可與觸珠蛋白受體配體結(jié)合相互作用的分子的用途的制作方法

專利名稱：可與觸珠蛋白受體配體結(jié)合相互作用的分子的用途的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及預防和治療葡萄球菌感染的藥物的制備。
背景技術(shù)：
葡萄球菌感染是全世界醫(yī)院中一個日益嚴重的威脅。金黃色葡萄球菌(S.aureus)是最常見的醫(yī)院感染來源之一。它引起多種不同的感染，如無癥狀的鼻腔攜帶、中度到重度皮膚和創(chuàng)傷感染、腹膜炎、骨髓炎、肺炎、尿道感染。當該細菌存在于血液中并且在全身移動時，最嚴重的情況是菌血癥和膿毒癥。葡萄球菌的外觀和致病能力與抗生素的廣泛使用有關(guān)，抗生素已經(jīng)誘發(fā)并且在繼續(xù)誘發(fā)多藥耐藥性。由于這個原因，針對葡萄球菌感染的醫(yī)學治療不能只依賴抗生素。這些疾病的治療需要策略上的改變，旨在預防感染或者干擾促進疾病的細菌機制(綜述見Cossley編著，1997)。
因此，本發(fā)明的一個目的在于為了對抗葡萄球菌感染提供替代治療方法。
本發(fā)明提供可與觸珠蛋白受體配體結(jié)合相互作用的分子在制備預防和治療葡萄球菌感染的藥物中的用途，從而解決了這一問題。

發(fā)明內(nèi)容
觸珠蛋白受體，以前被稱為LPXT-Gp5，沒有與之有關(guān)的任何功能(特別是受體功能)，使用來自不同金黃色葡萄球菌感染患者的人血清，通過細菌表面展示和蛋白質(zhì)組學，被鑒定為一種重要的抗原(WO02/059148 A，Etz等人，2002，Vytvytska，2002)。它屬于金黃色葡萄球菌中的一類細胞表面蛋白質(zhì)，與宿主組織、宿主細胞和分子的直接相互作用有關(guān)(Patti等人，1994；Schneewind等人，1995)。本發(fā)明提供了與該蛋白質(zhì)的生物學功能有關(guān)的新用途，該蛋白質(zhì)作為觸珠蛋白受體，介導金黃色葡萄球菌的鐵攝取，影響吞噬細胞的殺傷。
金黃色葡萄球菌和其它病原體的最限制生長的因素之一是鐵限制。本發(fā)明第一次使預防和治療金黃色葡萄球菌感染的藥物制備針對金黃色葡萄球菌的鐵攝取途徑。鐵作為大量酶的輔因子是細菌的一種必需的、限制生長的養(yǎng)分。鐵過載產(chǎn)生毒性，主要是因為不受控制的氧化還原循環(huán)、酶抑制、可與所有類型的生物分子強烈反應的羥自由基的形成，DNA損傷產(chǎn)生最有害的后果。因此，鐵饑餓與鐵中毒之間的精細平衡至關(guān)重要。眾所周知，鐵在幾種感染的易感性和后果中起作用。低于和高于臨界水平的鐵濃度可減弱身體的抗微生物防御。在醫(yī)學領域眾所周知，補鐵(特別是靜脈內(nèi))能夠加重不明顯的慢性疾病，眾所周知的例子是結(jié)核。這一現(xiàn)象在幾種動物模型中再現(xiàn)(Lounis等人，2001)。
在體內(nèi)，(在宿主中生長的)病原體細菌面臨鐵限制，因為在真核生物中不含或者只含少量(10-12-15M)的游離鐵，因為事實上在需氧條件和生理pH下，F(xiàn)e離子是不可溶的且有毒的。鐵被小無機物(如檸檬酸鹽)復合或與蛋白質(zhì)結(jié)合。細胞外致病菌必須從Fe結(jié)合的血漿(胞外)蛋白質(zhì)(如轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳鐵蛋白、游離(血漿)血紅蛋白和血紅素結(jié)合蛋白)中提取鐵。細胞內(nèi)鐵構(gòu)成血紅素和非血紅素鐵結(jié)合蛋白，最豐富的是血紅蛋白(紅細胞中)、肌紅蛋白(肌肉中)和細胞色素C(所有細胞中)。過量的鐵在細胞內(nèi)被一種特化的貯存蛋白——鐵蛋白螯合。
由于細菌高度依賴于外部鐵來源，專門的離子獲取系統(tǒng)是宿主中致病菌存活和生長的必要條件。大量細菌蛋白質(zhì)與微生物鐵攝取和轉(zhuǎn)運有關(guān)，在不同細菌種使用的攝取系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)相當多的變化。細菌使用兩種主要的機制從宿主的鐵結(jié)合蛋白中提取鐵。在革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌中鑒定了幾種表面受體，它們直接結(jié)合宿主的鐵結(jié)合蛋白，使它們緊密靠近細菌表面，在表面上鐵或血紅素從這些蛋白質(zhì)上脫落。該方法之后由專門的或通用的轉(zhuǎn)運蛋白穿過膜特異性轉(zhuǎn)運(Braun，2001綜述)。獲得鐵的另外一種機制是產(chǎn)生并分泌低分子量分子，即對Fe3+和血紅素有極高親和力的所謂的鐵載體。這種極高的親和力(10-12M)使這些分子能夠從蛋白質(zhì)結(jié)合的鐵中清除鐵。裝載鐵和血紅素的鐵載體通過特異性受體被攝取，鐵在細胞內(nèi)被利用。不同的細菌偏愛一種或者另外一種、甚至使用兩種方法，并且表達幾種不同的受體，用于結(jié)合宿主的鐵結(jié)合蛋白，或者輸入低分子量鐵螯合化合物，如血紅素、檸檬酸鹽或鐵載體。例如，致病的奈瑟氏球菌(腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoe)、肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)或釀膿鏈球菌(S.pyogenes))不含用于產(chǎn)生和攝取鐵載體成分的酶和受體，只依賴于通過捕獲宿主的鐵結(jié)合蛋白清除鐵。同源轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的(TbpA，B)和乳鐵蛋白結(jié)合的(LbpA，B)蛋白質(zhì)已經(jīng)在奈瑟氏球菌和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)中鑒定(Cornelissen等人，1992；Pettersson等人，1994；Bonnah等人，1995；Biswas和Sparling，1995；Gray-Owen等人，1995；Schryvers，1988)。另外，奈瑟氏球菌也含有與血紅蛋白結(jié)合的受體(HmbR)和觸珠蛋白-血紅蛋白復合物(HpuA，B)(Lewis等人，1997；Kahler等人，2001；Stojiljkovic等人，1996)。在流感嗜血菌中也發(fā)現(xiàn)了血紅蛋白-觸珠蛋白受體(Jin等人，1996；Ren等人，1998)。這些鐵結(jié)合蛋白的表達模式和配體特異性已經(jīng)表征。已經(jīng)確定，它們是在低鐵培養(yǎng)基中生長所必需的，因為敲除株的生長受到限制，但不是完全缺陷，這是由于流感嗜血菌或奈瑟氏球菌表達的血紅素采集系統(tǒng)的多余性質(zhì)。在流感嗜血菌或腦膜炎奈瑟氏球菌感染的恢復期患者的血清中，循環(huán)抗體的存在是體內(nèi)表達的指示。
本發(fā)明證實，重組LPXTGp5能夠在親和純化中使用，用來結(jié)合并純化來自人血漿的血清觸珠蛋白。作為商品獲得的觸珠蛋白也顯示能夠結(jié)合LPXTGp5蛋白，其作為重組蛋白，或者直接分離自細菌細胞。因此，本發(fā)明清楚地表明，LPXTG5作為一種觸珠蛋白受體起作用，用于使觸珠蛋白與金黃色葡萄球菌表面結(jié)合，從而使該細菌能夠攝取鐵。
最豐富的Fe結(jié)合蛋白是血紅蛋白(Hb)，它主要在細胞內(nèi)(紅細胞)。然而，由于紅細胞的生理更新(t1/2＝180天)，血清中總是含有少量(～10μg/ml)的游離血紅蛋白。在溶血過程中，大量Hb釋放到血漿中。血漿(游離)Hb立即通過極高親和力的結(jié)合(Ka＞10-15M)與觸珠蛋白(Hp)復合，后者是一種豐富的(0.5-2mg/ml)血漿糖蛋白。大量溶血能夠耗盡血清觸珠蛋白，因此低Hp濃度對于溶血具有診斷價值。觸珠蛋白與血紅蛋白結(jié)合的主要作用之一是，僅僅通過將蛋白質(zhì)復合物的大小提高到濾過限度以上(＞70kDa)，阻止Hb(64-kDa)被腎小球濾過到尿中。Hp-Hb復合物的形成防止發(fā)展兩種危險的疾病。直接危險是腎小球中高濃度的Hb，這阻塞濾過液的流動，阻止排尿，導致急性腎衰竭。慢性危險是體內(nèi)失鐵，導致鐵缺乏，主要是貧血。為了防止腎臟損傷和失鐵，肝臟的RES(網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng))從循環(huán)中提出Hp-Hb復合物。RES細胞含有對于觸珠蛋白與Hb結(jié)合特異的高親和力受體。
眾所周知，與鐵代謝有關(guān)的血漿蛋白，如觸珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白和乳鐵蛋白，具有免疫功能，有助于正常的感染抗性。
觸珠蛋白是一種急性期蛋白質(zhì)，具有推測的抗炎癥活性。促炎細胞因子IL-6和IL-1可以增強它的肝表達(Baumann等人，1990)。另外，TNF-α似乎迅速提高感染或損傷部位的Hp水平，導致急性炎癥反應的調(diào)節(jié)(Berkova等人，1999)。最近已經(jīng)證實，觸珠蛋白也能夠被肺上皮細胞表達，可能有助于局部微生物抗性(Yang等人，2000)。而且，觸珠蛋白與吞噬細胞功能的調(diào)節(jié)有關(guān)。人吞噬細胞(多形核粒細胞以及單核細胞，但不是嗜酸粒細胞)在特定顆粒內(nèi)含有觸珠蛋白。這些觸珠蛋白貯存反映了從胞外環(huán)境中特異攝取觸珠蛋白。而且，如同其它顆粒部分一樣，觸珠蛋白在吞噬過程中被胞吐(Wagner等人，1996)。在體外測定中，顯示Hp抑制吞噬作用和粒細胞對細菌的胞內(nèi)殺傷(Rossbacher等人，1999)。推測的功能是吞噬過程中氧化爆發(fā)(oxidative burst)的下調(diào)，從而防止吞噬細胞的氧化損傷。最近已經(jīng)描述了巨噬細胞上的一種新型Hp-Hb受體(CD163)(Kristiansen等人，2001)。CD163/Hb清除受體負責肝臟從循環(huán)中攝取Hb-Hp復合物。另外，已經(jīng)證明中性粒細胞表面整聯(lián)蛋白CD11b/CD18結(jié)合Hp(El Ghmati等人，1996)。這些數(shù)據(jù)提示，觸珠蛋白在宿主抗感染和炎癥的防御中具有重要的生物功能，作為免疫系統(tǒng)受體-配體激活的一種天然拮抗劑。
令人感興趣的是，有一些報道稱Hp對細菌(例如釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes))的生長甚至具有直接的抑制作用(Delanghe等人，1998b)。一種觸珠蛋白同源物，觸珠蛋白相關(guān)蛋白(HRP)，被鑒定為一種錐蟲裂解復合物的主要成分，負責T.cruci的直接殺傷(Smith等人，1995)。
