專利名稱：用于腎病診斷和治療中的尿樣分析的方法和組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及診斷和治療腎病中生物學樣品的分析。具體地說，本發明涉及通過分析尿樣來診斷和監測腎病以及與各種癥狀(包括但不限于腎小球性腎炎、腎病綜合征、糖尿病、狼瘡、高血壓、急性腎小管壞死(ATN)、腎阻塞性疾病、腎癌)有關的疾病以及其他疾病或綜合征的治療進展情況。
背景技術：
醫師在治療患者時通常需要分析腎狀態和功能。對于諸如腎小球疾病，目前是通過檢測尿液中的蛋白質(白蛋白)，即測定從腎中排入尿液中的蛋白質的量來實現的。然而，這種方法并不靈敏，其根本原因是許多腎在異常測試結果出現之前就已喪失功能。這種方法也不正確，因為尿液中出現蛋白有許多不明確的原因，所以測試升高的變性蛋白尿(albuminuria)在許多受試者中呈假陽性。而且，對于某些腎疾病，如近端小管疾病，通常不能進行靈敏的基于尿液的測試。另一種分析方法是腎活檢。該方法很昂貴，是侵入性的，而且由于存在出血和感染的危險，與有限的發病率相關。
目前唯一可用來直接監測足細胞(即足狀突細胞，podocyte)疾病的基于尿液的測試(只在實驗水平采用)是用抗體測試腎分泌出的足細胞。然而，該方法并不如我們所提供的方法那樣靈敏，因為它僅僅是在尿液中存在白蛋白時才會呈現出異常。因此，需要有一種特定的通常可行的測試，該測試能在腎疾病的早期、較佳是靠近開始時就顯示與腎功能不良相關的陽性結果。
本發明通過采用新的腎狀態或功能的指標解決了這一情況，通過將一種該細胞特有的基因在尿道中表達，該指標能鑒定出給定細胞類型的異常脫落。
因此，需要有在腎病期間比其他基于尿液的測試能更早和更晚地準確評價腎狀態的靈敏的方法和組合物。
發明概述本發明提供新的組合物、系統和方法來診斷和控制腎相關疾病、病癥以及相關指標。出于本發明的目的，術語“腎病(腎疾病)”和“腎異常(失調)”可互換，其意味著腎臟或其組成部分的結構或功能的任何疾病、紊亂、綜合征、異常、病變或異常情況。本發明已經發現了一種鑒定僅在臨床或科學上重要的尿道細胞中表達的特定基因的獨特方法，具體是一種鑒定和監測腎病治療的方法。通過檢測通常不存在于尿液中、但在有影響這些細胞的腎臟疾病存在時而存在的腎細胞(足細胞或近端小管細胞)，就可以檢測這些病癥。
在一個實施方案中，所述獨特方法和組合物能通過檢測腎小球足細胞和/或近端小管細胞的存在來確定腎臟疾病的開始以及監測足細胞和/或近端小管細胞對治療的反應。
在本發明中，這些細胞的存在是通過篩選一基因的表達來檢測的，該基因僅僅存在于尿道中的特別感興趣的細胞中(足細胞或近端小管細胞)。在另一實例中，本發明包括分析尿沉淀(urine sediment)細胞中表達的基因，然后在許多醫學疾病和紊亂中提供非侵入性的迅速準確的分析腎狀況和功能。
在其他實例中，本發明包括分析自發脫落到尿液中的細胞中的基因表達，以便用非侵入性的基于尿液的測試來迅速診斷這些疾病和綜合征。在一個實例中，基因表達的監測采用逆轉錄酶定量的聚合酶鏈反應(RT-QPCR)來獨特地檢測足細胞(通過在尿道中這些細胞內唯一表達的nephrin的表達)，和近端小管細胞(通過在尿道中這些細胞內唯一表達的Indian hedgehog的表達)。根據本發明，這些指標能在比變性蛋白尿早的疾病過程中顯示出陽性。在另一實施方案中，本發明包括用于檢測感興趣細胞中的基因表達的新的引物和探針及其試劑盒。
附圖簡述
圖1a和1b顯示了TaqMan測定步驟的一個實例。
圖2顯示了AmpliSensor測定步驟的一個實例。
圖3是本發明的一個非限制性實例的流程框圖。
較佳實施方案詳述在一個非限制性實施方案中，本發明包括鑒別和分析一種或多種特定的基因序列，以標記出足細胞；以及鑒別和分析一個或多個其他特異性基因序列，從而標記出近端小管細胞。已知這兩類細胞受許多腎病的影響，如僅作為例子的下列疾病。在本發明中，為了減少由于正常脫落進入尿液的其他細胞類型(如下部尿路細胞)的基因表達所引起的混淆，單獨鑒別這些細胞類型中的基因表達。
這些基因的鑒定取決于使用的靈敏方法。例如，使用靈敏度較低的方法，認為不會在某些細胞中表達的基因實際上也會以低水平(如已知在細胞中的基因表達水平的1％)表達。由于尿沉淀中的大多數細胞源自下部尿路細胞，這些細胞中的低水平轉錄干擾了檢測上部尿路細胞的靈敏的RT-QPCR研究。相反，根據本發明，可以唯一地鑒定僅僅在感興趣的上部尿路細胞中表達的基因，例如但不局限于，足細胞中的nephrin和近端小管細胞中的Indian hedgehog。例如，在疾病的較晚階段，變性蛋白尿可以始終異常，因此，對于為防止足細胞損失而設計的治療沒有反應。此時，如果治療有效地防止足細胞尿(podocyturia)，nephrin的RT-QPCR可以為正常，而變性蛋白尿測試則始終為異常，因為對足細胞的已有損傷不能被修復。
本發明還包括鑒定具體疾病中的感興趣細胞的脫落。在本發明中，我們出人意料地顯示，正常的腎不會將足細胞或近端小管細胞釋放到尿沉淀中。然而，涉及這些細胞的疾病或紊亂導致喪失足細胞或近端小管細胞進入尿沉淀中。這意味著至少一部分釋放的細胞以完整細胞或細胞片段的方式存在，它們能旋轉進入尿沉淀中。出于評定、診斷和治療的目的，本發明鑒定這種脫落。
本發明另一方面提供了與現有技術所見的那些不同的特異性探針。盡管以前的表達分析描述了潛在的探針候選物，但是沒有人使用和RT-QPCR一樣靈敏的技術，因此不能最終確定哪個是合適的標記。例如，根據靈敏度較低的表達研究，gleppl顯示出其在尿道中僅在足細胞中表達，所以gleppl顯示出有希望作為足細胞特異性標記的候選物。然而，本發明的RT-QPCR技術顯示，除了預計到在足細胞中較大的合成外，下部尿路細胞中也有以前未檢測到的較少量的gleppl轉錄。因此，gleppl基因的表達不適合作為足細胞的標記。這是因為下部尿路細胞中有低的有限的基因表達引起了混淆。相反，采用本發明，顯示nephrin不在除足細胞外的尿路細胞中表達，因此其在尿沉淀中的存在可用作足細胞尿的替代標記。
類似地，正常的尿沉淀中存在許多潛在的小管細胞的標記物，這表明這些基因在下部尿路細胞中有少量表達。甚至在用靈敏度較低的分析中顯示僅在腎臟特定區域表達的候選基因(如N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷酶、水孔蛋白(aquaporin)1、尿調素(uromodulin)和SLC3A1)進行篩選時，也是如此。現已發現，Indian hedgehog是近端腎曲小管細胞和近端腎直小管細胞的合適標記。某些實例的靈敏RT-QPCR分析顯示，在大量正常受試者的尿沉淀中，Indian hedgehog的水平不超過10-4(Indian hedgehog轉錄物的豐度/β-肌動蛋白轉錄物的豐度)。
在一個非限制性實施方案中，本發明還包括用RT-QPCR分析尿沉淀中現存的核糖核酸(RNA)，以鑒別感興趣的細胞。這需要至少一部分脫落進入尿沉淀的細胞有足夠的完整性以產生RT-QPCR產物(這是以前未認識到的結果)。因此，出于本發明的目的，感興趣的細胞可以被認為是足以提供完整RNA的全細胞或其片段。本發明還包括使遍在轉錄的管家基因表達，以確認能引導逆轉錄的RNA已被分離。
在較佳的非限制性方案中，本發明包括，在足細胞和近端小管細胞所參與的疾病中，使用RT-QPCR技術來分別檢測尿沉淀中的足細胞和/或近端小管細胞的異常存在。然而，本領域技術人員應當理解，本發明還存在其他實施方案，可用其他技術來檢測相關基因的表達。因此，通過采用本發明的方法，可以在臨床上將患者分為足細胞和/或近端小管細胞脫落進入或沒有進入尿液的患者。
另外，本發明的RT-QPCR試驗產生了一個半定量的腎關聯分析結果。這樣，就可以通過僅僅使用非侵入性方法獲得的尿液和分子生物標記來監測腎疾病或紊亂的進展。異常可在比使用變性蛋白尿升高標記或腎功能異常更早得多的時間就被確定。
