輔助分子中的許多是由細胞表面上的單克隆抗體反應性定義的天然細胞表面分化(CD)抗原(McMichael，Ed.，Leukocyte Typing III，Oxford Univ.Press，Oxford，N.Y.，1987)。
T輔助細胞(Th)抗原應答需要APC提供的信號。第一個信號由T細胞受體復合物(Weiss，J.Clin.Invest.1990，861015)與APC上II類主要組織相容性復合物(MHC)分子背景中呈遞的抗原的相互作用啟動(Allen，Immunol.Today 1987；8270)。該抗原特異性信號并不足以產生完全應答，在缺乏第二信號時實際上可能導致克隆失活或無反應性(Schwartz，Science1990；2481349)。在許多實驗系統中已闡明了對MHC提供的第二“共刺激”信號的需要(Schwartz，如上引文；Weaver和Unanue，Immunol.Today1990；1149)。該第二信號的分子性質還不完全清楚，但已經清楚在一些情況下可溶性分子如白介素(IL)-1(Weaver和Unanue，如前引文)和參與胞間粘附的膜受體(Springer，Nature 1990；346425)可提供共刺激信號。
CD28抗原——免疫球蛋白超家族的一種同二聚體糖蛋白(Aruffo和Seed，Proc.Natl.Acad.Sci.1987；848573-8577)——是一種在大多數成熟人T細胞上發現的輔助分子(Damle等，J.Immunol.1983；1312296-2300)。現今的證據表明該分子在與T細胞受體復合物啟動的T細胞活化途徑不同的替代T細胞活化途徑中起作用(June等，Mol.Cell.Biol.1987；74472-4481)。與CD28抗原有反應性的單克隆抗體(Mab)可提高由各種多克隆刺激物啟動的T細胞應答(June等的綜論，如前引文)。這些刺激作用可能由于Mab誘導的細胞因子產生(Thompson等，Proc.Natl.Acad.Sci1989；861333-1337；和Lindsten等，Science 1989；244339-343)作為mRNA穩定性增加的結果(Lindsten等，1989，如前引文)而出現。抗CD28mAb也可具有抑制作用，即，它們可以阻斷自體的混合淋巴細胞反應(Damle等，Proc.Natl.Acad.Sci.1981；785096-6001)和抗原特異性T細胞克隆活化(Lesslauer等，Eur.J.Immunol.1986；161289-1296)。
CTLA-4是一種T細胞表面分子，其最初通過鼠的溶細胞性T細胞cDNA文庫的示差篩選鑒定(Brunet等，Nature 328267-270(1987))。CTLA-4也是免疫球蛋白(Ig)超家族的一員；CTLA-4含有單個胞外Ig結構域。CTLA-4轉錄物已經在具有細胞毒活性的T細胞群體中發現，提示CTLA-4可能在溶細胞反應中發揮功能(Brunet等，如前引文；Brunet等，Immunol.Rev.103-21-36(1988))。研究人員已報導了對CTLA-4的人類對應物(Dariavach等，Eur.J.immunol.181901-1905(1988))的基因克隆和作圖，其作圖定位在與CD28相同的染色體區域(2q33-34)(Lafage-Pochitaloff等，Immunogenetics 31198-201(1990))。該人CTLA-4 DNA和編碼CD28蛋白的DNA的序列比較揭示了序列的顯著同源性，在近膜區和胞質區具有最大的同源性(Brunet等，1988，如前引文；Dariavach等，1988，如前引文)。
公認CTLA-4可以對抗CD28活性并可以抑制T細胞活化(Krummel，J.Exp.Med.1995；182459-465；Krummel等，Int′l Immunol.1996；8519-523；Chambers等，Immunity.1997；7885-895)。CTLA-4缺陷小鼠患有大面積淋巴組織增生(Chambers等，同上引文)。據報導CTLA-4的阻斷可以增加體外(Walunas等，Immunity.1994；1405-413)和體內(Kearney，J.Immunol.1995；1551032-1036)T細胞應答，加劇抗腫瘤免疫(Leach，Science 1996；2711734-1736)，和增加誘導的自身免疫疾病(Luhder，J Exp.Med.1998；187427-432)。據報導CTLA-4對T細胞免疫應答的最初特征還具有可選的或額外的影響(Chambers，Curr.Opin.Immunol.1997；9396-404；Bluestone，J.Immunol.1997；1581989-1993；Thompson，Immunity 1997；7445-450)。這和所觀察到的一些自身免疫患者具有抗CTLA-4自身抗體的現象相一致。可能阻斷CTLA-4的自身抗體在這些患者中起著致病的作用(Matsui，J.Immunol.1999；1624328-4335)。
非人CTLA-4抗體已經在上面討論的各種研究中使用。此外，抗人CTLA-4的人抗體已經被描述為許多疾病狀況的免疫刺激調節劑，如治療和防止病毒和細菌感染和用于治療癌癥(例如，PCT出版物WO01/14424和PCT出版物WO00/37504)。美國專利號5,855,887公開了通過組合T細胞與CTLA-4阻斷劑增加哺乳動物T細胞對抗原刺激的應答。美國專利號5,811,097公開了一種通過使用CTLA-4阻斷劑減少非-T細胞腫瘤生長的方法。美國專利申請號09/644,668和09/948,939公開了人CTLA-4抗體，在此處將其引入作為參考。
本說明書中該部分和其他部分中對參考文獻的引用和討論僅僅用于闡明本發明而不是承認這些參考文獻是此處描述的發明的“現有技術”。
發明概述本發明提供了使用抗CTLA-4抗體促進或加強再次免疫應合或記憶免疫應答的方法。抗CTLA-4抗體顯示出能夠增加已經具有針對病原體的保護性抗原，例如，癌抗原或來自感染物的抗原的免疫性的受試者中的保護性免疫的幅度。導致這種先前免疫的可能原因有天然暴露于，例如，切除后的腫瘤的癌細胞或已減退或抑制的感染劑感染。可檢查這些患者以得到這種暴露的證據，即，患者是否具有對病原體的保護性抗原的免疫性。備選地，患者可能已經接受過針對該病原體的接種免疫，在這種情況下可以認為或檢驗到存在免疫性。
在一個實施方案中，本發明的CTLA-4抗體可以用于惡性腫瘤的治療，其中患者以前已經接受過癌癥疫苗或者顯示出對腫瘤具有一定水平的天然保護性免疫。這些抗體可以作為單一的藥劑使用或者與一種或多種其他療法，如化療、放射療法、細胞因子、趨化因子和其他生物信號分子、腫瘤特異性疫苗、自體和同種異體干細胞拯救因子(例如，以提高移植物抗腫瘤效果)、其他治療性抗體、分子定向療法、抗血管生成療法、具有治療目的的感染劑(如使腫瘤局限化的細菌)和基因療法相組合。這些抗體可以以單劑量或多劑量形式施用。這些抗體可以在輔助治療或新輔助治療(neoadiuvant therapy)中單獨使用或者與上面提到的療法聯合使用。
使用抗CTLA-4抗體的治療可以用于激活接受過癌癥疫苗治療的患者體內先已存在的記憶應答。因此，可選擇經疫苗治療的患者以進一步用抗CTLA-4抗體治療從而進一步誘導或增強免疫應答。
在一個實施方案中，抗原是癌抗原并且患者先前已經用抗癌疫苗治療。癌抗原可以是例如，黑素瘤抗原或前列腺癌抗原。在另一個實施方案中，抗原為病毒抗原并且患者先前已經用病毒疫苗治療。病毒抗原可以是例如，肝炎抗原。在一個實施方案中，患者為人。在一個優選的實施方案中，抗CTLA-4抗體是人抗-CTLA4抗體。本發明的一種優選的人抗-CTLA4抗體是10D1，但是本發明的方法可以使用任何人CTLA-4抗體。在其它的實施方案中，抗CTLA-4抗體是重組抗體如嵌合的或人源化的(例如，CDR-嫁接的)抗CTLA-4抗體。
本發明的抗體也可以用于控制由感染性生物體，包括但不限于，細菌、分枝桿菌、螺旋菌、真菌、病毒、寄生生物和朊病毒，引起的致病性感染。抗體可以作為單一藥劑使用或者與一種或多種其它藥劑，如抗生素、疫苗、抗體、細胞因子、受體抑制劑和毒力阻斷劑(virulence blocking agent)組合使用。抗體可以以單劑量或多劑量形式使用。
本發明的治療方法(其被設計以刺激再次或記憶免疫應答)可能尤其有利于治療可能有高度危險出現疾病并發癥的免疫抑制患者。這些免疫抑制患者的實例包括逆轉錄病毒感染，包括HIV感染的患者、先生性、遺傳性自身免疫或藥理學誘導的免疫缺陷患者、包括糖尿病和老年患者，以及具有傷口、創傷或嚴重燒傷的患者。
通過施用抗CTLA4抗體刺激免疫應答的本發明方法也可以用于急性接觸抗原的情況(如暴露于生物恐怖劑，如炭疽或天花，其中被暴露的患者已經事先接種過抗該物質的疫苗)或代替加強免疫接種。
本發明也闡明了患者可以用抗CTLA4進行長期治療而不會出現有害的副作用如非特異性T細胞活化，如自身免疫。
