專利名稱：人肝細胞增殖方法和人肝細胞的獲取方法
技術領域：
本申請發明涉及到在小鼠體內使人肝細胞增殖的方法，肝臟內含有人肝細胞的嵌合小鼠，由嵌合小鼠獲取人肝細胞的方法以及通過該方法獲取的人肝細胞。由這樣操作從嵌合小鼠得到的人肝細胞成為肝細胞試劑盒和體外人工肝臟的材料。
背景技術：
肝臟具有500多種以上的多種多樣的特異功能。作為肝臟的主要功能如血漿蛋白質的合成分泌、通過糖異生和糖原代謝進行血糖調節、脂質合成、尿素合成、膽汁合成分泌、解毒等。
攝入到體內的很多物質在肝臟中代謝。在醫藥品開發的領域中，醫藥品候補物質在肝臟受到什么樣的代謝，對肝臟和其他臟器或組織有什么樣影響等是必需的資料。另外，到目前為止，很多化學物質被合成也釋放到環境。闡明這些物質每一個、或復合后對人體有什么樣的影響對于社會也是非常重要的，對于這樣的化學物質對人體的影響的評價中也需要對肝功能的毒性試驗。
在以醫藥品候補物質為首的化學物質的安全性試驗和藥物代謝試驗中，目前可以使用小鼠、大鼠、兔、狗、猴等。特別在醫藥品開發中，在進入以人為對象的第一相試驗之前，有義務使用動物進行毒性試驗和安全性試驗，試驗需要大量的時間和勞力，投資額也巨大。
然而，通過這些動物實驗得到的資料不能保證直接可以應用于人。事實上，在動物實驗中認為沒有毒性的物質對人表現出毒性的事例很多，而相反的場合也有。因此，到目前為止，很多醫藥品候補物質在進入以人為對象的第一相試驗后處于開發中止，而在動物實驗中由于毒性強在進入臨床試驗前變成開發中止的物質中實際上認為對人沒有毒性的個案也存在很多。
人們認為這起因于人的肝臟中的代謝功能和小鼠或大鼠的肝臟的代謝功能不同。最近，已經可以使用人肝細胞進行體外代謝試驗或毒性試驗了。可是，從通過不能用于移植的腦死亡患者的肝臟或腫瘤摘出等的切除肝得到的人肝細胞的量遠遠低于需要。因此，人肝細胞的增殖技術的開發在醫藥品開發中非常必要。
而大量的人肝細胞的必要性在體外型人工肝臟中也同樣。人工肝臟是通過人工方式代行肝臟功能的醫療裝置，將吸附、透析、過濾等依據物理化學原理的人工作用和通過摘出肝或肝組織的灌流產生的生物學作用組合的混合型人工肝臟的開發正全力進行著。在進行這樣的人工肝臟開發時，在用于使物理化學方面的功能提高的膜或回路的性能提高的同時，可適用于人的大量肝細胞的供給是不可缺的。
然而，人的肝細胞到目前為止一直認為對成熟個體分離的原代細胞進行傳代培養是不可能的。即，因為對于粘附依賴性的成熟肝細胞，為了進行該細胞的傳代操作從培養基質進行剝離時會造成很大損傷，再使他粘附培養基質更困難。與此相反，本申請發明人發明了從由人肝臟分離的正常肝細胞分離具有克隆性的增殖能力的小型肝細胞，對該小型肝細胞進行原代培養，再將該培養肝細胞進行傳代培養之后使肝細胞增殖的方法，獲得了專利(特開平08-112092號公報；日本專利第3266766號；美國專利第6,004,810號、特開平10-179148號公報；日本專利第3211941號、特開平7-274951公報；日本專利第3157984號、特開平9-313172號公報；日本專利第3014322號)。
該專利發明的方法是提供用于在體外使肝細胞增殖，得到大量人肝細胞的新的手段的方法，但存在著在長期的傳代培養中幾種肝功能下降的問題。由于這一原因，雖然作為例如維持肝功能的藥劑的篩選體系，或就長期傳代培養后仍保存的特定功能進行藥劑的毒性或藥效進行試驗的體系是有用的，但作為代替人肝功能的肝細胞，或作為混合型人工肝臟的材料還存在不充分的地方。
作為用于消除在體外的肝細胞增殖中的上述那樣問題的手段，有人提出了在動物個體內(in vivo)使肝細胞增殖的方法。
例如，Heckel等人制作了清蛋白尿激酶型纖溶酶激活物轉基因小鼠(uPA-Tg小鼠)。在該小鼠中，尿激酶型纖溶酶激活物(uPA)基因與清蛋白的增強子和啟動子連接，合成對肝臟特異作用的uPA蛋白(HeckelJL，Sandgren EP，Degen JL，Palmiter RD，and Brinser RL.Neonatalbleeding in transgenic mice expressing urokinase-typeplasminogen activator.Cell 62447-456，1990)。肝細胞被uPA損傷，肉眼看呈白色，也觀察到由于出血或肝衰竭而死亡的個體。如果從該小鼠的脾臟移植lac轉基因小鼠的正常肝細胞，可知在肝臟活存和增殖，最終被供體肝細胞置換(Rhim JA，Sandgren EP，Degen JL，PalmiterRD，and Brinster RL.Replacement of diseased mouse liver by hepaticcell transplantation.Science 2631149-1152，1994)。另外，Rhim等人使uPA-Tg小鼠和由于先天缺損胸腺而不具有T細胞功能的NUDE小鼠交配，制作uPA-Tg/NUDE小鼠。通過向uPA-Tg/NUDE小鼠移植大鼠的肝細胞，制作帶有大鼠肝細胞的小鼠(Rhim JA，Sandgren EP，PalmiterRD and Brinster RL.Complete reconstitution of mouse liver withxenogeneic hepatocytes.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 924942-4946，1995)。然而，使用該小鼠的帶有人肝細胞的嵌合小鼠的報告還沒有。
