結締組織刺激肽的制作方法

專利名稱：結締組織刺激肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及結締組織的發育、維持和修復。更具體而言，本發明涉及鑒定能夠影響骨骼組織的形成和修復的新型肽，所述骨骼組織包括骨、軟骨及相關結締組織。本發明進一步涉及這些肽的藥物組合物，以及肽的治療和預防用途。
背景技術：
貫穿本申請，括號中引用的多種參考文獻是為了更充分地描述本發明所屬領域的現狀。這些參考文獻在此引作本發明內容的參考。
已經鑒定和表征了多種因子用于刺激骨/或軟骨形成和組織修復。這類因子的例子可包括，例如，鈣制劑(如碳酸鈣)，降血鈣素制劑，性激素(如雌激素，雌二醇)，前列腺素A1，雙膦酸，伊普黃酮(ipriflavones)，氟化合物(如氟化鈉)，維生素K，骨形態發生蛋白(BMPs)，成纖維細胞生長因子(FGF)，血小板衍生的生長因子(PDGF)，轉化生長因子(TGF-P)，胰島素樣生長因子1和2(IGF-1，IGF-2)，甲狀旁腺激素(PTH)，表皮生長因子(EGF)，白介素抑制因子(LIF)，成骨素(osteogenin)，和骨重吸收阻遏物，諸如雌激素，降血鈣素和二膦酸鹽(酯)。
U.S.5,169,837和5,403,825公開了抽提自哺乳動物骨的粗提取物的成骨因子和方法。成骨因子能夠誘導骨生長，如利用大鼠骨生長分析所確定。U.S.5,599,792公開了顯示骨刺激活性和降低的血管活性的甲狀旁腺激素(PTH)變體。
各種專利公開了骨形態發生蛋白(BMPs)和分離這些蛋白的方法。BMPs用于處理骨和軟骨缺陷。U.S.4,761,471公開了從去礦化的骨組織中純化混合的BMP組合物的方法；U.S.5,013,649公開了骨形態發生蛋白-3(BMP-3)；U.S.5,106,748公開了骨形態發生蛋白-5(BMP-5)；U.S.6,187,076公開了骨形態發生蛋白-6(BMP-6)；U.S.5,141,905公開了骨形態發生蛋白-7(BMP-7)；PCT公布No.WO91/18098公開了骨形態發生蛋白-8(BMP-8)；U.S.6,287,816公開了骨形態發生蛋白-9(BMP-9)；以及PCT公布No.WO94/26893公開了骨形態發生蛋白-10(BMP-10)。
U.S.6,352,973公開了用于治療骨病的骨刺激因子多肽。U.S.6,344,439公開了用于促進骨形成的因子，所述因子包括RGD結合序列。U.S.5,958,428公開了促進細胞與膠原蛋白結合的合成化合物。
雖然上述因子在骨修復方面的確具有通用性，但也存在多種缺點。例如，一些因子是相對非特異性的，因此在促進骨組織修復時不很有效。某些因子，諸如抽提的因子，還與免疫原性，感染性和/或疾病傳播的風險相關。從組織的粗提取物中抽提或經重組方法制備也是昂貴的，因此抵消了其市場生命力。此外，一些因子具有繼發性不期望的全身性或局部效應。最著名的事實是若干已知因子可導致異位骨形成。這種異常骨形成是高度不期望的，并且可能導致嚴重的藥并發癥。
因此，有需要提供新型肽，其對于有效影響結締組織的發育，維持和修復具有特異的體外、體內或離體用途。
發明概述本發明提供眾多新型肽及其類似物，它們在骨骼生物學中的影響力在于肽用來刺激骨、軟骨和相連結締組織在體外、體內、離體正常形成，以及用于組織工程應用。這些新型肽的功能性類似物對公開的肽序列含有一個或多個氨基酸添加、替換或缺失。
本發明所述的新型肽統稱為BCSP(“骨和軟骨刺激肽”)。
本發明還涉及編碼分離的結締組織促進肽及其類似物的核酸，含有所述核酸分子的表達載體，含有所述核酸分子的宿主細胞，這些肽的組合物以及編碼這種肽的核酸和針對這些肽的抗體。
新型肽及其編碼核酸可用于利用各種載體和方法所施用的組合物以促進諸如骨和軟骨的各種結締組織的形成和作用。照此，肽及其類似物可用于治療各種骨骼異常，所述異常包括但不限于由于創傷和/或疾病造成的骨和軟骨缺陷。
肽及其功能性類似物可用于各種體外、體內或離體應用和方法中。此外，肽及其功能性類似物在各種組織工程應用中也具有效用。
在一個實施方案中，本發明提供了治療組合物和方法，用于治療包括異常骨和/或軟骨形成的紊亂和由疾病造成的有關異常骨骼發育，關節炎和包括軟骨退化的關節變性病。治療組合物和方法也可用于治療創傷誘導的骨骼或軟骨損傷。
本發明一方面是一種肽，包括選自“PG”、“GP”、“PI”和“IG”的氨基酸基元并最多具有所述氨基酸基元上游和/或下游的10個氨基酸，其中基元中的“P”表示脯氨酸或羥脯氨酸，以及肽刺激骨，軟骨和相連結締組織的發育，維持和修復。
本發明的另一方面是一種肽，包含一個或多個“GP”和/或“PG”基元并包含多達共約20個氨基酸，其中基元中的“P”表示脯氨酸或羥脯氨酸以及肽誘導骨和軟骨細胞的活性，以致骨和軟骨組織得以發育，維持和/或修復。
本發明的肽刺激骨細胞、骨細胞前體和與其共有譜系的細胞的活性。同樣，本發明的肽刺激軟骨細胞、軟骨細胞前體和與其共有譜系的細胞的活性。照此，這些肽在刺激骨和軟骨形成中具有效用，如在體外、離體和/或體內中使用的一樣。
本發明的肽在長度上可少至3個氨基酸，并且更優選地，長度為至少4個氨基酸。肽可進一步包括一個或多個接頭，鈣結合基元和因子，并用于局部或全身性施用。
根據本發明的另一方面，提供了具有選自下列通式的肽(I)X-(P1)mGly(P2)n，(II)(P1)mGly(P2)n-Z，和(III)X-(P1)mGly(P2)n-Z；-其中P1和P2選自脯氨酸和羥脯氨酸，m＝0或1，n＝0或1，其中m和n獨立地選擇；-其中X選自亮氨酸、甘氨酸-亮氨酸、脯氨酸-異亮氨酸、甘氨酸-脯氨酸-異亮氨酸、天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸和脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸；以及-其中Z選自異亮氨酸、精氨酸、異亮氨酸-甘氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-羥脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸和精氨酸-甘氨酸-精氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸。
因此，在本發明的一方面中，提供了具有下列氨基酸序列和命名的肽BCSP1，其具有氨基酸序列NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；BCSP2，其具有氨基酸序列NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；BCSP3，其具有氨基酸序列NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；BCSP4，其具有氨基酸序列NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；BCSP5，其具有氨基酸序列NGLPGP(SEQ ID.NO.5)；BCSP6，其具有氨基酸序列LPGP(SEQ.ID.NO.6)；BCSP7，其具有氨基酸序列PGPIG(SEQ ID.NO.7)；BCSP8，其具有氨基酸序列NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；BCSP9，其具有氨基酸序列PGPIGP(SEQ ID.NO.9)；BCSP10，其具有氨基酸序列PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；BCSP11，其具有氨基酸序列GPIG(SEQ.ID.NO.11)；BCSP12，其具有氨基酸序列PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；BCSP13，其具有氨基酸序列GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；BCSP14，其具有氨基酸序列PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；BCSP15，其具有氨基酸序列PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；BCSP16，其具有氨基酸序列PGPI(SEQ.ID.NO.16)；BCSP17，其具有氨基酸序列GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；BCSP18，其具有氨基酸序列GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；BCSP19，其具有氨基酸序列GPIGP(SEQ.ID.NO.19)；以及BCSP20，其具有氨基酸序列PIGP(SEQ.ID.NO.20)。如本發明所用，P*用于表示羥脯氨酸。這些肽分別用于體外、體內和離體引發結締組織促進反應。
在另一方面，本發明提供了下列肽的功能性類似物用于體外、體內和離體引發結締組織促進反應BCSP1，BCSP2，BCSP3，BCSP4，BCSP5，BCSP6，BCSP7，BCSP8，BCSP9，BCSP10，BCSP11，BCSP12，BCSP13，BCSP14，BCSP15，BCSP16，BCSP17，BCSP18，BCSP19和BCSP20。
在另一方面，本發明提供了下列肽的模擬類似物用于體外、體內和離體引發結締組織促進反應BCSP1，BCSP2，BCSP3，BCSP4，BCSP5，BCSP6，BCSP7，BCSP8，BCSP9，BCSP10，BCSP11，BCSP12，BCSP13，BCSP14，BCSP15，BCSP16，BCSP17，BCSP18，BCSP19和BCSP20。
在本發明的進一步方面，提供了在哺乳動物，例如，人中用于刺激結締組織反應的組合物，所述組合物包括有效量的一種或多種選自下列的肽BCSP1，BCSP2，BCSP3，BCSP4，BCSP5，BCSP6，BCSP7，BCSP8，BCSP9，BCSP10，BCSP11，BCSP12，BCSP13，BCSP14，BCSP15，BCSP16，BCSP17，BCSP18，BCSP19和BCSP20及其功能性類似物和/或功能性模擬物，還包括可藥用稀釋劑或載體。這些組合物可配制成制劑含有其他佐劑，共刺激分子和/或穩定劑。