抗CTLA4的血漿濃度可以保持在檢測水平以上至少1、2、3、4或5個月或者更長，而不會出現不期望的免疫學結果。在一個優選的實施方案中，本發明提供了誘導或增強患者中抗原免疫應答的方法，包括對患者施用抗CTLA4抗體使抗CTLA4抗體的血漿濃度保持在可檢測水平以上至少1、2、3、4或5個月。在一個實施方案中，抗CTLA4抗體被多次施用從而使得血漿濃度保持在可檢測水平之上至少1、2、3、4或5個月。在另一個實施方案中，抗CTLA4抗體以一定量和時間間隔施用從而患者中抗CTLA4抗體的血漿濃度持續至少1、2、3、4或5個月為至少2μg/ml。在另一個實施方案中，施用抗CTLA4抗體的量和時間間隔使得患者體內抗CTLA4抗體的血漿濃度為至少5μg/ml并持續至少1、2、3、4或5個月。在另一個實施方案中，抗CTLA4抗體的施用量和施用時間間隔使得患者中抗CTLA4抗體的血漿濃度為至少10μg/ml并持續至少1、2、3、4或5個月。在一個優選的實施方案中，被長期用抗CTLA4抗體治療的患者患有惡性腫瘤，如黑素瘤或前列腺癌。在另一個優選的實施方案中，除了利用抗CTLA4抗體治療外患者已經，或者正在接受疫苗治療。
本發明的另一方面涉及使用與細胞毒性劑相連的抗CTLA4抗體的方法。細胞毒性劑的實例包括細胞毒性藥物(例如，阿霉素、刺孢霉素，等等)和放射性同位素。這種與細胞毒性劑相連的抗CTLA4抗體可用于耗竭CTLA4+細胞。可被耗竭的CTLA4+細胞的實例包括CTLA4+惡性腫瘤和在T細胞介導的自身免疫疾病中表達CTLA4的抗原特異性活化T細胞。因此，在另一個實施方案中，本發明提供了治療患有CTLA4+T細胞惡性腫瘤的患者的方法，包括向患者施用與細胞毒性劑相連的抗CTLA4抗體從而治療患者的T細胞惡性腫瘤。在另一個實施方案中，本發明提供了治療患者的T細胞介導的自身免疫疾病的方法，包括向患者施用與細胞毒性劑相連的抗CTLA4抗體從而治療患者的T細胞介導的自身免疫疾病。
在一個優選的實施方案中，本發明的抗CTLA4抗體為在WO01/14424中公開的人單克隆抗體10D1。
本文引用的所有出版物、圖、GenBank Accession參考(序列)、ATCC保藏物、專利和專利申請為所有目的在這里特別地被并入作為參考，就像它們中的每一個被單獨表示并入一樣。
附圖簡述
圖1顯示了用黑素瘤疫苗和抗CTLA4抗體10D1治療的動物中黑素瘤-特異性抗體應答。通過流式細胞計數法測量了來自治療的動物的合并血漿中的抗體反應性。
圖2顯示了靈長類動物的持續給藥過程中抗CTLA4抗體10D1的藥物動力學圖譜。在第0、28、56、84和140天施用抗體并通過ELISA分析10D1的血漿濃度。顯示了6個治療的動物的平均值+/-SEM。
圖3顯示了在第0天用單劑10D1治療的前列腺癌患者中抗CTLA-4抗體10D1的藥物動力學圖譜。顯示了血漿濃度(μg/ml)。顯示了14個治療的患者的平均值+/-SEM。
圖4顯示了在第0天用抗CTLA4抗體輸注后各個時間點處兩名人類患者中前列腺特異性抗原(PSA)水平(ng/ml)。
發明詳述本發明提供了用于促進或加強再次免疫應答或記憶免疫應答以及用于進行更有效的癌癥治療的基于CTLA-4抗體的新方法。此外，公開了抗CTLA-4抗體的優選的血漿濃度。本發明的方法提供了治療癌癥、感染和對免疫應答有響應的其他疾病或病癥的手段。
本發明部分基于在癌癥的免疫治療中臨床試驗人序列抗CTLA-4抗體時得到的如下觀察結果。試驗證明了抗CTLA抗體在以前接觸過腫瘤抗原的受試者的治療中的有效性。此外，顯示了一次或多次給藥后抗CTLA4抗體的可檢測的血漿水平的持續性。
A.對先已用癌癥疫苗接種的患者的臨床試驗患有晚期黑素瘤或晚期卵巢癌的9名患者參與研究，其中他們靜脈內接受3mg/kg CTLA-4單克隆抗體10D1(Medarex)。患者以前接受過早期黑素瘤治療，這些治療包括免疫治療(三名患者接受α-干擾素，一名患者接受與QS-21混合的GM2神經節苷脂疫苗)、手術(4名患者)、放射(2名患者)、化療(3名患者)和蛋白酶體抑制劑(1名患者)。兩名卵巢癌患者以前接受過多次化療。此外，所有患者都參與I期疫苗研究。三個黑素瘤患者和兩個卵巢癌患者用經工程化而分泌GM-CSF的自體細胞免疫。這些患者之一還接受了MUC-1疫苗。三個黑素瘤患者用工程化后表達gp100和MART-1的自體樹突細胞免疫。一個黑素瘤患者接種gp100肽和高劑量IL-2。
以前用GM-CSF分泌性腫瘤細胞接種的三個黑素瘤患者在用10D1治療后具有廣泛的腫瘤壞死。從所有三個患者切除的組織的組織病理學顯示出嚴重破壞的腫瘤血管以及腫瘤附近的淋巴細胞和粒細胞浸潤。一個患者在用10D1治療后3月縱隔腫塊被完全切除。以前用黑素瘤抗原接種的四個患者在腫瘤附近出現淋巴細胞浸潤，但是沒有腫瘤壞死。卵巢癌患者沒有經歷切除或活組織檢查，但是兩個患者在10D1治療后CA-125(卵巢癌的腫瘤標記)血液水平都發生有利的改變。
B.對自然暴露于腫瘤抗原的患者的檢查具有IV期黑素瘤的14名患者在一個或多個治療周期中接受抗CTLA4抗體10D1，并用兩種gp100肽接種。所有患者以前都經歷過對原發性腫瘤的手術。六名患者以前進行過化療。11名患者以前進行過免疫治療。通過計算機軸向斷層造影(CT)和磁共振(MR)成像測量臨床應答。一名患者(其先前經歷過手術和化療)在5個治療周期后肺、腦和皮下腫瘤完全消退。另兩名患者是部分應答者。兩名患者是“混合型”非應答者，因為一些損害縮小而其他損害尺寸增加。因為沒有進行組織活檢，混合型非應答者中損害的變大可能不是由于癌癥引起。例如，一名患者(3號患者)的幾處肺損害出現消退但是縱隔淋巴結增大。來自肺的淋巴管將淋巴液排到縱隔淋巴結中(Schwartz，等，Principle of Surgery，1984，第4版，p.661)；淋巴結可以因淋巴結流域(drainage basin)內組織發炎而變大。可能3號患者是完全應答者，其淋巴結變大是由于炎癥而不是由于癌癥所致。
基于上面討論的結果，本發明提供了抗CTLA-4抗體的許多有利的用途。如在以前經歷過免疫或暴露的癌癥患者中所證實的，這些抗體提供了再次或記憶免疫刺激。從而，抗CTLA-4抗體可用作加強劑，其特別可以用于免疫受損的患者。免疫系統抑制可有許多原因導致，這些原因包括但不限于疾病(包括像HIV等免疫缺陷疾病)、衰老、增加的腫瘤負擔、癌癥治療(例如，化療和放療)，以及其他原因。因此，抗CTLA-4抗體治療適應于增強免疫受損個體的免疫力。
C.用CTLA-4抗體和黑素瘤疫苗對猴的試驗單獨用黑素瘤疫苗或者用黑素瘤疫苗與抗CTLA4抗體10D1在第0、28、56、84和140天處理恒河猴。抗CTLA4抗體和疫苗的組合使用比只使用疫苗導致顯著更大的抗黑素瘤細胞的抗體應答。此外，T細胞增殖研究表明用抗CTLA4抗體和疫苗治療導致CD8+和CD4+細胞的抗原特異性增殖。抗CTLA-4抗體的血漿水平在整個160天期間保持在可檢測水平之上。平均血漿濃度在6個月研究中保持高于20μg/ml。
該研究表明在靈長類動物中抗CTLA4抗體的長期給藥是安全的并且可檢測的血漿水平可以保持6個月以上。
D.用抗CTLA-4抗體對晚期黑素瘤患者的試驗患有晚期黑素瘤的17名患者被靜脈內以3mg/kg施用單劑抗CTLA4抗體10D1。9名患者以前進行過免疫治療，6名以前接受過放射治療，5名以前接受過化療。抗CTLA4抗體的血漿水平長達4個月保持在可檢測水平。在以前進行過免疫接種的患者中，2名患者有部分應答，包括三個軟組織腫塊消退和肺部腫塊減小大于50％。
該研究表明在單劑抗CTLA4抗體后人類患者中血漿水平可以保持高于可檢測水平長達4個月。此外，在以前接種疫苗的患者中見到的肺部腫塊的減小表明CTLA4抗體可激活針對腫瘤的預先存在的記憶應答。
E.用抗CTLA-4抗體對晚期前列腺癌患者的試驗14名患有晚期前列腺癌的患者被靜脈內以3.0mg/kg施用單劑人單克隆抗CTLA4抗體10D1。抗CTLA-4抗體的血漿水平存在長達4個月。觀察到前列腺特異抗原(PSA)的減少和癥狀減輕。除皮疹和搔癢癥(它們是可逆的)外，沒有不利的免疫影響。
在下面及實施例中更詳細地解釋本發明的這些和其他益處。
除非指出，術語“患者”或“受試者”可互換使用并且指哺乳動物如人類患者和非人靈長類動物，以及實驗動物如兔、大鼠和小鼠及其他動物。動物包括所有脊椎動物，例如，哺乳動物和非哺乳動物，如綿羊、狗、母牛、雞、兩棲動物，和爬行動物。
術語“治療”包括施用本發明的化合物或藥劑以預防或延緩疾病的癥狀、并發癥或生物化學標記的出現，減輕癥狀或阻止或抑制疾病、病癥或失調(例如，自身免疫疾病)的進一步發展。治療可以是預防性的(以預防或延緩疾病的發作，或預防其臨床或亞臨床癥狀的表現)或可以是治療性抑制或減輕疾病表現后的癥狀。
術語“晚期癌癥”指不再局限于原發性腫瘤位置的癌癥，或者根據美國癌癥聯合委員會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)定為III或IV期的癌癥。
通常，短語“良好耐受的”指健康狀況上沒有出現治療引起的并會影響治療決定的不利改變。
如此處所用的術語“淋巴細胞”具有本領域中的通常意義，指血液、淋巴和淋巴組織中存在的任何單個核、非吞噬性白細胞，即，B和T淋巴細胞。
短語“T淋巴細胞亞群”或“T細胞亞群”指以表達特定細胞表面標記為特征的T淋巴細胞或T細胞(見Barclay，A.N.等(eds.)，1997，TheLeukocyte Antigen Facts Book，第二版，Academic Press，倫敦，英國)。關于T細胞，術語“穩定”指T細胞亞群的頻率或百分數不隨著藥劑的施用過程或持續時間而變。