根據本發明，用RT-QPCR對nephrin(足細胞)和Indian hedgehog(近端小管蛋白)進行靈敏測試僅需要少量尿液，而且它是非侵入性的，因為其只需要自然排泄的尿液；而且，它反映了腎臟所涉及的當前狀況。這為臨床醫師提供監控治療效果的機會。例如，始終有變性蛋白尿但是nephrin RT-QPCR呈陰性的糖尿病對象一律處于晚期治療階段的患者(ACE抑制劑或血管緊張素2受體拮抗劑)。利用本發明，在糖尿病早期階段，所見的nephrin RT-QPCR變化可先于變性蛋白尿升高和臨床上明顯的腎病的較后變化。在糖尿病的晚期，nephrin RT-QPCR靈敏地檢測到了藥物治療成功防止足細胞損失的患者。因此，nephrin RT-QPCR是檢測腎病異常以及監控其治療的靈敏方式。
本發明的實施方案還包括用RT-PCR方法，通過測定尿沉淀中特定類型的受損腎細胞的存在，來檢測腎臟損傷。因此，本發明避免了用現有技術來檢測尿液中白蛋白的靈敏度困難和不準確性。盡管Hara及其同事已經開發出一種免疫學測試來檢測尿液中的足細胞，但是該測試是有局限性的，因為它僅僅檢測已有變性蛋白尿升高情況的糖尿病受試者和兒科受試者中的異常。相反，本發明包括了一種更靈敏的測試，如本文所述，其在nephrin RT-QPCR(足細胞)測試中比該免疫學測試更早地顯示出了異常。
為了檢測許多腎病(例如包括腎小球病)，本發明的一些實施方案可使用基因nephrin，該基因在尿道中的轉錄僅限于足細胞。在其他實施方案中，在尿道中的轉錄限于足細胞的任何基因均可用于此目的。顯示尿沉淀中存在足細胞的異常狀態包括(僅作為一些例子)腎小球病、腎病綜合征、全身性紅斑狼瘡(SLE)、糖尿病和高血壓。在不導致足細胞脫落的非腎小球腎疾病中，未見有這些nephrin RT-QPCR變化。用本發明獲得的nephrin RT-QPCR測試結果在腎損傷的其他尿標記之前就顯示出了異常水平。在糖尿病晚期，存在升高的變性蛋白尿，且伴有或不伴有RT-QPCR異常。此時，即使存在升高的變性蛋白尿反映了以前的足狀突細胞足細胞喪失，陰性nephrinRT-QPCR測試結果表明有效的治療使得足細胞不繼續喪失。
為了檢測糖尿病如急性腎小管壞死或阻塞性疾病，本發明采用了基因Indianhedgehog，該基因在尿道中的轉錄局限于近端小管細胞。在其他實施方案中，其在尿道中的轉錄局限于近端小管細胞的任何基因均可用于此目的。Indian hedgehog數據也顯示了許多腎小球疾病中近端小管細胞脫落通常在時間上與腎小球喪失無關。盡管不清楚該細胞喪失在腎小球疾病的發病機制中的作用(如果有的話)，但是注意到其作為一種因子在這些疾病中起作用。
在一些實施方案中，本發明還包括簡單的保存方案，在該方案后，來自經處理的尿沉淀細胞的RNA在室溫下穩定(可以郵寄)。尿樣通過非侵入性的方法獲得，僅僅小心保存即可。然后，它可以小的體積在室溫下運輸至集中化機構進行復雜的RT-QPCR分析。其結果可在收到樣品后一天內獲得，然后將報告返回給醫師。
實施例RNA的分離。所有尿樣的采集得到了知情同意。樣品由大約3-40毫升自發排泄的尿液組成。用于此目的的尿液是新鮮的或是以前經過冷凍的。以8000rpm對尿液離心10分鐘。傾析出上清液，用pH7.4的磷酸緩沖鹽溶液(137mM NaCl+2.7mM KCl+4.3mM Na2HPO4+1.4mM KH2PO4)洗滌沉淀一次，然后再次離心，將經空氣干燥的沉淀重新懸浮于少量雙蒸水中，等分并冷凍于-80℃。
用本發明檢測尿沉淀細胞中的RNA。尿液在排出體外之前，在體內約37℃下在膀胱內貯存數小時。然后，尿液通常在診所內室溫下放置(leave out)數小時。然后離心沉降尿沉淀，并用RNAlater(Ambion)或STG緩沖液(Biotronics，Lowell MA)處理以使RNA酶滅活。如果樣品是在自然排泄后12小時內獲得的，則尿液RNA始終是完整的，足以直接進行RT-QPCR。在室溫下培育尿液數天后顯示出顯著百分比樣品有RNA降解，其體現在參照標記β-肌動蛋白不能支持RT-QPCR。這說明需要在RNA降解之前診所之后不久就處理樣品，否則RNA將不足以進行RT-QPCR。然后，用本領域已知的手段分離RNA，例如按照Biotronics的RNA分離程序用它的尿沉淀RNA分離試劑盒來進行。
引物和探針用于某些實施方案的AmpliSensor反應的人nephrin的引物和探針包括下列過量引物5′-GCCCCGAGGGTCCTGAAGGTG-3′(位于外顯子23和外顯子24的接頭處)(SEQ ID NO1)；有限的引物5′-TGGACTGGCTGACAAAGGGACCCAG-3′(位于外顯子22內)(SEQ ID NO2)；和AmpliSensor探針5′-TACTGGAGAACCTGAAGACCAGCTGCC-3′(位于外顯子23內)(SEQ ID NO3)。
用于某些實施方案的TaqMan反應的人Indian hedgehog的引物和探針包括下列Indian hedgehog-正向引物5′-CAATTACAATCCAGACATCATCTTCAA-3′(SEQID NO4)；Indian hedgehog-反向引物5′-CGAGATAGCCAGCGAGTTCAG-3′(SEQ ID NO5)；和Indianhedgehog-TaqMan探針5′-CATGACCCAGCGCTGCAAGGAC-3′(SEQ IDNO6)，在一個實施方案中標記為6FAM-5′-CATGACCCAGCGCTGCAAGGAC-3′-TAMRA(標記的SEQ ID NO6)。
用于某些實施方案的TaqMan反應的人β-肌動蛋白的引物和探針包括下列β-肌動蛋白正向引物5′-AACTTGAGATGTATGAAGGCTTTTGG-3′(SEQ ID NO7)；β-肌動蛋白反向引物5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAG-3′(SEQID NO8)；和β-肌動蛋白-TaqMan探針5′-CAACTGGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGCCCT-3′(SEQ ID NO9)，在一個實施方案中，標記為6FAM-5′-CAACTGGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGCCCT-3′-TAMRA(標記的SEQ ID NO9)。
本發明另一方面提供了一種用于通過本發明方法來檢測感興趣細胞的試劑盒，其中上述公開的一種或多種新的引物或探針提供于一容器中。
在一些非限制性的實施方案中，本發明包括了在美國專利4,965,188和5,079,352中公開的PCR方法和/或美國專利5,210,015中公開的TaqMan RT-QPCR方法；所有這些專利均全部納入本文作為參考。在一些非限制性的實施方案中，本發明包括美國專利4,965,188和5,079,352中公開的PCR方法和/或美國專利5,348,853和5,567,583中公開的AmpliSensor RT-QPCR方法；所有這些專利均全部納入本文作為參考。
TaqMan試驗的原理。TaqMan試驗在本領域中已有描述，是本領域普通技術人員所知道的(見圖1A和圖1B)。該試驗所基于的原理是由于Taq-介導的核酸外切酶消化與兩個引物之間的序列同源的熒光標記的寡核苷酸，成功的聚合酶鏈反應(PCR)產生了熒光信號。消化程度直接取決于發生的PCR的量，可通過測定由能量轉移的減少而引起的熒光增量來直接準確地定量測定。該測定允許在PCR反應的指數期進行檢測，這是測定初始基因組序列拷貝數所需要的。
AmpliSensor試驗的原理。為了測定在各種疾病中足細胞脫落進入尿液中的情況，TaqMan系統可能不是足夠的靈敏或特異，對于這一需求可采用AmpliSensor試驗。