本發明的另一實施方案是用于刺激骨、軟骨和相連結締組織的發育、維持和修復的組合物，所述組合物包括具有選自下列通式的肽(I)X-(P1)mGly(P2)n，(II)(P1)mGly(P2)n-Z，和(III)X-(P1)mGly(P2)n-Z；-其中P1和P2選自脯氨酸和羥脯氨酸，m＝0或1，n＝0或1，其中m和n獨立地選擇；-其中X選自亮氨酸、甘氨酸-亮氨酸、脯氨酸-異亮氨酸、甘氨酸-脯氨酸-異亮氨酸、天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸和脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸；-其中Z選自異亮氨酸、精氨酸、異亮氨酸-甘氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-羥脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸和精氨酸-甘氨酸-精氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸；以及可藥用載體。
本發明的另一方面是在哺乳動物中用于刺激骨、軟骨和相連結締組織的發育、維持和修復的方法，所述方法包括施用有效量的肽，所述肽含有選自“PG”、“GP”、“PI”和“IG”的氨基酸基元并最多具有所述氨基酸基元上游和/或下游的10個氨基酸，其中基元中的“P”表示脯氨酸或羥脯氨酸。
本發明的進一步實施方案是用于在哺乳動物中促進結締組織形成的治療方法，所述方法包括給哺乳動物施用具有選自下列通式的肽(I)X-(P1)mGly(P2)n，(II)(P1)mGly(P2)n-Z，和(III)X-(P1)mGly(P2)n-Z；-其中P1和P2選自脯氨酸和羥脯氨酸，m＝0或1，n＝0或1，其中m和n獨立地選擇；-其中X選自亮氨酸、甘氨酸-亮氨酸、脯氨酸-異亮氨酸、甘氨酸-脯氨酸-異亮氨酸、天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸和脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸；-其中Z選自異亮氨酸、精氨酸、異亮氨酸-甘氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-羥脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸和精氨酸-甘氨酸-精氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸；-或者(I)、(II)和/或(III)的功能性類似物或變體。
本發明的進一步實施方案是用于在個體中促進結締組織形成的治療方法，所述方法包括給所述個體施用一種或多種選自下列的肽BCSP1，BCSP2，BCSP3，BCSP4，BCSP5，BCSP6，BCSP7，BCSP8，BCSP9，BCSP10，BCSP11，BCSP12，BCSP13，BCSP14，BCSP15，BCSP16，BCSP17，BCSP18，BCSP19和BCSP20及其功能性類似物。
根據進一步實施方案，本發明提供了用于在個體中治療受損的骨、軟骨和相關組織的方法，包括給個體施用有效量的一種或多種選自下列的肽BCSP1，BCSP2，BCSP3，BCSP4，BCSP5，BCSP6，BCSP7，BCSP8，BCSP9，BCSP10，BCSP11，BCSP12，BCSP13，BCSP14，BCSP15，BCSP16，BCSP17，BCSP18，BCSP19和BCSP20及其功能性類似物和/或模擬類似物，其中肽刺激結締組織修復和形成。
根據進一步實施方案，本發明提供了用于在個體中增強整形外科或牙科植入物的骨整合的方法，包括給個體施用有效量的一種或多種選自下列的肽BCSP1，BCSP2，BCSP3，BCSP4，BCSP5，BCSP6，BCSP7，BCSP8，BCSP9，BCSP10，BCSP11，BCSP12，BCSP13，BCSP14，BCSP15，BCSP16，BCSP17，BCSP18，BCSP19和BCSP20及其功能性類似物。
根據本發明的進一步實施方案，提供了在軟骨缺陷部位處體內生產軟骨的方法，所述方法包括-將一群軟骨形成細胞植入缺陷部位，所述細胞在一種或多種選自下列的肽存在下已經體外培養BCSP1，BCSP2，BCSP3，BCSP4，BCSP5，BCSP6，BCSP7，BCSP8，BCSP9，BCSP10，BCSP11，BCSP12，BCSP13，BCSP14，BCSP15，BCSP16，BCSP17，BCSP18，BCSP19和BCSP20及其功能性類似物。
本發明包括在軟骨缺陷部位處體內促進軟骨修復的方法，其中在一種或多種選自下列肽的存在下通過組織工程技術制備的新軟骨已經被植入缺陷部位BCSP1，BCSP2，BCSP3，BCSP4，BCSP5，BCSP6，BCSP7，BCSP8，BCSP9，BCSP10，BCSP11，BCSP12，BCSP13，BCSP14，BCSP15，BCSP16，BCSP17，BCSP18，BCSP19和BCSP20及其功能性類似物。
根據本發明的另一實施方案，提供了用于治療特征為軟骨退化的關節變性病的方法，所述方法包括-將治療有效量的一種或多種選自下列的肽傳遞到疾病部位BCSP1，BCSP2，BCSP3，BCSP4，BCSP5，BCSP6，BCSP7，BCSP8，BCSP9，BCSP10，BCSP11，BCSP12，BCSP13，BCSP14，BCSP15，BCSP16，BCSP17，BCSP18，BCSP19和BCSP20及其功能性類似物。
根據進一步實施方案，本發明提供了用于在哺乳動物中治療骨相關紊亂的方法，包括給藥于哺乳動物細胞，所述細胞選自衍生自骨，骨髓或血液的成骨細胞(osteoblastic cell)，前成骨細胞，軟骨細胞，前軟骨細胞，骨骼祖細胞及其混合物，并用有效量的一種或多種選自下列的肽處理BCSP1，BCSP2，BCSP3，BCSP4，BCSP5，BCSP6，BCSP7，BCSP8，BCSP9，BCSP10，BCSP11，BCSP12，BCSP13，BCSP14，BCSP15，BCSP16，BCSP17，BCSP18，BCSP19和BCSP20及其功能性類似物。
本發明的方法包括提供全身性和/或局部施用本發明選定的肽或功能性類似物。
根據本發明的另一方面，提供了在脊椎動物的骨部位種植用的形態發生裝置，所述裝置包括-可植入的生物相容性載體；以及-在所述載體之內或之上提供或分散的一種或多種選自下列的肽BCSP1，BCSP2，BCSP3，BCSP4，BCSP5，BCSP6，BCSP7，BCSP8，BCSP9，BCSP10，BCSP11，BCSP12，BCSP13，BCSP14，BCSP15，BCSP16，BCSP17，BCSP18，BCSP19和BCSP20及其功能性類似物。
本發明的另一方面是在哺乳動物中用于刺激骨發育的方法，所述方法包括施用有效量的一種或多種選自下列的肽SEQ.ID.NO.1，SEQ.ID.NO.4，SEQ.ID.NO.7，SEQ.ID.NO.8，SEQ.ID.NO.9，SEQ.ID.NO.10，SEQ.ID.NO.12，SEQ.ID.NO.15和SEQ.ID.NO.18及其功能性類似物和模擬類似物。
本發明的另一方面是在哺乳動物中用于刺激軟骨發育的方法，所述方法包括施用有效量的一種或多種選自下列的肽SEQ.ID.NO.1，SEQ.ID.NO.4，SEQ.ID.NO.7，SEQ.ID.NO.8，SEQ.ID.NO.9，SEQ.ID.NO.10，SEQ.ID.NO.11及其功能性類似物和模擬類似物。
本發明的另一方面是刺激骨和/或軟骨形成和相連結締組織的肽的篩選方法，所述方法包括下列步驟(a)將能夠接受骨和/或軟骨形成的第一生物樣品與測試肽接觸；(b)單獨將能夠接受骨和/或軟骨形成的第二生物樣品與生物有效量的選自下列的肽接觸從而提供對照NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQ.ID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)和PIGP(SEQ.ID.NO.20)；(c)評價由步驟(a)和步驟(b)產生的骨和/或軟骨形成的水平；以及(d)比較步驟(c)中評價的骨和/或軟骨形成的水平，由此能夠刺激骨和/或軟骨形成的肽由其改變骨和/或軟骨形成的水平的能力與步驟(b)的對照比較后所鑒定。
本發明的另一方面是刺激骨和/或軟骨形成和相連結締組織的調節劑的篩選方法，所述方法包括下列步驟(a)將能夠接受骨和/或軟骨形成的第一生物樣品與測試化合物和生物有效量的選自下列的肽接觸NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQ.ID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)和PIGP(SEQ.ID.NO.20)；(b)單獨將第二生物樣品與生物有效量的選自下列的肽接觸從而提供對照NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQ.ID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)和PIGP(SEQ.ID.NO.20)；(c)評價由步驟(a)和步驟(b)產生的骨和/或軟骨形成的水平；以及(d)比較步驟(c)中評價的骨和/或軟骨形成的水平，由此骨和/或軟骨形成的調節劑由其改變骨和/或軟骨形成的水平的能力與步驟(b)的對照比較后所鑒定。
本發明的另一方面是刺激骨、軟骨和相連結締組織的發育、維持和修復的肽的鑒定方法，所述方法包括-確定所述肽是否與一種或多種選自下列的肽具有可比較的活性NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQ.ID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)和PIGP(SEQ.ID.NO.20)；其中活性的評價方法是分析一種或多種選自下列的標準骨礦物質密度，骨礦物質含量，堿性磷酸酶活性，成骨細胞增殖，骨結形成，骨結礦化，軟骨細胞增殖，膠原蛋白分析和蛋白聚糖分析。