術語“細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4”、“CTLA-4”、“CTLA4”、“CTLA-4抗原”和“CD152”(見，例如，Murata(1999)Am.J.Pathol.155453-460)可互換使用，包括人CTLA-4的變體、同種型、物種同源物，和與CTLA-4具有至少一個共同表位的類似物(見，例如，Balzano(1992)Int.J.Cancer Suppl.728-32)。CTLA-4的全序列見GenBank記錄號L15006。
術語“表位”指能夠特異結合抗體的蛋白質決定簇。表位通常由分子的化學活性表面簇如氨基酸或糖側鏈組成并通常具有特定三維結構特征以及特定電荷特征。構象性和非構象性表位的區別在于存在變性溶劑時喪失與前者但不是與后者的結合。
完整“抗體”包括通過二硫鍵相互連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈。每條重鏈由重鏈可變區(此處簡寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區組成。重鏈恒定區由三個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(此處簡寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區組成。輕鏈恒定區由一個結構域CL組成。VH和VL區可進一步細分成叫做互補決定區(CDR)的高變區，其散布于叫做構架區(FR)的更保守的區域中。每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，從氨基端到羧基端以下面的順序排列FRl，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合域。抗體的恒定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，這些組織或因子包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(Clq)。術語抗體包括保持結合CTLA-4的能力的完整抗體的抗原結合部分。結合的實例包括(i)Fab片段——由VL、VH、CL、和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab’)2片段——含有在鉸鏈區通過二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單個臂的VL和VH結構域組成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341544-546)，其由VH結構域組成；和(vi)分離的互補決定區(CDR)。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由單獨的基因編碼，但是它們可以連接在一起——這可使用重組方法，通過合成的接頭使它們成為單個蛋白鏈而實現，其中VL和VH區配對形成單價分子(稱作單鏈Fv(scFv)；見，例如，Bird等(1988)Science 242423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883)。這種單鏈抗體被包括到術語“抗體”中。可通過重組技術或完整抗體的酶促或化學切割制備片段。
術語“人序列抗體”包括具有來自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恒定區(如果存在)的抗體。本發明的人序列抗體可包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機或定點誘變或通過體內體細胞突變導入的突變)。這種抗體可在非人轉基因動物中產生，即，如在PCT公開號WO01/14424和WO00/37504中所描述的。然而，術語“人序列抗體”，如此處所用的，不旨在包括如下抗體，在該抗體中來自另一哺乳動物物種(如小鼠)種系的CDR序列被嫁接到人構架序列上(即，人源化抗體)。
術語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指具有單分子組成的抗體分子制品。單克隆抗體組合物顯示出對特定表位的單一結合特異性和親和性。因此，術語“人單克隆抗體”指具有來自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恒定區(如果存在)的顯示出單一結合特異性的抗體。在一個實施方案中，人單克隆抗體通過雜交瘤產生，該雜交瘤包括與永生化細胞融合的B細胞，該B細胞來自轉基因非人動物，如轉基因小鼠，具有包含人重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組。
術語“多克隆抗體”指具有1種以上(兩種或多種)不同的人CTLA-4抗體的制品。這種制品含有結合多種不同表位的抗體。
CTLA-4抗體可結合人CTLA-4上的表位以抑制CTLA-4與人B7相應受體的相互作用。因為人CTLA-4與人B7的相互作用會轉導一種信號導致具有人CTLA-4受體的T細胞失活，所以對此相互作用的拮抗將有效誘導、提高或延長具有人CTLA-4受體的T細胞的活化，從而延長或提高免疫應答。優選的抗CTLA-4抗體在例如，美國專利號5,811,097、5,855,887、6,051,227、PCT公開號WO01/14424和WO00/37504；以及美國公開號2002/0039581A1中描述。適于在本發明中使用的這些和其他抗體可以根據本領域中熟知的方法和/或在此處引用的參考文獻中描述的方法制備。在優選的實施方案中，本發明中使用的抗CTLA-4抗體為“人抗體”——即，從人分離的抗體——或者它們為“人序列抗體”(定義如上)。例如，國際專利公開號WO01/14424描述了從用人抗體基因修飾的轉基因小鼠分離人序列抗CTLA-4抗體的方法。因此，這些抗體雖然分離自非人動物，但是具有相應于人抗體序列的氨基酸序列(包括恒定區和可變區序列)。一種尤其優選的抗體(其用于實施例中，下文)在此處稱作抗體10D1。該人序列抗體以前已經被描述過并且在例如，WO01/14424中被全面表征。
短語“免疫細胞應答”指免疫系統細胞對外部或內部刺激物(例如，抗原、細胞因子、趨化因子，和其他細胞)的應答，該應答在免疫細胞中產生生化變化，導致免疫細胞遷移、殺死靶細胞、吞噬作用、產生抗體及免疫應答的其他可溶性效應物，等等。
術語“T淋巴細胞應答”和“T淋巴細胞活性”在此處可互換使用，指依賴于T淋巴細胞的免疫應答組分(即，T淋巴細胞增殖和/或分化成輔助細胞、細胞毒性殺傷細胞或抑制性T淋巴細胞，輔助T淋巴細胞為B淋巴細胞提供導致或防止抗體產生的信號，細胞毒性T淋巴細胞殺傷特異靶細胞，以及釋放調節其他免疫細胞的功能的可溶性因子如細胞因子)。
術語“免疫應答”指淋巴細胞、抗原呈遞細胞、吞噬細胞、粒細胞，和上面的細胞或肝臟產生的可溶性大分子(包括抗體、細胞因子和補體)的協同作用，其導致選擇性損害、破壞、或消除侵入人體的病原體、感染病原體的細胞或組織、癌細胞、或者，對于自身免疫或病理炎癥而言，正常的人細胞或組織。
免疫應答的各組成要素可以體外通過本領域普通技術人員熟知的各種方法檢測。例如，(1)細胞毒性T淋巴細胞可與放射性標記的靶細胞孵育并且通過放射活性的釋放檢測這些靶細胞的裂解，(2)輔助T淋巴細胞可與抗原和抗原呈遞細胞孵育并通過標準方法測量細胞因子的合成和分泌(Windhagen A；等，1995，Immunity 2(4)373-80)，(3)抗原呈遞細胞可與完整蛋白抗原孵育并通過T淋巴細胞活化試驗或生物物理方法檢測抗原在MHC上的呈遞(Harding等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.，864230-4)，(4)肥大細胞可與和它們的Fc-ε受體交聯的試劑孵育并通過酶免疫分析測量組胺的釋放(Siraganian，等，1983，TIPS 4432-437)。
類似地，模式生物(例如，小鼠)或人類患者中的免疫應答產物也可以通過本領域中普通技術人員熟知的各種方法檢測。例如，(1)應答疫苗接種引起的抗體產生可容易地通過臨床實驗室中現今使用的標準方法，如ELISA檢測；(2)免疫細胞向炎癥部位的遷移可通過擦傷皮膚表面并安置無菌容器以捕獲擦傷部位上遷移的細胞來檢測(Peters等，1988，Blood 721310-5)；(3)應答有絲分裂原引起的外周血單個核細胞增殖或混合淋巴細胞反應可使用3H-胸苷測量；(4)PBMC中粒細胞、巨噬細胞和其他吞噬細胞的吞噬能力可通過將PMBC與標記的顆粒一起置于孔中來測量(Peters等，1988)；和(5)免疫系統細胞的分化可通過將PBMC用抗CD分子如CD4和CD8的抗體標記并測量表達這些標記物的PBMC的分數來確定。