AmpliSensor試驗(圖2)所基于的原理是熒光能量轉移的減量可用來測定PCR介導的寡核苷酸雙鏈體(“AmpliSensor”)的破壞。寡核苷酸雙鏈體的兩條鏈分別用供體和受體熒光團修飾。在沒有PCR的天然雙鏈體狀態下，熒光團(供體為熒光素，受體為得克薩斯紅)之間的能量轉移是有效的；在熒光素的激發頻率下刺激后，得克薩斯紅的發射頻率下有高熒光信號。由于鏈的置換，PCR破壞了該寡核苷酸雙鏈體，從而減少了能量轉移(與2個受激熒光源(fluor)之間的距離的6次方(sixth power)成反比變化)。破壞程度與PCR的發生量直接相關，它可通過測定由能量轉移的減少而引起的熒光減量來直接準確地定量測定。AmpliSensor系統在本質上比TaqMan系統更靈敏，因為雙向AmpliSensor引物和探針序列是積極參與聚合酶鏈反應的信號分子。與之相比，TaqMan中的探針序列被動地依靠雜交來使能量轉移介導的熒光行為發生。因此，AmpliSensor系統比TaqMan系統更靈敏。
僅與RNA反應的管家基因探針。用組成型表達的基因β-肌動蛋白的探針來驗證從尿液沉積物尿沉淀中成功制得了RNA。盡管合成了探針來識別表征轉錄序列的被剪接的序列，這些探針并不能從經過加工的假基因中區分真實的基因。因此，在RNA迅速抽提中通常存在的基因組DNA污染會產生組成型表達的基因的假陽性物(具有經加工的假基因)。為了僅僅檢測真正轉錄的序列，我們采用了poly(A)cDNA特異性方法，其中一個引物主要由一段T殘基序列組成。該T殘基序列與對轉錄物特異的聚腺苷酸尾序列雜交。寡核苷酸3′端的核苷酸與該信息互補，以防引物在poly A尾序列上打滑(stuttering)。該設置以可以忽略的效率與基因組DNA反應(總RNA實現的信號的0.1％)，因此可以區分轉錄的序列與基因組DNA。
A.足細胞在沒有腎活檢時，足細胞喪失引起的腎病的早期診斷通常在蛋白(或白蛋白)排到尿液中的量升高的基礎上間接實現的。然而，該測試并不是特異性的，因為有許多因素會影響白蛋白排入尿液。另外，只有當有顯著量的足細胞喪失使得剩余足細胞的補償不足以產生正常的屏障而導致蛋白泄漏到尿液中時，該測試才會有異常。由于足細胞在腎臟獲得最大體積后不再復制，因此較早地檢測出這些細胞的損失以防腎功能喪失是尤其重要的。
根據本發明的一個方面，通過在足細胞中選擇性表達從而在尿道中是足細胞特異性的基因異常存在于尿沉淀中，可以高靈敏度檢測足細胞喪失。為描述該方法，我們采用了基因nephrin，該基因在尿道中的轉錄僅發生在足細胞內。得到的發明是一種迅速的、非侵入性的方法，以篩選對影響足細胞的腎臟疾病的早期影響。
在慢性疾病糖尿病開始后的確定時間，將RT-QPCR檢測nephrin的靈敏度與尿液中蛋白質(白蛋白)的存在進行比較。另外，還將該試驗對nephrin的靈敏度與測定足細胞特異性標記物足萼蛋白(podocalyxin)存在的抗體測試進行比較。
足細胞的nephrin標記物。有多種在尿道中的表達的基因被認為是足細胞特異性的。利用這些序列，用gleppl和nephrin進行TaqMan RT-QPCR分析。構建了多個探針，這些探針在正常樣品中沒有信號或本底。然而，沒有獲得特異性信號，這表明這些基因在尿沉淀總RNA中的豐度很低，甚至在腎小球病中，足細胞組成也僅占了尿沉淀細胞中的一小部分。
用更靈敏的AmpliSensor系統檢查gleppl獲得了出人意料的結果，正常個體的尿液中顯示出稀疏量的gleppl。在來自大鼠泌尿組織特定部的RNA上用大鼠TaqMangleppl探針，結果在膀胱細胞檢測到低但有限的gleppl的轉錄水平。盡管該轉錄水平很低而不能用大多數以前的分析技術檢測到(在腎小球中約1％的水平)，但它干擾了尿沉淀的靈敏的RT-QPCR分析，因為大多數脫落的細胞來自膀胱。
在尿道中對足細胞進行選擇性分離的下一個候選探針是nephrin。nephrin是足細胞中的結構蛋白，它包含用于將足細胞分開的裂縫膜鎖合的分子。在來自大鼠泌尿組織特定部的RNA上用大鼠TaqMan探針，結果僅在腎小球內發現有nephrin轉錄。除了該大鼠解剖研究外，還構建了人nephrin探針，以避免與基因組序列之間的任何交叉反應，其利用的事實是外顯子22和23以及外顯子23和24被3kb以上的內含子序列隔開。AmpliSensor序列組跨越了這3個外顯子，且沒有顯示出與人基因組DNA有可檢測的反應。因此，在一些實施方案中，本發明構建的AmpliSensor nephrin探針是非常靈敏的且是特異性的。
表1顯示，該nephrin探針不產生假陽性。平板內和平板間試驗均表明，nephrinmRNA不存在于正常個體的尿沉淀中。另外，檢查了來自40位正常對象的超過200份不同的正常尿沉淀，結果顯示沒有陽性物＞2E＝00(＝2×100＝2)nephrin mRNA分子/尿沉淀試驗(對應于來自5毫升尿液的沉積物)。
另外還評價了由RNA降解引起的假陰性的可能性。常規監測具有和β-肌動蛋白探針的RNA制備物，以確保制備質量滿足要求的RNA。該質量控制是必要的，但沒有表明nephrin mRNA是否有特異性降解還是足細胞的脫分化從而使其不再表達nephrin。現已證實，經歷局灶性節段性腎小球硬化癥(focal segmentalglomerulosclerosis)、最小變化腎病或先天性腎病變的腎小球的足細胞中出現了gleppl的這種脫分化。然而，某些實施方案的RT-QPCR測試發現nephrin存在于所有這些疾病，這使得不表達nephrin的足細胞不可能說明該技術的明顯問題。
我們發現足細胞通常不分泌到尿沉淀中。因此，每種尿沉淀的nephrin mRNA的絕對數＞5可以認為是異常的。正常的樣品沒有大于2的數值，因此數值5用作保守性的突破點(知道有許多關于腎體積和腎濃縮尿液能力的未知量)。盡管這不說明腎臟的濃縮能力，但很難實現標準化，因為無法對少量細胞(即通常不存在于尿沉淀的足細胞)的存在進行標準化。實際上，如果足細胞的脫落僅僅隨時間而變，尿液濃度標記(如肌酸酐)進行標準化是不合適的。幸運的是，基本上任何nephrin的存在都是異常的。
然而，由于對肌酸酐的標準化是用通常方法進行的，因此nephrin RT-QPCR數值也是通過在進行nephrin RT-QPCR時除以同一尿液等份的96份樣品所得肌酸酐濃度來進行標準化的。在該標準化后，96份樣品中僅有2份樣品偏離原始診斷(在nephrinRT-QPCR/尿液肌酸酐的正常和異常數值之間，根據經驗獲得截斷點為5×10-2dl/mg)。另外，如預計的那樣，用兩類分析而有不同的樣品具有RT-QPCR的邊線值。肌酸酐濃度的變化幾乎不超過一個數量級，而nephrin RT-QPCR的絕對值變化在許多數量級內。因此，某些實施方案的AmpliSensor技術，無論數據是否使肌酸酐標準化，均顯示了極好的特異性。
RT-QPCR分析、u-足細胞和升高的變性蛋白尿在兒科腎病中的比較。表2表明，nephrin RT-QPCR、對足萼蛋白的足細胞分析和尿液中白蛋白的存在均是不一致的。u-足細胞以及尿液中白蛋白的分析由日本的M.Hara博士進行。除了這些分析，還用RNAlater(Qiagen)處理了一部分尿沉淀。將經RNAlater處理的樣品在室溫下從日本送至密歇根州。尿沉淀在密歇根州進行收集，方法是離心沉淀經RNAlater處理的細胞、用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌一次、然后用Biotronics程序(同上)分離RNA。如用β-肌動蛋白探針進行的TaqMan RT-QPCR分析所示，用常規方式獲得PCR級質量的RNA。