人群中存在觸珠蛋白基因多態(tài)性，這是由于編碼Hp一條鏈的復制基因部分引起的?？寡趸鞍踪|(zhì)觸珠蛋白已知有三個表型Hp 1-1、Hp2-1和Hp 2-2。這些不同的表型與不同疾病(如細菌和病毒感染(例如AIDS)、糖尿病、心臟病等)的易感性有關(guān)(Delanghe等人，1998a；Hochberg等人，2002；Van Vlierberghe等人，2001)。主要解釋為不同的分子大小(單體對寡聚體形成)，因此不同的組織穿透和局部抗氧化活性。Hp能夠抵抗Hb誘導的Fenton反應引起的氧化損傷。
由于Hp的眾所周知的抗氧化活性，金黃色葡萄球菌的觸珠蛋白包被可導致吞噬體內(nèi)細菌氧化損傷減少。此外，與金黃色葡萄球菌表面結(jié)合的Hp也可以使其逃脫殺傷，這是通過調(diào)節(jié)進入專業(yè)吞噬細胞的途徑(通過觸珠蛋白受體)，在細胞質(zhì)而不是在吞噬細胞顆粒內(nèi)產(chǎn)生游離細菌。
根據(jù)本發(fā)明，提供了與觸珠蛋白受體介導的配體結(jié)合相互作用的分子，其反過來將導致細菌，特別是金黃色葡萄球菌的鐵饑餓。如本發(fā)明所用的“相互作用”涉及導致阻礙病原體中的這種觸珠蛋白受體與配體結(jié)合的任何相互作用。優(yōu)選地，通過破壞這種機制進行相互作用，即完全滅活或阻斷這種途徑。然而，該途徑功能性的顯著降低(例如通過競爭性反應)通常也足以對抗由含有觸珠蛋白受體的病原體引起的疾病。
本發(fā)明表明，LPXTGp5基因的預測的開放閱讀框(金黃色葡萄球菌N315株中的SA1552，根據(jù)Kuroda等人，2001的描述)(SEQ ID No 1)編碼一種長895個氨基酸的蛋白質(zhì)，它在N端有一個典型的信號肽序列，在C端有典型的革蘭氏陽性錨定基序，包含LPXTG基序、疏水性跨膜區(qū)和帶正電的尾(SEQ ID.No 2)。
應當指出，在本發(fā)明中，“觸珠蛋白受體”是LPXTGp5基因(SEQ ID.No 1)編碼的LPXTGp5蛋白(SEQ ID.No 2)，也被稱為“HarA”，它代表觸珠蛋白受體A，具有針對人血漿觸珠蛋白和觸珠蛋白-血紅蛋白復合物的特異性配體結(jié)合活性。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，可與配體的觸珠蛋白受體結(jié)合相互作用的分子選自觸珠蛋白受體抗體、與根據(jù)SEQ ID NO 2的肽(觸珠蛋白受體)結(jié)合的觸珠蛋白模擬位(mimotope)，或其片段。
“觸珠蛋白受體抗體”包括任何一種抗體或抗體片段或衍生物，其顯示對根據(jù)本發(fā)明的觸珠蛋白受體的結(jié)合親和力。它們可以是多克隆或單克隆抗體、單鏈抗體或含有抗體分子的可變結(jié)合域的其它片段。
抑制與觸珠蛋白(Hp)結(jié)合的一個有效方法是通過抗LPXTGp5的特異性抗體。除了中和其作為HpR的功能以外，相同的抗體能夠支持調(diào)理吞噬，因為Hp結(jié)合區(qū)必須是表面暴露的。在動物模型中使用的保護性疫苗有幾個例子，它們包含細菌鐵攝取受體蛋白(Webb和Cripps，1999)。Webb和Cripps證明，在大鼠模型中，用重組轉(zhuǎn)移結(jié)合蛋白(TbpB)免疫可通過刺激保護性應答(抗體產(chǎn)生)加速從肺中清除無法分型的流感嗜血菌。
而且，抗LPXTGp5抗體能夠用于發(fā)展有效抑制劑和拮抗劑，如模擬位。這些拮抗劑優(yōu)選地是肽或無機(或有機)小分子。此外，HpR的鑒定也能夠產(chǎn)生小藥物抑制劑，是抗細菌化學治療或化學預防的一部分。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，觸珠蛋白受體抗體或觸珠蛋白模擬位可結(jié)合選自SEQ ID NO 4(D1)和SEQ ID NO 6(D2)或其片段的多肽。
在本發(fā)明的過程中，已經(jīng)鑒定了兩個高度同源的結(jié)構(gòu)域(D1和D2)，它們位于LPXTGp5蛋白的胞外部分。這兩個分離的結(jié)構(gòu)域都能夠結(jié)合從人血漿中純化的觸珠蛋白。
根據(jù)一個方面，本發(fā)明也提供了編碼觸珠蛋白結(jié)合分子(即一種觸珠蛋白受體)的基因。因此本發(fā)明也涉及這些含有根據(jù)SEQ.ID.NO.1的序列的基因。編碼根據(jù)SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5的D1或D2結(jié)構(gòu)域的核酸和編碼觸珠蛋白結(jié)合多肽的片段也是根據(jù)本發(fā)明的核酸分子。
根據(jù)本發(fā)明的核酸序列可以是例如RNA或DNA；它們也可以與適當?shù)膯幼?、增強子、標記等序列共存于例如一種載體中，如質(zhì)粒或病毒載體，使多肽或mRNA在靶細胞、組織或體液中表達。根據(jù)SEQ.ID.NO.7的Fur盒是根據(jù)本發(fā)明使用的一種優(yōu)選的調(diào)節(jié)元件。本發(fā)明也包括編碼觸珠蛋白受體或其觸珠蛋白結(jié)合片段的核酸序列，分別可與SEQ.ID.Nos1、3、5、7嚴格雜交的核酸(或其互補序列)。可能的嚴格雜交條件是例如6×SSC(例如Sambrook等人1989，《分子克隆實驗室方法》所定義的)。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了分離的多肽，包括選自下列的多肽SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 6及其觸珠蛋白結(jié)合片段，以及同源結(jié)構(gòu)域?！巴唇Y(jié)構(gòu)域”包括所有觸珠蛋白結(jié)合域，根據(jù)SIM(Expasy)程序(例如可以利用PSIPRED預測排比程序進行二級結(jié)構(gòu)測定(例如用于結(jié)構(gòu)域限定；也用于同源性))計算，它們與SEQ ID NOs 4或6有至少40％、優(yōu)選地至少70％、特別是至少90％的序列同源性。
只在結(jié)構(gòu)域和相鄰區(qū)之間存在顯著同源性

根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供一種合成偶聯(lián)物，其含有一種根據(jù)SEQ ID NO 4的肽，該肽通過非天然存在的接頭與根據(jù)SEQ ID NO 6的肽連接。原則上不干擾Hp結(jié)合的所有偶聯(lián)物都可用于本發(fā)明，例如GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、His-tag、FLAG-尾等)。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，非天然存在的接頭是多肽。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明包括反義技術(shù)的使用。因此，病原體中觸珠蛋白受體的表達被可結(jié)合觸珠蛋白受體mRNA或其調(diào)節(jié)元件的反義核酸分子阻斷或大大抑制。用來與觸珠蛋白受體配體結(jié)合相互作用的分子因此是一種結(jié)合觸珠蛋白受體基因或結(jié)合調(diào)節(jié)元件的反義核酸，用于表達觸珠蛋白受體基因，特別是根據(jù)SEQ ID NO 7的Fur盒。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種在嚴格條件下可與選自SEQID NO 7的核酸序列雜交的核酸。
嚴格雜交條件在本領域公知(見上)。如果核酸序列已知，能夠計算最佳雜交條件。例如，能夠根據(jù)將要雜交的核酸的GC含量確定雜交條件(Sambrook等人1989，《分子克隆實驗室方法》)。
在原核生物中，鐵代謝主要在基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)。在進化過程中，已經(jīng)發(fā)展了高度調(diào)節(jié)的、復雜的、繁瑣的攝取系統(tǒng)，大量基因(在有些情況下＞40種)的表達由優(yōu)勢胞內(nèi)濃度的Fe通過與調(diào)節(jié)蛋白復合直接控制。在幾乎所有細菌中表征最好的、最保守的是Fur阻抑蛋白(鐵攝取調(diào)節(jié)蛋白)。Fur直接感知細胞內(nèi)鐵濃度的改變，是一種鐵結(jié)合蛋白。在足夠或高濃度下，鐵與Fur結(jié)合。鐵的結(jié)合使得該蛋白質(zhì)能夠結(jié)合被稱為fur盒的某些DNA序列，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。在鐵限制條件下，F(xiàn)e2+易于從Fur-Fe復合物上解離，使Fur調(diào)節(jié)的基因轉(zhuǎn)錄(Escolar等人，1999)。重要的是，毒力因子的表達與鐵饑餓聯(lián)系在一起(例如，志賀毒素、大腸菌素、溶血素)，提示低鐵濃度是體內(nèi)“戰(zhàn)場上的”致病菌的一個總體信號。這在目的上可能是合理的，因為細胞毒素、溶血素導致鐵結(jié)合蛋白(如血紅蛋白和肌紅蛋白)釋放，它們是細菌生長的極佳的鐵源。
通常對于革蘭氏陽性菌，特別是葡萄球菌，對它們的鐵轉(zhuǎn)運和調(diào)節(jié)所知相對較少。金黃色葡萄球菌基因組編碼三個鐵攝取調(diào)節(jié)基因(Fur)同源物Fur、PerR和Zur。發(fā)現(xiàn)PerR控制編碼氧化應激抗性蛋白過氧化氫酶(KatA)、烷基氫過氧化物還原酶(AhpCF)、細菌鐵蛋白共遷移蛋白(Bcp)和硫氧還蛋白還原酶(TrxB)的基因轉(zhuǎn)錄。此外，PerR也調(diào)節(jié)編碼鐵貯存蛋白-鐵蛋白和鐵蛋白樣Dps同源物MrgA的基因的轉(zhuǎn)錄(Horsburgh等人，2001綜述)。而且，已經(jīng)證明金黃色葡萄球菌能夠利用幾種氧肟酸鹽鐵載體在鐵限制條件下生長(Sebulsky等人，2000)。曾經(jīng)提出sir(鐵載體調(diào)節(jié))操縱子構(gòu)成金黃色葡萄球菌中的鐵載體轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。它含有受體和細胞質(zhì)膜結(jié)合的交通ATPase，該酶與鐵(III)-氧肟酸鹽復合物的具體轉(zhuǎn)運有關(guān)(Sebulsky等人，2001)。然而，關(guān)于通過與宿主鐵結(jié)合蛋白直接結(jié)合獲得鐵所知甚少。表面GAPDH是一種42-kDa的金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)，可能是轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Modun和Williams，1999)。最近，一種LPXTG蛋白已經(jīng)被鑒定為金黃色葡萄球菌的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Taylor和Heinrichs，2002)。本發(fā)明表明，LPXTGp5上游的核苷酸序列對應于位于起始ATG密碼子上游-53和-35bps之間的共有fur結(jié)合盒。本發(fā)明表明，LPXTGp5一方面在fur缺失突變的金黃色葡萄球菌株中組成型表達，另一方面，在fur基因完整的野生型金黃色葡萄球菌株中，這種表達是鐵調(diào)節(jié)的。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種方法，用于分離可與觸珠蛋白受體配體結(jié)合相互作用的分子，其特征在于下列步驟-在固體表面上提供觸珠蛋白受體多肽或其觸珠蛋白結(jié)合片段，-使標記的觸珠蛋白與這種固定的觸珠蛋白受體多肽或其觸珠蛋白結(jié)合片段結(jié)合，形成固定的觸珠蛋白受體多肽或其觸珠蛋白結(jié)合片段與標記的觸珠蛋白的復合物，-使這種復合物接觸含有候選分子的庫(pool)，-確定該庫中替代復合物中所述標記觸珠蛋白的分子，和-分離替代該復合物中的標記觸珠蛋白的所述分子。