為了方便起見，免疫應答通常在本發明中描述為“初次”或“再次”免疫應答。初次免疫應答(其也被描述為“保護性”免疫應答)指因初次接觸特定抗原(例如，最初“免疫作用”)而在個體中產生的免疫應答。這種免疫作用可以例如，由于天然接觸抗原引起(例如，因初次感染顯示或呈遞抗原的某種病原體引起)或由個體中某個腫瘤(例如，切除的腫瘤)的癌細胞呈遞的抗原引起。備選地，免疫作用也可以通過向個體接種含有抗原的疫苗而出現。例如，疫苗可以是抗特定病原體(例如，抗病毒、細菌或寄生蟲)的疫苗或者其可以是含有來自癌細胞的一種或多種抗原的癌癥疫苗。
初次免疫應答可隨著時間變弱或減弱并且甚至可能消失或者至少減弱至不能被檢測到。因此，本發明也涉及“再次”免疫應答，其在此處也被描述為“記憶免疫應答”。術語“再次免疫應答”指初次免疫應答已經產生后在個體中引起的免疫應答。從而，可以通過引發再次免疫應答以，例如增強已經變弱或減弱的現有免疫應答，或者使已經消失或者不再能被檢測到的先前免疫應答重新產生。可以通過施用來引起再次免疫應答的藥劑以后被稱為“加強劑”，因為該藥劑可以說是“加強”了初次免疫應答。
作為實例，但是不是限制，再次免疫應答可通過向個體再次導入引起初次免疫應答的抗原而產生(例如，通過重新施用疫苗)。然而，對抗原的再次免疫應答也可以通過施用可能不含有實際抗原的其他藥劑引起。例如，本發明提供了通過對個體施用抗CTLA-4抗體來加強再次免疫應答的方法。在這些方法中，實際抗原不需要與抗CTLA-4抗體一起施用，并且含有抗CTLA-4抗體的組合物也不必含有該抗原。再次或記憶免疫應答可以是體液(抗體)應答或細胞應答。再次或記憶體液應答在對抗原首次呈遞時產生的記憶性B細胞進行刺激時發生。遲發型超敏(DTH)反應是一種由CD4+細胞介導的細胞再次或記憶免疫應答。對抗原的首次暴露造成免疫系統被致敏，而再次暴露導致DTH。
如此處所用的，短語“細胞表面受體”包括能夠接收信號并跨細胞質膜傳送這種信號的分子和分子復合體。本發明的“細胞表面受體”的實例是T細胞受體(TCR)或CTLA-4的B7配體。
術語“非特異性T細胞活化”指不依賴于T細胞的抗原特異性而對T細胞的刺激。
如此處所用的，術語“效應細胞”指參與免疫應答的效應階段(與免疫系統的認知和活化階段相對的階段)的免疫細胞。示例性免疫細胞包括骨髓或淋巴來源的細胞，例如，淋巴細胞(例如，B細胞和T細胞，包括溶細胞性T細胞(CTL))、殺傷細胞、天然殺傷細胞、巨噬細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、多形核細胞、粒細胞、肥大細胞和嗜堿性粒細胞。效應細胞表達特異Fc受體并執行特定免疫功能。效應細胞可誘導依賴抗體的細胞介導的細胞毒性(ADCC)，例如，嗜中性粒細胞能夠誘導ADCC。例如，表達FcαR的單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞參與靶細胞的特異殺傷和向免疫系統的其他組分呈遞抗原，或者與呈遞抗原的細胞結合。效應細胞也可以吞噬靶抗原，靶細胞或微生物。
“靶細胞”指可被組合物(例如，本發明的人序列抗體或人單克隆抗體，本發明的雙特異性或多特異性分子)靶定的受試者(例如，人或動物)中的任何不想要的細胞。靶細胞可以是表達或過表達人CTLA-4的細胞。表達人CTLA-4的細胞可以包括腫瘤細胞，例如淋巴瘤。
本發明還包括修飾的抗體。術語“修飾的抗體”包括已經通過例如部分抗體的缺失、加入或置換修飾的抗體，如單克隆抗體、嵌合抗體，和人源化抗體。例如，可通過缺失恒定區并將其替代為旨在增加抗體的半衰期，例如血清半衰期、穩定性或親和性的恒定區來修飾抗體。
本發明的抗體綴合物可用于修飾給定的生物學應答或創造生物學應答(例如，募集效應細胞)。藥物部分不應理解為限于經典化學治療劑。例如，藥物部分可以是具有期望的生物學活性的蛋白質或多肽。這種蛋白質可包括，例如，酶活性毒素，或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒素A、假單胞菌外毒素、或白喉毒素；蛋白質，如腫瘤壞死因子或α干擾素；或生物反應調節物，如，淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細胞集落刺激因子(“G-CSF”)，或者其他生長因子。
綴合這種治療部分到抗體的技術是熟知的，見例如，Arnon等，″癌癥治療中用于藥物的免疫定向的單克隆抗體″，Monoclonal Antibodies AndCancer Therapy，Reisfeld等(編輯)，243-56頁(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，″藥物遞送抗體″，Controlled Drug Delivery(第二版)，Robinson等(編輯)，623-53頁(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“癌癥治療中細胞毒性劑的抗體載體綜述”，Monoclonal Antibodies′84Biological And Clinical Applications，Pinchera等(編輯)，475-506頁(1985)；“對癌癥治療中放射性標記抗體的治療性用途的分析、結果和前景展望”，Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(編輯)，303-16頁(Academic Press 1985)，和Thorpe等，“抗體-毒素綴合物的制備和細胞毒性性質”，Immunol.Rev.，62119-58(1982)。
癌癥治療通過抗體對CTLA-4的阻斷可增強患者體內對癌細胞的記憶或再次免疫應答。抗CTLA-4的抗體可以與免疫原性劑組合使用或單獨使用以刺激免疫，這些免疫原性劑如癌細胞、純化的腫瘤抗原(包括重組蛋白、肽和糖分子)、細胞和用編碼免疫刺激細胞因子和細胞表面抗原如B7的基因轉染的細胞(見，例如，Hurwitz，A.等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.1998；9510067-10071)。
當按照接種疫苗方案時CTLA-4阻斷是有效的。已經設計了許多抗腫瘤免疫接種的實驗策略(見Rosenberg，S.，2000，Development of CancerVaccines，ASCO Educational Book Spring60-62；Logothetis，C.，2000，ASCO Educational Book Spring300-302；Khayat，D.2000，ASCOEducational Book Spring414-428；Foon，K.2000，ASCO EducationalBook Spring730-738；還見Restifo，N.和Sznol，M.，Cancer Vaccines，Ch.61，pp.3023-3043，DeVita，V.等(編輯)，1997，CancerPrinciples andPractice of Oncology，第五版)。在這些策略之一中，使用自體或同種異體腫瘤細胞制備疫苗。當腫瘤細胞經轉導表達GM-CSF時這些細胞疫苗顯示出最有效。GM-CSF已經被證實為腫瘤接種中抗原呈遞的有力激活劑(Dranoff等Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.1993；903539-43)。
通過抗CTLA-4的阻斷作用加強GMCSF-修飾的腫瘤細胞疫苗可以提高許多實驗室腫瘤模型如乳腺癌(Hurwitz等，1998，如前引文)、原發性前列腺癌(Hurwitz等，Cancer Research 2000；602444-8)和黑素瘤(vanElsas等J.Exp.Med.1999，190355-66)中疫苗的功效。在這些實例中，已經使得非免疫原性腫瘤，如B16黑素瘤，變得易于被免疫系統破壞。腫瘤細胞疫苗也可以被修飾以表達其他免疫激活劑，如IL2，和共刺激分子，等等。
對各種腫瘤中基因表達和大規模基因表達模式的研究已經導致對所謂的“腫瘤特異性抗原”的定義(Rosenberg，Immunity 1999；10281-7)。在許多情況中，這些腫瘤特異性抗原為在腫瘤和腫瘤所來源的細胞中表達的分化抗原，例如黑素細胞抗原gp100、MAGE抗原、Trp-2。更重要的，這些抗原中的許多可能被證實是宿主中發現的腫瘤特異性T細胞的靶標。CTLA-4阻斷劑可作為加強劑與基于發現在腫瘤中表達的蛋白和/或肽的重組版本的疫苗聯合使用，以加強對這些蛋白的再次或記憶免疫應答。這些蛋白通常被免疫系統認作自身抗原并因此對免疫系統產生耐受。腫瘤抗原也可以包括蛋白質端粒酶，該酶是染色體端粒合成所必需的并且在超過85％的人類癌癥中和僅僅有限數目的體細胞組織中表達(Kim等，Science1994；2662011-2013)。這些體細胞組織可通過各種方法躲避免疫攻擊。腫瘤抗原也可以是因改變蛋白質序列或在兩種不相關序列間造成融合蛋白(如，費城染色體中的bcr-abl)的體細胞突變而在癌細胞中表達的“新生抗原”，或者是來自B細胞腫瘤的獨特型。其他腫瘤疫苗可包括來自人類癌癥所涉及的病毒的蛋白，這些病毒如人乳頭瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波西皰疹肉瘤病毒(KHSV)。可以與CTLA-4阻斷劑聯合使用的另一種腫瘤特異性抗原為從腫瘤組織自身分離的純化的熱休克蛋白(HSP)。這些熱休克蛋白含有來自腫瘤細胞的蛋白質的片段，并且這些HSP在向抗原呈遞細胞遞送以引起腫瘤免疫方面非常有效(Suot和Srivastava，Science 1995；2691585-1588；Tamura等，Science 1997，278117-120)。