比較兒科腎病中尿液白蛋白、u-足細胞計數、和nephrin RT-QPCR的水平(表2)。在u-足細胞計數異常的所有病例中均見到了升高的變性蛋白尿(表2)。相反，許多nephrin RT-QPCR異常的對象沒有升高的變性蛋白尿或異常的u-足細胞計數(u-足細胞計數高的異常樣品包括了一亞組變性蛋白尿升高的異常樣品)。這些分析證明，在兒科腎病中，nephrin RT-QPCR的異常可在沒有u-足細胞異常或升高的變性蛋白尿的情況下存在。因此，這些nephrin RT-QPCR異常存在于用其他基于尿液的測試未能鑒別的一組患者中。受試者中沒有升高的變性蛋白尿但有明顯的nephrin RT-QPCR的現象與這些來自早期受影響但尚未發展成升高的變性蛋白尿的受試者的樣品是一致的。
nephrin RT-QPCR異常是腎小球疾病特異性的。表3證明了nephrin RT-QPCR異常對腎小球疾病的特異性。在許多檢查的兒科腎小球疾病中，至少一個尿沉淀顯示出nephrin RT-QPCR異常。這在表3中有所描述，其顯示許多兒科腎小球腎病與尿沉淀中的nephrin RT-QPCR相關。相反，沒有一例檢查的非腎小球疾病表明尿沉淀中有nephrin。如預計的那樣，nephrin RT-QPCR不依賴于移植體的狀態。異常情況注意(胱氨酸貯積癥)顯示了蛋白尿，但是沒有顯示nephrin的異常。這與該疾病中的蛋白尿來源于腎小管而非腎小球的觀點是相符的，它表明尿液中的異常蛋白其本身并不引起nephrin RT-QPCR異常。
糖尿病中腎損傷的分析隨時間的比較。在1型糖尿病中，可以確切地確定疾病的開始時間。在1型糖尿病中，疾病的開始是明確的。而且，在1型糖尿病中，腎疾病需許多年才發展成為臨床上明顯的疾病。因此，通過在該疾病開始后確定異常何時發生來畫出時間線。對于2型糖尿病可作類似的分析，盡管對于2型糖尿病開始的確切時間含糊使產生的結果也不明確。
表4顯示，在診斷糖尿病后最初10年內所見的nephrin RT-QPCR異常比在該間隔期間見到的升高的變性蛋白尿更為頻繁。這著重表明，在診斷后的早期，nephrinRT-QPCR測試比尋找變性蛋白尿或u-足細胞更為敏感。表4-6的數據結合起來證明，在疾病期間，nephrin RT-QPCR異常比蛋白尿升高的發生更早。許多nephrin RT-QPCR異常的糖尿病患者的血壓是正常的，因此表4-6中的異常不僅僅是由于高血壓而引起的(表7)。
在疾病早期顯示RT-QPCR異常的個體的尿沉淀中，沒有升高的變性蛋白尿(表2-8)。這使得RT-QPCR可作為一種有價值的腎臟損傷標記物，因為nephrin RT-QPCR對足細胞是特異性的，而且能在蛋白尿還沒有發生的疾病早期靈敏的檢測到。不同的是nephrin RT-QPCR測定足細胞的當前狀態，而升高的變性蛋白尿測定的是損失這些細胞后的效果。總之，1型糖尿病中各事件的時間順序是nephrin RT-QPCR異常、蛋白尿以及明顯的腎臟疾病。
電子顯微鏡證實，在nephrin RT-QPCR無法辨認的疾病晚期，仍尚存有足細胞。這一發現的基礎有幾種非限制性的可能性1.脫離的足細胞可能脫分化并且不再表達nephrin RNA。在gleppl的表達中，一些由于疾病而脫分化的足細胞已經顯示出這一缺陷。
2.沒有一個在晚期脫離的足細胞保留了足夠的存活力以便有質量足夠好的RNA來支持RT-QPCR。盡管用常規方式進行了β-肌動蛋白分析來確保尿沉淀RNA足夠完整以支持RT-QPCR，這卻并不能保證足細胞RNA足夠完整以支持RT-QPCR。
如果在發現眾多個體在疾病晚期有可測定的nephrin RT-QPCR，這兩種可能性是不可靠的。
3.最有可能的是，治療有效地防止了足細胞繼續損失。因此，nephrin RT-QPCR是可忽視的。假定尿液中出現升高的白蛋白是由于超出腎臟修復能力的年老的足細胞損失的結果。實際上，當超過大約50％的足細胞損失時，其余足細胞不足以補充以前的損失，因而發生了永久性的升高的變性蛋白尿。因此，在沒有足細胞損失的情況下能觀察到升高的變性蛋白尿，所以在制止足細胞繼續損失的情況下，nephrin RT-QPCR是可忽視的。
支持第三種可能性的歷史表明，所有具有正常nephrin RT-QPCR而變性蛋白尿升高的個體正在進行治療以降低血壓和減少足細胞損傷。表5說明，在疾病晚期，變性蛋白尿可以始終呈現出異常，但nephrin RT-QPCR保留了區分足細胞尿的能力。我們檢查了18例具有顯著的變性蛋白尿且正在進行治療(ACE抑制劑或血管緊張肽2受體阻斷劑)的1型糖尿病患者。在這些病例的8例中，nephrin RT-QPCR通常低，表明藥物治療有效地阻止了足細胞損失。在剩余10例中，仍然見到有nephrin RT-QPCR異常，這表明藥物治療沒有有效地阻止足細胞的損失。在2型糖尿病中，我們見到了相同的現象在接受藥物治療的8例變性蛋白尿對象中，有4例顯示出通常低的nephrinRT-QPCR值。該數據證明了nephrin RT-QPCR如何來起到確定藥物治療效果的作用。具有低的RT-QPCR值的那些病例表明，藥物治療抑制了進一步的足細胞損失。根據治療阻止了進一步的足細胞損失這一假設，此時即使電子顯微鏡表明仍尚有足細胞，但是尿沉淀細胞中檢測不到nephrin mRNA。具有低的RT-QPCR數值的那些病例表明，藥物治療抑制了進一步的足細胞損失。
確定2型糖尿病的開始時間比1型糖尿病更為困難，這解釋了為何在2型糖尿病中nephrin RT-QPCR和升高的變性蛋白尿之間在時間上的劃分不如1型糖尿病。在個體中見到的nephrin RT-QPCR異常的情況比發展成末期腎臟疾病(ESRD)多，該靈敏分析表明亞臨床腎病在1型和2型糖尿病中有高流行率。
縱向研究(表6)表明，腎臟在糖尿病中的參與比以前所認識到的更為常見。一半以上受檢查的個體至少有異常的尿液沉積nephrin RT-QPCR(nephrin RT-QPCR＞5E+00)。由于所有尿沉淀對組成型表達的β-肌動蛋白探針呈陽性，有可能正常樣品(nephrin RT-QPCR≤5E+00)確實反映了沒有足細胞尿癥。如果是這樣，表6中的數據表明足細胞尿是糖尿病中的一種間歇的常見現象。如果是這樣，則需要在疾病的整個期間縱向監測尿沉淀的RT-QPCR，以監測腎臟的狀態和對治療的反應。
因此，nephrin RT-QPCR測試至少有兩種可能的臨床用途。在疾病早期，nephrinRT-QPCR在其他測試之前變得異常，因而有可能靈敏地檢測早期腎病。在治療疾病的晚期，當存在升高的變性蛋白尿時，nephrin RT-QPCR可以是正常的，其反映了這樣一個事實足細胞的損失不一定會成為變性蛋白尿升高的永久性疾病。因此，nephrinRT-QPCR應當能確定，在疾病晚期，當升高的變性蛋白尿變成永久性異常時，治療措施是否有效地治療了足細胞損失。
高血壓和全身性紅斑狼瘡。在這兩種疾病中，均可見到足細胞異常(表7-8)。同樣，ESRD病理學可能再次由該足細胞損失引起。大量個體中存在的尿沉淀nephrinRT-QPCR異常證實了足細胞預計在這些疾病中起的重要作用。
腎癌。癌癥與未正常粘附的細胞的增殖有關。因此，腎癌能導致正常尿沉淀中沒有見到的腎細胞脫落。從斯特拉斯堡的Pierre Oudet博士處獲得了22份用RNAlater保存的尿沉淀。在22份沉積物中，有21份觀察到nephrin的異常存在。這些結果表明，足細胞尿和/或腎細胞脫分化而導致nephrin表達可用來檢測腎癌。因此，本發明包括了一種新的有價值的診斷腎癌以及監測其對治療的反應的方法，該方法是用非侵入性的方法測試尿沉淀中的nephrin轉錄。同樣，對足細胞特異性轉錄物需要有靈敏的檢測。
nephrin和蛋白尿是不相關的。沒有見到nephrin RT-QPCR和蛋白尿之間有關聯(通過尿液中的總蛋白/肌酸酐或白蛋白/肌酸酐來測定)。在正常樣品中，這些變數均不呈陽性，以致所有這些陽性數值表示異常。關聯性的缺乏表明兩種技術是測定不同的屬性。nephrin RT-QPCR是通過測定尿沉淀中足細胞特異性的基因nephrin的存在來評價當前的足細胞損失。在見到蛋白尿之前RT-QPCR測試可以異常是不奇怪的，因為明顯的足細胞損失必定發生在能檢測到蛋白尿之前。當nephrin RT-QPCR不明顯時，尿液中繼續顯示喪失蛋白的樣品可能表示個體不再損失足細胞，但是仍然存在由以前的足細胞損失而引起的顯著缺陷。因此，即使沒有持續的足細胞損失，仍有導致慢性蛋白尿的血液和尿液流之間的永久性聯系。