利用這種方法，能夠分離與觸珠蛋白競爭觸珠蛋白受體之觸珠蛋白結(jié)合位點的分子。
根據(jù)本發(fā)明的一種相當?shù)姆椒ǎ糜诜蛛x可與觸珠蛋白受體配體結(jié)合相互作用的分子，其特征在于下列步驟-提供固定于固體表面上的觸珠蛋白，-使標記的觸珠蛋白受體多肽或其觸珠蛋白結(jié)合片段與這種固定的觸珠蛋白結(jié)合，形成固定的觸珠蛋白與標記的觸珠蛋白受體多肽或其觸珠蛋白結(jié)合片段的復合物，-使該復合物接觸含有候選分子的庫，
-確定該庫中替代該復合物中所述標記觸珠蛋白受體多肽或其觸珠蛋白結(jié)合片段，并與固定的觸珠蛋白結(jié)合的分子，-分離該庫中與固定觸珠蛋白結(jié)合的所述分子。
利用該方法，能夠分離觸珠蛋白受體模擬位。
根據(jù)本發(fā)明的另一種相當?shù)姆椒?，用于分離可與觸珠蛋白受體配體結(jié)合相互作用的分子，其特征在于下列步驟-提供候選分子庫，-從該庫中提取并分離可與固定的觸珠蛋白受體或其觸珠蛋白結(jié)合片段結(jié)合的分子，-從該庫中提取并分離可與固定的觸珠蛋白結(jié)合的分子，-使其余的候選分子庫接觸在觸珠蛋白與觸珠蛋白受體或其觸珠蛋白結(jié)合片段之間形成的固定復合物，-分離與該固定復合物結(jié)合的所述分子。
利用該方法，能夠分離特異性結(jié)合觸珠蛋白/觸珠蛋白受體復合物而不結(jié)合(未復合的)單種成分的分子。因為復合物只在病原體細胞表面上體內(nèi)存在，因此能夠?qū)⑦@些復合物特異性分子與適當?shù)膶共≡w的分子(例如特定抗生素)組合，以實現(xiàn)病原體的定點控制。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，該觸珠蛋白結(jié)合片段選自SEQID No.4、SEQ ID No.6及其片段，或這些片段的組合。
如本發(fā)明的實施例所述，能夠建立一種基于ELISA的體外測定和一種基于FACS的體外測定，用于測定LPXTGp5或其片段(例如D1和D2)與觸珠蛋白的競爭性結(jié)合。這類測定系統(tǒng)在篩查、分離可相互作用或破壞LPXTGp5和觸珠蛋白相互作用的分子中特別有用。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，該觸珠蛋白受體是金黃色葡萄球菌觸珠蛋白受體。
在本發(fā)明的另外一個優(yōu)選實施方案中，該觸珠蛋白是一種哺乳動物，特別是人觸珠蛋白。
本發(fā)明通過下列實施例和附圖更詳細地描述，但是并不限于此。


圖1顯示LPXTGp5蛋白的結(jié)構(gòu)，以及LPXTGp5與含有同源結(jié)構(gòu)域的其它葡萄球菌蛋白質(zhì)之間的二級結(jié)構(gòu)的比較。
圖2通過凝膠電泳、蛋白質(zhì)染色和免疫印跡法顯示重組LPXTGp5。
圖3-4顯示在不同金黃色葡萄球菌感染患者和健康供體的血清中，測定的抗rLPXTGp5、D1和D2的IgG水平。
圖5顯示人血漿蛋白質(zhì)與重組LPXTGp5的結(jié)合。
圖6顯示觸珠蛋白與體外培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌細胞表達的原始LPXTGp5的結(jié)合。
圖7顯示金黃色葡萄球菌的依賴生長條件的LPXTGp5表達。
圖8顯示fur盒序列的排比，以及鐵和Fur調(diào)節(jié)的LPXTGp5表達。
圖9顯示在基于ELISA的測定中，rLPXTGp5結(jié)構(gòu)域?qū)τ|珠蛋白的結(jié)合。
圖10顯示在基于FACS的測定中，觸珠蛋白與活金黃色葡萄球菌細胞的結(jié)合。
圖11顯示在D1結(jié)構(gòu)域存在下，觸珠蛋白與金黃色葡萄球菌結(jié)合的抑制。
圖12顯示觸珠蛋白與金黃色葡萄球菌8325-4和LXTGp5KO的結(jié)合。
圖13顯示Hp-Hb復合物引起的金黃色葡萄球菌生長的增強。
圖14顯示觸珠蛋白受體結(jié)合觸珠蛋白-血紅蛋白復合物。
實施例方法與實驗程序菌株和培養(yǎng)條件金黃色葡萄球菌野生株8325-4(Novick，1967)、臨床分離株COL(Shafer和Iandolo，1979)和限制缺陷株RN4220(Kreiswirth等人，1983)來自我們實驗室的菌株庫。金黃色葡萄球菌fur突變體(Horsburgh等人，2001)由Simon Foster(Sheffield University，UK)惠贈。金黃色葡萄球菌株在BHI(腦心浸液)培養(yǎng)液或RPMI 1640組織培養(yǎng)基(含有25mMHepes緩沖液和L-谷氨酰胺，Gibco BRL)中培養(yǎng)，作為鐵含量較少的貧乏培養(yǎng)基。向RPMI培養(yǎng)基中加入FeCl3至終濃度為25μM實現(xiàn)補鐵?？勺鳛樯唐帆@得的大腸桿菌BL21株和ElectroMAX DH10B(Invitrogen)分別用于重組蛋白質(zhì)表達和克隆目的，在Luria-Bertani培養(yǎng)液(LB)中生長。當含有抗生素時，以下列濃度加入對于大腸桿菌氨芐青霉素，100μg ml-1；紅霉素，300μg ml-1；對于金黃色葡萄球菌紅霉素，5μg ml-1；林可霉素，25μg mol-1；四環(huán)素，5μg ml-1。除非另外說明，所有細菌培養(yǎng)都在37℃和150轉(zhuǎn)/分振搖下進行。
細菌裂解物制備在蛋白酶抑制劑(Complete∑，不含EDTA的片劑，Roche)存在下，通過在37℃下溶葡萄球菌素消化(100μg ml-1，在PBS中)30分鐘，制備總細菌裂解物。除了酶消化之外，也利用微型超聲破碎儀(BandelinSonopuls，HD 2200，德國)超聲處理，破壞細胞。離心后，回收可溶性級分，用Bredford法(Bio-Rad蛋白質(zhì)測定法)測定蛋白質(zhì)濃度。
重組HarA的表達利用摻入BsaI位點的基因特異性寡核苷酸HARA1和HARA2，由金黃色葡萄球菌COL基因組DNA擴增編碼HarA的cDNA(表1)。將限制性內(nèi)切酶消化的PCR產(chǎn)物克隆到BsaI酶切的pASK-IBA4載體中，位于編碼Strep-tag II(IBA，Gottingen)的序列的下游。獲得的基因缺乏位于sortase酶切位點(LPKT，G)下游的對應于信號肽和C端部分的序列(QAQA，AENT)。通過StrepTactin親和層析(根據(jù)廠商說明)，從無水四環(huán)素誘導的BL21大腸桿菌的細菌提取物中純化重組蛋白。除了全長蛋白質(zhì)之外，擴增對應于預測的D1和D2結(jié)構(gòu)域的DNA序列也產(chǎn)生HarA的兩種截短形式。分別使用寡核苷酸引物MOL1031和MOL1032或MOL1033和MOL1034，產(chǎn)生聚合酶鏈反應產(chǎn)物(表1)，然后用BamHI-SalI消化，以插入BamHI-SalI消化的pGEX-4T-3(AmershamBiosciences)中。通過超聲處理(緩沖液50mM Tris-HCl pH8.0，100mMNacl，1mM EDTA)從IPTG誘導的BL21大腸桿菌細胞中提取GST融合蛋白，在谷胱甘肽Sepharose 4B親和柱(Amersham Biosciences)上從可溶性細菌級分中純化。通過凝血酶消化(50U ml-1，室溫下3小時)或使用10mM谷胱甘肽，洗脫重組蛋白。
表1.引物列表名稱核苷酸序列 限制酶切位點以下劃線標出人血漿蛋白質(zhì)的親和純化首先，通過與Ultralink固定的蛋白質(zhì)G珠(PIERCE)結(jié)合，使人血漿耗盡IgG。簡言之，將用PBS(pH7.4)1∶2稀釋的1ml血漿分兩次加到蛋白G Sepharose柱上，收集流過液。IgG耗盡的血漿(～60mg總蛋白質(zhì))與固定于StrepTactin瓊脂糖(IBA，Gottingen)上的20ug StrepII-標記的重組蛋白溫育。用PBS充分洗珠后，用100μl等電聚焦樣品緩沖液(IEF10M尿素，4％CHAPS，0.5％SDS，100mM DTT)洗脫蛋白質(zhì)。
使用純化觸珠蛋白的金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)的親和純化通過200μg生物素化的觸珠蛋白(Hp∶生物素=1∶10)與40μl鏈霉抗生物素蛋白凝膠Ultralink Plus(PIERCE)結(jié)合，制備觸珠蛋白親和柱。從在RPMI中培養(yǎng)到穩(wěn)定期的金黃色葡萄球菌8325-4細胞中提取總蛋白質(zhì)，將2mg加到Hp柱上。充分洗滌后，結(jié)合的蛋白質(zhì)用100μl IEF緩沖液洗脫，40μl洗脫物通過SDS-PAGE隨后通過免疫印跡法分析。
二維凝膠電泳高分辨率二維凝膠電泳如別處所述進行(Hochstrasser等人，1988)，其使用mini-Protean電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)。為了分析IgG耗盡的血漿，用IEF樣品緩沖液稀釋1μl樣品，可達10μl。樣品緩沖液中的洗脫級分直接加到凝膠上。一維等電聚焦在2625V-h下在1mm×10cm管式凝膠中分步進行(10min，500V，3.5h，750V)，其中使用4％丙烯酰胺(Gerbu，Gaiberg，德國)/0.1％PDA，0.035％Nonidet P-40和2％兩性電解質(zhì)(pH3.5-10∶pH4-8∶pH5-7＝1∶1∶2；Merck，Darmstadt，德國)，用脫氣的20mM NaOH作為陰極電解質(zhì)，6mM H3PO4作為陽極電解液。管式凝膠置于1.0mm 12％SDS-PAGE平板凝膠之上。用3％SDS，70mM Tris堿，0.001％溴酚藍平衡3分鐘后，使用0.1％SDS，25mMTris堿和200mM甘氨酸作為電極緩沖液，在15℃下進行第二維電泳。凝膠用考馬斯藍染色。在該系統(tǒng)中可以檢測的蛋白質(zhì)的范圍是10-220-kDa，pI3.5-7.5。