樹突細胞(DC)是可用于引發抗原特異性應答的有力抗原呈遞細胞。DC可離體產生并可以用各種蛋白質和肽抗原以及腫瘤細胞提取物加載(Nestle等，Nature Medicine1998；4328-332)。DC也可以通過遺傳方法轉導以表達這些腫瘤抗原。為了免疫目的，DC也已經直接與腫瘤細胞融合(Kugler等，Nature Medicine 2000；6332-336)。作為接種疫苗的一種方法，可通過CTLA-4阻斷有效地加強DC免疫以激活更強的抗腫瘤應答。
可以與CTLA-4阻斷劑組合的另一類黑素瘤疫苗是從黑素瘤細胞系裂解物及免疫學佐劑制備的疫苗，如MELACINE疫苗——來自兩種人黑素瘤細胞系的裂解物加DETOXTM免疫學佐劑的混合物。疫苗治療可用抗CTLA4加強，并使用或不使用額外的化療治療。
CTLA-4阻斷也可用于加強通過標準癌癥治療誘導的免疫。在這些情況中，可能可以減小施用的化療劑的劑量(Mokyr等，Cancer Research，1998；585301-5304)。CTLA-4阻斷劑和化療組合使用的科學基礎是細胞死亡(其是多數化療化合物的細胞毒性作用的結果)將導致抗原呈遞途徑中腫瘤抗原的水平增加。從而，CTLA-4可增強由化療釋放的腫瘤細胞引發的免疫應答。此外，CTLA-4的免疫刺激活性可用于克服化療的免疫抑制效果。可與抗CTLA-4治療組合的化療劑的實例包括，但不限于，阿地白介素、六甲聚腈胺、阿米斯丁、天冬酰胺酶、博來霉素、卡培他濱、卡鉑、卡氮芥、克拉屈濱、西沙比利、順氯氨鉑、環磷酰胺、阿糖胞苷、達卡巴嗪(DTIC)、放線菌素D、多西紫杉、阿霉素、屈大麻酚、重組人類紅細胞生成素α、依托泊苷、非格司亭、氟達拉濱、氟尿嘧啶、吉西他濱、格雷西隆、羥基脲、去甲柔毛霉素、異環磷酰胺、α干擾素、伊立替康、達克普隆、左旋四咪唑、甲酰四氫葉酸、甲地孕酮、巰基乙磺酸鈉、氨甲蝶呤、甲氧氯普胺、絲裂霉素、鄰氯苯對氯苯二氯乙烷、二羥蒽二酮、奧美拉唑、奧丹西隆、紫杉醇(泰索)、匹魯卡品、甲哌氯丙嗪(prochloroperazine)、利妥希瑪、他莫西芬、紅豆杉醇、鹽酸托撲替堪、司徒曼布、長春堿、長春新堿和去甲長春花堿。對于前列腺癌治療，可與抗CTLA-4組合的優選的化療劑是紫杉醇(Taxol)。對于黑素瘤癌癥治療，可與抗CTLA-4組合的優選的化療劑是達卡巴嗪(DTIC)。
可通過細胞死亡來致敏免疫系統的其他組合治療為放射、手術和激素剝奪(hormone deprivation)(Kwon，E.等Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.1999；96(26)15074-9)。這些方案均在宿主中造成腫瘤抗原來源。例如，手術時對腫瘤的任何操作都可以極大地增加血液中的癌細胞數目(Schwartz，等，Principle of Surgery 1984.第四版，338頁)。血管生成抑制劑也可以與CTLA-4阻斷劑組合。血管生成的抑制導致腫瘤細胞死亡，而這可使腫瘤抗原流入宿主抗原呈遞途徑。所有這些導致腫瘤釋放和可以被CTLA-4阻斷加強的可能的免疫系統致敏。
感染性疾病本發明的其他方法用于治療曾暴露于特定毒素或病原體的患者。類似于如上討論的本發明方法在腫瘤中的應用，抗體介導的CTLA-4阻斷可單獨使用，或者作為佐劑與疫苗組合，以刺激對病原體、毒素和自身抗原的再次或記憶免疫應答。CTLA-4阻斷已經顯示出在巴西日本圓線蟲(Nippostrongylus brasiliensis)(McCoy，K.等(1997)186(2)；183-187)和杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)(Murphy，M.等(1988)J.Immunol.1614153-4160)感染的急性期有效。該治療方法對其尤其有用的病原體的實例包括現今對其沒有有效疫苗的病原體，或常規疫苗對其不完全有效的病原體。這些病原體包括，但不限于HIV、肝炎病毒(A、B、&C)、流感病毒、皰疹病毒、賈第蟲、瘧原蟲、利什曼原蟲、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)。CTLA-4阻斷尤其可以用于加強針對諸如HIV等因素導致的已建立感染的免疫性，這些因素在感染過程中呈現變化的抗原。這些新的表位在抗人CTLA-4施用時被識別為外來的，從而激起不會被通過CTLA-4的負信號抑制的強烈T細胞應答。
可通過本發明方法治療的導致感染的病原性病毒的一些實例包括肝炎病毒(A、B或C)、皰疹病毒(例如，VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II、和CMV、Epstein Barr病毒)、腺病毒、流感病毒、黃病毒、艾可病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、cornovirus、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、細小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革熱病毒、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和蟲媒腦炎病毒。
可通過本發明的方法治療的導致感染的病原性細菌的一些實例包括衣原體、立克次氏體細菌、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌、Conococci和克雷白氏桿菌、變形桿菌、沙雷氏菌、假單胞菌、軍團菌、白喉菌、沙門氏菌、芽孢桿菌、霍亂菌、破傷風菌、肉毒桿菌、炭疽桿菌、鼠疫細菌、鉤端螺旋體、和Lyme氏疏螺旋體病細菌。
可通過本發明的方法治療的導致感染的病原性真菌的一些實例包括假絲酵母(Candida)(白假絲酵母(C.albicans)、克魯斯氏假絲酵母(C.krusei)、光滑假絲酵母(C.glabrata)、熱帶假絲酵母(C.tropicalis)、等)、新型隱球酵母(Ctyptococcus neoformans)、曲霉(Aspergillus)(煙曲霉(A.fumigatus)、黑曲霉(A.niger)、等)、毛霉菌目(Mucorales)(毛霉((Mucor)、犁頭霉(Absidia)、根霉(Rhizophus))、Sporothrixschenkii、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢菌(Coccidioides immitis)和英膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)。
可通過本發明的方法治療的導致感染的病原性寄生蟲的一些實例包括溶組織內阿米巴(Entamoebahistolytica)、結腸小袋蟲(Balantidium coli)、福氏耐格里阿米巴(Naegleria fowleri)、棘阿米巴屬種(Acanthamoebasp.)、蘭伯賈第蟲(Giardia lambia)、隱孢子蟲屬種(Cryptosporidiumsp.)、卡氏肺孢子蟲(Pneumocystis carinii)、間日瘧原蟲(Plasmodiumvivax)、微小巴貝蟲(Babesia microti)、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)、鼠弓形體(Toxoplasma gondi)、巴西日本圓線蟲(Nippostrongylusbrasiliensis)。
促進有益的“自身免疫”反應抗CTLA-4抗體引起和增大自身免疫反應的能力已經在許多實驗系統中記載(EAE-實驗室自身免疫腦脊髓炎MS的一種鼠模型(Perrin等，JImmunol 1996；1571333-1336)；糖尿病(Luhder等，1998，如前引文)。實際上，通過使用腫瘤細胞和肽疫苗誘導抗腫瘤應答揭示了許多抗腫瘤應答涉及抗自身反應(在抗CTLA-4+GM-CSF修飾的B16黑素瘤中觀察到的褪色(Van Elsas等，如前引文)；在Trp-2接種的小鼠中的褪色(Overwijk等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1999 962982-2987)；TRAMP腫瘤細胞疫苗引起的自身免疫前列腺炎(Hurwitz 2000，如前引文)，在人臨床試驗中觀察到的黑素瘤肽抗原接種和白斑(Rosenberg和White，J ImmunotherEmphasis Tumor Immunol 1996；1981-4)。