某些實施方案的nephrin RT-QPCR實現了非侵入性的監測影響足細胞的疾病。將nephrin RT-QPCR設計成用于篩選足細胞疾病是因為它所關注的是在尿道中僅在足細胞內表達的基因。nephrin RT-QPCR測試的間斷性使人聯想起升高的變性蛋白尿測試，而升高的變性蛋白尿的發現并不隨時間而恒定。實際上，在縱向研究的糖尿病對象中，升高的變性蛋白尿可回復成正常。這些發現與這樣一個假設相一致大多數1型糖尿病個體有來自其疾病的腎損傷，而其中只有一部分會繼續發展成ESRD。然而，變性蛋白尿升高的試驗仍然是有用的，因為始終具有升高的變性蛋白尿的個體發展成腎病的危險在增加。將nephrin RT-QPCR與變性蛋白尿測試結合起來能更確切地診斷腎臟及其治療所處的階段。
總之，本發明的nephrin RT-QPCR測試(或其類似方案)應該用來檢測影響足細胞的疾病的早期效應以及監測足細胞對治療的反應。
B.近端小管細胞Indian hedgehog作為近端小管的標記物。研究了腎臟的不同解剖學部位的許多分子標記物對于近端腎曲小管和近端腎直小管的Indian hedgehog，針對近端小管的n-乙酰基β-D-氨基葡糖苷酶、針對近端小管和下行四肢消瘦細胞(descending thin limbcells)的水孔蛋白(aquaporin)1、針對近端腎曲小管和近端腎直小管的SLC3A1，以及針對遠端小管的尿調節蛋白(uromodulin)。這些探針的TaqMan分析顯示，在人體內正常細胞中沒有明顯本底(由于下部尿路細胞的表達)的唯一探針是Indian hedgehog探針。這不能通過演繹得知。和nephrin一樣，進行了擴大系列的40個正常對照尿沉淀的工作。這表明，在正常對照中，RT-QPCR對Indian hedgehog與RT-QPCR對β-肌動蛋白的比例沒有出現大于10-4的異常值(表9)。與nephrin的情況(少量足細胞脫落在尿沉淀中，需要用更靈敏的AmpliSensor系統)不同，TaqMan分析Indian hedgehog基因的表達檢測到了近端小管細胞的排出。較稀少的足細胞與較豐富的近端小管細胞之間的這一定量差異是有意義的，因為一旦腎臟生長完全，有限量的高度專一化的足細胞不再活躍地復制。相反，更豐富的近端小管細胞能在成人的整個生命期間復制。
近端小管細胞的異常定義為與β-肌動蛋白對照信號的比例，其反映了排入尿沉淀中的近端小管細胞的比例。這種需要進行標準化體現了一個事實，即正常人能排泌少量Indian hedgehog轉錄物。因此，與nephrin的情況(正常人中基本上沒有檢測到信號)不同，正常情況中有有限量的Indian hedgehog信號。盡管正常的定義(對Indianhedgehog的RT-QPCR與對β-肌動蛋白的RT-QPCR之比小于10-4)必定包括了一些異常情況，但是采用保守的標準，從而使得基本上不會產生假的異常信號。40份正常對照樣品均未顯示出Indian hedgehog的RT-QPCR與β-肌動蛋白的RT-QPCR的比例大于10-4(表9)。
阻塞性疾病。小管疾病在阻塞性疾病的致病原因中起主要作用。在阻塞性疾病情況下，近端小管細胞隨疾病而排入尿液內(通過Indian hedgehog mRNA的存在來測定)。沒有觀察到明顯的足細胞組分，因為在尿沉淀RNA中沒有見到足細胞標記nephrin的表達(表9)。Indian hedgehog的RT-QPCR測試是特別有價值的，因為它將目前沒有丟失近端小管細胞的阻塞性疾病與目前正丟失近端小管細胞的那些疾病區分開來(表10A)。表10B描述了從給定對象的縱向試驗獲得的數值。通過β-肌動蛋白標準品的RT-QPCR確認，所有尿沉淀被適當保存。異常數值的間斷性表明對腎臟的效果的波動狀態。異常現象的依次持續存在表明影響腎臟的疾病的持續存在。
盡管在一些情況下不清楚近端小管細胞來自年老的有病的或移植的腎臟，但是顯然本發明包括了一種靈敏的、非侵入性的方法來檢測阻塞性疾病中的近端小管脫落。
急性小管壞死。急性小管壞死(ATN)見于各種臨床情況且對生命有威脅。實現該疾病的早期診斷是有利的，因為然后能進行特殊的治療。對自然排泄的尿液進行非侵入性的測試并靈敏地檢測作為該疾病基礎的近端腎小管病變或許是監測該疾病過程的理想方式。現已注意到，在該疾病中，排斥臺盼藍的活的近端小管細胞脫落到尿液。這支持了通過RT-QPCR檢測近端小管特異性基因產物Indian hedgehog來檢測該近端小管細胞的原理。
通過使用針對Indian hedgehog的TaqMan探針，尿沉淀的RT-QPCR成功地應用于ATN的問題(表11)。因此，近端小管細胞脫落進入尿沉淀的半定量測定(從Indianhedgehog的RT-QPCR與對組成型表達的β-肌動蛋白基因的RT-QPCR的比例獲得)是檢測該疾病的一種有用的方式。如表11所示，RT-QPCR可用來檢測急性小管壞死的存在和嚴重程度。表11中的所有患者均產生了與ATN相容的泌尿問題。然而，并不知道哪些受試者事實上患ATN而哪些對象患其他疾病。患者尿液中有Indianhedgehog，則其分泌近端小管細胞，因而患有ATN，這樣，其就能和具有與ATN相容的臨床癥狀、但未患該疾病的對象區分開來。因此，尿液中Indian hedgehog的存在代表了篩選ATN存在的一種方式，然后就接受治療ATN。
在腎小球病理學參與的各種腎臟疾病中的Indian hedgehog RT-QPCR異常。Indianhedgehog的RT-QPCR測試除了在阻塞性疾病和ATN中反映了原發性疾病對腎臟的影響，Indian hedgehog的RT-QPCR(數值)在被認為主要作用在腎小球上的各種疾病中也會升高。其具體包括非阻塞性腎臟疾病如腎小球性腎炎和腎病綜合征、糖尿病、高血壓和狼瘡，所有這些疾病均被認為反映了腎小球致病機理。利用該方法，在所有這些疾病中均檢測到尿沉淀中存在足細胞特異性的基因nephrin。盡管這些疾病主要為腎小球效果，但是也注意到了對近端小管的影響。通過使用RT-QPCR試驗，這些發現確認在這些疾病中也存在對近端小管細胞的影響(表12-13)。
表12-13表明，在各種已知的腎小球疾病(糖尿病、高血壓、狼瘡和兒科腎病對象中的腎小球疾病)中，在給定時間時的nephrin的RT-QPCR和Indian hedgehog的RT-QPCR通常是不一致的。為了研究這些異常的時間過程，采用了慢性疾病糖尿病，因為1型糖尿病的開始是急性的，且其很容易記錄。然而，糖尿病中的腎臟疾病需要許多年才會發展成臨床上明顯的程度。表12表明，在診斷后的最初10年內，nephrin和Indian hedgehog的RT-QPCR異常比升高變性蛋白尿更頻繁。然而，即便是同一患者，足細胞異常的發生和近端小管異常的發生也是不一致的(表13A)。Indian hedgehog的RT-QPCR異常與升高的變性蛋白尿之間也是不一致的(表13B)。表12和13的數據合起來表明，nephrin和/或Indian hedgehog的RT-QPCR異常在疾病歷程中早于升高的變性蛋白尿的發生。許多RT-QPCR異常的糖尿病患者的血壓是正常的，因此，表12-13中的異常不僅僅是由于高血壓引起的(表7)。
與nephrin RT-QPCR正常而變性蛋白尿升高的發現一樣，當變性蛋白尿升高時，Indian hedgehog/β-肌動蛋白的RT-QPCR也可以是正常的。同樣，升高的變性蛋白尿測定的是隨時間對血液和尿液流之間足細胞屏障完整性的損傷，而Indian hedgehog/β-肌動蛋白RT-QPCR測定的是近端小管細胞的急性損失。