本發明的其他特征和優點將從下列詳細描述中變得清晰。然而，應該理解，說明本發明實施方案的詳細描述和具體實施例僅以示例性方式給出，這是因為，對本領域技術人員來說，從所述的詳細描述中在本發明的實質和范圍內進行各種改變和修飾是顯而易見的。


參照附圖，本發明將從下列說明中進一步加以理解，其中圖1示出了用SkeliteTM/BCSP1移植物處理的骨缺陷的組織學切片；圖2示出的X光照片表明手術后9周SkeliteTM/BCSP1移植物與自體移植物的性能比較；圖3示出了BCSP1處理對移植物去脂體(lean mass)(愈傷組織形成)與自體移植物的影響比較；圖4示出了用BCSP1肽注射的脛骨的DEXA分析區。全骨分析包括所有3個脛骨區。BCSP1肽注射施用在區2；圖5示出了BCSP1對全脛骨的骨礦物質密度(BMD)的影響與BSCP1對脛骨內區2的局部影響的比較；圖6示出了BCSP1對全脛骨的骨礦物質含量(BMC)的影響與BCSP1對脛骨內區2的局部影響的比較；圖7A示出了BCSP1，BCSP7，BCSP9，BSCP10和對照對全脛骨的骨礦物質密度的平均增加值；圖7B示出了BCSP1，BCSP7，BCSP9，BSCP10和對照對脛骨區2的骨礦物質密度的平均增加值(參見圖4)；圖8A示出了BCSP1，BCSP7，BCSP9，BSCP10和對照對全脛骨的骨礦物質含量的平均增加值；圖8B示出了BCSP1，BCSP7，BCSP9，BSCP10和對照對脛骨區2的骨礦物質含量的平均增加值(參見圖4)；圖9示出了BCSP1對牛軟骨細胞生長的影響；圖10示出了BSCP1對人軟骨細胞生長的影響；圖11示出了BCSP1對大鼠骨髓衍生的成骨細胞培養物中DNA合成的影響；圖12示出了BSCP1對頭頂衍生的成骨細胞培養物增殖的影響；圖13示出了BCSP1對骨髓衍生的成骨細胞中堿性磷酸酶活性的影響；圖14示出了BCSP1對頭頂衍生的成骨細胞中堿性磷酸酶活性的影響；圖15示出了BCSP1對頭頂培養物中骨結形成的影響；以及圖16示出了BCSP1對頭頂培養物中骨結礦化的影響。
優選實施方案的詳細說明本發明提供了新型肽及其功能性類似物，其在哺乳動物體外和體內以及離體組織工程中均影響結締組織的發育，維持和修復。這些肽在結締組織修復和再生中具有多種用途。
如本發明所用的術語“結締組織”包括骨，軟骨和由共有譜系的細胞形成的相關結締組織。這種細胞可包括例如，衍生自骨，骨髓或血液的成骨細胞，前成骨細胞，軟骨細胞，前軟骨細胞和骨骼祖細胞。照此，肽可用于骨，軟骨和相連結締組織的正常結構的發育，維持和修復。
如本發明所用的術語“骨”是本領域技術人員公知的，定義為形成大多數脊椎動物骨骼的主要部分的致密，半剛性，多孔，鈣化的結締組織。其由致密的有機基質和無機礦物質組分以及其中所含的細胞所組成。
如本發明所用的術語“軟骨”是本領域技術人員公知的，為諸如關節，外耳和喉的多種身體部分發現的堅韌、彈性、纖維狀結締組織。軟骨不是鈣化樣骨，但由與骨-形成的成骨細胞共有譜系的軟骨細胞產生。
如本發明所用的術語“相關結締組織”定義為與骨和軟骨相關的組織，諸如骨髓和其中所含的細胞，腱和韌帶。
在一個實施方案中，本發明的肽提供了“骨刺激反應”，其導致軟骨內骨形成，骨礦化，骨礦物質密度，骨礦物質含量以及骨修復的增加。一般而言，這涉及對骨-形成細胞(包括但不限于成骨細胞，前成骨細胞，軟骨細胞以及前軟骨細胞)的有益效果導致產生和分泌增量的礦化基質，所述礦化基質是新骨組織形成的基礎。反應是特異的，以致肽的局部傳遞不會導致異位骨形成。
如本發明所用的縮寫“BCSP”表示新型“骨和軟骨刺激肽”。本領域普通技術人員將會理解，本發明的BCSP肽長度是變化的，可以少至3個連續氨基酸，更優選至少4個連續氨基酸。在本發明的某些實施方案中，本發明的BCSP肽包括少至3個氨基酸到多至10或20個氨基酸或更多。如本發明所述的肽序列采用正如本領域技術人員所理解的氨基酸的標準單字代碼來表示(Short Protocols In MolecularBiology，Second Edition，John WILEY & Sons，1992)。
本發明的BCSP肽是一種包括選自“PG”、“GP”、“PI”和“IG”的氨基酸基元并最多具有氨基酸基元上游和/或下游的10個氨基酸的肽。所述肽刺激骨，軟骨和相連結締組織的發育，維持和修復。基元中的“P”可選自脯氨酸和羥脯氨酸。
在另一實施方案中，本發明的BCSP肽含有一個或多個“GP”和/或“PG”基元，并且包含多達共約20個氨基酸，其中肽誘導骨和軟骨細胞的活性，以致骨和軟骨組織得以發育，維持和/或修復。基元中的“P”可選自脯氨酸和羥脯氨酸。
本發明的肽一般在所選定的基元上游和/或下游可以連接下列氨基酸的組合亮氨酸，甘氨酸，天冬酰胺，異亮氨酸，脯氨酸，羥脯氨酸，精氨酸，蘇氨酸，天冬氨酸和腺嘌呤。照此，與選定的基元一起使用的適合的氨基酸序列包括但不限于脯氨酸，精氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，亮氨酸-脯氨酸，脯氨酸-異亮氨酸，甘氨酸-脯氨酸，脯氨酸-精氨酸，甘氨酸-亮氨酸，甘氨酸-亮氨酸-脯氨酸，甘氨酸-亮氨酸-脯氨酸-甘氨酸，天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸，天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸-脯氨酸，脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸，脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-蘇氨酸-甘氨酸，脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-蘇氨酸，脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸，天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸-脯氨酸-甘氨酸，天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸，天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-異亮氨酸，脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-甘氨酸，脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸，脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸及其組合。
本發明的肽可由選自下列的通式來表示(I)X-(P1)mGly(P2)n，(II)(P1)mGly(P2)n-Z，和(III)X-(P1)mGly(P2)n-Z；-其中P1和P2選自脯氨酸和羥脯氨酸，m＝0或1，n＝0或1，其中m和n獨立地選擇；-其中X選自亮氨酸、甘氨酸-亮氨酸、脯氨酸-異亮氨酸、甘氨酸-脯氨酸-異亮氨酸、天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸和脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸；以及-其中Z選自異亮氨酸、精氨酸、異亮氨酸-甘氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-羥脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸和精氨酸-甘氨酸-精氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸。在本發明的特定實施方案中，肽選自NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQ.ID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)以及PIGP(SEQ.ID.NO.20)。
本發明還涉及如上和在此所述的肽的功能性等同變體。“功能性等同變體”或“功能性類似物”包括具有部分序列同源性的肽，具有一個或多個特異性保守和/或非保守氨基酸替換的肽，肽共軛物，嵌合蛋白，融合蛋白以及肽編碼核酸。功能性等同變體保持天然肽的生物活性。生物活性(即，刺激骨或軟骨細胞)可通過分析一種或多種選自下列標準進行評價骨礦物質密度，骨礦物質含量，堿性磷酸酶活性，成骨細胞的增殖，骨結形成，骨結礦化，軟骨細胞增殖，胞內鈣通道分析，膠原蛋白分析，以及蛋白聚糖分析。這些方法是眾所周知的，并且完全在本領域范圍內(參見，例如U.S.專利6,333,312，5,972,623，5,965,136，6,030,792和6,060,255)。
根據“功能性類似物”，為本領域技術人員充分理解，生物功能性肽類似物定義中固有的概念是對變化數目存在限制，所述變化可以在分子的限定部分內進行，并且還導致具有可接受水平的等同生物活性的分子，在這種情況下，所述活性包括在結締組織形成中誘導變化的能力。根據本發明，可容易制得和使用多個具有不同替換的獨特的肽/蛋白。也可以理解的是，某些殘基對于蛋白或肽的生物或結構特性尤其重要，諸如受體識別區中的殘基，這類殘基通常不可以替換。
通過保守或非保守性氨基酸替換可生成功能性類似物。氨基酸替換一般是基于氨基酸側鏈取代基之間的相似性，例如，它們的疏水性，親水性，電荷，大小等。因此，在本發明范圍內，保守性氨基酸替換表示在特定位置處的氨基酸變化，其與原始存在的氨基酸屬于同一類型，即，疏水性氨基酸替換疏水性氨基酸，堿性氨基酸替換堿性氨基酸等。保守性替換的例子包括一種極性(疏水性)氨基酸諸如異亮氨酸，纈氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸替換另一種疏水性氨基酸，一種極性(親水性)氨基酸替換另一種親水性氨基酸，諸如在精氨酸和賴氨酸之間，谷氨酰胺和天冬酰胺之間，甘氨酸和絲氨酸之間的替換，一種堿性氨基酸諸如賴氨酸，精氨酸或組氨酸替換另一種堿性氨基酸，或者一種酸性氨基酸，諸如天冬氨酸或谷氨酸替換另一種酸性氨基酸，一種支鏈氨基酸，諸如異亮氨酸，亮氨酸或纈氨酸替換另一種支鏈氨基酸，一種芳香族氨基酸，諸如苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸替換另一種芳香族氨基酸。這種氨基酸變化所導致的功能性類似物并未顯著改變肽的整個電荷和/或構型。這種保守性替換的例子對本領域專業技術人員是眾所周知的，并且落入本發明的范圍內。保守性替換還包括使用化學衍生化的殘基取代非衍生化的殘基，條件是所得的肽在生物功能上等同于如本發明所述的肽以及SEQ ID NOS.1-20中的任一種肽。