抗HarA抗體的產(chǎn)生從經(jīng)ELISA確定含有高水平抗rHarA抗體的健康供體的血漿中分離人抗HarA IgG。50ml血漿用ImmunoPure IgG結(jié)合緩沖液(PIERCE)1∶2稀釋，加到UltraLink固定的蛋白G珠(PIERCE)上。與該柱結(jié)合的IgG用ImmunoPure IgG洗脫緩沖液(PIERCE)洗脫，用1M Tris-HClpH8.0中和。合并洗脫級分，在4℃下對PBS透析過夜。150mg IgG與40mg生物素標記的HarA溫育，后者固定于50μl UltraLink Plus固定的鏈霉抗生物素蛋白凝膠(PIERCE)上。在充分洗滌后，用ImmunoPure IgG洗脫緩沖液洗脫級分。這種純化產(chǎn)生～20μg IgG，使用rHarA和幾種無關(guān)金黃色葡萄球菌重組蛋白，通過ELISA和免疫印跡法檢測其特異性，作為陰性對照。用代表全長HarA或含有單結(jié)構(gòu)域D1和D2的截短形式的重組蛋白免疫兔，產(chǎn)生超免疫的多克隆免疫血清。在采血前，新西蘭白兔以3周的間隔免疫三次，每只兔每次注射250μg蛋白質(zhì)。有效的免疫和特異性抗體的存在使用各自的重組蛋白通過ELISA和免疫印跡法證實。
免疫印跡利用mini-Protean電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)通過一維和二維SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，并利用半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Bio-Rad)將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(ECL，Amersham Biosciences)上，通過麗春紅S染色顯示。用5％牛奶封閉過夜后，加入100ng ml-1濃度的純化的人抗HarA IgG或1∶10000稀釋的兔免疫前或免疫血清，HarA蛋白的特異性檢測使用HRP標記的山羊抗人IgG(Southern Biotech)或HRP標記的山羊抗兔IgG(Amersham Biosciences)。用ECL檢測系統(tǒng)(Amersham Biosciences)檢測信號。
利用抗HarA抗體的細胞表面染色在含有或不含作為鐵源的25μM FeCl3的情況下，在RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對數(shù)晚期的5×106金黃色葡萄球菌細胞(OD600為0.8-1.0；在RPMI中的最大OD600～1.6)用多克隆兔抗HarA抗血清染色。在加入1∶500稀釋的兔超免疫血清之前，與10μg樣品-1的人IgG Fc片段(Jackson ImmunoResearch)溫育，阻止抗體的非特異性結(jié)合。用PBS洗滌后，加入第二種試劑——FITC標記的抗兔IgG/Fab特異性片段(Jackson ImmunoResearch)。所有步驟都在冰上進行，每步30分鐘。最后，用PBS洗滌細胞，用2％PFA固定，用FACScan(Becton Dickinson)定量熒光。
觸珠蛋白結(jié)合測定基于ELISA的體外測定以兩個不同的設置進行。首先，我們使用從合并的人血漿(SIGMA和FLUKA)中純化的觸珠蛋白作為包被試劑，它在包被緩沖液(0.1M碳酸鈉，pH9.3)中濃度為10μg ml-1，并且以2.5-12pmoles(2-10μg ml-1)的量使用GST-D1和GST-D2作為結(jié)合配偶體。用1∶5000稀釋的生物素標記的山羊抗GST mAbs(Abcam，UK)和1∶10000稀釋的鏈霉抗生物素蛋白-HRP(Roche)檢測Hp與D1或Hp與D2之間的相互作用。其次，rHarA、D1和D2結(jié)構(gòu)域蛋白以10μg ml-1的濃度在包被緩沖液中包被，加入含量為0.08-4.0pmoles的配體觸珠蛋白、觸珠蛋白-血紅蛋白復合物或血紅蛋白。在室溫下以1∶1摩爾比輕輕混合觸珠蛋白與血紅蛋白(Sigma)45分鐘，制備觸珠蛋白-血紅蛋白復合物。復合物的形成通過非變性PAGE凝膠的CBB染色顯示。使用1∶2000稀釋的抗人觸珠蛋白(SIGMA)和抗人血紅蛋白(Abcam，UK)單克隆抗體，和HRP標記的抗小鼠IgG作為第二種試劑，檢測配體蛋白質(zhì)的結(jié)合。根據(jù)用自動ELISA讀板器(Wallace Victor 1420)讀取的OD405nm，測定底物(ABTS)向有色產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，由此定量抗原-抗體復合物。以10∶1的生物素與觸珠蛋白比，用純化的生物素標記的觸珠蛋白(EZ-連接磺基-NHS-LC生物素，PIERCE)進行基于FACS的測定，在室溫下30分鐘。在用Nanosep 10K離心裝置(Pall，Life Sciences，USA)除去游離生物素后，使用鏈霉抗生物素蛋白-HRP作為檢測試劑，通過免疫印跡證實觸珠蛋白的標記。在存在或不存在作為鐵源的25μM FeCl3的情況下，金黃色葡萄球菌細胞在RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到對數(shù)晚期(OD600＝0.8-1.0)。向5×106細胞中加入生物素化的觸珠蛋白(5-30μg)，在室溫下溫育30分鐘。用PBS洗滌后，加入1∶100稀釋的鏈霉抗生物素蛋白-FITC(DAKO)，然后用2％PFA固定細胞。通過用FACScan(Becton Dickinson)測定熒光強度定量觸珠蛋白的表面結(jié)合。
依賴鐵的生長生長研究使用鐵耗盡的RPMI培養(yǎng)基。RPMI的鐵消耗通過與Chelex100(Sigma)成批溫育實現(xiàn)。簡言之，向1L培養(yǎng)基中加入10gChelex100，在室溫下攪拌4小時。然后向培養(yǎng)基中補充二價離子至10μM CaCl2和100μM MgSO4。從BHI平板上接種金黃色葡萄球菌8325-4和harA突變細胞，在RPMI完全培養(yǎng)基中溫育過夜。收集細胞，洗滌，重懸浮于鐵耗盡的RPMI培養(yǎng)基中，達到OD600＝0.05。在鐵饑餓3小時后，收集細胞，用補充不同鐵源的鐵耗盡RPMI稀釋為OD600＝0.02。使用下列鐵源濃度為25mM的三氯化鐵，0.5mM Hb和1μM和0.5μM濃度的Hp-Hb(2∶1)復合物。通過用Hitachi U-2001分光光度計測量600nm的光密度監(jiān)測細菌的生長。
harA插入滅活突變體的構(gòu)建使用以前(Chakraborty等人，1992)描述的pAUL-A載體(SimonFoster惠贈)構(gòu)建用于插入滅活harA的質(zhì)粒。使用分別添加SalI/KpnI和KpnI/EcoRI限制酶切位點的基因特異性引物MOL1313、MOL1314和MOL1315、MOL1316(表1)，PCR產(chǎn)生harA開放閱讀框的5′和3′側(cè)翼區(qū)。將1kb片段克隆到SalI-EcoRI消化的pAUL-A載體中，產(chǎn)生質(zhì)粒pAUL-AD。使用摻入KpnI限制酶切位點的引物MOL1317和MOL1318(表1)，由pDG1513(Guerout-Fleury等人，1995；Simon Foster惠贈)擴增四環(huán)素抗性盒。然后將KpnI消化的含有1.5kb四環(huán)素抗性盒(Tc)的PCR片段克隆到pAUL-AD內(nèi)。通過電穿孔法用50微克獲得的pAD02質(zhì)粒轉(zhuǎn)化金黃色葡萄球菌RN4220限制缺陷轉(zhuǎn)化受體。在質(zhì)粒復制的許可溫度(30℃)下鑒定紅霉素抗性轉(zhuǎn)化子。通過將溫度轉(zhuǎn)變?yōu)?2℃篩選單交換Campbell型染色體插入，并在四環(huán)素上篩選。pAD02質(zhì)粒向染色體DNA內(nèi)的整合通過PCR分析證實。四環(huán)素抗性標記向金黃色葡萄球菌8325-4染色體內(nèi)的整合通過用噬菌體11轉(zhuǎn)導實現(xiàn)。根據(jù)紅霉素和林可霉素抗性的丟失進一步選擇轉(zhuǎn)導的菌落，通過使用基因特異性引物的PCR，以及利用Southern印跡法，檢查harA基因的缺乏。
結(jié)果實施例1.LPXTGp5是在不同金黃色葡萄球菌感染過程中在體內(nèi)表達的高度免疫原性的新細胞壁蛋白質(zhì)1/A.LPXTGp5作為抗原的鑒定特異性抗細菌抗體是相應抗原體內(nèi)表達的分子證據(jù)?？乖禺愋匝蹇贵w的鑒定廣泛用于對某些病原體(特別是不可培養(yǎng)的病原體)的血清診斷。
通過細菌表面展示以及使用不同金黃色葡萄球菌感染患者的人血清進行的蛋白質(zhì)組學，LPXTGp5被鑒定為一種重要的抗原(參見WO02/059148 A，Etz等人，2002，Vytvytska等人，2002)。通過表面展示鑒定了該蛋白質(zhì)的5個不同的B細胞表位區(qū)，全部位于N端。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，LPXTGp5在人金黃色葡萄球菌感染期間表達，在許多患者中用多個表位產(chǎn)生廣泛的免疫原性。生物信息學分析鑒定了一種不知道功能的新型蛋白質(zhì)。
1/B.LPXTGp5基因和蛋白質(zhì)根據(jù)TIGR注釋(SA1781，InterCell ORF01361；Kuroda等人，2001)(SEQ.ID.No 1)，LPXTGp5基因的預測的開放閱讀框位于金黃色葡萄球菌COL株的1824064與1821380 bps之間。預測的ORF編碼一種長895個氨基酸的蛋白質(zhì)，其在N端含有一個典型的信號肽序列，在C端含有典型的革蘭氏陽性錨定基序，含有LPXTG基序、疏水跨膜區(qū)和帶正電的尾(SEQ.ID.No 2)。一級氨基酸序列和預測的二級結(jié)構(gòu)分析都提示，結(jié)構(gòu)域的所有β折疊結(jié)構(gòu)中存在兩個同源結(jié)構(gòu)域(D1和D2)，它們被螺旋或卷曲區(qū)分開(圖1)。這兩個結(jié)構(gòu)域含有～145個氨基酸殘基，顯示52％的同一性和71％的相似性。