對1型糖尿病進行了足夠數量的分析，以檢查nephrin RT-QPCR、Indian hedgehog的RT-QPCR或蛋白尿(通過總蛋白/肌酸酐或白蛋白/肌酸酐來測定)是否相關。沒有發現有關聯，因此，這些變量是獨立的。注意到這些變量均沒有在正常人中呈陽性，以致所有這些陽性值均表示有異常。令人驚奇的是，在所有研究的疾病中，nephrin和Indian hedgehog的RT-QPCR測定是相互獨立的(表9)。還注意到，同一個體的縱向研究證明，一個給定的個體能隨時間顯示出不同的異常(數據未顯示)。與同一個體內升高的蛋白尿能隨時間而變化的發現相一致的是，這著重強調了用基于尿液的測試來跟蹤對糖尿病、高血壓和狼瘡患者腎臟的影響的復雜性。然而，顯然基于尿液的測試為洞察對這些疾病的腎臟的影響提供了一種獨特有力的非侵入性的手段。在早期糖尿病和局灶性節段性腎小球硬化癥中已經提示了近端小管缺陷，表9提供了其存在的直接證據。
總之，本發明包括通過檢查尿沉淀來檢測腎臟的足細胞和近端小管異常的新的方法、系統和組合物。在某些實施方案中，足細胞和/或近端小管細胞的檢測是通過篩選由足細胞和/或近端小管細胞獨特轉錄的基因的轉錄來實現的。本發明包括的出人意料的發現是，足細胞和/或近端小管細胞的脫落發生在影響這些細胞的各種疾病中，但是不發生在正常人中。另外，脫落細胞的類型的分子鑒定可通過篩選在尿道源足細胞或近端小管細胞中選擇性表達的基因(因而是足細胞特異性的或近端小管細胞特異性的基因)的轉錄物來實現。這兩個事實是本發明之前所未知的。本發明的非限制性的較佳實施方案采用nephrin RT-QPCR和Indian hedgehog RT-QPCR來實現這一任務。
本發明包括用RT-QPCR來篩選足細胞特異性基因(nephrin)或近端小管細胞特異性的基因(Indian hedgehog)。尋找這些基因轉錄物來鑒別脫落到尿液中的腎細胞是本發明的新穎的一部分。該策略只有在能夠對尿沉淀細胞(或這些細胞的片段)中的尿RNA并然后對保存的RNA進行靈敏的分析下才是可行的。如目前某些實施方案中所用的，nephrin RT-QPCR可檢測足細胞異常，Indian hedgehog RT-QPCR可檢測小管異常。因此，nephrin RT-QPCR代表了一種測定各種疾病對足細胞的影響的有用方法。Indian hedgehog RT-QPCR代表了測定阻塞性疾病或急性小管壞死對近端小管的影響的有用方法。
前面已經描述了本發明的較佳實施方案。然而，本領域技術人員應當理解，某些變化也在本發明的教導范圍內。下列權利要求應當被用來研究確定本發明的真實范圍和內容。另外，本發明的方法和結構可納入各種實施方案中，而本文僅僅描述了其中的一些而已。技術人員顯然知道還有不脫離本發明精神的其他實施方案。因此，所述的實施方案僅僅是描述性的，其不應被理解為具有限制性。
SEQ ID NO列表SEQ ID NO15’-GCCCCGAGGGTCCTGAAGGTG-3’SEQ ID NO25’-TGGACTGGCTGACAAAGGGACCCAG-3’SEQ ID NO35’-TACTGGAGAACCTGAAGACCAGCTGCC-3’SEQ ID NO45’-CAATTACAATCCAGACATCATCTTCAA-3’SEQ ID NO55’-CGAGATAGCCAGCGAG3TTCAG-3’SEQ ID NO65’-CATGACCCAGCGCTGCAAGGAC-3’SEQ ID NO75’-AACTTGAGATGTATGAAGGCTTTTGG-3’SEQ ID NO85’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAG-3’SEQ ID NO95’-CAACTGGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGCCCT-3’表1nephrin RT-QPCR的平板內和平板間差異
所有正常樣品小于2E00
表2在兒科腎病樣品中比較nephrin RT-QPCR、u-足細胞和微量白蛋白/肌酸酐
表3僅在腎小球疾病的尿沉淀中見到nephrin
表4.糖尿病中nephrin RT-QPCR和變性蛋白尿異常的時間過程
表5.1型糖尿病中nephrin RT-QPCR和變性蛋白尿異常之間的關系
表3
BMS細胞中沒有大腸桿菌(E.coli)IHF(即，MUSynHFα和MUSynHFβ)的表達情況下，突變體λ整合酶MUSynInt-h(pSynInt-h)的表達介導了質粒和病毒復制子對pAttB+pAttP和vAttB+pAttP之間的重組。BMS細胞中，MUSynInt-h與MUSynHFα和MUSynHFβ的共表達介導了質粒和病毒復制子對pAttB+pAttP，vAttB+pAttP和pAttB+vAttP之間的重組。BMS細胞中，在MUSynHFα和MUSynHFβ<p>表7高血壓
異常數值用粗體表示表8全身性紅斑狼瘡(SLE)
表9不同情況下尿沉淀中的Indian hedgehog和nephrin mRNA的存在Indian hedgehog/nephrin
表10Indian hedgehog可異常存在于阻塞性疾病的尿沉淀中(絕對值＞1E-04的用粗體表示)10A.個體病例
由表1可以得到以下的結果。即，實施例1～7得到的人工毛發用氯乙烯類纖維的光澤、觸感、纖維強度以及紡絲性的任意一項都是可以使用的水平(△或△以上)，特別是實施例5～8得到的人工毛發用氯乙烯類纖維，各評價項目中，大多為良好水平(○)。與此相反，比較例1～3得到的人工毛發用氯乙烯類纖維的抑制表面光澤的效果不充分，而比較例4得到的人工毛發用氯乙烯類纖維不僅在熔融紡絲時產生斷絲，而且觸感也不好。
工業實用性本發明的人工毛發用聚氯乙烯類纖維由于具有天然毛發那樣的光澤、觸感、自然的手感，因此，適合于例如假發套、部分假發、辮子、駁發條等頭發裝飾制品的制造。
表11 IHH排泄入急性小管壞死的受試者的尿液中
表12糖尿病中nephrin、Indian hedgehog(IHH)和變性蛋白尿異常的時間過程
(比較例4)除了在氯乙烯類樹脂組合物中含有(b)水滑石類熱穩定劑(協和化學公司制造，ALCAMIZER-1)2質量份、以及(c)環氧化合物(日本油脂公司制造，フアルパツク75ASV)20質量份以外，與上述實施例1同樣地，得到氯乙烯類纖維。
評價以上的實施例1～3和比較例1～4中得到的氯乙烯類纖維的(1)長期連續性、(2)變色性、(3)斷絲頻率、以及(4)初期著色性。評價結果示于下面的表1。
在熔融紡絲時由于金屬絲網網孔阻塞而經常發生斷絲，上述(1)的“長期連續性”是表示直到如果不更換金屬絲網就不能進行制造的狀態的連續熔融紡絲時間，其評價基準如下◎連續紡絲時間超過96小時也沒有斷絲問題，因此，在操作性·生產性方面能更加提高效果○連續紡絲時間在96～48小時產生微量的斷絲，但作為長期連續制造沒有問題×連續紡絲時間不到48小時就產生大量的斷絲，因此，不能維持長期連續制造。