Dandri等人使uPA-Tg小鼠和具有免疫缺陷性質的敲除小鼠Rag2小鼠交配，制作uPA-Tg/Rag2小鼠。向uPA-Tg(+/-)/Rag2小鼠移植由人肝臟採取的人肝細胞，顯示出小鼠肝臟的15％被置換。他們成功地使B型肝炎病毒感染了該小鼠(Dandri M，Burda MR，Torok B，PollokJM，Iwanska A，Sommer G，Rogiers X，Rogler CE，Gupta S，Will H，GretenH，and Petersen J.Repopulation of mouse liver with humanhepatocytes and in vivo infection with hepatitis Bvirus.Hepatology 33981-988，2001)。
另外，本申請發明人公布了在先前專利申請的發明(特開2002-45087號公報)中，向作為免疫缺陷小鼠的SCID小鼠與uPA-Tg交配得到的uPA-Tg/SCID小鼠移植人肝細胞，該移植肝細胞實質上承擔著小鼠的肝功能的嵌合小鼠。先前申請發明的嵌合小鼠由于通過uPA基因的表達造成小鼠肝細胞功能缺陷，所以該肝功能被移植的人肝細胞保持。因此，可以正確評價移植的人肝細胞的個體內功能，作為用于對被檢測物質的毒性和藥效進行判定的實驗動物個體是非常有用的。然而，對于先前申請發明的嵌合小鼠，人肝細胞移植后不能生存50天以上，另外由于在成長過程中正常化的小鼠肝細胞增殖，移植人肝細胞的增殖效率低，人肝細胞的置換率停止在約50％程度。
這種現象也可以通過最近的Mercer等人的報告(MercerDF，Schiller DE，Eliiott JF，Douglus DF，Hao C，Ricnfret A，AddisonWR，Fischer KP，Churchill TA，Lakey JRT，Tyrrell DLJ and KetemanNM.Hepatits C virus replication in mice with chimeric humanlivers.Repopulation of mouse liver with human hepatocytes and invivo infection with hepatitis B virus.Nature Medicine7927-933，2001)證實。Mercer等人報告了與本申請發明人同樣制作uPA-Tg/SCID，將冷凍保存的人肝細胞融解后進行移植，結果在小鼠血清中檢測到2mg/ml以下的人清蛋白 (換算成血液中約1mg/ml以下)，約50％肝臟被人肝細胞置換。
如上所述，將人肝細胞移植到免疫缺陷肝損傷小鼠(uPA-Tg/SCID小鼠)，制作嵌合小鼠雖然在該嵌合小鼠本身中存在有用性(例如，對人肝細胞的毒性和藥效的體內試驗等)，但作為用于在小鼠個體內使移植肝細胞大量增殖的手段并不充分。
另外，由于移植了人肝細胞的嵌合小鼠不能長期生存，而且在成長過程中小鼠肝細胞增殖，作為對人肝細胞的毒性和藥效的體內評價體系其利用對象被限定。
本申請發明作為課題提供用于在體內使人肝細胞充分增殖的改良方法作為人肝細胞的增殖方法。
另外作為課題也提供對通過長期生存在小鼠體內增殖的人肝細胞進行分離、回收的方法。
另外，作為課題還提供通過將分離的人肝細胞移植到許多小鼠中，在小鼠體內使人肝細胞增殖，可以大量獲取在體內保持一定規格的人肝細胞的嵌合小鼠，可以大量獲取從該小鼠中分離的一定規格的人肝細胞的方法。
另外，作為課題提供分離的肝細胞的利用方法。
另外，本申請作為課題也提供用于實施上述各個發明的單克隆抗體以及產生該單克隆抗體的新的雜交瘤細胞株。
發明內容
本申請作為解決上述課題的第1發明提供一種人肝細胞增殖方法，其特征是通過將人肝細胞移植到免疫缺陷肝損傷小鼠的肝臟中，在防御來自人肝細胞產生的人補體的攻擊的狀態下，對人肝細胞移植小鼠進行飼養，使移植的人肝細胞在小鼠肝臟中增殖。
在第1發明的方法中，其中防御來自人補體的攻擊的狀態作為優選狀態至少是以下的(a)和(b)中一種狀態。
(a)至少投給人肝細胞移植小鼠1次補體抑制劑；(b)作為免疫缺陷肝損傷小鼠，使用免疫缺陷肝損傷小鼠和衰變加速因子(decayaccelerating factor)(DAF/CD55)轉基因小鼠交配后得到的后代小鼠。
在第1發明的方法中，作為優選的狀態，其中免疫缺陷肝損傷小鼠是遺傳性免疫缺陷小鼠和遺傳性肝損傷小鼠交配后得到的后代小鼠。另外，作為各個優選狀態，后代小鼠是半合子免疫缺陷肝損傷小鼠，而且在將肝細胞增殖抑制物質投給半合子免疫缺陷肝損傷小鼠后，進行人肝細胞移植。
在第1發明的方法中以及其優選的狀態中，作為另外的一種優選狀態是將抗小鼠Fas抗體投給移植了人肝細胞的免疫缺陷肝損傷小鼠。