令人感興趣的是，序列同源性搜索在其它三種金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)中鑒定了類似的單結(jié)構(gòu)域，我們稱之為LPXT-Gp6、LPXTGp7和p7。顯然，這三種蛋白質(zhì)是金黃色葡萄球菌染色體上直接相鄰的基因。LPXTGp7和p7似乎被轉(zhuǎn)錄為一種mRNA。而且，p7基因之后是三個預測的膜蛋白，它們顯示與蛋白質(zhì)的鐵ABC轉(zhuǎn)運家族同源。包括p5在內(nèi)的所有四種蛋白質(zhì)在5種金黃色葡萄球菌株之間高度保守，其基因組信息是可以獲得的。令人感興趣的是，發(fā)現(xiàn)使用人血清，所有四種蛋白質(zhì)都是免疫原性的(參見，例如WO 02/059148 A)。類似于LPXTGp5，p6和p7/p7樣含有fur盒序列，在最近的公開文本中，證實這些蛋白質(zhì)是鐵調(diào)節(jié)的(Mazmanian等人，2002)。預測的同源結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)非常相似(PhD)，盡管其具有～40％的適中的氨基酸同一性。另外，在其它革蘭氏陽性菌中也存在含有同源結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，它們?nèi)繉儆谒缶鷮?Clostridium)。單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocyotgenes)含有一種蛋白質(zhì)，稱為p64，它含有三個這樣的結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)組學分析提示，p64的表達是鐵調(diào)節(jié)的(Borezee等人，2000)。Bacillus halodurans基因組含有一個預測的含有該結(jié)構(gòu)域的開放閱讀框。
1/C.產(chǎn)生重組蛋白由金黃色葡萄球菌COL株基因組DNA擴增編碼LPXTGp5的cDNA，其中分別使用基因特異性寡核苷酸5′-CGTAGCTGGAGCCACCGCAGTTC-3和5′-AAAATGCTACCAAAAACTTGA-3′。將限制性內(nèi)切酶消化的PCR產(chǎn)物克隆到pASK-IBA4載體的BamHI-SalI位點內(nèi)，位于編碼Strep-tagII的序列下游(IBA，Gottingen)。獲得的基因缺乏位于sortase酶切位點(LPXTG)下游的對應于信號肽和C末端的序列。通過Streptactin親和層析(根據(jù)廠商說明)，從氨芐青霉素誘導的BL21大腸桿菌的細菌提取物中純化重組蛋白。盡管該895aa蛋白質(zhì)的預測分子量是101-kDa，但是重組全長LPXTGp5作為一種～130-kDa蛋白質(zhì)遷移。細菌細胞壁蛋白質(zhì)的遷移速度通常慢于其實際大小。
除了全長蛋白質(zhì)之外，也產(chǎn)生LPXTGp5的兩種不同截短形式，方法是擴增對應于預測的D1和D2結(jié)構(gòu)域的DNA序列，并插入BamHI-SalI消化的pGEX4T-3內(nèi)。通過溶菌酶消化(緩沖液50mM TrispH8.0，100mM NaCl，1mM EDTA)，從IPTG誘導的DH10B大腸桿菌細胞中提取GST-融合蛋白，利用谷胱甘肽親和柱從可溶性細菌級分中純化。通過凝血酶消化，或者使用10mM谷胱甘肽，洗脫重組蛋白。因此，可以獲得長145aa的D1和D2重組截短形式，其含或不含GST尾。
1/D.LPXTGp5在人類中具有廣泛免疫原性在一系列免疫印跡和ELISA實驗中，測定來自不同金黃色葡萄球菌感染患者以及健康個體的人血清是否含有抗LPXTGp5抗體(圖2)。在不同血清之間，抗LPXTGp5 IgG(圖3)與IgA(數(shù)據(jù)未顯示)的水平存在差異，金黃色葡萄球菌創(chuàng)傷感染患者顯示最高水平。使用D1和D2蛋白的ELISA證明，這些結(jié)構(gòu)域也具有高度免疫原性(圖4)。
實施例2.血清觸珠蛋白作為LPXTGp5的結(jié)合配體的鑒定2/A.用重組LPXTGp5對人血漿蛋白質(zhì)的親和純化為了鑒定LPXTG-p5的結(jié)合配偶體和功能，將StrepII-標記的重組蛋白固定到Streptactin瓊脂糖(IBA)上，加IgG耗盡的人血漿。血漿樣品的選擇取決于通過ELISA獲得的抗rLPXTGp5的低IgG和IgA滴度，以避免不希望的免疫作用。與LPXTGp5柱結(jié)合的人血漿蛋白質(zhì)的洗脫級分，以及只有Streptactin的對照柱的級分，進行2D-PAGE分析。2D凝膠的考馬斯藍染色顯示一組蛋白質(zhì)斑點，其具有40-到45-kDa和pI 4.5-5.5的特征(圖5A)。對照柱的洗脫物(圖5B)以及單獨的rLPXTGp5凝膠(圖5C)中沒有這些斑點。未分級的血漿樣品的分離顯示同一組斑點(圖5D)，有助于相應蛋白質(zhì)的鑒定。根據(jù)2D凝膠中蛋白質(zhì)斑點的特征，借助于可從瑞士-2DPAGE數(shù)據(jù)庫(http//us.expasy.org/ch2d/)中獲得的蛋白質(zhì)組學信息，純化的40-45-kDa蛋白質(zhì)被鑒定為人血漿/血清糖蛋白——觸珠蛋白的亞基。特有的“珠位于帶上”的外觀是由于在前述Asn殘基的4個可能的糖基化位點處N連接的糖基化。為了證實這一發(fā)現(xiàn)，來自LPXTGp5親和柱的洗脫級分用抗人觸珠蛋白抗體進行2D免疫印跡分析，并且用純化的人血清觸珠蛋白作為陽性對照。2D凝膠相同區(qū)域中信號特有的5個斑點外觀再次證實。
為了提供確切的證據(jù)，購買可以作為商品獲得的從合并人血漿中純化的觸珠蛋白(cat# 51325，F(xiàn)luka)，檢測它與LPXTGp5親和柱結(jié)合的能力。類似于使用血漿的實驗，純化的Hp通過與LPXTGp5相互作用保留在柱上，因為對照Streptactin瓊脂糖的洗脫物不含觸珠蛋白。也進行逆轉(zhuǎn)實驗，其中使用通過生物素標記固定于鏈霉抗生物素蛋白瓊脂糖珠上的純化的觸珠蛋白，以及由在耗盡鐵(含有Chelex 100)的RPMI培養(yǎng)基中生長到對數(shù)期的金黃色葡萄球菌8325-4spa株制備的總裂解液。來自觸珠蛋白偶聯(lián)珠的洗脫物的免疫印跡分析進一步證實，直接從細菌細胞中分離的天然LPXTGp5實際上是這種胞外宿主糖蛋白的結(jié)合配偶體(圖6)。
2/B.與LPXTGp5的D1和D2結(jié)構(gòu)域結(jié)合的配體的定位在大腸桿菌中產(chǎn)生重組LPXTGp5總是產(chǎn)生降解產(chǎn)物(圖2)，這可能是由于蛋白質(zhì)大小較大，以及這種革蘭氏陽性細胞壁蛋白在革蘭氏陰性大腸桿菌中表達的部分不相容性。為了鑒定識別觸珠蛋白所必需的蛋白質(zhì)部分，如上所述產(chǎn)生GST標記的缺失突變LPXTGp5蛋白。同源結(jié)構(gòu)域是配體結(jié)合的有吸引力的候選者。使用通過D1和D2蛋白免疫產(chǎn)生的超免疫兔血清顯示了這兩個結(jié)構(gòu)域的細胞表面位置，證實它們可用于細胞外配體結(jié)合。用重組結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)和純化的觸珠蛋白或IgG耗盡的血漿重復親和層析。GST-D1和GST-D2蛋白固定于谷胱甘肽Sepharose柱上，人血漿或純化的觸珠蛋白作為配體來源，類似于全長LPXTGp5使用的。洗脫物的2D分析鑒定觸珠蛋白為結(jié)構(gòu)域的結(jié)合配偶體。盡管該實驗的設置不適于親和測定，但是似乎GST-D1比GST-D2更好地結(jié)合。
實施例3.LPXTGp5/SAHpR表達的調(diào)節(jié)3/A.在應激培養(yǎng)基中的優(yōu)先表達用抗LPXTGp5抗體對由金黃色葡萄球菌8325-4 spa-(蛋白A缺陷株)制備的細菌提取物進行免疫印跡分析，顯示一條約130-kDa分子量的蛋白帶(圖7)。重要的是，純化的人IgG和兔免疫血清顯示相同的帶。盡管這種895aa蛋白質(zhì)的預測分子量為101-kDa，但是細菌細胞壁蛋白質(zhì)通常比其實際大小更慢地遷移。支持這一觀點，重組全長LPXTGp5實際上類似于天然形式作為一種～130-kDa的蛋白質(zhì)遷移(圖2)。
令人感興趣的是，由在成分已知的、貧乏、低鐵培養(yǎng)基(RPMI 1640)中培養(yǎng)的細菌制備的提取物含有LPXTGp5，而在豐富培養(yǎng)基，如腦心浸液(BHI)中培養(yǎng)的細菌的提取物不含(圖7)。而且，蛋白質(zhì)的表達只在細胞生長的對數(shù)后期和穩(wěn)定期觀察到，而在對數(shù)早期觀察不到。眾所周知，離子濃度類似于人血漿的成分已知的、貧乏培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基使病原體表達更多的體內(nèi)相關(guān)的蛋白質(zhì)，通常用于細菌的實驗室生長。
3/B.鐵和Fur對表達的調(diào)節(jié)LPXTGp5 ORF上游的核苷酸序列對應于位于起始ATG密碼子上游-53與-35bps之間的共有fur結(jié)合盒(圖8A)。該DNA基序的存在高度預示了依賴鐵的表達抑制，如同革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌中的幾種基因所顯示的一樣(Escolar等人，1999)。
基因中存在fur盒序列引起了比較LPXTGp5蛋白在低和高鐵濃度培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細菌中表達的興趣。由在補充RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)的8325-4野生型金黃色葡萄球菌株制備的細菌裂解物進行免疫印跡分析，顯示鐵將表達抑制到不可檢測的水平(圖8B，左圖)。在一種金黃色葡萄球菌株中沒有這種調(diào)節(jié)，其中fur基因通過插入誘變滅活。Fur是一種依賴鐵濃度的轉(zhuǎn)錄抑制蛋白，因此在不存在時，預期靶基因解除抑制，從而上調(diào)。實際上，LPXTGp5在fur缺失突變金黃色葡萄球菌株(具有8325-4背景)中在每個生長階段組成型表達(圖8B，右圖)。根據(jù)這些結(jié)果，明確了LPXTGp5的表達處于Fur介導的鐵調(diào)節(jié)之下。
相反，agr和sar是與大量葡萄球菌毒力蛋白的調(diào)節(jié)有關(guān)的關(guān)鍵基因座(Arvidson和Tegmark，2001)，它們似乎不調(diào)節(jié)LPXTGp5的表達，根據(jù)單敲除株(agr-，sar-)的提取物的結(jié)果，相對于用野生型株獲得的結(jié)果，顯示類似的130-kDa帶的染色強度(數(shù)據(jù)未顯示)。