本發明的肽可以嵌合蛋白形式提供，以致嵌合蛋白含有另一蛋白的序列。在一個方面，理想的是給本發明肽提供另一蛋白的非天然鈣結合結構域。本發明的嵌合肽包括選自下列蛋白的鈣結合序列骨調素(osteopontin)，牙基質磷蛋白，卵黃高磷蛋白，phosphohoryn，β-酪蛋白，stratherin，基質gla蛋白，核黃素結合蛋白以及αS1酪蛋白。在一個實施方案中，鈣結合序列可選自S*S*，S*S*GS*EE，S*S*S*EE，S*S*S*S*S*S*，DS*S*DS*S*，S*LS*S*S*S*，DS*S*EE，DS*S*ES*，S*MS*S*S*EE和S*IS*S*S*EE及其組合，其中S*表示磷酸化的絲氨酸氨基酸殘基。因此，這種嵌合肽的功能性類似物和模擬物也落入本發明的范圍內。
一個或多個接頭分子與本發明肽連接也落入本發明的范圍內。在這方面，接頭分子可以連接在選定肽的任意一側或兩側(即末端部分)。這些接頭分子可選自碳二亞胺，醛，馬來酰亞胺，巰基，氨基，羧基，羥基，NHS酯，修飾的半胱氨酸，磷酸化的氨基酸，氨基酸，二醋酸，磺酰氯，異氰酸酯，異硫氰酸酯，環氧樹脂，雙膦酸酯，焦磷酸酯，磷酸酯，二硫化物，苯基疊氮化物，烷基鹵，以及酰肼酰基氯。
本發明的肽還衍生自下列肽SEQ.ID.NO.1，SEQ.ID.NO.2，SEQ.ID.NO.3，SEQ.ID.NO.4，SEQ.ID.NO.5，SEQ.ID.NO.6，SEQ.ID.NO.7，SEQ.ID.NO.8，SEQ.ID.NO.9，SEQ.ID.NO.10，SEQ.ID.NO.11，SEQ.ID.NO.12，SEQ.ID.NO.13，SEQ.ID.NO.14，SEQ.ID.NO.15，SEQ.ID.NO.16，SEQ.ID.NO.17，SEQ.ID.NO.18，SEQ.ID.NO.19和SEQ.ID.NO.20，但在一個或多個位置含有非保守性氨基酸替換，替換程度只是這種肽仍能在體外，體內和/或離體提供反應。
本發明的肽可利用全自動儀器通過化學合成獲得，或者通過核酸序列表達獲得，采用本領域技術人員眾所周知的重組DNA技術，所述核酸序列能夠指導肽的合成。本發明的肽的制備可采用蛋白化學中熟知的技術通過化學合成進行，諸如固相合成(Merrifield，J.Am.Chem.Assoc.852149-2154(1964))或均勻溶液中的合成(Houbenweyl，Methods of Organic Chemistry(1987)，(Ed.E.Wansch)Vol.15，pts.I andII，Thieme，Stuttgart)。通過重組表達生產蛋白的技術是本領域技術人員熟知的，并且描述在例如，Sambrook等(1989)或其最新版本。
本發明還涉及本發明肽的非肽類似物，例如，提供了結構穩定或生物降解減少的肽模擬物。肽模擬類似物的制備是基于具有選自下列序列的選定的BCSP肽通過一個或多個殘基替換非肽部分進行的SEQ.ID.NO.1，SEQ.ID.NO.2，SEQ.ID.NO.3，SEQ.ID.NO.4，SEQ.ID.NO.5，SEQ.ID.NO.6，SEQ.ID.NO.7，SEQ.ID.NO.8，SEQ.ID.NO.9，SEQ.ID.NO.10，SEQ.ID.NO.11，SEQ.ID.NO.12，SEQ.ID.NO.13，SEQ.ID.NO.14，SEQ.ID.NO.15，SEQ.ID.NO.16，SEQ.ID.NO.17，SEQ.ID.NO.18，SEQ.ID.NO.19或SEQ.ID.NO.20。優選的是，非肽部分允許肽保留其天然構型，或者使優選的例如生物活性構型穩定化。這種肽可在基于分子或細胞結合的分析中進行測試，以評價替換對構型和/或活性的影響。從本發明肽中制備非肽模擬類似物可例如，按下列文獻所教導的進行Nachman等，Regul.Pept.57359-370(1995)。
本發明還包括含有核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列編碼一種或多種選自SEQ.ID.NO.1，SEQ.ID.NO.2，SEQ.ID.NO.3，SEQ.ID.NO.4，SEQ.ID.NO.5，SEQ.ID.NO.6，SEQ.ID.NO.7，SEQ.ID.NO.8，SEQ.ID.NO.9 SEQ.ID.NO.10，SEQ.ID.NO.11，SEQ.ID.NO.12，SEQ.ID.NO.13，SEQ.ID.NO.14，SEQ.ID.NO.15，SEQ.ID.NO.16，SEQ.ID.NO.17，SEQ.ID.NO.18，SEQ.ID.NO.19或SEQ.ID.NO.20的氨基酸序列及其變體。
本發明還包括核酸序列，其互補及反互補于編碼序列及其等同序列變體。本領域技術人員能夠容易地確定這種互補或反互補的核酸序列。在嚴格條件下與前述核酸分子之一雜交的核酸序列也是本發明的一部分。如本發明所用的“嚴格條件”是指本領域所熟悉的參數，并且這些參數討論在例如，最新版的分子克隆實驗室手冊(MolecularCloningA Laboratory Manual)，J.Sambrook等編，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，或者Current Protocolsin Molecular Biology，F.M.Ausubel等編，John Wiley & Sons Inc.，NewYork。本領域技術人員能夠識別編碼本發明BCSP肽的核酸類似物。細胞和文庫的篩選用于表達這種分子，然后進行常規分離，接著分離相關核酸分子和測序。
值得注意的是，本發明所述的核酸分子還可包括簡并核酸。由于遺傳密碼的簡并性，DNA序列的變化導致翻譯同樣的肽。因此，可以理解的是對核苷酸有眾多選擇，以導致能夠指導生產本發明的肽或其功能性類似物的序列。結果，簡并核苷酸替換也包括在本發明的范圍內。
正如本領域技術人員所理解，本發明的核酸分子可包括單鏈和雙鏈形式，質粒，病毒核酸，質粒細菌DNA，裸露/游離DNA和RNA。包括編碼本發明至少一種肽的核酸序列的病毒核酸可以稱作病毒載體。
本發明也包括表達載體，所述載體含有本發明的核酸序列，其在表達載體內編碼一種或多種肽SEQ ID NO.1-20及其功能性類似物。可以采用任何表達載體，只要其在原核生物或真核生物宿主細胞中能夠攜帶和表達編碼本發明肽及其功能性類似物的核酸序列，包括重組病毒，諸如痘病毒，腺病毒，α病毒和慢病毒(lentivirus)。
本發明還包括轉化，轉染或感染有這種載體以表達本發明的肽或功能性類似物的宿主細胞。照此，宿主細胞包括任何潛在的細胞，其中導入和/或轉染了本發明的核酸。
組合物由于證明了本發明的一種或多種肽可在體外，體內或離體直接影響結締組織形成，尤其是具有影響組織修復和組織工程的骨生成促進活性或軟骨生成促進活性，因此為了治療骨骼創傷，骨骼發育異常(非代謝性骨病和代謝性骨病)，關節炎和關節變性病，現在可以開發和使用藥物組合物。
本發明肽針對骨創傷或骨發育異常的代表性用途包括例如，修復骨缺陷和缺乏，諸如那些在閉合，開放和非聯合性骨折中發生的骨缺陷和缺乏，骨/脊椎變形，骨肉瘤，骨髓瘤，骨發育異常和脊柱側凸；預防性用于閉合和開放性骨折減少；在整形手術中促進骨愈合；刺激骨向內生長到非接合的修復術關節和牙科植入物；提升絕經期前婦女的骨峰質量；治療生長缺陷；治療牙周疾病和缺陷，以及其他牙修復過程；增加牽張骨生成過程中的骨形成；以及治療其他骨骼紊亂，諸如年齡有關的骨質疏松癥，絕經期后骨質疏松癥，糖皮質激素誘導的骨質疏松癥或廢用性骨質疏松癥和關節炎，軟骨病(osteomalcia)，纖維性骨炎，腎性骨營養不良以及骨的Paget氏病，或從刺激骨形成中受益的任何狀況。
本發明肽也可在刺激軟骨形成方面用于治療性用途中。本發明肽針對軟骨創傷或軟骨異常的代表性用途包括軟骨運動損傷，諸如軟骨裂傷；軟骨缺陷，諸如軟骨損傷和骨軟骨缺陷；以及軟骨變性病，諸如骨關節炎。
本領域技術人員能夠利用本發明所述的肽組合物來治療和緩解前述創傷和疾病，并且對各種細胞類型的生理有益效果具有成功的合理預期，所述細胞類型包括但不限于衍生自骨，骨髓或血液的骨細胞(即，成骨細胞，前成骨細胞和與其共有譜系的細胞)，軟骨細胞(即，軟骨細胞，前軟骨細胞，以及與其共有譜系的細胞)，以及骨骼祖細胞。此外，眾多因子，諸如骨形態發生因子，抗重吸收因子，骨生成因子，軟骨形態發生因子，生長激素以及分化因子，可與本發明的肽組合物一起使用，目的是有助于促進結締組織發育，維持和修復。
本發明的組合物在修復結締組織的先天性，創傷-誘導的或手術切除術(例如，對癌癥治療而言)以及在美容手術中也是有用的。這種組織缺乏或缺陷通過施用本發明的肽可在脊椎動物個體中得到治療，所述肽顯示了某些結構和功能特征。
對于在脊椎動物中進行移植而言，本發明的肽可用于涉及軟骨和/或骨組織的離體組織工程的骨骼重建。在組織工程過程中，細胞和/或發育組織可用選定的肽或其功能性類似物進行體外治療以促進任何或所有步驟的細胞增殖，細胞分化，和/或組織結構形成。用于組織工程過程的細胞源可以是自體的，同種異體的或異種的。離體過程可在細胞擴增，細胞分化或組織結構形成，以及將如此生成的細胞和/或組織導入病人體內后結束。組織工程技術的應用使得組織能夠從頭形成，從而減少或消除了獲得自體移植物，同種異體移植物或異種移植物組織的需要。這種實踐是高度理想的，因為這些組織源分別具有相伴的并發癥。自體移植物方法一般導致供體部分發病，而使用同種異體移植物帶來感染風險，以及異種移植物具有誘導免疫并發癥的可能性。本發明的組合物可以全身性或局部施用。對全身性使用而言，本發明的化合物根據常規方法可配制成制劑用于選自下列施用靜脈內，皮下，肌內，腹膜內，口服，腸內，腸胃外，鼻內，肺部，局部或經皮施用。例如，局部施用的組合物的制備可通過關節內注射或采用移植物進行。
對于口服而言，組合物可以液體制劑的形式，或者當其以液體形式獲得時，可以填充在軟膠囊等中以生成口服制劑。當本發明的組合物為固相分散體時，其可包裝在膠囊中或成型為丸劑，細顆粒，顆粒或片劑以生成口服制劑。作為固相分散體，組合物可在其他添加劑存在下成型為固相形式，諸如球形，棒形，針形，丸形和膜形，這根據本領域技術人員所理解的需要進行。