在第1發明的方法中，也可以將移植到免疫缺陷肝損傷小鼠的肝細胞是增殖性人肝細胞，其增殖性人肝細胞是被特異識別形成集落增殖的人肝細胞的單克隆抗體識別的人肝細胞，而且單克隆抗體是小鼠-小鼠雜交瘤K8223(FERM BP-8334)產生的單克隆抗體作為各自的優選狀態。
作為第2發明，本申請提供人肝細胞大量增殖方法，其特征是由以下步驟(1)～(3)構成，并且將步驟(2)和(3)重復一次以上。
(1)通過將人肝細胞移植到免疫缺陷肝損傷小鼠的肝臟，在防御來自人肝細胞產生的人補體的攻擊的狀態下對人肝細胞移植小鼠進行飼養，使移植的人肝細胞在小鼠肝臟中增殖的步驟；(2)從小鼠肝臟分離增殖的人肝細胞的步驟；以及(3)將分離的人肝細胞移植到免疫缺陷肝損傷小鼠的肝臟，在防御來自人肝細胞產生的人補體的攻擊的狀態下將人肝細胞移植小鼠飼養50天以上的步驟。
在該第2發明的方法中，作為優選的狀態是在步驟(1)和/或步驟(3)中防御來自人補體的攻擊的狀態至少是以下的(a)和(b)中的一種狀態。
(a)至少投給人肝細胞移植小鼠一次補體抑制劑；(b)作為免疫缺陷肝損傷小鼠使用免疫缺陷肝損傷小鼠和衰變加速因子(DAF/CD55)轉基因小鼠交配后得到的后代小鼠。
在該第2發明的方法中，作為各個優選的狀態是在步驟(1)和/或步驟(3)中，免疫缺陷肝損傷小鼠是遺傳性免疫缺陷小鼠和遺傳性肝損傷小鼠交配得到的后代小鼠，后代小鼠是半合體免疫缺陷肝損傷小鼠，而且將肝細胞增殖抑制物質投給半合體免疫缺陷肝損傷小鼠后，進行肝細胞移植，在該第2發明的方法以及上述的優選狀態中，在步驟(1)和/或步驟(3)中，也可以將抗Fas抗體投給移植了人肝細胞的免疫缺陷肝損傷小鼠作為另一種理想狀態。
另外，在該第2發明的方法中，各個優選的狀態是在步驟(1)和/或步驟(3)中向免疫缺陷肝損傷小鼠進行移植的人肝細胞是增殖性人肝細胞，增殖性人肝細胞是被特異識別形成集落增殖的人肝細胞的單克隆抗體識別的人肝細胞，而單克隆抗體是小鼠-小鼠雜交瘤K8223(FERM BP-8334)產生的單克隆抗體。
在該第2發明的方法中，更為優選的狀態是通過在步驟(2)中至少進行以下的(a)和(b)(a)對從小鼠肝臟分離的肝臟組織進行膠原酶處理，以及(b)對被不識別非人肝細胞，特異識別人肝細胞的單克隆抗體識別的細胞進行分離，中的一種操作，實質上只分離人肝細胞。而在該狀態中單克隆抗體是小鼠-小鼠雜交瘤K8216(FERM BP-8333)產生的單克隆抗體。
作為第3發明，本申請提供在肝臟內含有通過上述第1發明或第2發明的方法增殖的人肝細胞的嵌合小鼠。
該第3發明的嵌合小鼠優選的狀態是增殖的人肝細胞占肝臟內細胞的70％以上，和/或具有人型P450活性。
作為第4發明，本申請還提供人肝細胞獲取方法，其特征是從上述第3發明的嵌合小鼠的肝臟分離人肝細胞。
在第4發明的方法中，更為優選的狀態是至少進行以下的(a)和(b)(a)對從小鼠肝臟分離的肝臟組織進行膠原酶處理，以及(b)對被不識別非人肝細胞，特異識別人肝細胞的單克隆抗體識別的細胞進行分離，中的一種操作，實質上只分離人肝細胞。而且在該狀態下單克隆抗體是小鼠-小鼠雜交瘤K8216(FERM BP-8333)產生的單克隆抗體。
作為第5發明，本申請還提供通過第4發明的方法獲取的人肝細胞。
另外，作為第6發明，本申請還提供含有上述第5發明的人肝細胞的細胞試劑盒。
另外，作為第7發明，本申請還提供充填了上述第5發明的人肝細胞的混合型人工肝臟。
另外，作為第8發明，本申請還提供一種不識別非人肝細胞，特異識別人肝細胞的單克隆抗體。該第8發明的一個例子是小鼠-小鼠雜交瘤K8216(FERM BP-8333)產生的單克隆抗體。
作為第9發明，本申請還提供將候補物質全身投給上述第3發明的嵌合小鼠，試驗候補物質的藥物動力學或毒性的方法。
以上各發明中的狀態和用語、概念在發明的實施方式的說明和實施例中有詳細的規定。另外為了實施本發明使用的各種各樣的技術，除了明確給出其資料的技術外，只要是同行，根據眾所周知的文獻都可以容易而且確實地實施。例如，本發明的基因工程和分子生物學技術在Sambrook and Maniatis，in Molecular Cloning-A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork，1989；Ausubel，F.M.et al.，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，New York，N.Y，1995等有記載。
附圖的簡單說明
圖1是補體抑制劑對人血清清蛋白濃度的效果的試驗結果。
圖2是對分別移植了人肝實質細胞和小型肝細胞的小鼠的血中清蛋白濃度進行測定的結果。
圖3是補體抑制劑對小鼠體重的效果的試驗結果。
圖4是將補體抑制劑投給或不投給嵌合小鼠時人補體(hC3a)濃度的比較。
圖5是表示小鼠血中人清蛋白濃度和被人肝細胞置換的置換率和功能的相關性的曲線圖。
圖6是利用人特異的細胞角蛋白8/18抗體染色后的免疫染色圖。
圖7是利用人特異的細胞角蛋白8/18抗體進行免疫染色的放大圖。
圖8是移植了人肝細胞的小鼠肝臟微粒體中人特異的CYP2CP的Western blot分析結果。