因此，可以考慮使用抗CTLA-4加強作用與各種自身蛋白聯合以設計接種方案從而有效產生抗這些自身蛋白的免疫應答用于治療疾病。例如，阿爾茨海默氏病涉及在腦中以淀粉樣沉積物形式不適當積累Aβ肽；抗淀粉狀蛋白的抗體應答能夠清除這些淀粉樣沉積物(Schenk等，Nature 1999；400173-177)。
其他自身蛋白也可用作靶標，如IgE(用于治療過敏和哮喘)，TNF(用于治療類風濕性關節炎)。最后，可通過使用抗CTLA-4抗體誘導針對各種激素的抗體應答。對生殖激素的中和抗體應答可用于避孕。對特定腫瘤生長所需的激素和其他可溶性因子的中和性抗體應答也可以被考慮作為可能的免疫接種目標。
與上述使用抗CTLA-4抗體的方法相類似的方法可用于誘導治療性自身免疫應答以治療患者體內其他自身抗原，如淀粉樣沉積物，包括阿爾茨海默氏病中的Aβ、細胞因子如TNFα和IgE的不適當積累。
實施例本發明也通過下面的實施例進行描述。然而，本說明書中這些和其他實施例的使用僅僅是闡明性的而決不是對本發明或任何示例性術語的范圍和意義的限制。同樣，本發明不被此處描述的任何特定優選的實施方案所限制。實際上，本發明的許多修改和變化在本領域技術人員讀過本說明書后是顯而易見的，并且可以實施這些修改和變化而不背離本發明的精神和范圍。因此本發明僅僅被所附權利要求以及這些權利要求的等價方案的完整范圍所限制。
實施例1抗CTLA-4治療增強恒河猴中對黑素瘤細胞疫苗的再次抗體和T細胞應答在恒河猴(得自Primate Products，Miami，Florida)中檢查本發明的人抗CTLA-4抗體增強對黑素瘤細胞疫苗的抗體和T細胞應答的能力。每組6只猴子(3只雄性，3只雌性)的試驗組用1)單獨的黑素瘤細胞疫苗(SK-mel-3——經轉染表達GM-CSF的人黑素瘤腫瘤細胞系)或2)SK-mel-3和在WO01/14424中描述的抗CTLA-4抗體10D1處理。完整細胞疫苗將允許在該動物模型中研究針對各種正常組織的自身免疫反應，盡管此細胞疫苗來源于人。
為了制備疫苗，使SK-mel細胞生長到匯合并收獲。將細胞用絲裂霉素C處理，洗滌幾次并以1×107/ml重懸于鹽水中。以體積1.3ml/kg以10mg/kg劑量靜脈內施用抗體。SK-mel-3細胞以固定量(5×106個細胞/只動物以0.5ml/只動物)皮下施用。針對每種疫苗制劑檢驗內毒素(＜2EU/ml)和48小時后的GM-CSF的產生(2-8ng/ml/106個細胞)。在第0、28、56、84和140天施用適宜抗體和/或疫苗。在第13、41、69和97天使用細胞流式計數法評價對黑素瘤細胞疫苗的抗體應答。猴子的健康狀況每周兩次評價并每周記錄體重。
血液學、藥物動力學分析和功能性分析在研究開始前進行并在整個研究中周期性地進行。完整的宏觀和微觀病理學檢查在第167天進行。
檢查用黑素瘤疫苗和抗CTLA-4抗體處理的動物中抗體應答的特異性。在處理的第41天從用SK-mel-3疫苗和mAb 10D1處理的6只恒河猴得到血漿并合并。將血漿以1∶1000稀釋并通過細胞流式計數法檢測對各種黑素瘤和非黑素瘤細胞系的反應性。結果如圖1所示，其表明猴子中的抗體應答對人黑素瘤細胞系比對人非黑素瘤細胞系和非人細胞系顯示出更大的特異性。
在第140天使用額外劑量后評價長期給藥對用抗體和/和疫苗治療的猴子的影響。在研究過程中直到第160天在各個時間點用重組CTLA-4通過ELISA監控抗CTLA-4抗體的血漿濃度。相對于標準曲線分析樣品稀釋液，確定10D1血漿濃度。在長期給藥過程中10D1的血漿濃度的數據如圖2所示，其中給出了6個治療的動物的平均+/-SEM。結果表明抗CTLA-4抗體的血漿水平在整個160天的期間保持在可檢測的水平之上，提示在整個治療期間都保持了CTLA4阻斷。被處理的猴子中mAb 10D1的平均血漿濃度在輸注后那天達到175到315μg/ml的峰值，并在6個月研究中保持高于20μg/ml。臨床化學、籠邊觀察(Cage-side observation)和完整的組織學分析沒有揭示與抗體或疫苗施用相關的任何顯著變化。長期給藥除了在兩只猴子的疫苗注射部位導致輕微刺激外沒有導致治療相關的病理，盡管CTLA-4阻斷具有建立自身反應性抗黑素細胞應答的潛在能力。這些猴沒有出現針對10D1 mAb的可檢測的抗體應答，并且在研究持繼期中保持高水平活性循環抗體。而且，該抗CTLA-4抗體的長期給藥與治療的功效相關并且未伴隨有害副作用(例如非特異性T細胞活化)。從而，本實驗闡明靈長類動物可有效地用抗CTLA-4抗體長期治療從而使血漿濃度保持在可檢測水平之上至少1、2、3、4或5個月或甚至更長時間而沒有嚴重副作用。
實施例2從人類遲發型超敏反應(DHT)實驗得到的抗原特異性T細胞增殖證據具有切除的III期(2名患者)或IV期(17名患者)黑素瘤的19名患者接受CTLA-4抗體10D1的遞增給藥(0.3，1和3mg/kg)，并注射gp100/酪氨酸酶/MART-1肽疫苗和不完全弗氏佐劑。酪氨酸酶368-376(370D)、MART-126-35(27L)和gp100 209-217(210M)肽都與野生型相比有一個氨基酸修飾以增加HLA結合。疫苗以1mg/劑/肽在12個月內施用8次。通過DTH反應性測量的免疫應答表明9名患者中4名對gp100應答，9名患者中的2名對MART-1應答。ELISPOT分析表明在使用新鮮CD8 T細胞試驗的16名患者中4名有免疫應答。
實施例3Mab 10D1黑素瘤的I期臨床試驗(MDXCTLA4-02)的結果MDXCTLA4-02是I期公開、多中心臨床試驗，用于在患有進行性、不可切除的惡性黑素瘤的17名患者中評價Mab 10D1的安全性和藥物動力學。中值年齡為59歲(范圍29-79)。9名患者以前曾接受過免疫治療，6名接受過放射，5名接受過化療。所有患者經90分鐘靜脈內接受單劑3mg/kg10D1，然后被跟蹤評價毒性、藥物動力學、循環T細胞活化和臨床結果。完成了所有輸注，僅僅有輕微的不利事件。7名患者出現輕微的、可逆的皮疹或搔癢。抗體的血漿水平持續1到4個月。活化的外周T細胞沒有顯著增加并且除了輕微皮疹沒有臨床自身免疫的跡象。兩名患者出現三個軟組織腫塊消褪和肺部腫塊減小超過50％的部分應答。此外，肺部腫塊減小超過50％的患者是以前用黑素瘤疫苗治療的患者，這提示抗CTLA-4抗體治療能夠活化對此腫瘤的預先存在的記憶應答。該研究的結果表明抗CTLA-4治療具有良好耐受性以及明顯的免疫學和抗腫瘤活性跡象。
抗體治療后在各個時間點通過流式細胞計數法分析用10D1治療的患者中的淋巴細胞亞群。結果總結在下面的表1中。
表1在用3.0mg/Kg MAb 10D1治療的黑素瘤癌癥受試者中淋巴細胞亞群的流式細胞計數法分析
類似于在前列腺癌患者中觀察到的結果(見下面的實施例6)，在黑素瘤研究中的結果表明10D1治療導致CD4/HLA-DR+亞群隨時間大約增加50％。其他淋巴細胞亞群隨時間保持基本恒定。如上所述，當評價抗CTLA4抗體時抗CTLA4抗體治療隨時間增加CD4/HLA-DR+亞群的能力可用作選擇性特征(即，可評價一組抗CTLA4抗體增加CD4/HLA-DR+亞群的能力并且可以選擇能夠隨時間增加該亞群的抗CTLA-4抗體)。此外，可以在用抗CTLA-4處理的受試者中隨時間監控淋巴細胞亞群，尤其是CD4/HLA-DR+亞群，作為抗體有效性的一個標記。
實施例4在先已免疫接種的黑素瘤和卵巢癌患者中進行抗CTLA-4抗體阻斷的人類研究對9名以前接受過免疫的晚期癌癥患者施用抗CTLA-4抗體10D1。患者1-6通過I期臨床MDXCTLA4-02入選，其合格標準為手術不可切除的III期或IV期黑素瘤、疾病發展、至少12周的預期壽命、足夠的終器功能、穩定的止痛治療，和至少60％的卡爾諾夫斯基活動狀況。患者如果患有另一種惡性腫瘤(除了治療的非黑素瘤皮膚癌或表面膀胱癌外)、自身免疫疾病、活性感染、卡那霉素超敏反應；或者如果使用過皮質類固醇，那么他們將被排除。患者7-9通過用于患有轉移性黑素瘤、轉移性卵巢癌、轉移性非小細胞肺癌或急性髓性白血病的患者的I期試驗而入選。
4名患者以前曾進行過早期黑素瘤治療(3名患者接受α干擾素，一名患者接受與QS-21混合的GM2神經節苷脂疫苗，一名患者接受放療)。對轉移性黑素瘤的以前的非免疫治療包括手術(4名患者)、放射(2名患者)、化療(3名患者)和蛋白酶體抑制劑(一名患者)。兩名卵巢癌患者在研究前整個3到4年中接受過對復發疾病的多次化療。
所有患者在進入本研究前參加過對轉移性疾病的I期疫苗研究。三名黑素瘤和兩名卵巢癌患者用輻射過的自體腫瘤細胞免疫，該細胞通過腺病毒介導的基因轉移被改造而分泌GM-CSF。這些患者之一(8號患者)還接受了MUC-1疫苗。3名黑素瘤患者用通過腺病毒介導的基因轉移而被工程化以表達gp100和MART-1的自體樹突細胞免疫。1名黑素瘤患者用修飾的gp100肽和高劑量白介素-2接種。
最初，以10ml生理鹽水中的0.2mg測試劑量在10分鐘內靜脈內施用10D1以鑒定潛在的超敏反應。然后在90分鐘內靜脈內遞送剩余的3mg/kg10D1劑量。抗體施用后，患者經歷臨床、實驗室和射線照片評估，每天都進行，連續3天，然后每周進行，連續4周，然后是每月進行。
1名患者具有急性超敏反應，表現為輸注過程中輕微的低血壓和惡心。該反應容易地被抗組胺所控制并且輸注平安地完成。5名患者在輸注后持續2到7天出現短暫的I/II級全身性癥狀，包括肌痛、關節痛、厭食、疲勞、鼻塞和咳嗽。1名患者持續幾個月出現間歇復發的癥狀。1名患者表現出短暫的III級肝功能異常。