靜脈內給藥可通過一系列注射或連續灌輸一延長的時間進行。以注射或其他分隔給藥的途徑進行給藥的間隔期從每周一次到每天1-3次。或者，本發明所公開的肽可以循環方式給藥(施用公開的肽，接著無施用，再施用公開的肽，等等)。治療持續直至取得理想的結果。
根據本發明，肽組合物以治療有效量施用。治療濃度為實現所需水平的組織形成或局部組織修復，或降低特定狀況或這種狀況擴張速率的濃度。有效治療或預防濃度將隨狀況不同而不同，并且在某些情況下，可隨著在治療狀況的嚴重性以及病人對治療的易感性的不同而不同。因此，沒有單一濃度是千篇一律有用的，而是取決于在治療的慢性或急性狀況的特性需要加以修飾。這種濃度可通過常規試驗獲得，正如本領域技術人員所公知的一樣。
一般而言，藥物制劑包括本發明的肽與可藥用載體的組合，所述載體諸如鹽水，緩沖鹽水，5％葡萄糖的水，乙醇，含有痕量金屬的硼酸緩沖的鹽水等及其混合物。制劑可進一步包括一種或多種賦形劑，防腐劑，增溶劑，緩沖劑，防止蛋白在病毒表面上喪失的白蛋白，潤滑劑，填料，穩定劑等。制劑方法是本領域眾所周知的，并且公開在例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，Gennaro編，Mack PublishingCo.，Easton Pa.，1990，在此引作參考。
本發明的組合物可相伴與其他因子一起使用用于治療骨病。同時使用的藥物的例子可包括例如，鈣制劑(如磷酸鈣，硫酸鈣，碳酸鈣)，降血鈣素制劑，性激素(如雌激素，雌二醇)，前列腺素A1，雙膦酸，伊普黃酮，氟化合物(如氟化鈉)，維生素K，血纖蛋白，蛋白聚糖，骨形態發生蛋白(BMPs)，成纖維細胞生長因子(FGF)，血小板衍生的生長因子(PDGF)，轉化生長因子(TGF-β)，胰島素樣生長因子1和2(IGF-1，2)，內皮素，甲狀旁腺激素(PTH)，表皮生長因子(EGF)，白介素抑制因子(LIF)，成骨素，和骨重吸收阻遏物，諸如雌激素，降血鈣素和二膦酸酯。也可考慮將這些因子的混合物使用和配制在本發明的組合物內或者與本發明的組合物結合使用。
本發明中所用的藥物組合物的形式可以為無菌，非熱原性液體溶液或懸浮液，包被的膠囊，膏體，洗劑，凍干粉或本領域已知的其他形式。本發明的肽可被配制成水凝膠用于局部給藥或施加到所需的載體上。局部給藥可以通過在損傷或缺陷的部位處注射或在該部位插入或連上固相載體進行。對于局部給藥而言，傳遞載體可提供骨或軟骨向內生長用的基體或支架，并且可以是一種被個體吸收而無副作用的載體。
在一個優選的實施方案中，本發明的肽可以與合成的生物材料化合物結合使用(SkeliteTM，描述在申請人的U.S.專利No.6,323,146中，在此引作參考)。這種分離的生物可重吸收的生物材料化合物包括鈣，氧和磷，其中至少一種所述元素的部分被離子半徑約0.1-0.6埃的元素所取代。在該實施方案中，合成的生物材料化合物可被成型為所需的三維移植物，而肽組合物可以其上的包衣或散布其中的基質形式提供。或者，肽組合物可以與SkeliteTM的顆粒或粉末形式密切混合用于局部給藥。
多種聚合物可用于形成移植物，以將本發明的肽組合物傳遞到所需的體內部位。合適的聚合物包括但不限于聚酯，聚乙酸乙烯酯，聚丙烯酸酯，聚原酸酯(polyorthoesters)，聚羥基乙基甲基丙烯酸酯(polyhema)和聚酐。基于生物可降解和生物相容的特性可對某些聚合物加以挑選。衍生自丙交酯，乙交酯和己內酯(caprolactone)單體的脂肪族聚酯尤其是有利的，這是因為它們具有相當廣泛的降解譜。本發明的肽組合物可以與膠原蛋白，血纖蛋白，淀粉，藻酸鹽和透明質酸結合使用。
除了上述聚合物和載體以外，摻入肽組合物中的生物可降解膜和基質可包括同上討論的其他活性或惰性組分及其混合物。尤其感興趣的是那些促進組織生長或浸潤的因子，諸如生長因子。為此目的的示例性生長因子包括表皮生長因子(EGF)，成纖維細胞生長因子(FGF)，血小板衍生的生長因子(PDGF)，轉化生長因子(TGFs)，甲狀旁腺激素(PTH)，白介素抑制因子(LIF)，胰島素樣生長因子(IGFs)等。促進骨生長的因子，諸如骨形態發生蛋白(U.S.專利No.4,761,471)，成骨素(Sampath等，Proc.Natl.Acad Sci USA(1987)847109-13)和NaF(Tencer等，J.Biomed.Mat.Res.(1989)23571-89)也是優選的。生物可降解膜或基質包括硫酸鈣，磷酸三鈣，羥基磷灰石，聚乳酸，聚酐，骨或皮膚膠原蛋白，純蛋白，胞外基質組分等及其組合。這些生物可降解材料可與非生物可降解材料(例如，聚合物移植物，鈦移植物)組合使用，以提供所需的生物，機械，化妝品，或基質界面特性。
一方面，將本發明所述的鈦傳遞給所需的部位可通過使用控釋組合物而得以增強，諸如那些在WIPO公布WO 93/20859(在此以其全文引作參考)中描述的控釋組合物。這種類型的膜作為可重吸收和非可重吸收的修復術裝置和手術移植物的包衣尤其有用。膜可例如，包在手術螺釘，桿，針，盤等的外表面。按慣例，這種類型的可移植裝置用于整形外科手術中。膜也可用于包覆骨填充材料，諸如羥基磷灰石塊，去礦物化的骨基質塞，膠原蛋白基質等。一般而言，如本發明所述的膜或裝置施用到骨的骨折部位上。通常，所述施用是利用標準手術程序移植至骨或連在表面。
傳遞本發明化合物的替代法包括采用ALZET滲透微型真空泵(Alza Corp.，Palo Alto，Calif.)，緩釋基質材料，諸如那些公開在Wang等(PCT公布WO 90/11366)中的材料，帶電葡聚糖珠，如在Bao等(PCT公布WO 92/03125)中所公開；基于膠原蛋白的傳遞系統，例如，如在Ksander等，Ann.Surg.(1990)211(3)288-94中所公開；甲基纖維素凝膠系統，如在Beck等，J.Bone Min.Res.(1991)6(11)1257-65中所公開；基于藻酸鹽的系統，如在Edelman等，Biomaterials(1991)12619-26中所公開，等等。其他本領域熟知的用于在骨中持續局部傳遞的方法包括多孔包覆的可被浸漬的金屬假體以及含有本發明治療用組合物的固體塑料棒。
在一個實施方案中，肽組合物可包括至少一種選自SEQ ID NO.1-20的肽，提供以稱為脂質體的磷脂囊泡中所含的溶液或乳狀液。脂質體可以是單層或多層，并且形成自選自磷脂酰膽堿，二棕櫚酰磷脂酰膽堿，膽固醇，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰絲氨酸，去肉豆蔻酰磷脂酰膽堿及其組合的組分。多層脂質體包括與單層囊泡有相似組成的多層囊泡，但其制備是為了導致多個區室，其中俘獲選定肽的溶液或乳狀液。另外，其他佐劑和改性劑可包括在脂質體制劑中，諸如聚乙烯醇，或其他材料。
本領域技術人員所理解的是，任何數目的脂質體雙層組合物可用于本發明的組合物中。脂質體的制備可采用多種公知的方法，諸如那些在U.S.專利No.4,235,871和RRC，LiposomesA Practical Approach.IRL Press，Oxford，1990，第33-101頁中公開的方法。
含有本發明肽的脂質體可具有修飾，諸如具有結合到脂質體外部的非聚合物分子，諸如半抗原，酶，抗體或抗體片段，細胞因子和激素以及其他小蛋白，多肽或非蛋白分子，它們賦予脂質體以所需的酶或表面識別特征。優先將脂質體靶向到特異器官或細胞類型的表面分子包括例如，將脂質體靶向到攜帶特異抗原的細胞的抗體。偶聯這種分子的技術為本領域技術人員所熟知的(參見，例如U.S.專利4,762,915)。此外，或者結合，本領域技術人員會理解，任何數目的攜帶陽性或陰性凈電荷的脂質體可用于改變脂質體膜的表面電荷或表面電荷密度。
脂質體也可摻入熱敏感或pH敏感的脂質作為脂質雙層的成分從而以受控方式降解脂質體囊泡膜。
對于通過靜脈內傳遞全身給藥而言，有益的是將本發明的肽以膠囊形式包裝在位阻穩定的脂質體內，所述脂質體顯示延長的血液循環時間。生產位阻穩定的脂質體，含有聚乙烯醇作為其表面的必需成分，以及制備這種脂質體的方法是本領域技術人員所公知的。
脂質體大小的選擇是基于目的靶和給藥途徑。約10nm-300nm之間的脂質體可以是合適的。此外，本發明的組合物可包括不同大小的脂質體。
盡管本發明的組合物可以被膠囊包裝，用于通過脂質體給藥，為本領域技術人員所理解的是，其他類型的膠囊密封材料也可用于密封本發明的BCSPs。微球體包括但不限于那些由離子交換樹脂，結晶陶瓷，生物可相容性玻璃，乳膠和散布的顆粒組成的微球體，用于本發明中是合適的。同樣，納米球和其他脂質，聚合物或蛋白材料也可使用。
單獨或以組合物方式提供的本發明的肽也可在體外用于刺激骨細胞和/或軟骨細胞的活性，然后將這種細胞給藥于哺乳動物，以治療骨或軟骨紊亂/缺陷。
本發明還提供了篩選和鑒定肽的其他功能性類似物的方法，其中這種鑒定的肽基本上具有如本發明所述的肽的活性。所述篩選包括將能夠接受骨和/或軟骨形成的生物樣品與測試肽或化合物接觸，然后單獨將也能夠接受骨和/或軟骨形成的第二生物樣品與一定量的一種或多種肽SEQ ID.NO.1-SEQ.ID.NO.20接觸。接著，骨和/或軟骨形成的水平通過分析一種或多種選自下列的標準加以評價骨礦物質密度，骨礦物質含量，堿性磷酸酶活性，成骨細胞的增殖，骨結形成，骨結礦化，軟骨細胞增殖，胞內鈣通道分析，膠原蛋白分析，以及蛋白聚糖分析。然后，在各個生物樣品中比較骨和/或軟骨形成的水平以鑒定測試肽或化合物是否基本上具有本發明肽的活性。利用相似方法，也可對骨和/或軟骨形成的調節劑進行評價。
總而言之，本發明的肽在結締組織的發育，維持和修復方面是具影響力的，所述結締組織不僅包括骨，而且包括軟骨和相關結締組織。
上述公開一般性地描述了本發明。通過參照下列具體實施例可對本發明有更全面的了解。這些實施例的描述僅僅為說明目的，并不旨在限制本發明的范圍。由于環境暗示或給予了便利，形式的變化和等同物的替換是可以預期的。雖然具體術語已經在本發明中采用，但是這些術語意在描述性意義而非為了限制目的。
實施例實施例的描述為了說明目的，并非旨在限制本發明的范圍。
本發明公開和實施例中提到但未明確描述的合成化學，蛋白和肽生物化學，分子生物學，組織學和免疫學的方法報道在科技文獻中，并且為本領域技術人員所熟知。