圖9是表示小鼠和供體肝臟的微粒體中的雙氯酚酸鈉的代謝活性的圖。
圖10是表示各種各樣的人肝細胞置換率的嵌合小鼠肝臟、以及投給了利福平的嵌合小鼠肝臟中的6種人型P450分子的表達量的圖。
圖11是對進行再移植人肝細胞的小鼠血中人清蛋白濃度進行試驗的結果。
圖12是將倒千里光堿投給uPA(+/+)SCID小鼠的效果的試驗結果。
圖13是對將抗小鼠Fas抗體投給人肝細胞嵌合小鼠后的小鼠血中的人清蛋白進行試驗的結果。
圖14是對各種各樣年齡患者採取的肝細胞進行培養時的增殖曲線。
圖15是為了制作單克隆抗體，作為抗原使用的培養人肝細胞的相差顯微鏡照片。
圖16是通過熒光抗體觀察雜交瘤培養上清(K8223)在人肝細胞中的反應性的照片。
圖17是通過FACS對雜交瘤培養上清(No.23)在人肝細胞表面的反應性進行解析的結果。
圖18是對與雜交瘤培養上清(No.23)反應的細胞集團(R2)和不反應的細胞集團(R3)分類收集、培養時的相差顯微鏡照片。
圖19是通過FACS對雜交瘤培養上清(No.23)在傳代培養人肝細胞表面的反應性進行解析的結果。
圖20是通過FACS對雜交瘤培養上清(K8216)在剛分離后的人、小鼠、大鼠肝細胞表面的反應性進行解析的結果。
具體實施例方式
第1發明的人肝細胞增殖方法，其特征是通過將人肝細胞移植到免疫缺陷肝損傷小鼠的肝臟中，在防御來自人肝細胞產生的人補體的攻擊的狀態下，對人肝細胞移植小鼠進行飼養，使移植的人肝細胞在小鼠肝臟中增殖。
上述的Mercer等人(Nature Medicine 7927-933，2001)報道了制作免疫缺陷肝損傷小鼠(uPA-Tg/SCID小鼠)，將冷凍保存的人肝細胞融解后移植到小鼠中，結果肝臟的50％左右細胞被人肝細胞置換。然而，Mercer等人制作的人肝細胞移植小鼠不能達到移植的人肝細胞的高置換率。
第1發明的方法通過防止移植的人肝細胞制造的補體攻擊小鼠本體，可以使人肝細胞移植小鼠存活50天以上。而且由于使小鼠存活50天以上，可以使小鼠肝臟細胞70％以上置換為人肝細胞。
用于防御來自人補體對接受移植的小鼠的攻擊的第1具體手段是給該小鼠注射「補體抑制劑」。作為補體抑制劑可以使用nafamostatmesilate(フサンR；鳥居制藥)、gabexate mesilate(FOYR；小野制藥)、comostat mesilate(フオイパンR；小野制藥)、眼鏡蛇毒因子等。另外，這些補體抑制劑是小鼠在細胞移植或臟器移植時使用的藥劑。但是，在通常移植手術中，補體抑制劑可以用于防御接受移植的肝臟產生的補體對移植細胞或移植臟器的攻擊。另外，在本發明中，由于接受移植小鼠因肝損傷，本身不能產生補體，所以補體抑制劑可以用于防御移植的人肝細胞產生的補體對接受移植的小鼠進行攻擊。
用于防御來自人補體對接受移植的小鼠的攻擊的第2具體手段是作為接受移植的小鼠，使用免疫缺陷肝損傷小鼠和人衰變加速因子(hDAF/CD55)轉基因小鼠交配后得到的后代小鼠。有報道hDAF/CD55轉基因小鼠在腎臟、心臟、肺、肝臟等內皮細胞表面高效表達hDAF，對人補體具有抗性能力。(Murakami H，Takahagi Y，Yoshitatsu M，Miyagawa S，Fujimura T，Toyomura K，Shigehisa.T，Shirakura R，and Kinoshita T.Porcine MCP gene promoterdirects high level expression of human DAF(CD55)in transgenic mice.Immunobiology，201583-597，1999/2000；van Denderen BJW，PearseMJ，Katerelos M，Nottle MB，Du Z-T，Aminian A，Adam WR，Shenoy-Scaria A，Lublin DM，Shinkel TA，and D′Apice AJF.Expression offunctional decay-accelerating factor(CD55)in transgenic mice protectsagainst human complement-mediated attack.Transplantation，61582-588，1996)。
因此，作為hDAF/CD55轉基因小鼠和免疫缺陷肝損傷小鼠的后代動物的接受移植小鼠對于移植人肝細胞產生的人補體有很高的抗性能力。hDAF/CD55轉基因小鼠可以根據上述文獻(Immunobiology，201583-597，1999/2000和Transplantation，61582-588，1996)，使用例如在廣泛的各種各樣組織、器官中表達的膜輔因子蛋白(MCP)或H2K(b)(MHC class I)的啟動子調控下hDAF可以表達那樣構建的載體，通過眾所周知的轉基因小鼠制作方法(例如，Proc.Natl.Acad.Scl.USA 77；7380-7384，1980)進行制作。