以前用輻射過的自體GM-CSF分泌性腫瘤細胞接種的三名黑素瘤患者在用10D1治療后出現廣泛腫瘤壞死。1號患者在入選本研究時具有中樞神經系統、肺、腹部和軟組織轉移瘤。10D1施用后1個月，1號患者的神經學狀況顯示出臨床改變，并且皮下損傷劇烈發炎。1號患者6天后死亡。尸體解剖時，注意到腦、硬膜外和內臟轉移瘤顯著的出血性腫瘤壞死。組織病理學檢查顯示伴隨著出血的廣泛腫瘤破壞(至少90％)。腫瘤血管被嚴重破壞，導致廣泛的局部缺血性壞死。在每個損傷中剩余邊緣存活的腫瘤細胞，伴隨著粒細胞和淋巴細胞反應。
2號患者在10D1輸注后1個月開始出現復發的II級全身性癥狀。縱隔損傷的活組織檢查顯示具有淋巴細胞和粒細胞浸潤的廣泛腫瘤壞死。免疫組織化學表明存在CD8+和CD4+T細胞以及產生免疫球蛋白的CD20+B淋巴細胞。縱隔損傷在2個月后被完全切除。對損傷的病理學分析表明密集的纖維樣變性、廣泛的壞死和正在進行的淋巴細胞和粒細胞應答。也觀察到以堵塞的血管壁中周圍淋巴浸潤為特征的血管病。腫瘤壞死和血管損傷在空間上相關。
7號患者在10D1輸注后3周在大的皮下損傷中發生炎癥。該損傷在輸注后2個月被切除。對該損傷的病理學檢查表明廣泛的腫瘤壞死和纖維樣變性、顯著的血管病和淋巴細胞與粒細胞浸潤。
在以前用限定的黑素瘤抗原免疫的4名黑素瘤患者中觀察到較不顯著的抗腫瘤效果。3號患者在輸注后7個月切除正擴大的縱隔損傷。病理學分析顯示無腫瘤壞死的密集淋巴細胞浸潤。免疫組織化學表明存在CD8+細胞，但是無CD4+和CD20+細胞。4號患者具有類似的CD4+細胞浸潤但是在淋巴結轉移瘤中沒有腫瘤壞死，轉移瘤在抗體輸注后2個月被切除。5號患者在皮下損傷中沒有出現淋巴浸潤和腫瘤壞死，該損傷在抗體輸注后2個月被切除。6號患者沒有進行活組織檢查，他的腫瘤繼續發展。
抗體輸注導致2名卵巢癌患者中CA-125水平的變化。CA-125從卵巢癌細胞的表面脫落并且是疾病狀態的有用標記(Jacobs，I.(1994)Gyn.Oncol.55S22-27)。對于8號患者，從抗體輸注后2個月開始，CA-125值減少43％(230到132)。該應答沒有保持但是10D1的第二次輸注使CA-125水平穩定了2個月。9號患者在抗體輸注后1個月具有穩定的CA-125值，伴隨著腹水減少。9號患者在輸注前具有快速上升的CA-125。
在4名患者中注意到持續1-2個月的低效價自身抗體(抗核抗體、抗甲狀腺球蛋白抗體、類風濕因子)。沒有自身免疫疾病的臨床跡象。
所有黑素瘤患者在抗體輸注后3天到3周之間在軀干和四肢上出現無癥狀I級網狀和紅斑狀皮疹。7名患者進行皮膚活檢。活檢的7名患者中的5名在表面真皮中有延伸到表皮內的顯著的血管周圍T細胞浸潤。與垂死的黑素細胞并列出現CD4+和CD8+T細胞。沒有臨床上明顯的白斑。在1名患者中注意到輕度的視網膜病灶性色素減退，但是沒有影響視敏度。一名卵巢癌患者在輸注后2周在臉和軀干上發生紅斑皮疹。皮膚活檢表明表面真皮中血管周的T細胞浸潤但是無針對黑素細胞的反應性。
10D1誘導循環性嗜中性粒細胞的顯著增加，并且嗜中性粒細胞浸潤和腫瘤壞死相關。
結果表明單劑10D1抗CTLA-4抗體輸注可以具有顯著的抗腫瘤效果并且可被安全地施用于人類患者。低效價自身抗體的產生表明該治療可以，至少部分地，損害系統耐受性，但是沒有觀察到自身免疫疾病的臨床跡象。
實施例5對患有黑素瘤的患者施用抗CTLA-4抗體10D1和肽疫苗的研究具有進行性IV期黑素瘤的14名患者接受抗CTLA-4抗體10D1，并用兩種HLA-A*0201-限制性gp100肽進行免疫接種治療。患者的特征總結在下面的表2中。
表2
1C＝化療，I＝免疫治療，R＝放療，S＝手術。
2一個治療周期由CTLA-4抗體的一次輸注和用gp100209-217(210M)和gp100280-288(288V)肽的一次接種組成。
3NR＝無應答，PR＝部分應答，CR＝完全應答。
4ANA＝抗核抗體。
所有患者都是卡爾諾夫斯基活動狀況≥60％的HLA*0201+。6名患者有內臟轉移瘤。患者沒有自身免疫或免疫缺陷疾病的跡象。所有患者以前都對他們的原發性損傷進行過手術。6名患者先前進行過化療。11名患者先前進行過免疫治療，包括α干擾素(患者2、5-8、10、12和13)、低劑量IL-2(患者2、5和13)、高劑量靜脈內IL-2(患者4、7和8)、全細胞黑素瘤疫苗(患者1、2和6)、NY-ESO-I肽疫苗(患者4和5)，和GM-CSF(患者9)。患者先前未用gp100免疫并且在治療前的3周內沒有進行系統性治療。
治療周期每3周進行一次，其組成為90分鐘靜脈內施用3mg/kg抗CTLA-4抗體10D1，接著在一肢皮下注射在不完全弗氏佐劑(IFA)中乳化的1mg gp100209-217(210M)肽(IMDQVPFSV)并在另一肢皮下注射IFA中乳化的1mg gp100280-288(288V)肽(YLEPGPVTV)(由國家癌癥研究所癌癥治療評價系統提供合成的肽)。患者在治療前和每兩個治療周期后3周采血。外周血單個核細胞(PBMC)通過Ficoll-Hypaque分離方法分離并用10％二甲亞砜在熱失活的人AB血清中冷藏之后在-180℃保藏備用。患者接受1到6個治療周期(表2)。
通過胸、腹和骨盆的計算機軸向X線斷層造影(CT)和腦的磁共振成像(MRI)評價臨床應答。這些成像研究在開始治療的4周內然后在每兩個治療周期后進行。按需要使用額外的放射學研究以估計疾病位置。計算治療前和治療后每個患者中腫瘤的最長直徑的總和(世界衛生組織RECIST標準)。部分應答定義為持續至少一個月所有可評價的轉移瘤的最長直徑的總和減少至少30％，但是小于100％，并且沒有新的或增大的腫瘤。完全應答定義為持續至少一個月所有可評價的轉移瘤的最長直徑的總和減少100％，并且沒有新的腫瘤。無應答定義為非部分或完全應答的應答。
評價患者的自身免疫應答。患者在治療前和開始治療后3個月接受眼科檢查。所有患者在甲狀腺球蛋白Ab、類風濕因子和抗核抗體的研究開始前進行陰性血清血液檢驗。在研究過程中每3周測量人抗人(抗獨特型)Ab、紅細胞沉降速率、抗核Ab、促甲狀腺素和游離T4水平。
使用標準ELISA用CTLA-4-Ig包被的微量滴定孔(R&D Systems，Minneapolis，Minnesota)確定10D1的血漿濃度。在板上孵育血漿樣品的稀釋液。結合的抗CTLA-4抗體用堿性磷酸酶標記的山羊抗人IgG F(ab)-特異性探針檢測，該探針用底物p-NPP顯影。
一種12天的體外致敏試驗(其比ELISPOT或四聚體分析(tetramerassay)更靈敏)被用于估計所有11名患者(可得到PBMC用于檢驗)的免疫學反應性(Rosenberg，S.A.等，Nat.Med.1998；4321-327)。將冷藏的PBMC融化并在含有10％熱失活的人AB血清和1μM天然gp100209-217或gp100280-288肽和300IU/ml IL-2的基于Iscove的完全培養基中培養。在培養開始后11到13天收獲細胞并將細胞與腫瘤細胞或肽脈沖的T2細胞共孵育過夜。上清液中釋放的γ干擾素(IFN-γ)使用商業ELISA測定法(Pierce-Endogen，Rockford，Illinois)測量。所有的11名患者在1到4個治療周期后顯示出成功的抗天然gp100209-217肽的免疫性。6名患者對天然gp100280-288肽具有成功的免疫性。
在Fc-受體封閉和用抗體(BD Biosciences，San Diego，California)或四聚體(Beckman Coulter Immunomics，San Diego，California)染色后進行流式細胞計數法分析。比較兩個治療周期之前和之后9名患者的PBMC上表面標記物的表達。HLA-DR(活化標記物)表達在治療后CD3+CD4+細胞(P＝0.0004；成對t-檢驗)和CD3+CD4+(可能CD8+)細胞(P＝0.04)上顯著增加。CD3+CD4+細胞在治療后也顯示出CD45RO(一種記憶細胞標記物)表達的顯著增加(P＝0.04)。表達CD69、CD25和CTLA-4的細胞群體的百分數沒有改變。
1、11和13號患者是應答者(表15)。1號患者在兩個治療周期后唯一的肺損傷縮小。13號患者在2個治療周期后唯一的肺損傷縮小且皮下損傷完全消除。11號患者有31個肺損傷、2個皮下損傷和1個腦損傷。腦損傷在2個治療周期后從0.5cm長大到約1.0cm。再3個治療周期后，11號患者的所有損傷均完全消除，包括腦損傷。
3號患者具有混合的應答，其中4個治療周期后一些肺損傷消除但是縱隔淋巴結變大。10號患者在2個治療周期后肺門損傷和幾個其他肺損傷顯著縮小，但是其他肺損傷變大。
I/II級不利事件包括腹瀉(3、5和14號患者)、皮膚皮疹(14號患者)、肺浸潤和輕微的胸膜炎性胸痛(4號患者)和白斑(2和6號患者)。
6名患者出現7種III/IV級不利事件，包括皮炎(1、2和13號患者)、結腸炎/小腸結腸炎(1和9號患者)、垂體炎(垂體發炎)(11號患者)和肝炎(12號患者)。在停止治療和施用維持性治療和/或類固醇治療后所有患者都恢復。沒有復發或隨后的自身免疫事件。
自身免疫篩檢血液檢查是正常的，除了5號和12號患者產生了抗核抗體。