實施例1-移植物應用的BCSP1和SkeliteTM載體BCSP1在骨修復應用中的表現采用臨界大小缺陷在體內進行評價，所述缺陷創建在骨骼成熟的新西蘭白(NZW)兔的尺骨中，如Bolander等(J.Bone和Joint Surg.，68-A(8)，Oct.1986)所述。收集自髂骨骨突的自體移植物用作對側對照。研究組和對照組的兔子在12周被終止。
先把9.0mg的肽溶解在0.15ml的水中，并將其凍干在移植物的表面上，從而使得BCSP1結合到SkeliteTM移植物，以創建SkeliteTM/BCSP1移植物。肌內注射芬太奴(Fentanyl)(0.3mg/kg)和咪達唑侖(Midazolam)(2.0mg/kg)使動物麻醉。測量長度2cm，全段尺骨臨界大小缺陷的創建采用hall微指令矢狀鋸(micros saggitalsaw)(型號100，刀片號5023-160)進行。小心確保相鄰撓骨的“刻劃”或切割不會出現，因為這種損傷會充當應力冒口(riser)，并可能導致撓骨骨折。
骨髓采用18號針經皮收集自股骨的較大轉子，將其施用至各個多孔SkeliteTM/BCSP1移植物(6×4×20mm)的表面。將SkeliteTM/BCSP1移植物放置在含有骨髓抽吸液(aspirate)池的無菌培養皿中，并且每分鐘旋轉移植物共4分鐘，同時創建尺骨缺陷，從而完成了上述施用步驟。在SkeliteTM/BCSP1移植物已經移植到右前肢的接受架上后，并且在傷口愈合之前，采用注射器另將0.5ml的骨髓抽吸液施用到SkeliteTM/BCSP1移植物的表面。采用標準整形外科技術，自體骨收集自髂骨骨突，將其修整至合適的尺寸，并且移植到左前肢缺陷。按照標準臨床實踐，自體移植物未補充有骨髓抽吸液。
采用2ml的戊巴比妥鈉(Euthanyl)，通過靜脈內過劑量注射在12周時將動物無痛處死。切除前肢，并去除周圍的肌肉組織。肉眼檢查后，將切除的骨(撓骨和尺骨)固定在70％乙醇或100％福爾馬林中，并利用組織學和骨密度計量學技術進行分析。
在所有動物中，在鄰近SkeliteTM/BCSP1移植物處注意到皮層樣結構或愈傷組織。皮層殼橋接位于移植物周圍尺骨的兩端。這種新皮層結構在偏振光下具有薄層模式。在新皮質和SkeliteTM/BCSP1移植物之間注意到脂肪髓樣組織。同樣，在SkeliteTM/BCSP1移植物和撓骨之間注意到髓樣組織。
所有SkeliteTM/BCSP1移植物處理的缺陷都顯示出優異的骨整合和大量的骨形成，貫穿全部SkeliteTM/BCSP1移植物的多孔結構，在缺陷兩端處在宿主骨和移植物之間整合。與對側對照不同，所有用SkeliteTM/BCSP1移植物處理的缺陷至手術后9周實現聯合(圖1)。此外，顯微鏡下組織學觀察鑒定到廣泛的破骨細胞重吸收SkeliteTM材料，以及組織在SkeliteTM‘支柱’的三角形空隙內形成。
對于用SkeliteTM/BCSP1移植物處理的缺陷而言，12周時的組織病理學觀察始終如一地表明了顯著到大量的骨整合，輕微形成編織骨(woven bone)，中度形成薄層骨，髓質樣腔，假皮層，以及聯合(圖2)。相比之下，用自體移植物處理的缺陷通過顯微鏡發現了假關節病，骨腐骨片，髓壞死/纖維癥，以及骨間聯合的證據。
當與用自體骨處理的缺陷相比時，用SkeliteTM/BCSP1移植物處理的臨界大小缺陷顯示了愈合的加速速率。這種愈合的加速速率在早至手術后3周的X光照片中是顯而易見的，并且在所有用SkeliteTM/BCSP1移植物處理的缺陷中觀察到大量愈傷組織形成。用SkeliteTM/BCSP1移植物處理的缺陷通常在手術后6周由X光線照片顯示出聯合證據。SkeliteTM/BCSP1移植物處理的缺陷的正在進行的愈合包括持續愈傷組織形成，愈傷組織改建，以及包括整個移植物的皮層殼的發育。至9周，所有用SkeliteTM/BCSP1移植物處理的缺陷具有結構聯合，并且主要是愈傷組織重建。SkeliteTM/BCSP1移植物和宿主骨之間優異的整合和強大的聯合在終止時是顯然的。這些X光照片結果得到了切除骨的骨礦物質密度掃描的確證。
對所有用SkeliteTM/BCSP1移植物處理的缺陷而言，組織學評價顯示骨整合。與自體骨僅導致部分愈合帶有假關節病，骨腐骨片，髓壞死/纖維癥的缺陷不同，用SkeliteTM/BCSP1移植物處理的缺陷顯示出實體骨聯合，高水平的骨整合，以及形成皮層殼和髓樣腔。在與SkeliteTM/BCSP1材料直接接觸中觀察到成熟的薄層骨(在缺乏纖維性組織膜界面的情況下)以及注意到高水平的破骨細胞活性。在所有SkeliteTM/BCSP1移植物的內外表面上經常觀察到圓齒狀重吸收腔隙和‘切割圓錐物’。
對于用SkeliteTM/BCSP1移植物處理的缺陷而言，愈傷組織形成也加以分析，以在移植物部位為增加的組織形成提供進一步的可計量參數。愈傷組織形成在部分缺陷兔模型上的增加利用DEXA分析去脂體(lean mass)(這排除了礦物質量)得以測量。去脂體的量變顯示愈傷組織或軟組織形成在SkeliteTM/BCSP1移植物掃描區中的變化(圖3)。
這些結果提示，用SkeliteTM/BCSP1移植物處理兔中的臨界骨缺陷與自體移植物對照比較導致顯著的骨修復。
實施例2-BCSP1，BSCP7，BSCP9和BSCP10對BMC和BMD的影響在下列4個劑量水平0.05，0.5，1.0和5.0mg/大鼠或介質，以每個劑量n＝6，對BCSP1肽和BCSP4肽進行測試。60只雄性Wistar大鼠，體重90-110g，隨機分成兩組，每只大鼠耳朵上附有標簽，在試驗前安靜放置1周。食物和水隨意施用。動物注射時體重150-190g。第1組大鼠在水土適應第8天接受BCSP4肽的注射，而第2組大鼠在水土適應第9天接受BCSP1肽的注射。注射后7天，在各自的天數進行解剖。
以0.05-5mg/100μl將肽溶解于無菌水，加入到0.5mg的SkeliteTM干粉中，并且凍干至載體上。樣品重懸浮在100μl的無菌注射用鹽水。在異氟烷(isofluorane)和氧氣的通用麻醉劑下，傳遞測試化合物。利用0.5cc裝有28G1/2″針的胰島素注射器，將肽沉積到位于脛側顱側(Tibialis Cranialis)肌組下鄰近膝蓋的右中脛骨表面的骨膜面上。對照動物注射有鹽水介質和SkeliteTM載體。
注射后7天，用二氧化碳麻醉動物，解剖去除處理后的右脛骨和對側對照肢。肌肉和軟結締組織在固定在70％乙醇之前切去。
在Norland Eclipse DEXA掃描儀上以小對象方式，成對掃描各個脛骨組的骨礦物質密度(BMD)和骨礦物質含量(BMC)。DEXA分析區示于圖4中。對照未處理的對側肢，計算局部BMD的百分比增加(圖5)。由于用BCSP1可見的骨大小增加，作為獨立于BMD的骨形成活性的測量，也確定了BMC的增加(圖6)。這種在物理大小上的增加降低了BMD的總百分比增加(BMD＝BMC/cm2)。各個脛骨分析在3個相鄰區，即近端，中端和遠端以及整個尺骨測量。利用標準斯氏t-檢驗，對各個肽的骨形成活性進行劑量與介質的比較和統計學評價。
在所有區的處理后的整個脛骨中，對BCSP7，BCSP9和BCSP10也表明BMD和BMC的顯著變化(圖7A，7B，8A和8B)。
實施例3-BCSP1對軟骨細胞的影響采用[3H]胸苷摻入試驗，對BCSP1進行體外測試以確定對牛和人初級軟骨細胞培養物的影響。對牛軟骨細胞，細胞以250,000/孔接種，而對人軟骨細胞，以500,000/孔接種(96孔板)，并且附著48小時(含有10％胎牛血清(FBS)的培養基)。然后，匯合前細胞以一式四份用BCSP1進行處理(0，10，20和40ng/ml)48小時，并且用[3H]胸苷(1Ci/ml)處理最后24小時(含有2％FBS的培養基)。所用的培養基為Dulbecco′sModified Eagle Medium(DMEM)(Gibco，目錄號#23800)，其含有200個單位/ml青霉素，200ug/ml鏈霉素和10％FBS用于生長，而2％FBS用于服藥。
結果表明當用BCSP1體外處理時，人或牛軟骨細胞增殖是劑量依賴性增加的。以ng級劑量處理，影響高達3倍(圖9和10)。
實施例4-利用BCSP1肽的體外分析在3個試驗中對BCSP1進行測試，以理解肽對骨刺激的機制。mg級的劑量范圍用于生成劑量反應曲線。所有試驗采用來自骨髓或頭頂的初級大鼠成骨細胞培養物。
成骨細胞增殖的評價采用基于DNA的分析，所述分析測量了溴脫氧尿苷(BrdU)摻入。成骨細胞分化的確定方法利用中到晚期骨標記堿性磷酸酶。晚期分化和礦化的確定方法利用了骨結形成分析(只是頭頂)。
衍生自大鼠骨髓的成骨細胞培養物在對BCSP1存在的反應中顯示出增殖增加。在與肽接觸24小時之前，將細胞培養4天(圖11)。觀察到成骨細胞增殖中劑量反應增加至100μg/ml。這表明加入BCSP1導致DNA合成增加高達75％。
衍生自大鼠頭頂的成骨細胞培養物也顯示出對BCSP1存在反應的增殖增加。以100μg/ml到1.3ng/ml的肽的劑量范圍與肽接觸24小時之前，將細胞培養4天(圖12)。在較高劑量時觀察到劑量反應反轉。在肽的劑量范圍為1.3-6.4ng/ml時觀察到統計學上顯著性增加。
細胞結合堿性磷酸酶，其來自大鼠骨髓衍生的成骨細胞和大鼠頭頂衍生的成骨細胞的細胞裂解物。BCSP1以100μg/ml到1μg/ml的劑量范圍提供。在與肽接觸48小時之前，將細胞培養3天。對大鼠骨髓培養物(RBM)而言，與對照(介質)相比，可見劑量依賴性反應為1μg/ml到100μg/ml(圖13)，而對大鼠頭頂培養物(RC)而言，為10μg/ml到100μg/ml(圖14)。
將大鼠頭頂培養物在BCSP1存在下以1ng/ml到100μg/ml的劑量范圍維持10天，服藥提供以各個流體變化。礦化的骨結的檢測是用茜素紅染色。用α圖像儀2000TM進行圖像分析，以計算和定量節結面積。結果表明了以1ng/ml到10ng/ml范圍的緩慢增加形成的骨結數的最小變化(圖15)。在BCSP1存在下，總的礦化骨結面積(節結大小)以劑量依賴方式顯著增加(圖16)，這與堿性磷酸酶數據一致。堿性磷酸酶增加會導致總礦化面積增加。
全部體外結果顯示，BCSP1肽增加了細胞增殖，導致堿性磷酸酶水平的增加。其他試驗已表明堿性磷酸酶的特異活性增加(未示出)，暗示了由肽帶來的進一步分化效果。這也從形成的骨結數和礦化面積的總量中見到的骨形成細胞增加，從而得以證實(圖16)。
盡管本發明優選的實施方案已在此詳細描述，但是本領域技術人員會理解，在不偏離本發明實質的情況下可對其作出改變。
序列表<110>米列姆·貝爾羅吉克公司(MILLENIUM BIOLOGIX INC.)SINDREY，Dennis，R.