在第1發明的人肝細胞增殖方法中使用的「免疫缺陷肝損傷小鼠」是本來的肝細胞受到損傷的「免疫缺陷肝損傷小鼠」，而且是對來自異種動物的細胞不表現出排斥反應的「免疫缺陷小鼠」。因此，免疫缺陷肝損傷小鼠可以通過對同一個小鼠實施肝損傷誘發處置和免疫缺陷處置制作。肝損傷誘發處置可以通過例如眾所周知的肝損傷誘發物質(例如，四氯化碳、D-半乳糖胺、2-乙酰氨芴、焦精[染料]生物堿等)進行處理，或外科的肝切除等。而作為免疫缺陷處置，是投給免疫抑制劑或摘出胸腺等。
但在第1發明的方法中，作為優選狀態小鼠，使用具有遺傳性肝損傷的小鼠和遺傳性免疫缺陷小鼠交配后作為后代個體得到的免疫缺陷肝損傷小鼠。作為遺傳性肝損傷小鼠例如上述Rhim等人(Science，263，1149(1994))作成的uPA-Tg小鼠。或者使用使肝損傷發生的基因(例如，組織型纖溶酶原激活物基因等)，通過眾所周知的轉基因法(Proc.Natl.Acad.Scl.USA 77；7380-7384，1980)也可以制作轉基因免疫缺陷肝損傷小鼠。另外，通過眾所周知的基因尋靶法(Science，244，1288-1292，1989)敲除承擔肝功能的基因，也可以得到基因遺傳性肝損傷的小鼠。另外，作為遺傳性免疫缺陷小鼠可以使用SCID小鼠、NUDE小鼠、RAG2敲除小鼠等眾所周知的小鼠。以下將這樣得到的小鼠記為「遺傳性免疫缺陷肝損傷小鼠」。
遺傳性免疫缺陷肝損傷小鼠優選使用肝損傷基因是純合體的小鼠。這樣的純合小鼠由于正常的肝細胞幾乎不增殖，小鼠肝細胞不妨礙人肝細胞的增殖。但是，這樣的純合小鼠在使半合體之間交配時概率上只得到1/4的比例。
另外，肝損傷基因為半合體的遺傳性免疫缺陷肝損傷小鼠(「半合體免疫缺陷肝損傷小鼠」)由于在使半合體之間交配時，或半合體和SCID小鼠交配時可以得到的概率為1/2，所以第1發明可以低成本實施。然而，半合體免疫缺陷肝損傷小鼠由于二倍體染色體的一方的基因是正常的，所以由于肝損傷基因的缺失使得正常肝細胞可形成集落，進行增殖，出生后7周時小鼠肝臟就被正常的小鼠肝細胞占據了。所以一般來說，半合體免疫缺陷肝損傷小鼠作為用于使人肝細胞增殖的接受移植小鼠是不合適的。因此，作為該第1發明的優選狀態，在向半合體免疫缺陷肝損傷小鼠移植人肝細胞之前，投給特異抑制肝細胞增殖的物質，預防正常化小鼠肝細胞增殖后形成集落。作為肝細胞增殖抑制物質如作為雙吡咯烷(類)生物堿的一種的倒千里光堿、毛果天芥菜堿、千里光菲靈、單野百合堿、毛束草堿等。
在第1發明的方法中，移植中使用的人肝細胞可以使用通過常規方法從正常的人肝組織分離的人肝細胞。在第1發明的方法中，作為優選的狀態使用在體內具有特別活躍增殖能力的增殖性肝細胞。而在本發明中所謂的「增殖性人肝細胞」指的是在培養條件下(in vitro)，形成單一細胞種集團的集落，進行增殖可以使集落增大的人肝細胞。另外，其增殖在集落構成細胞是單一種這一點上有時也稱之為「克隆性增殖」。另外，這樣的細胞是通過傳代培養可以進一步增加細胞數的細胞。
這樣的增殖性人肝細胞作為一個例子可以使用本申請發明人發明的人小型肝細胞。即本申請發明人在大鼠或人的肝臟中發現了增殖能力高的小型肝細胞，已經申請了專利(特開平08-112092號公報；日本專利第3266766號；美國專利第6,004,810號、特開平10-179148號公報；日本專利第3211941號、特開平7-274951公報；日本專利第3157984號、特開平9-313172號公報；日本專利第3014322號)。另外相關的論文也已經發表(Chise Tateno，and Katsutoshi YoshizatoGrowth and differentiation in culture ofclonogenic hepatocytes that express both phenotypes of hepatocytes andbiliary epithelial cells.American Journal of Pathology 1491593-1605，1996.Hiroshi Hino，Chise Tateno，Hajime Sato，Chihiro Yamasaki，Shigeru Katayama，Toshihiko Kohashi，Akio Aratani，Toshimasa Asahara，Kiyohiko Dohi，and Katsutoshi YoshizatoA long-term culture of humanhepatocytes which show a high growth potential and express theirdifferentiated phenotypes.Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 256184-191，1999.Chise Tateno，Kaori Takai-Kajihara，Chihiro Yamasaki，Hajime Sato，and Katsutoshi YoshizatoHeterogeneity of growth potential of adult rat hepatocytes in vitro.Hepatology 3165-74，2000.Shigeru Katayama，Chise Tateno，Toshimasa Asahara，and Katsutoshi YoshizatoSize-dependent in vivogrowth potential of adult rat hepatocytes.American Journal of Pathology15897-105，2001.)。