實施例4.篩選和發(fā)展LPXTGp5-觸珠蛋白相互作用抑制劑的試驗4/A.使用重組LPXTGp5蛋白的基于ELISA的體外測定發(fā)展了一種基于ELISA的測定，其使用觸珠蛋白作為包被試劑(10μg/ml，在包被緩沖液中)，GST-D1和GST-D2作為結(jié)合配偶體。Hp-D1與-D2的相互作用用生物素標記的抗GST mAbs(cat# ab6648，Abcam)和鏈霉抗生物素蛋白-HRPO(cat# 1089153，Roche)檢測。含量升高的D1和D2導致更高的OD讀數(shù)，直到在大約250pmol時達到飽和水平。相同摩爾含量(根據(jù)實際分子量校正)的GST相對于背景不產(chǎn)生可檢測的信號(圖9)。這些結(jié)果進一步支持LPXTGp5內(nèi)Hp結(jié)合的定位。這也提供了一種篩選LPXTGp5與Hp相互作用抑制劑的容易、可能的高通量測定。
4/B.使用活金黃色葡萄球菌細胞的基于FACS的體外測定純化的觸珠蛋白用生物素標記(10∶1生物素與觸珠蛋白比)，并以逐漸升高的濃度加入活的野生型和fur突變金黃色葡萄球菌細胞中，該細胞在含或不含作為鐵源的25μM FeCl3的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)。利用鏈霉抗生物素蛋白-FITC(cat# F0422，DAKO)作為第二試劑檢測觸珠蛋白的結(jié)合，通過FACS定量分析。在允許LPXTGp5表達的條件下培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌的表面染色證實了觸珠蛋白的顯著結(jié)合(圖10A)。使用在富含鐵的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌，無法檢測到觸珠蛋白的結(jié)合(圖10B)，這與使用抗LPXTGp5抗體的免疫印跡上信號的缺乏相一致。重要的是，無論環(huán)境中的鐵濃度如何均過量表達LPXTGp5的fur突變體顯示最明顯的觸珠蛋白結(jié)合(圖10C，D)。為了檢驗配體與LPX-TGp5結(jié)合的特異性，也在重組GST-D1結(jié)構(gòu)域的存在下添加觸珠蛋白。提高GST-D1的摩爾過量可以以濃度依賴的方式降低用觸珠蛋白實現(xiàn)的表面染色。9倍過量的GST-D1已經(jīng)使觸珠蛋白的結(jié)合幾乎降低到背景水平，而相同摩爾過量的GST不顯著影響結(jié)合(圖11)。該競爭實驗強烈提示，存在一種葡萄球菌觸珠蛋白受體，觸珠蛋白結(jié)合功能不是多余的。因此，破壞劑，無論是抗體、模擬位還是中斷觸珠蛋白-LPXTGp5相互作用的小藥物，都可能對Hp-金黃色葡萄球菌的相互作用有害。
實施例5.金黃色葡萄球菌對來自Hp-Hb復合物的鐵的應用在人體內(nèi)生長的金黃色葡萄球菌不得不從體內(nèi)，即從宿主的鐵結(jié)合蛋白中“竊取”鐵。最豐富的含鐵蛋白質(zhì)是血紅蛋白(Hb)。由于細胞外血紅蛋白立即被觸珠蛋白復合，實際上是Hp-Hb復合物，它是血漿中的鐵源之一。檢測在鐵耗盡的RPMI培養(yǎng)基中生長的金黃色葡萄球菌8325-4株在體外利用來自Hp-Hb復合物的鐵的能力。只加入觸珠蛋白和只加入血紅蛋白作為陰性對照，F(xiàn)eCl3作為生長增加的陽性對照。金黃色葡萄球菌的生長在復合物存在下受到刺激，提示鐵的獲取通過Hp-Hb復合物(圖12)。
實施例6一種LPXTGp5插入滅活突變體的構(gòu)建為了研究LPXTGp5的作用，制備了一種插入滅活的LPXTG-p5突變體。使用在引物上分別添加SalI、KpnI、KpnI和EcoRI限制酶切位點的基因特異性引物，通過PCR擴增LPXTGp5開放閱讀框的1kb 5′和3′側(cè)翼區(qū)，構(gòu)建一種用于破壞LPXTGp5的質(zhì)粒。PCR產(chǎn)物用SalI-KpnI和KpnI-EcoRI酶切，克隆到用SalI-EcoRI酶切的pAUL-A載體中，在大腸桿菌DH10B中產(chǎn)生質(zhì)粒pAUL-AD。使用摻入KpnI限制位點的MOL1317和MOL1318引物，由pDG1513擴增1.5kb四環(huán)素抗性盒。含有四環(huán)素抗性盒的KpnI片段去磷酸化，克隆到去磷酸化的pAUL-AD的KpnI位點內(nèi)，在大腸桿菌DH10B中產(chǎn)生pAD02。通過電穿孔用pAD02的質(zhì)粒DNA(50μg)轉(zhuǎn)化金黃色葡萄球菌RN4220，在質(zhì)粒復制的許可溫度(30℃)下鑒定紅霉素抗性轉(zhuǎn)化子。通過將溫度轉(zhuǎn)變?yōu)?2℃選擇單交換Campbell-型染色體插入，而在四環(huán)素上篩選。使用LPXTGp5內(nèi)部引物通過PCR證實克隆02中滅活的和完整拷貝的LPXTGp5的存在。02的噬菌體裂解物由Φ11原種制備，轉(zhuǎn)導金黃色葡萄球菌8325-4，在四環(huán)素平板上篩選。檢測所有回收的轉(zhuǎn)導子的紅霉素和林可霉素敏感性。使用LPXTGp5內(nèi)部引物通過PCR證實，并且用四環(huán)素和LPXTGp5 N端片段作為探針通過Southern印跡分析證實LPXTGp5∷Tc標記向這些轉(zhuǎn)導子47之一的金黃色葡萄球菌染色體內(nèi)的成功整合。Southern印跡法按照標準程序進行，按照廠商說明用PCRIDG探針合成試劑盒(Roche)制備的DNA探針發(fā)出信號。簡言之，在轉(zhuǎn)移后，膜在高嚴格條件下預雜交和雜交(DIG Easy Hyb溶液，42℃)。用低嚴格緩沖液(2×SSC+0.1％SDS)洗滌兩次，用高嚴格緩沖液(0.5×SSC+0.1％SDS)洗滌兩次。這些雜交條件可以檢測與根據(jù)試劑盒所帶廠商手冊的探針＞80％同源性的基因。Southern印跡分析證實野生型株中存在LPXTGp5基因，而在敲除株中不存在。在這些條件下，探針也檢測一條在兩個菌株中都存在的對應于LPXTGp6的帶。
實施例7HarA偏好結(jié)合觸珠蛋白-血紅蛋白復合物觸珠蛋白的主要生理作用是復合血漿中的細胞外血紅蛋白。假定該相互作用有極高的親和力，觸珠蛋白捕獲釋放的血紅蛋白幾乎是同時發(fā)生。為了解決當HarA與血紅蛋白結(jié)合時是否能夠識別觸珠蛋白為一種配體的問題，我們使用rHarA以及HarA-D1和HarA-D2結(jié)構(gòu)域蛋白進行了體外結(jié)合研究。在這些測定中，通過包被ELISA板固定蛋白質(zhì)，然后加入含量逐漸提高的觸珠蛋白、觸珠蛋白-血紅蛋白復合物和血紅蛋白，用抗觸珠蛋白或抗血紅蛋白單克隆抗體檢測信號。觸珠蛋白與血紅蛋白之間有效復合物的形成通過非變性凝膠分析證實(圖14A)。通過比較相同摩爾含量的不同配體產(chǎn)生的信號強度，我們檢測到觸珠蛋白-血紅蛋白復合物的結(jié)合顯著高于觸珠蛋白。在低配體濃度下較高水平的結(jié)合暗示較高的親和相互作用，使用全長HarA以及結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)是明顯的(圖14B和C，上圖)。重要的是，增強的復合物的結(jié)合不是HarA結(jié)構(gòu)域與血紅蛋白高親和力相互作用的結(jié)果，盡管我們也能夠證明Hb的直接結(jié)合(圖14C，下圖)。當我們使用配體蛋白包被并且使用GST標記結(jié)構(gòu)域蛋白檢測時，在結(jié)合測定中獲得非常相同的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)提示，觸珠蛋白和血紅蛋白都能夠被HarA結(jié)構(gòu)域識別為結(jié)合配偶體，其親和力低于Hp-Hb復合物。然而，假定血漿中游離血紅蛋白的濃度極低，生理相關(guān)的相互作用似乎介于HarA與觸珠蛋白-血紅蛋白復合物之間，以及與豐富的觸珠蛋白之間。
圖例圖1(A)LPXTGp5是一種典型的革蘭氏陽性細胞壁蛋白質(zhì)，在N端含有信號肽(SP)，在C端含有胞外域和LPXTG細胞分類信號，之后是一個疏水距膜域(TM)和帶正電的尾(++)。在該蛋白質(zhì)的細胞外部分內(nèi)鑒定了兩個高度同源的結(jié)構(gòu)域(D1、D2)。(B)顯示了LPXTGp5/SA1552/結(jié)構(gòu)域與其它金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)LPXTGp6/SA0976/和LPXTGp7/SA0977/之間二級結(jié)構(gòu)的相似性。
圖2(A)重組LPXTGp5的考馬斯藍染色的10％SDS-PAGE凝膠。第1道——分子量標準，第2道——BSA(2mg/mL)，第3道——BSA(1mg/mL)，第4道——LPXTGp5。(B)重組LPXTGp5與分離的抗LPXTGp5抗體的免疫印跡。(C)用ELISA測定的人血清抗LPXTGp5抗體滴度(上圖)與rLPXTGp5的免疫印跡信號(下圖)相比較。
圖3利用標準ELISA測定的健康供體(實心灰色圓形)和金黃色葡萄球菌感染患者(血液感染——空心菱形，創(chuàng)傷感染——實心正方形，其它感染——實心三角形)的抗LPXTGp5 IgG滴度。
圖4利用標準ELISA測定的健康非攜帶者(灰色實心圓形)、鼻攜帶者(黑色實心圓形)和金黃色葡萄球菌感染患者(血液感染——空心菱形，創(chuàng)傷感染——實心正方形，其它感染——實心三角形)的抗D1(A)和抗D2(B)IgG抗體滴度。
圖5考馬斯藍染色的2D電泳凝膠。IgG耗盡的人血漿與20μg重組LPXTGp5蛋白結(jié)合。特異性結(jié)合配偶體用100μl樣品緩沖液-9M尿素，4％CHAPS，100mM DTT，0.5％SDS洗脫。與LPXTGp5結(jié)合的血漿蛋白質(zhì)偶聯(lián)Stretpactin瓊脂糖(A)、單獨的Streptactin瓊脂糖(B)、純化的StrepII標記的rLPXTGp5(C)，IgG耗盡的人血漿(D)。
圖6將在RPMI中生長至對數(shù)期的8325-4 spa-細胞的金黃色葡萄球菌裂解物加到通過將生物素標記的觸珠蛋白固定到鏈霉抗生物素蛋白基質(zhì)上制成的親和柱上。裂解蛋白質(zhì)與鏈霉抗生物素蛋白珠的非特異性結(jié)合被認為是背景(第4道)。使用人抗LPXTGp5抗體的免疫印跡顯示，從Hp-鏈霉抗生物素蛋白柱上洗脫的天然LPXTGp5(第3道)是觸珠蛋白的一種結(jié)合配偶體。用重組LPXTGp5(第1道)和金黃色葡萄球菌8325-4spa-裂解物(第2道)作為免疫印跡的陽性對照。
圖7金黃色葡萄球菌野生型(8325-4)株在RPMI 1640或腦心浸液(BHI)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生長到所述的OD600nm。通過溶葡萄球菌素消化和超聲處理制備總細菌裂解物。20μg總蛋白質(zhì)加樣到7.5％聚丙酰胺凝膠上。利用半干系統(tǒng)將電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到Hybond ECL膜上。該膜用親和純化的人抗LPXTGp5 IgG探針雜交，用ECL檢測系統(tǒng)檢測信號。