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<120>結締組織促進肽(CONNECTIVE TISSUE STIMULATING PEPTIDES)<130>SCT044300-47<150>U.S.60/377,271<151>03/05/2002<160>20<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>骨和軟骨刺激肽1<400>1Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Xaa1 5<210>2<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>骨和軟骨刺激肽2<400>2Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly1 5<210>3<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>骨和軟骨刺激肽3<400>3Asn Gly Leu Xaa Gly Pro Ile Gly1 5
<210>4<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>骨和軟骨刺激肽4<400>4Asn Gly Leu Xaa Gly Pro Ile Gly Xaa1 5<210>5<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>骨和軟骨刺激肽5<400>5Asn Gly Leu Pro Gly Pro1 5<210>6<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>骨和軟骨刺激肽6<400>6Leu Pro Gly Pro1<210>7<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>骨和軟骨刺激肽7<400>7Pro Gly Pro Ile Gly1 5<210>8<211>9<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>骨和軟骨刺激肽8<400>8Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro1 5<210>9<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>骨和軟骨刺激肽9<400>9Pro Gly Pro Ile Gly Pro1 5<210>10<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>骨和軟骨刺激肽10<400>10Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg1 5 10<210>11<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>骨和軟骨刺激肽11<400>11Gly Pro Ile Gly1<210>12<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>骨和軟骨刺激肽12<400>12
Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Arg Thr Gly Asp Ala1 5 10 15<210>13<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>骨和軟骨刺激肽13<400>13Gly Pro Arg Gly Arg Thr Gly Asp Ala1 5<210>14<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>骨和軟骨刺激肽14<400>14Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro1 5<210>15<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>骨和軟骨刺激肽15<400>15Pro Gly Pro Ile Gly Xaa1 5<210>16<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>骨和軟骨刺激肽16<400>16Pro Gly Pro Ile1
<210>17<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>骨和軟骨刺激肽17<400>17Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly1 5<210>18<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>骨和軟骨刺激肽18<400>18Gly Pro Ile Gly Xaa1 5<210>19<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>骨和軟骨刺激肽19<400>19Gly Pro Ile Gly Pro1 5<210>20<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>骨和軟骨刺激肽20<400>20Pro Ile Gly Pro權利要求
1.一種肽，包括選自“PG”、“GP”、“PI”和“IG”的氨基酸基元并最多具有所述氨基酸基元上游和/或下游的10個氨基酸，其中所述基元中的“P”表示脯氨酸或羥脯氨酸，以及所述肽刺激骨，軟骨和相連結締組織的發育，維持和修復。
2.權利要求1的肽，其中所述肽刺激骨細胞、骨細胞前體和與其共有譜系的細胞的活性。
3.權利要求1的肽，其中所述肽刺激軟骨細胞、軟骨細胞前體和與其共有譜系的細胞的活性。
4.權利要求1的肽，其中所述肽刺激骨形成。
5.權利要求1的肽，其中所述肽刺激軟骨形成。
6.權利要求1-5任一項的肽，其中所述肽在體外，離體和/或體內刺激反應。
7.權利要求6的肽，其中所述肽長度為至少3個氨基酸。
8.權利要求6的肽，其中所述肽長度為至少4個氨基酸。
9.權利要求6，7或8的肽，其中所述肽進一步包括一個或多個接頭基。
10.權利要求9的肽，其中所述接頭基選自碳二亞胺，醛，馬來酰亞胺，巰基，氨基，羧基，羥基和NHS酯，修飾的半胱氨酸，磷酸化的氨基酸，氨基酸，二醋酸，磺酰氯，異氰酸酯，異硫氰酸酯，環氧樹脂，雙膦酸酯，焦磷酸酯，磷酸酯，二硫化物，苯基疊氮化物，烷基鹵以及酰肼酰基氯。
11.權利要求1-10任一項所述的肽，其中所述肽提供以嵌合肽。
12.權利要求11的肽，其中所述嵌合肽包括選自下列蛋白的鈣結合序列骨調素，牙基質磷蛋白，卵黃高磷蛋白，phosphohoryn，β-酪蛋白，stratherin，基質gla蛋白，核黃素結合蛋白以及αS1酪蛋白。
13.權利要求12的肽，其中所述結合序列選自S*S*，S*S*GS*EE，S*S*S*EE，S*S*S*S*S*S*，DS*S*DS*S*，S*LS*S*S*S*，DS*S*EE，DS*S*ES*，S*MS*S*S*EE和S*IS*S*S*EE及其組合。
14.權利要求1-5任一項的肽，其中所述刺激的評價是分析一種或多種選自下列的標準骨礦物質密度，骨礦物質含量，堿性磷酸酶活性，成骨細胞的增殖，骨結形成，骨結礦化，軟骨細胞增殖，胞內鈣通道分析，膠原蛋白分析，以及蛋白聚糖分析。
15.權利要求1-13任一項的肽，其中所述肽以組合物與可藥用載體一起提供。
16.權利要求15的肽，其中所述組合物進一步包括選自下列的因子磷酸鈣，硫酸鈣，碳酸鈣，血纖蛋白，透明質酸，蛋白聚糖，降血鈣素，雌激素，雌二醇，前列腺素A1，雙膦酸，伊普黃酮，氟化鈉，維生素K，骨形態發生蛋白，成纖維細胞生長因子，血小板衍生的生長因子，轉化生長因子，胰島素樣生長因子1和2，內皮素，甲狀旁腺激素，表皮生長因子，白介素抑制因子，成骨素及其混合物。
17.權利要求15或16的肽，其中所述組合物可局部和/或全身性施用。
18.權利要求17的肽，其中全身性施用選自靜脈內，肌內，腹膜內注射，口服，腸內，腸胃外，鼻內，肺部，局部或經皮施用及其組合。
19.權利要求17的肽，其中局部施用通過注射或采用移植物提供。
20.權利要求19的肽，其中所述肽提供以包衣，填料或散布在所述移植物的基質內。
21.權利要求20的肽，其中所述肽與顆粒或粉末狀生物材料化合物一起提供。
22.權利要求1，15或21的肽，其中所述肽與生物相容的和/或生物可降解的聚合物一起提供。
23.權利要求1-5任一項的肽，其中所述肽選自NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQ.ID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)；PIGP(SEQ.ID.NO.20)及其混合物。
24.權利要求23的肽的功能性類似物。
25.權利要求23的肽的模擬類似物。
26.一種具有選自下列通式的肽(I)X-(P1)mGly(P2)n，(II)(P1)mGly(P2)n-Z，和(III)X-(P1)mGly(P2)n-Z；-其中P1和P2選自脯氨酸和羥脯氨酸，m＝0或1，n＝0或1，其中m和n獨立地選擇；-其中X選自亮氨酸、甘氨酸-亮氨酸、脯氨酸-異亮氨酸、甘氨酸-脯氨酸-異亮氨酸、天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸和脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸；以及-其中Z選自異亮氨酸、精氨酸、異亮氨酸-甘氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-羥脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸和精氨酸-甘氨酸-精氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸。
27.權利要求26的肽，其中所述肽刺激骨細胞、骨細胞前體和與其共有譜系的細胞的活性。
28.權利要求26的肽，其中所述肽刺激軟骨細胞、軟骨細胞前體和與其共有譜系的細胞的活性。
29.權利要求26的肽，其中所述肽刺激骨，軟骨和相連結締組織的發育，維持和修復。
30.權利要求26-29的肽，其中所述肽在體外，離體和/或體內刺激反應。
31.權利要求30的肽，其中所述肽長度為至少3個氨基酸。
32.權利要求30的肽，其中所述肽長度為至少4個氨基酸。
33.權利要求30的肽，其中所述肽進一步包括一個或多個接頭基。
34.權利要求33的肽，其中所述接頭基選自碳二亞胺，醛，馬來酰亞胺，巰基，氨基，羧基，羥基和NHS酯，修飾的半胱氨酸，磷酸化的氨基酸，氨基酸，二醋酸，磺酰氯，異氰酸酯，異硫氰酸酯，環氧樹脂，雙膦酸酯，焦磷酸酯，磷酸酯，二硫化物，苯基疊氮化物，烷基鹵以及酰肼酰基氯。