該人小型肝細胞由于其優越的增殖能力，可以在接受移植者的體內急速增殖，在短時間內可以形成能夠發揮正常肝功能的人肝細胞集團。
這樣的小型肝細胞的採取除了使用上述以前申請發明記載的那樣的離心分離的方法之外，也可以通過淘析器或FACS等細胞分級裝置採取。另外，也可以通過特異識別形成集落進行增殖的肝細胞的單克隆抗體採取。無論是在體外(in vitro)增殖的人肝細胞、冷凍保存肝細胞、通過端粒末端轉移酶基因等的導入存活的肝細胞、使這些肝細胞和非實質細胞混合后的細胞都可以。
增殖性人肝細胞的其他例子是通過特異識別增殖性人肝細胞的單克隆抗體(實施例6)識別的人肝細胞。這樣的單克隆抗體識別的增殖性人肝細胞根據對抗體的標記，可以通過眾所周知的EIA、RIA、熒光抗體法等以高純度獲取。具體來說，例如使酶、放射性同位素、磁珠、或熒光色素等標記的單克隆抗體接觸由人肝臟分離的肝細胞集團，通過分離發出標記信號的細胞進行。作為標記使用的酶只要滿足轉換數大、與抗體結合也穩定、使底物特異著色等條件的酶，沒有特別限制，通常的EIA中使用的酶，例如可以使用過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、乙酰膽堿酯酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶等。另外也可以使用酶抑制物質或輔酶等。這些酶和抗體結合可以通過使用馬來酰亞胺化合物等架橋劑的眾所周知的方法進行。作為底物可以根據使用的酶的種類使用眾所周知的物質。例如作為酶使用過氧化物酶時，可以使用3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺，而作為酶使用堿性磷酸酶時，可以使用對硝基苯酚等。作為放射性同位素可以使用125I或3H等通常RIA中使用的同位素。作為熒光色素可以使用異硫氰酸熒光素(FITC)或四甲基羅丹明熒光素(TRITC)等通常在熒光抗體法中使用的熒光色素。另外，標記信號的檢測在使用酶時加由于酶分解作用而發色的底物，通過對底物的分解量進行光學測定，求酶活性，將其換算為結合抗體量，從與標準值的比較可以算出抗體量。使用放射性同位素時，通過閃爍掃描計數器等測定放射性同位素發出的放射線量。而在使用熒光色素時，可以通過組合了熒光顯微鏡的測定裝置測定熒光量。
在將象上述那樣的人肝細胞、特別是增殖性人肝細胞移植到免疫缺陷肝損傷小鼠時，就象實施例所表示的那樣，可以經由小鼠的脾臟移植到肝臟。另外，也可以由門靜脈進行移植。移植的人肝細胞的數目可以是1～10000個程度。
另外在第1發明的方法中作為優選的狀態之一是將抗小鼠Fas抗體投給移植了人肝細胞的小鼠。抗小鼠Fas抗體與小鼠肝細胞的Fas抗原反應，具有誘導凋亡的作用。通過將抗小鼠Fas抗體投給移植了人肝細胞的小鼠，小鼠的肝細胞發生凋亡，死掉。該抗體由于對人肝細胞沒有影響，所以可以有選擇地只增殖移植了的人肝細胞。通過該方法可以使小鼠肝臟中被人肝細胞置換的置換率進一步上升。
以下就第2發明的人肝細胞大量增殖方法進行說明。
第2發明的方法，其特征是進行以下步驟(1)～(3)。
步驟(1)與第1發明的方法同樣進行，使人肝細胞在小鼠肝臟中增殖。
步驟(2)對在小鼠肝臟內增殖的人肝細胞進行分離。
步驟(3)將分離的人肝細胞分別移植到免疫缺陷肝損傷小鼠的肝臟，與第1發明的方法同樣使人肝細胞增殖。
而且，該第2發明的方法將上述步驟(2)和(3)重復1次以上。即在步驟(1)中，移植到1只小鼠的人肝細胞在該小鼠肝臟內增加到約100倍。因此，在步驟(2)中如果全部回收增殖的人肝細胞，那么在步驟(3)中從原理上講可以向100只小鼠移植人肝細胞，最終可以回收最初移植的人肝細胞的100×100倍的人肝細胞。另外通過將步驟(2)和(3)反復進行2次，可以回收最初移植的人肝細胞的100×100×100倍的人肝細胞。
在該第2發明的方法中，可以與上述第1發明方法和其優選狀態方法同樣操作進行步驟(1)和/或步驟(3)。這里所謂「和/或」指的是對于上述第1發明方法中的一個要素可以只在步驟(1)進行，也可以只在步驟(3)進行，或者也可以在步驟(1)和步驟(3)兩方中進行。例如，在步驟(1)中，將上述的單克隆抗體(第8發明)識別的增殖性肝細胞移植到小鼠中，也可以將在步驟(3)中回收的人肝細胞的全部用于移植。上述第1發明中各個要素可以根據使人肝細胞增殖的小鼠個體、或從小鼠回收的人肝細胞的用途等適當選擇。
第2發明的步驟(2)是從小鼠肝臟分離在步驟(1)[反復進行步驟(2)和(3)時，其前面的步驟]中增殖的人肝細胞的步驟。分離方法可以采用各種各樣的方法(例如，膠原酶灌流法)，優選是至少采用以下方法(a)和(b)中的一種方法進行。