該研究闡明了在接受抗CTLA-4抗體10D1和兩種肽疫苗的患者中轉移性黑素瘤退化的客觀證據。
實施例6在前列腺癌中的MAb 10D1的I期人類臨床試驗(MDXCTLA4-01)MDXCTLA4-01是在患有進行性、轉移性、激素不應性前列腺癌的患者中對抗細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4的單克隆抗體(抗CTLA-4)10D1(Mab 10D1)的公開研究。治療為單劑MAb 10D1，其通過輸注以3.0mg/kg的劑量靜脈內施用。組織學診斷為原發性前列腺腺癌和進行性轉移性前列腺瘤的患者在雄激素剝奪和至少一種全身性非激素治療后經篩選參與本研究。入選標準為進行性可測量的疾病、進行性PSA，PSA＞5ng/ml，睪酮＜50ng/dl，原發性生殖腺雄激素抑制，預期壽命＞12周和卡爾諾夫斯基活動狀況≥60％。
由于試驗中監控患者免疫狀態的重要性和監控抗CTLA-4抗體對T細胞活化的全身性影響的特定目標，該研究的進入標準包括CD4和CD8 T細胞的最小水平分別為≥500/ml和≥500/ml。然而，在研究的最初積累過程中觀察到盡管CD4和CD8 T細胞明顯存在，但是前列腺癌患者的T細胞數目顯著減少。基于上面的進入標準，許多患者在開時就被排除。所觀察的T細胞數目的明顯減少是在前列腺癌患者中以前未曾記錄的觀察資料，這可能和這些患者中涉及癌癥疫苗接種的治療相關。在這些觀測后，修改入選標準以包括CD4和CD8數分別為≥300/ml和≥200/ml的患者。
受試者經歷體檢、ECG、胸部X光照片、診斷成像和用于血液學、生化和免疫功能評價的血液采樣。每月進行電話訪問直到治療后6個月以收集和記錄疾病進展后關于部分不利事件的信息，這些不利事件包括自身免疫不利事件。監控PSA(下降、下降持續時間、上升、達到上升的時間)和疾病應答(完全的、部分的、穩定的、進行性的)。臨輸注前、輸注過程中、輸注后最多2個月評價MAb 10D1的血漿濃度。
具有HRPC的14名患者入選。中值年齡為69歲(范圍是56-79)。7名患者以前接受過化療。所有患者經90分鐘靜脈內接受單劑3mg/kg 10D1然后跟蹤以檢查毒性、藥物動力學、循環T細胞活化和臨床結果。所有輸注按計劃完成，只有輕微的輸注相關不利事件(AE)。應答口服類固醇治療有輕微的可逆皮疹或搔癢。沒有其他3級或更大的與10D1相關的AE。藥物動力學圖譜如圖3所示，該圖以μg/ml給出血漿濃度。顯示了關于14名患者(n＝14)的平均值+/-SEM。圖3中顯示的結果表明抗體的血漿水平長達3個月保持可檢測并且額外的監測發現血漿水平可持續甚至4個月保持可檢測。活化的外周T細胞沒有顯著增加，并且沒有觀察到臨床自身免疫。7名未進行過化療的患者中的2名患者具有持續3個月和5個月的PSA應答(一致標準(consensus criteria))，一名癥狀改善。其他患者經歷PSA曲線斜率的顯著變化。將患者再次用第二劑10D1(3mg/kg)治療并且在再次治療時，以前應答的患者再次經歷PSA減少而無顯著AE。該治療被良好耐受，并且有免疫學和抗腫瘤活性的明顯跡象。從而，該研究表明人類患者可以用抗CTLA-4抗體治療使抗體的血漿水平保持在可檢測水平之上1、2、3或甚至4個月而沒有有害副作用。
抗體治療后在各個時間點通過流式細胞計數法分析用10D1治療的患者中的淋巴細胞亞群。結果在表3中總結(術語以平均值+/-SEM給出)。
表3在用3.0mg/Kg MAb 10D1治療的前列腺癌癥受試者中淋巴細胞亞群的流式細胞分析。
結果表明10D1治療導致CD4/HLA-DR+亞群隨時間增加約50％。其他淋巴細胞亞群隨時間基本保持恒定。
為了評價是否施用MAb 10D1可誘導不期望的非特異性T細胞活化，針對下面每一標記通過流式細胞計數法分析來自前列腺癌受試者的外周血淋巴細胞CD4、CD8、CD25、CD44、CD69和HLA-DR。對于迄今處理的每個前列腺癌受試者，未觀察到治療過程中這些標記的頻率有顯著變化。該分析的一個實例在表4中給出，表4顯示了在兩名受試者中MAb10D1施用前、施用過程中和之后CD4、CD25、CD69陽性細胞和CD8、CD25、CD69陽性細胞的頻率。這些數據表明MAb 10D1不導致非特異性T細胞活化。
表4.在用3.0mg/Kg MAb 10D1治療的前列腺癌受試者中T細胞活化標記的流式細胞計數法分析。
來自MDXCTLA4-01臨床試驗的結果已經表明輸注是可耐受的，僅僅有微小反應。觀察到抗體的延長的血漿半衰期，抗體保留在血漿中約3到4個月。觀察到免疫效果的明顯證據而無顯著非特異性T細胞活化。在用抗CTLA-4抗體治療的前列腺癌患者中觀察到癥狀減輕和前列腺特異抗原(PSA)水平下降。PSA水平降低的代表性結果在圖4中顯示，其顯示了第0天輸注3mg/kg抗CTLA-4抗體后各個時間點兩名患者的PSA水平(ng/ml)(一個用實心圓代表，另一個通過空心圓代表)。結果表明PSA水平在抗體輸注后減少并在治療后持續受抑制約3-4個月，這和血漿中抗CTLA-4抗體的存在相關。也觀察到一些其他小的免疫效果，包括免疫介導的皮疹和搔癢、短暫的陽性自身抗體血清轉變、在黑素瘤患者中黑色素的色素改變和腫瘤位置的炎癥反應。除了皮疹和搔癢，所有潛在的不利免疫效果都是亞臨床的。總之，現在從抗CTLA-4抗體治療的人類臨床試驗得到的結果表明該抗體被良好耐受并在接受者中刺激免疫效應。
引用的參考文獻在本發明的說明書中引用和討論了許多參考文獻，包括專利、專利申請和各種出版物。對這些參考文獻的引用和/或討論僅僅用于闡明本發明的說明書而不是承認這些文獻是此處描述的發明的“現有技術”。在本說明書中引用和討論的所有參考文獻在此處被完整地并入作為參考，就像每篇參考文獻被單獨并入作為參考一樣。
權利要求
1.加強患者體內對抗原的再次免疫應答的方法，該方法包括向已經產生對該抗原的初次免疫應答的患者施用有效量的抗CTLA-4抗體，該抗CTLA-4抗體的有效量將足以增強與該抗原接觸時患者體內針對該抗原的再次免疫應答。
2.權利要求1的方法，其中抗原是癌抗原并且患者以前已經用抗癌疫苗治療過。
3.權利要求2的方法，其中癌抗原是黑素瘤抗原。
4.權利要求2的方法，其中癌是黑素瘤并且患者已經用含有NY-ESO-1肽的抗黑素瘤疫苗治療過。
5.權利要求2的方法，其中癌是黑素瘤并且抗癌疫苗含有選自gp100和MART-1的抗原。
6.權利要求2的方法，其中癌抗原是前列腺癌抗原。
7.權利要求1的方法，其還包括在施用抗CTLA-4抗體前檢測患者對所述抗原的免疫性，和僅僅向顯示出對所述抗原具有免疫性的患者施用抗CTLA-4抗體。
8.權利要求7的方法，其中抗原是癌抗原。
9.權利要求7的方法，其中抗原是病毒抗原。
10.權利要求7的方法，其中抗原是細菌抗原。
11.權利要求1的方法，其中抗原為病毒抗原并且患者以前已經用病毒疫苗治療過。
12.權利要求1的方法，其中病毒抗原為肝炎抗原。
13.權利要求1的方法，其中患者為人。
14.權利要求1的方法，其中抗CTLA-4抗體為人抗CTLA-4抗體。
15.權利要求1的方法，其中抗CTLA-4抗體為人源化抗CTLA-4抗體。
16.權利要求1的方法，其中抗CTLA-4抗體為人序列抗CTLA-4抗體。
17.誘導或增強患者體內對抗原的免疫應答的方法，其包括向患者施用抗CTLA-4抗體從而使抗CTLA-4抗體的血漿濃度保持在可檢測水平之上至少4個月。
18.權利要求17的方法，其中抗CTLA-4抗體被多次施用從而使得血漿濃度保持在可檢測水平之上至少4個月。
19.權利要求17的方法，其中抗CTLA-4抗體的施用量和施用時間間隔使患者中抗CTLA-4抗體的血漿濃度持續至少4個月為至少2μg/ml。
20.權利要求17的方法，其中抗CTLA-4抗體的施用量和施用時間間隔使患者中抗CTLA-4抗體的血漿濃度至少持續4個月為至少5μg/ml。
21.權利要求17的方法，其中抗CTLA-4抗體的施用量和施用時間間隔使患者中抗CTLA-4抗體的血漿濃度持續至少4個月為至少10μg/ml。
22.權利要求17的方法，其中患者為人。
23.權利要求17的方法，其中抗CTLA-4抗體為人抗CTLA-4抗體。
24.權利要求17的方法，其中抗CTLA-4抗體為人源化抗CTLA-4抗體。
25.權利要求17的方法，其中抗CTLA-4抗體為人序列抗CTLA-4抗體。
26.治療患者的CTLA4+T細胞惡性腫瘤的方法，包括向患者施用與細胞毒性劑連接的抗CTLA-4抗體從而治療患者的T細胞惡性腫瘤。
27.權利要求26的方法，其中細胞毒性劑為細胞毒性藥物。
28.權利要求26的方法，其中細胞毒性劑為放射性同位素。
29.治療患者的T細胞介導的自身免疫疾病的方法，包括向患者施用與細胞毒性劑連接的抗CTLA-4抗體從而治療患者的T細胞介導的自身免疫疾病。
30.權利要求29的方法，其中細胞毒性劑為細胞毒性藥物。
31.權利要求29的方法，其中細胞毒性劑為放射性同位素。
全文摘要
本發明提供了使用抗人CTLA－4的人序列抗體的治療方法。尤其是提供了癌癥治療方法。
文檔編號C07KGK1652820SQ03810859
公開日2005年8月10日 申請日期2003年4月11日 優先權日2002年4月12日
發明者T·戴維斯, T·克勒, R·格拉齊亞諾, A·J·科曼 申請人:梅達雷克斯公司