上述(2)的“變色性”是判斷賦予卷曲的工序時的變色程度的特性值。該“變色性”是在使氯乙烯類纖維拉緊的狀態下于105℃的齒輪干燥箱(ギアオ一ブン)中進行1小時熱處理后，用色差計(倉敷紡織公司制造，高精度<p>序列表<110>D.M.庫爾尼特(Kurnit，David M)<120>用于腎病診斷和治療中的尿樣分析的方法和組合物<130>65306-0083<150>US10/108,969<151>2002-03-28<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人nephrin過量引物<400>1gccccgaggg tcctgaaggt g 21<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Amplisensor探針<400>2tggactggct gacaaaggga cccag 25<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Amplisensor探針<400>3tactggagaa cctgaagacc agctgcc 27<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Indian hedgehog反向引物<400>4caattacaat ccagacatca tcttcaa 27<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Indian hedgehog反向引物<400>5cgagatagcc agcgagttca g 21<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Indian hedgehog TaqMan探針<400>6catgacccag cgctgcaagg ac 22<210>7<211>26<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人Beta-肌動蛋白正向引物<400>7aacttgagat gtatgaaggc ttttgg 26<210>8<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人Beta-肌動蛋白反向引物<400>8tttttttttt tttttttttt ttttttttta ag 32<210>9<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人Beta-肌動蛋白TaqMan探針<400>9caactggtct caagtcagtg tacaggtaag ccct 3
權利要求
1.一種檢測腎疾病的方法，該方法包括以下步驟篩選哺乳動物尿液樣品中一特定基因的表達，該特定基因只有在暗示腎疾病的細胞存在時才存在于所述尿液樣品中，其中尿液樣品中可檢測的白蛋白濃度為0至30mg/dl。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述特定基因是足狀突細胞nephrin基因。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述暗示有腎疾病的細胞選自足狀突細胞和近端小管細胞。
4.一種評定哺乳動物尿液樣品中存在足狀突細胞的方法，該方法包括以下步驟提供哺乳動物尿液樣品，該樣品選擇性地含有一個或多個足狀突細胞；和測定基因在尿液樣品中的足狀突細胞中選擇性表達的水平，其中尿液樣品中的可檢測的白蛋白濃度為0至30mg/dl。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述測定步驟包括用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗測定在尿液樣品中足狀突細胞內的選擇性表達的基因的表達水平。
6.一種評價哺乳動物尿液樣品中足狀突細胞存在的方法，該方法包括以下步驟提供哺乳動物尿液樣品，所述樣品選擇性地含有一個或多個足狀突細胞；和測定尿液樣品中足狀突細胞nephrin基因的表達水平。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述測定步驟包括用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗測定尿液樣品中足狀突細胞nephrin基因的表達水平。
8.一種評價哺乳動物尿液樣品中足狀突細胞存在的方法，該方法包括以下步驟提供哺乳動物尿液樣品，該樣品選擇性地含有一個或多個足狀突細胞；用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗測定尿液樣品中足狀突細胞nephrin基因的表達水平；和用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗測定尿液樣品中組成型表達的基因的表達水平。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述組成型表達的基因是β-肌動蛋白的基因。
10.一種評價人尿液樣品中足狀突細胞存在的方法，該方法包括以下步驟提供人尿液樣品，該樣品選擇性地含有來自至少一個足狀突細胞的一個或多個RNA分子；和用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗測定尿液樣品中足狀突細胞nephrin基因的表達水平。
11.根據權利要求10所述的方法，它還包含用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗測定尿液樣品中β-肌動蛋白基因的表達水平的步驟，其中所述試驗包含一個或多個RNA分子，以及β-肌動蛋白正向引物SEQ ID NO7、β-肌動蛋白反向引物SEQ ID NO8或β-肌動蛋白探針SEQ ID NO9中的一個或多個。
12.一種評價哺乳動物尿液樣品中近端小管細胞存在的方法，該方法包括以下步驟提供哺乳動物尿液樣品，該樣品選擇性地含有一個或多個近端小管細胞；和測定尿液樣品中在近端小管細胞內選擇性表達的基因的表達水平。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述測定步驟包括用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗測定尿液樣品中近端小管細胞內選擇性表達的基因的表達水平。
14.一種評價哺乳動物尿液樣品中近端小管細胞存在的方法，該方法包括以下步驟提供哺乳動物尿液樣品，該樣品選擇性地含有一個或多個近端小管細胞；和測定尿液樣品中近端小管細胞的Indian hedgehog基因的表達水平。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述測定步驟包括用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗測定尿液樣品中近端小管細胞Indian hedgehog基因的表達水平。
16.一種評價哺乳動物尿液樣品中近端小管細胞存在的方法，該方法包括以下步驟提供哺乳動物尿液樣品，該樣品選擇性地含有一個或多個近端小管細胞；用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗測定尿液樣品中近端小管細胞Indianhedgehog基因的表達水平；和用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗測定尿液樣品中組成型表達的基因的表達水平。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述組成型表達的基因是β-肌動蛋白的基因。
18.一種評價人尿液樣品中近端小管細胞存在的方法，該方法包括以下步驟提供人尿液樣品，該樣品選擇性地含有來自至少一個近端小管細胞的一個或多個RNA分子；用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗測定尿液樣品中近端小管細胞Indianhedgehog基因的表達水平，其中所述試驗包括一個或多個RNA分子，以及正向引物SEQ ID NO4、反向引物SEQ ID NO5和探針SEQ ID NO6中的一個或多個。
19.根據權利要求18所述的方法，它還包括一步驟用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗測定尿液樣品中β-肌動蛋白的表達水平，其中所述試驗包括所述一個或多個RNA分子和β-肌動蛋白正向引物SEQ ID NO7、β-肌動蛋白反向引物SEQ ID NO8或β-肌動蛋白探針SEQ ID NO9中的一個或多個。