方法(a)通過對從小鼠肝臟分離的肝臟組織進行膠原酶處理，實質上只回收人肝細胞。由于膠原酶的細胞毒性對小鼠肝細胞比對人肝細胞更高，所以通過調節膠原酶的消化時間可以造成肝細胞損傷，也可以只收獲人肝細胞。膠原酶處理的時間也因人肝細胞和小鼠肝細胞的比例不同而不同，例如人肝細胞在70％以上時，可以進行8～20分鐘程度的處理。
方法(b)通過對被不識別非人肝細胞，特異識別人肝細胞的單克隆抗體識別的細胞進行分離，可以回收純度高的人肝細胞。作為這樣的單克隆抗體例如小鼠-小鼠雜交瘤K8216(FERM P-18751)產生的單克隆抗體。
本申請的第3發明是在肝臟內含有通過上述第1發明或第2發明的方法增殖的人肝細胞的「嵌合小鼠」。該嵌合小鼠優選是從人肝細胞移植后生存50天以上，更優選的是生存70天以上的嵌合小鼠。另外，該嵌合小鼠鼠肝臟的70％以上、優選是90％以上、更優選的是98％以上被人肝細胞占據的小鼠。另外該嵌合小鼠是具有人細胞色素P450活性的小鼠。即，人型P450存在著CYP1A1、1A2、2C9、2C19、2D6、3A4等數十種的分子種類，本發明的嵌合小鼠的特征之一是這些人型P450與各個人肝細胞實質上同等程度地進行表達。細胞色素P450是肝臟中與外源性化學物質代謝等有關的蛋白質，表達人型P450的小鼠肝臟與人肝臟實質上同樣對化學物質等進行代謝。因此，這個第3發明的嵌合小鼠使得試驗例如藥劑的藥效和毒性對人肝細胞的影響的方法(第9發明)成為可能。而這樣的嵌合小鼠的利用可以參照本申請發明人等先前提出的發明(特開2002-45087號公報嵌合動物)。另外，肝臟內含有通過第2發明的大量增殖方法增殖的人肝細胞的嵌合小鼠的集團是分別含有來自同一人的肝細胞的嵌合小鼠的集團，可以在實質上均一的條件下進行大規模試驗。
本申請的第4發明是從上述第3發明的嵌合小鼠分離人肝細胞的方法。該方法可以與上述第2發明的步驟(2)同樣進行。
本申請的第5發明是通過上述第4發明的方法從嵌合小鼠的肝臟分離的人肝細胞。該人肝細胞通過在小鼠個體內增殖，實質上具有與人肝組織的正常肝細胞同樣的肝功能。因此，通過該第5發明的人肝細胞可以提供用于藥物代謝試驗或安全性試驗等的人肝細胞試劑盒(第6發明)以及混合型人工肝臟(第7發明)。另外，使用在混合型人工肝臟中使用的模件(充填了人肝細胞的模件)，可以回收人肝細胞生產的有用物質。
肝細胞試劑盒根據細胞的種類和用途有各種各樣，只要是同行，通過采用第5發明的人肝細胞和眾所周知的細胞試劑盒的構成，可以很容易制作第6發明的細胞試劑盒。另外模件和混合型人工臟器的構成也眾所周知，只要是同行可以很容易制作第7發明的人工肝臟等。
作為第8發明，本申請還提供不識別非人肝細胞，特異識別人肝細胞的單克隆抗體。
該單克隆抗體根據眾所周知的單克隆抗體制作方法(「單克隆抗體」，長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、1990年；“Monoclonal Antibody”James W.Goding，third edition，Academic Press，1996)，可以按照例如以下步驟制作。
1雜交瘤細胞的制作用含有傳代培養的人正常肝細胞的免疫原免疫哺乳動物，根據需要可以適當進行追加免疫，對動物充分致敏。然后從該動物中摘出抗體產生細胞(淋巴細胞或脾臟細胞)，得到該細胞與骨髓瘤細胞株的融合細胞。然后從這些融合細胞中選擇產生目的單克隆抗體的細胞，通過培養可以得到雜交瘤細胞。以下對各工序進行詳細說明。
a)免疫原的制備對通過膠原酶從正常肝組織分離到的人肝細胞進行傳代培養，作為免疫原。人肝細胞可使用進行4次以上，優選是6次以上傳代的，例如從15歲以下的人肝組織分離的肝細胞。
b)動物免疫作為被免疫動物，可以使用眾所周知的在雜交瘤制作法中使用的哺乳動物。具體來說，如小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛、馬等。但從與摘出的抗體產生細胞融合的骨髓瘤細胞容易獲取等觀點考慮，優選使用小鼠或大鼠作為被免疫動物。而實際使用的小鼠和大鼠的系統沒有特別限制，使用小鼠時，可以使用例如各系統A、AKR、BALB/c、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BR、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、RIII、SJL、SWR、WB、129等，使用大鼠時可以使用例如Low、Lewis、Spraque、Daweley、ACI、BN、Fischer等。其中如果考慮到與下面的骨髓瘤細胞的融合適合性，小鼠的BALB/c系統，大鼠的Low系統作為被免疫動物特別合適。另外這些小鼠或大鼠在免疫時的周齡優選為5～12周齡。
動物的免疫可以通過將作為免疫原的傳代人肝細胞約104～108個注射到動物的皮下或腹腔內進行。免疫原投給的程序因被免疫動物的種類、個體差異等而有所不同，一般來說，投給免疫原次數為1～6次，多次投給時投給間隔優選1～2周。
c)細胞融合在無菌條件下從上述投給程序的最終免疫日后1～5天的被免疫動物取出含有抗體產生細胞的脾臟細胞或淋巴細胞。可以根據眾所周知的方法從這些脾臟細胞或淋巴細胞分離抗體產生細胞。