圖8(A)已知的Fur盒核苷酸序列與推斷的位于LPXTGp5基因上游的Fur盒的比較。(B)在不同培養(yǎng)基(RPMI、RPMI+FeCl3)上培養(yǎng)后，從野生型8325-4(wt)和fur突變(fur-)株分離的金黃色葡萄球菌總裂解物的免疫印跡分析。將10μg總蛋白質(zhì)加樣到7.5％聚丙烯酰胺凝膠上。利用半干系統(tǒng)將電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到ECL膜上。該膜用親和純化的抗LPXTGp5 IgG探針雜交，用ECL檢測系統(tǒng)檢測信號。
圖9在基于ELISA的測定中進行觸珠蛋白與GST-D1和GST-D2的結(jié)合。Polysorb ELISA板用觸珠蛋白包被，然后加入濃度逐漸增加的GST-D1、GST-D2和單獨的GST作為陰性對照。用生物素標記的抗GST mAb和鏈霉抗生物素蛋白-HRPO檢測特異性信號。
圖10利用基于FACS的測定法檢測觸珠蛋白與金黃色葡萄球菌細胞的結(jié)合。生物素標記的Hp(30μg、12.5μg、5μg)與在RPMI(A，C)或補充25μM FeCl3的RPMI(B，D)中培養(yǎng)的5×106金黃色葡萄球菌野生型8325-4株(A，B)或fur-(C，D)在室溫下溫育30分鐘。洗滌后，加入鏈霉抗生物素蛋白-FITC，在室溫下30分鐘，然后用2％Pfa固定細胞，用FACScan分析樣品。對照細胞的熒光強度(灰色)與結(jié)合30μg Hp(1)、12.5μg Hp(2)和5μg Hp(3)的細胞的熒光相比較。
圖11利用基于FACS的測定法檢測觸珠蛋白與金黃色葡萄球菌細胞的結(jié)合。12.5μg單獨的生物素標記的Hp(1)或與9倍摩爾過量的D1-GST(2)或與GST(2)的復合物與在RPMI中生長的5×106金黃色葡萄球菌細胞(野生型8325-4株)在室溫下溫育30分鐘。洗滌后加入鏈霉抗生物素蛋白-FITC，在室溫下30分鐘，然后用2％Pfa固定細胞，用FACScan分析樣品。
圖12利用基于FACS的測定比較觸珠蛋白與金黃色葡萄球菌8325-4野生型株(wt)、LPXTGp5敲除株(LPXTGp5 KO)的結(jié)合。生物素標記的Hp(20μg，，5μg)或與在RPMI(A，C，D)或在補充25μM FeCl3的RPMI(B)中生長的5×106金黃色葡萄球菌細胞(野生型8325-4株)(A，B)、LPXTGp5 KO(C)或fur-(D)在室溫下溫育30分鐘。洗滌后加入鏈霉抗生物素蛋白-FITC，在室溫下30分鐘，然后用2％Pfa固定細胞，用FACScan分析樣品。對照細胞的熒光強度(灰色)與結(jié)合20μg Hp(1)和5μg Hp(2)的細胞的熒光相比較。
圖13在含有不同鐵源的培養(yǎng)基中的生長率。金黃色葡萄球菌野生型8325-4細胞在耗盡鐵的RPMI培養(yǎng)基(空心圓形)或重新補充25mMFeCl3的培養(yǎng)基(實心圓形)中培養(yǎng)，含有1mM Hp(空心三角形，虛線)，含有0.5mM Hb(實心三角形，虛線)，含有Hp∶Hb復合物(空心三角形，實線)。在指定的時間點，測量細菌培養(yǎng)物的OD600nm。
圖14 HarA結(jié)合觸珠蛋白-血紅蛋白復合物。A.通過觸珠蛋白(Hp)和血紅蛋白(Hb)以1∶1的摩爾比溫育，形成觸珠蛋白-血紅蛋白復合物(Hp-Hb)，用CBB染色的非變性PAGE凝膠顯示。B.在基于ELISA的測定中，將純化的觸珠蛋白(●)和血紅蛋白(■)的結(jié)合與觸珠蛋白-血紅蛋白復合物的結(jié)合(▲)相比較，其中使用重組HarA作為包被試劑，抗觸珠蛋白mAb作為檢測試劑。C.GST-D1(填充的符號)和GST-D2(空心符號)蛋白質(zhì)包被ELISA板，以逐漸升高的含量添加Hp、Hb和Hp-Hb復合物(如B所示)。用單克隆抗觸珠蛋白(上圖)或抗血紅蛋白抗體(下圖)檢測信號。
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序列表<110>Intercell AG<120>治療葡萄球菌感染的藥物<130>R 41506<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2685<212>DNA<213>金黃色葡萄球菌<400>1atgaacaaac atcacccaaa attaaggtct ttctattcta ttagaaaatc aactctaggc 60gttgcatcgg tcattgtcag tacactattt ttaattactt ctcaacatca agcacaagca120gcagaaaata caaatacttc agataaaatc tcggaaaatc aaaataataa tgcaactaca180actcagccac ctaaggatac aaatcaaaca caacctgcta cgcaaccagc aaacactgcg240aaaaactatc ctgcagcgga tgaatcactt aaagatgcaa ttaaagatcc tgcattagaa300aataaagaac atgatatagg tccaagagaa caagtcaatt tccagttatt agataaaaac360aatgaaacgc agtactatca ctttttcagc atcaaagatc cagcagatgt gtattacact420aaaaagaaag cagaagttga attagacatc aatactgctt caacatggaa gaagtttgaa480gtctatgaaa acaatcaaaa attgccagtg agacttgtat catatagtcc tgtaccagaa540gaccatgcct atattcgatt cccagtttca gatggcacac aagaattgaa aattgtttct600tcgactcaaa ttgatgatgg agaagaaaca aattatgatt atactaaatt agtatttgct660aaacctattt ataacgatcc ttcacttgta aaatcagata caaatgatgc agtagtaacg720aatgatcaat caagttcagt cgcaagtaat caaacaaaca cgaatacatc taatcaaaat780acatcaacga tcaacaatgc taataatcaa ccgcaggcaa cgaccaatat gagtcaacct840
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<210>2<211>895<212>PRT<213>金黃色葡萄球菌<400>2Met Asn Lys His His Pro Lys Leu Arg Ser Phe Tyr Ser Ile Arg Lys1 5 10 15Ser Thr Leu Gly Val Ala Ser Val Ile Val Ser Thr Leu Phe Leu Ile20 25 30Thr Ser Gln His Gln Ala Gln Ala Ala Glu Asn Thr Asn Thr Ser Asp35 40 45Lys Ile Ser Glu Asn Gln Asn Asn Asn Ala Thr Thr Thr Gln Pro Pro50 55 60Lys Asp Thr Asn Gln Thr Gln Pro Ala Thr Gln Pro Ala Asn Thr Ala65 70 75 80Lys Asn Tyr Rro Ala Ala Asp Glu Ser Leu Lys Asp Ala Ile Lys Asp85 90 95Pro Ala Leu Glu Asn Lys Glu His Asp Ile Gly Pro Arg Glu Gln Val100 105 110Asn Phe Gln Leu Leu Asp Lys Asn Asn Glu Thr Gln Tyr Tyr His Phe115 120 125Phe Ser Ile Lys Asp Pro Ala Asp Val Tyr Tyr Thr Lys Lys Lys Ala130 135 140Glu Val Glu Leu Asp Ile Asn Thr Ala Ser Thr Trp Lys Lys Phe Glu145 150 155 160Val Tyr Glu Asn Asn Gln Lys Leu Pro Val Arg Leu Val Ser Tyr Ser165 170 175Pro Val Pro Glu Asp His Ala Tyr Ile Arg Phe Pro Val Ser Asp Gly180 185 190
Thr Gln Glu Leu Lys Ile Val Ser Ser Thr Gln Ile Asp Asp Gly Glu195 200 205Glu Thr Asn Tyr Asp Tyr Thr Lys Leu Val Phe Ala Lys Pro Ile Tyr210 215 220Asn Asp Pro Ser Leu Val Lys Ser Asp Thr Asn Asp Ala Val Val Thr225 230 235 240Asn Asp Gln Ser Ser Ser Val Ala Ser Asn Gln Thr Asn Thr Asn Thr245 250 255Ser Asn Gln Asn Thr Ser Thr Ile Asn Asn Ala Asn Asn Gln Pro Gln260 265 270Ala Thr Thr Asn Met Ser Gln Pro Ala Gln Pro Lys Ser Ser Thr Asn275 280 285Ala Asp Gln Ala Ser Ser Gln Pro Ala His Glu Thr Asn Ser Asn Gly290 295 300Asn Thr Asn Asp Lys Thr Asn Glu Ser Ser Asn Gln Ser Asp Val Asn305 310 315 320Gln Gln Tyr Pro Pro Ala Asp Glu Ser Leu Gln Asp Ala Ile Lys Asn325 330 335Pro Ala Ile Ile Asp Lys Glu His Thr Ala Asp Asn Trp Arg Pro Ile340 345 350Asp Phe Gln Met Lys Asn Asp Lys Gly Glu Arg Gln Phe Tyr His Tyr355 360 365Ala Ser Thr Val Glu Pro Ala Thr Val Ile Phe Thr Lys Thr Gly Pro370 375 380Ile Ile Glu Leu Gly Leu Lys Thr Ala Ser Thr Trp Lys Lys Phe Glu385 390 395 400Val Tyr Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Val Glu Leu Val Ser Tyr Asp405 410 415Ser Asp Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Pro Val Ser Asn Gly Thr420 425 430Arg Glu Val Lys Ile Val Ser Ser Ile Glu Tyr Gly Glu Asn Ile His435 440 445