20.一種診斷、監控哺乳動物腎疾病過程的方法，該方法包括以下步驟提供哺乳動物尿液樣品，該樣品選擇性地含有一個或多個足狀突細胞；和測定尿液樣品中在足狀突細胞內選擇性表達的基因的表達水平；其中尿液樣品中可檢測的白蛋白的濃度為0至30mg/dl。
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述測定步驟包括用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗測定尿液樣品中在足狀突細胞內選擇性表達的基因的表達水平。
22.根據權利要求20所述的方法，其中所述基因是足狀突細胞nephrin基因。
23.一種診斷、監控哺乳動物腎疾病過程的方法，該方法包括以下步驟提供哺乳動物尿液樣品，該樣品選擇性地含有一個或多個足狀突細胞；和測定尿液樣品足狀突細胞nephrin基因的表達水平。
24.根據權利要求23所述的方法，其中所述測定步驟包括用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗測定尿液樣品內足狀突細胞nephrin基因的表達水平。
25.一種診斷、監控哺乳動物腎疾病過程的方法，該方法包括以下步驟提供哺乳動物尿液樣品，該樣品選擇性地含有一個或多個足狀突細胞；和用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗測定尿液樣品內足狀突細胞nephrin基因的表達水平；和用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗測定尿液樣品中β-肌動蛋白基因的表達水平。
26.一種診斷、監控人腎疾病過程的方法，該方法包括以下步驟提供人尿液樣品，該樣品選擇性地含有來自至少一個足狀突細胞的一個或多個RNA分子；和用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗測定尿液樣品內足狀突細胞nephrin基因的表達水平。
27.根據權利要求26所述的方法，該方法還包括用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗測定尿液樣品內β-肌動蛋白基因的表達水平，其中所述試驗包括所述一個或多個RNA分子，以及β-肌動蛋白正向引物SEQ ID NO7、β-肌動蛋白反向引物SEQ ID NO8或β-肌動蛋白探針SEQ ID NO9中的一個或多個。
28.一種診斷、監控哺乳動物腎疾病過程的方法，該方法包括以下步驟提供哺乳動物尿液樣品，該樣品選擇性地含有一個或多個近端小管細胞；和測定尿液樣品中在近端小管細胞內選擇性表達的基因的表達水平。
29.根據權利要求28所述的方法，其中所述測定步驟用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗測定尿液樣品中在近端小管細胞中選擇性表達的基因的表達水平。
30.一種診斷、監控哺乳動物腎疾病過程的方法，該方法包括以下步驟提供哺乳動物尿液樣品，該樣品選擇性地含有一個或多個近端小管細胞；和測定尿液樣品近端小管細胞Indian hedgehog基因的表達水平。
31.根據權利要求30所述的方法，其中所述測定步驟包括用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗測定尿液樣品內近端小管細胞Indian hedgehog基因的表達水平。
32.一種診斷、監控哺乳動物腎疾病過程的方法，該方法包括以下步驟提供哺乳動物尿液樣品，該樣品選擇性地含有一個或多個近端小管細胞；和用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗測定尿液樣品內近端小管細胞Indianhedgehog基因的表達水平；和用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗測定尿液樣品中β-肌動蛋白基因的表達水平。
33.一種診斷、監控人腎疾病過程的方法，該方法包括以下步驟提供人尿液樣品，該樣品選擇性地含有來自至少一個近端小管細胞的一個或多個RNA分子；和用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗測定尿液樣品內近端小管細胞Indianhedgehog基因的表達水平，其中所述試驗包括所述一個或多個RNA分子，以及正向引物SEQ ID NO4、反向引物SEQ ID NO5或探針SEQ ID NO6中的一個或多個。
34.根據權利要求33所述的方法，它還包括步驟用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗測定尿液樣品中β-肌動蛋白基因的表達水平，其中所述試驗包括所述一個或多個RNA分子，以及β-肌動蛋白正向引物SEQ ID NO7、β-肌動蛋白反向引物SEQ IDNO8或β-肌動蛋白探針SEQ ID NO9中的一個或多個。
35.一種用于通過逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗來評價人近端小管細胞中人Indian hedgehog基因表達水平的引物，它包含SEQ ID NO4。
36.一種用于通過逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗來評價人近端小管細胞中人Indian hedgehog基因表達水平的引物，它包含SEQ ID NO5。
37.一種用于通過逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗來評價人近端小管細胞中人Indian hedgehog基因表達水平的探針，它包含SEQ ID NO6。
38.一種用于通過逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗來評價人β-肌動蛋白基因表達水平的引物，它包含SEQ ID NO7。
39.一種用于通過逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗來評價人β-肌動蛋白基因表達水平的引物，它包含SEQ ID NO8。
40.一種用于通過逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應試驗來評價人β-肌動蛋白基因表達水平的探針，它包含SEQ ID NO9。
41.一種用于評價人尿液樣品中足狀突細胞的試劑盒，它分別包含權利要求38、39或40中的SEQ ID NO7、8或9中的一個或多個。
42.一種用于評價人尿液樣品中近端小管細胞的試劑盒，它分別包含權利要求35、36、37、38、39或40中的SEQ ID NO4、5、6、7、8或9中的一個或多個。
43.一種用于評價β-肌動蛋白基因的試劑盒，它分別包含權利要求38、39或40中的SEQ ID NO7、8或9中的一個或多個。
全文摘要
本發明包括新的組合物、系統和方法來分析生物學樣品如尿液樣品，以便診斷和治療腎疾病，這些腎疾病包括但不限于腎小球性腎炎、腎病綜合征、糖尿病、狼瘡、高血壓、急性腎小管壞死、尿路塞疾病、腎癌以及其他疾病或綜合征。在較佳的實施方案中，本發明包括鑒別尿道中僅在臨床或科學上特別感興趣的細胞(如足細胞或近端小管細胞)中表達的特定基因。因此，本發明能以非侵入性的方式迅速正確地分析多個疾病和紊亂中腎和尿道的狀況和功能。
文檔編號C07H21/04GK1863923SQ03807235
公開日2006年11月15日 申請日期2003年3月27日 優先權日2002年3月28日
發明者D·M·庫爾尼特 申請人:密執安州立大學董事會