35.權利要求26的肽，其中所述肽提供以嵌合肽。
36.權利要求35的肽，其中所述嵌合肽包括選自下列蛋白的鈣結合序列骨調素，牙基質磷蛋白，卵黃高磷蛋白，phosphohoryn，β-酪蛋白，stratherin，基質gla蛋白，核黃素結合蛋白以及αS1酪蛋白。
37.權利要求36的肽，其中所述結合序列選自S*S*，S*S*GS*EE，S*S*S*EE，S*S*S*S*S*S*，DS*S*DS*S*，S*LS*S*S*S*，DS*S*EE，DS*S*ES*，S*MS*S*S*EE和S*IS*S*S*EE及其組合。
38.權利要求30的肽，其中所述刺激的評價是分析一種或多種選自下列的標準骨礦物質密度，骨礦物質含量，堿性磷酸酶活性，成骨細胞的增殖，骨結形成，骨結礦化，軟骨細胞增殖，胞內鈣通道分析，膠原蛋白分析，以及蛋白聚糖分析。
39.權利要求26的肽，其中所述肽選自NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)；和PIGP(SEQ.ID.NO.20)。
40.權利要求39的肽，其中所述肽具有序列NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)。
41.權利要求39的肽，其中所述肽具有序列PGPIG(SEQ ID.NO.7)。
42.權利要求39的肽，其中所述肽具有序列GPIG(SEQ.ID.NO.11)。
43.權利要求39的肽，其中所述肽具有序列PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)。
44.權利要求30的肽的功能性類似物。
45.權利要求30的肽的模擬類似物。
46.一種用于刺激骨、軟骨和相關結締組織的發育、維持和修復的組合物，所述組合物包括具有選自下列通式的肽(I)X-(P1)mGly(P2)n，(II)(P1)mGly(P2)n-Z，和(III)X-(P1)mGly(P2)n-Z；-其中P1和P2選自脯氨酸和羥脯氨酸，m＝0或1，n＝0或1，其中m和n獨立地選擇；-其中X選自亮氨酸、甘氨酸-亮氨酸、脯氨酸-異亮氨酸、甘氨酸-脯氨酸-異亮氨酸、天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸和脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸；-其中Z選自異亮氨酸、精氨酸、異亮氨酸-甘氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-羥脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸和精氨酸-甘氨酸-精氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸；以及可藥用載體。
47.權利要求46的組合物，其中所述組合物進一步包括選自下列的因子磷酸鈣，硫酸鈣，碳酸鈣，血纖蛋白，透明質酸，蛋白聚糖，降血鈣素，雌激素，雌二醇，前列腺素A1，雙膦酸，伊普黃酮，氟化鈉，維生素K，骨形態發生蛋白，成纖維細胞生長因子，血小板衍生的生長因子，轉化生長因子，胰島素樣生長因子1和2，內皮素，甲狀旁腺激素，表皮生長因子，白介素抑制因子，成骨素及其混合物。
48.權利要求45或46的肽，其中所述肽選自NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQ.ID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)；PIGP(SEQ.ID.NO.20)及其混合物。
49.權利要求48的組合物，其中所述組合物可局部和/或全身性施用。
50.權利要求49的組合物，其中全身性施用選自靜脈內，肌內，腹膜內注射，口服，腸內，腸胃外，鼻內，肺部，局部或經皮施用及其組合。
51.權利要求49的組合物，其中局部施用通過注射或采用移植物提供。
52.權利要求51的組合物，其中所述組合物提供以包衣，填料或散布在所述移植物的基質內。
53.權利要求52的組合物，其中所述組合物與顆粒或粉末狀生物材料化合物一起提供。
54.權利要求48，52或53的組合物，其中所述組合物與生物相容的和/或生物可降解的聚合物一起提供。
55.一種在哺乳動物中刺激骨、軟骨和相連結締組織發育、維持和修復的方法，所述方法包括施用有效量的肽，所述肽含有選自“PG”、“GP”、“PI”和“IG”的氨基酸基元并最多具有所述氨基酸基元上游和/或下游的10個氨基酸，其中基元中的“P”表示脯氨酸或羥脯氨酸。
56.權利要求55的肽，其中所述肽長度為至少3個氨基酸。
57.權利要求56的肽，其中所述肽長度為至少4個氨基酸。
58.權利要求55，56或57的方法，其中所述肽由選自下列的通式代表(I)X-(P1)mGly(P2)n，(II)(P1)mGly(P2)n-Z，和(III)X-(P1)mGly(P2)n-Z；-其中P1和P2選自脯氨酸和羥脯氨酸，m＝0或1，n＝0或1，其中m和n獨立地選擇；-其中X選自亮氨酸、甘氨酸-亮氨酸、脯氨酸-異亮氨酸、甘氨酸-脯氨酸-異亮氨酸、天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸和脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸；-其中Z選自異亮氨酸、精氨酸、異亮氨酸-甘氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-羥脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸、異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸和精氨酸-甘氨酸-精氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸。
59.權利要求58的方法，其中所述肽選自NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQ.ID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)；PIGP(SEQ.ID.NO.20)及其混合物。
60.一種在哺乳動物中刺激骨發育的方法，所述方法包括施用有效量的一種或多種選自下列的肽SEQ.ID.NO.1，SEQ.ID.NO.4，SEQ.ID.NO.7，SEQ.ID.NO.8，SEQ.ID.NO.9，SEQ.ID.NO.10，SEQ.ID.NO.12，SEQ.ID.NO.15和SEQ.ID.NO.18及其功能性類似物和模擬類似物。
61.一種在哺乳動物中刺激軟骨發育的方法，所述方法包括施用有效量的一種或多種選自下列的肽SEQ.ID.NO.1，SEQ.ID.NO.4，SEQ.ID.NO.7，SEQ.ID.NO.8，SEQ.ID.NO.9，SEQ.ID.NO.10，SEQ.ID.NO.11及其功能性類似物和模擬類似物。
62.一種刺激骨和/或軟骨形成和相連結締組織的肽的篩選方法，所述方法包括下列步驟(a)將能夠接受骨和/或軟骨形成的第一生物樣品與測試肽接觸；(b)單獨將能夠接受骨和/或軟骨形成的第二生物樣品與生物有效量的選自下列的肽接觸從而提供對照NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQ.ID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID，NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)；和PIGP(SEQ.ID.NO.20)；(c)評價由步驟(a)和步驟(b)產生的骨和/或軟骨形成的水平；以及(d)比較步驟(c)中評價的骨和/或軟骨形成的水平，由此能夠刺激骨和/或軟骨形成的肽由其改變骨和/或軟骨形成的水平的能力與步驟(b)的對照比較后所鑒定。
63.一種刺激骨和/或軟骨形成和相連結締組織的調節劑的篩選方法，所述方法包括下列步驟(a)將能夠接受骨和/或軟骨形成的第一生物樣品與測試化合物和生物有效量的選自下列的肽接觸NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQ.ID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)；和PIGP(SEQ.ID.NO.20)；(b)單獨將第二生物樣品與生物有效量的選自下列的肽接觸從而提供對照NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQ.ID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)；和PIGP(SEQ.ID.NO.20)；(c)評價由步驟(a)和步驟(b)產生的骨和/或軟骨形成的水平；以及(d)比較步驟(c)中評價的骨和/或軟骨形成的水平，由此骨和/或軟骨形成和相連結締組織的調節劑由其改變骨和/或軟骨形成的水平的能力與步驟(b)的對照比較后所鑒定。
64.權利要求62或63的方法，其中步驟(c)的評價是分析一種或多種選自下列的標準骨礦物質密度，骨礦物質含量，堿性磷酸酶活性，成骨細胞的增殖，骨結形成，骨結礦化，軟骨細胞增殖，胞內鈣通道分析，膠原蛋白分析，以及蛋白聚糖分析。
65.一種刺激骨、軟骨和相連結締組織的發育、維持和修復的肽的鑒定方法，所述方法包括-確定所述肽是否與一種或多種選自下列的肽具有可比較的活性NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQ.ID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)；和PIGP(SEQ.ID.NO.20)；其中所述活性的評價是分析一種或多種選自下列的標準骨礦物質密度，骨礦物質含量，堿性磷酸酶活性，成骨細胞增殖，骨結形成，骨結礦物化，軟骨細胞增殖，膠原蛋白分析和蛋白聚糖分析。
66.一種肽，其包含一個或多個“GP”和/或“PG”基元，并且包含多達共計約20個氨基酸，其中基元中的“P”為脯氨酸或羥脯氨酸，以及所述肽誘導骨和軟骨細胞的活性，以致骨和軟骨組織得以發育，維持和/或修復。
全文摘要
本發明公開了一些新型肽，其包括選自“PG”、“GP”、“PI”和“IG”的氨基酸基元，并最多具有氨基酸基元上游或下游的10個氨基酸，其中基元中的“P”表示脯氨酸或羥脯氨酸，以及肽刺激骨、軟骨和相連結締組織的發育、維持和修復。本發明進一步涉及這些肽的藥物組合物，以及肽的治療和預防用途。
文檔編號C07K14/78GK1649899SQ03810034
公開日2005年8月3日 申請日期2003年5月2日 優先權日2002年5月3日
發明者丹尼斯·R·辛代里, 西德尼·M·皮尤, 蒂莫西·J·N·史密斯 申請人:米列姆·貝爾羅吉克公司