Glu Asp Tyr Asp Tyr Thr Leu Met Val Phe Ala Gln Pro Ile Thr Asn450 455 460Asn Pro Asp Asp Tyr Val Asp Glu Glu Thr Tyr Asn Leu Gln Lys Leu465 470 475 480Leu Ala Pro Tyr His Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu485 490 495Leu Glu Lys Leu Gln Glu Lys Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Ala Glu Tyr500 505 510Lys Lys Lys Leu Asp Gln Thr Arg Val Glu Leu Ala Asp Gln Val Lys515 520 525Ser Ala Val Thr Glu Phe Glu Asn Val Thr Pro Thr Asn Asp Gln Leu530 535 540Thr Asp Leu Gln Glu Ala His Phe Val Val Phe Glu Ser Glu Glu Asn545 550 555 560Ser Glu Ser Val Met Asp Gly Phe Val Glu His Pro Phe Tyr Thr Ala565 570 575Thr Leu Asn Gly Gln Lys Tyr Val Val Met Lys Thr Lys Asp Asp Ser580 585 590Tyr Trp Lys Asp Leu Ile Val Glu Gly Lys Arg Val Thr Thr Val Ser595 600 605Lys Asp Pro Lys Asn Asn Ser Arg Thr Leu Ile Phe Pro Tyr Ile Pro610 615 620Asp Lys Ala Val Tyr Asn Ala Ile Val Lys Val Val Val Ala Asn Ile625 630 635 640Gly Tyr Glu Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Ile Asn Gln Asp Ile Asn645 650 655Thr Lys Asp Asp Asp Thr Ser Gln Asn Asn Thr Ser Glu Pro Leu Asn660 665 670Val Gln Thr Gly Gln Glu Gly Lys Val Ala Asp Thr Asp Val Ala Glu675 680 685
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<400>3gcggatgaat cacttaaaga tgcaattaaa gatcctgcat tagaaaataa agaacatgat 60ataggtccaa gagaacaagt caatttccag ttattagata aaaacaatga aacgcagtac120tatcactttt tcagcatcaa agatccagca gatgtgtatt acactaaaaa gaaagcagaa180gttgaattag acatcaatac tgcttcaaca tggaagaagt ttgaagtcta tgaaaacaat240caaaaattgc cagtgagact tgtatcatat agtcctgtac cagaagacca tgcctatatt300cgattcccag tttcagatgg cacacaagaa ttgaaaattg tttcttcgac tcaaattgat360gatggagaag aaacaaatta tgattatact aaattagtat ttgctaaacc tatttataac420gatccttcac t 431<210>4<211>144<212>PRT<213>金黃色葡萄球菌<400>4Ala Asp Glu Ser Leu Lys Asp Ala Ile Lys Asp Pro Ala Leu Glu Asn1 5 10 15Lys Glu His Asp Ile Gly Pro Arg Glu Gln Val Asn Phe Gln Leu Leu20 25 30Asp Lys Asn Asn Glu Thr Gln Tyr Tyr His Phe Phe Ser Ile Lys Asp35 40 45Pro Ala Asp Val Tyr Tyr Thr Lys Lys Lys Ala Glu Val Glu Leu Asp50 55 60Ile Asn Thr Ala Ser Thr Trp Lys Lys Phe Glu Val Tyr Glu Asn Asn65 70 75 80Gln Lys Leu pro Val Arg Leu Val Ser Tyr Ser Pro Val Pro Glu Asp85 90 95His Ala Tyr Ile Arg Phe Pro Val Ser Asp Gly Thr Gln Glu Leu Lys100 105 110Ile Val Ser Ser Thr Gln Ile Asp Asp Gly Glu Glu Thr Asn Tyr Asp115 120 125
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權(quán)利要求
1.與觸珠蛋白受體或配體結(jié)合相互作用的分子在制備預防和治療葡萄球菌感染的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述分子破壞觸珠蛋白受體配體結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其特征在于所述分子選自觸珠蛋白受體抗體，與根據(jù)SEQ ID No.2的肽結(jié)合的觸珠蛋白模擬位，其它的觸珠蛋白受體，或其片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其特征在于觸珠蛋白受體抗體或觸珠蛋白模擬位結(jié)合于一種選自SEQ ID No.4或SEQ ID No.6或其片段的肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其特征在于所述分子是一種反義核酸，它結(jié)合觸珠蛋白受體基因或觸珠蛋白受體基因表達的調(diào)節(jié)元件，特別是根據(jù)SEQ ID No.7的Fur盒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其特征在于所述分子是一種抑制化合物，它結(jié)合根據(jù)SEQ ID No.7的Fur盒。
7.一種核酸分子，它在嚴格條件下可與具有根據(jù)SEQ ID No.7的序列的核酸分子雜交。
8.分離的多核苷酸，其含有選自SEQ ID No.3和SEQ ID No.5的核酸序列。
9.分離的多肽，其含有選自SEQ ID No.4和SEQ ID No.6的多肽序列。
10.合成偶聯(lián)物，其含有根據(jù)SEQ ID No.4的肽，該肽通過非天然存在的接頭與根據(jù)SEQ ID No.6的肽連接。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的合成偶聯(lián)物，其特征在于所述非天然存在的接頭是多肽。
12.分離與觸珠蛋白受體配體結(jié)合相互作用的分子的方法，其特征在于下列步驟-在固體表面上提供觸珠蛋白受體多肽或其觸珠蛋白結(jié)合片段，-使標記的觸珠蛋白結(jié)合于該固定的觸珠蛋白受體多肽或其觸珠蛋白結(jié)合片段，形成固定的觸珠蛋白受體多肽或其觸珠蛋白結(jié)合片段與標記的觸珠蛋白的復合物，-使這種復合物接觸含有候選分子的庫，-確定該庫中替代該復合物中的標記觸珠蛋白的分子，和-分離替代該復合物中所述標記觸珠蛋白的所述分子。
13.分離與觸珠蛋白受體配體結(jié)合相互作用的分子的方法，其特征在于下列步驟-提供固定于固體表面上的觸珠蛋白，-使標記的觸珠蛋白受體多肽或其觸珠蛋白結(jié)合片段與所述固定的觸珠蛋白結(jié)合，形成固定的觸珠蛋白與標記的觸珠蛋白受體多肽或其觸珠蛋白結(jié)合片段的復合物，-使該復合物接觸含有候選分子的庫，-確定該庫中替代該復合物中的標記觸珠蛋白受體多肽或其觸珠蛋白結(jié)合片段，并與固定的觸珠蛋白結(jié)合的分子，-分離該庫中與固定的觸珠蛋白結(jié)合的所述分子。
14.分離與觸珠蛋白受體配體結(jié)合相互作用的分子的方法，其特征在于下列步驟-提供候選分子庫，-從該庫中提取并分離與固定的觸珠蛋白受體或其觸珠蛋白結(jié)合片段結(jié)合的分子，-從該庫中提取并分離與固定的觸珠蛋白結(jié)合的分子，-使其余的候選分子庫接觸觸珠蛋白與觸珠蛋白受體或其觸珠蛋白結(jié)合片段形成的固定的復合物，-分離與所述固定的復合物結(jié)合的分子。
15.根據(jù)權(quán)利要求12-14中任何一項的方法，其特征在于所述觸珠蛋白結(jié)合片段選自SEQ ID No.4、SEQ ID No.6及其片段，或這些片段的組合。
16.根據(jù)權(quán)利要求12-15中任何一項的方法，其特征在于所述觸珠蛋白受體是金黃色葡萄球菌觸珠蛋白受體。
17.根據(jù)權(quán)利要求12-16中任何一項的方法，其特征在于所述觸珠蛋白是人觸珠蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供可與觸珠蛋白受體配體結(jié)合相互作用的分子在制備預防和治療葡萄球菌感染的藥物中的用途。
文檔編號C07K14/31GK1649626SQ03809474
公開日2005年8月3日 申請日期2003年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月3日
發(fā)明者E·納吉, A·德拉, D·蓋爾曼 申請人:英特塞爾股份公司