然后，對抗體產生細胞和骨髓瘤細胞進行融合。對于骨髓瘤細胞沒有特別限制，可以從眾所周知的細胞株中選用合適的。但考慮到從融合細胞選擇雜交瘤時的便利性，優選使用其選擇已經確立的HGPRT(Hpoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)缺損株。即，來自小鼠的X63-Ag8(X63)、NS1-Ag4/1(NS-1)、P3X63-Ag8.U1(P3U1)、X63-Ag8.653(X63.653)、SP2/O-Ag14(SP2/O)、MPC11-45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO，BU.1等，來自大鼠的210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)等，來自人的U266AR(SKO-007)、GM1500·GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy2(HMy2)、8226AR/NIP4-1(NP41)等。
抗體產生細胞和骨髓瘤細胞的融合根據眾所周知的方法可以在不使細胞存活率極度降低的條件下適宜實施。這樣的方法如可以使用在聚乙二醇等高濃度聚合物溶液中對抗體產生細胞和骨髓瘤細胞進行混合的化學方法，利用電刺激的物理方法等。
融合細胞和非融合細胞的選擇優選是通過例如眾所周知的HAT(次黃嘌呤、氨甲蝶呤和胸苷)選擇法進行。該方法在使用在氨甲蝶呤存在下不能存活的HGPRT缺損株的骨髓瘤細胞，獲取融合細胞是有效的。即，通過將未融合細胞和融合細胞在HAT培養基培養，有選擇地保留了對氨甲蝶呤具有抗性的融合細胞，而且可以使其增殖。
d)雜交瘤的篩選對產生目的單克隆抗體的雜交瘤細胞的篩選可以通過眾所周知的酶免疫檢定法(EIAEnzyme Immunoassay)、放射線免疫測定法(RIARadio Immunoassay)、熒光抗體法等進行。
通過這樣篩選，可以得到分別產生與非人肝細胞不結合，而只與人肝細胞特異結合的單克隆抗體的雜交瘤細胞群。
通過這樣篩選后的雜交瘤細胞可以通過甲基纖維素法、軟瓊脂糖法、有限稀釋法等眾所周知的方法進行篩選，用于產生抗體。
通過以上那樣方法得到的雜交瘤細胞可以在液氮中或-80℃以下的冷庫中以冷凍狀態保存。作為這樣的雜交瘤細胞的具體例子，本申請提供小鼠-小鼠雜交瘤K8216(FERM BP-8333)。
2單克隆抗體的獲取和純化通過用眾所周知的方法對上述1制作的雜交瘤細胞進行培養，可以獲取不識別非人肝細胞，而只與人肝細胞特異結合的單克隆抗體。
培養可以在例如在上述克隆法中使用的同樣組成的培養基中進行培養，或為了使單克隆抗體大量生產，也可以向小鼠腹腔內注射雜交瘤細胞，從腹水中採取單克隆抗體。
這樣得到的單克隆抗體可以通過硫銨鹽析法、凝膠過濾法、離子交換層析法、親和層析法等進行純化。
作為單克隆抗體的具體例子，本申請提供上述雜交瘤(小鼠-小鼠雜交瘤K8216)產生的單克隆抗體。
第8發明的單克隆抗體可以用于上述第2發明和第4發明的方法中從小鼠肝臟只分離人肝細胞。而本第8發明的單克隆抗體由于不識別非人肝細胞，可以用于在小鼠以外的非人動物的體內使人肝細胞增殖時，或對非人肝細胞和人肝細胞進行混合培養時，對人肝細胞進行分離、純化。
另外，本申請發明中使用的「特異識別增殖性人肝細胞的單克隆抗體」除了在篩選工序中選擇產生目的抗體的雜交瘤，可以用與上述同樣的方法作成(參照實施例6)。本申請作為那樣的單克隆抗體的具體例子提供小鼠-小鼠雜交瘤K8223(FERM BP-8334)產生的單克隆抗體。
實施例以下給出了實施例，對本申請發明進行詳細而且具體的說明，但本申請發明并不限定于以下例子。
實施例1使人肝細胞增殖的嵌合小鼠的作成制作將人肝細胞移植到免疫缺陷肝損傷小鼠的肝臟，在肝臟內使人肝細胞增殖的嵌合小鼠。作成的材料、方法以及各種試驗結果如下所述。
1材料(a)清蛋白尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑轉基因小鼠(uPA-Tg)B6SJL-TgN(AlblPlau)144Bri(b)SCID小鼠(Scid)C.B-17/Icr Scidjcl(c)nafamostat mesilate(d)倒千里光堿(e)人肝細胞小鼠(a)從The Jackson Laboratory購入，小鼠(b)從日本クレア購入。藥品(c)從鳥居制藥公司(商品名フサン)購入，(d)從SIGMA公司購入。
而細胞(e)象下述那樣制備。與進行肝切除手術的患者簽訂協議書，得到承諾后，從切除的肝獲取正常組織，用UW液進行灌流，在4℃下進行搬運。通過膠原酶處理由正常肝臟組織得到肝臟分散液。通過低速離心法(50g，2分鐘)分離為沉淀和上清，將他們含有的細胞(上清小型肝細胞，沉淀肝實質細胞)分別用培養基洗凈后，對肝細胞計數。進行冷凍保存時加冷凍保存液(クラボウ生產)，用程序(控制)冷凍機進行冷凍。保存在液氮的沉淀或上清的肝細胞于37℃的恒溫水槽中融解，對細胞數進行計數。在移植前用培養基調整到4×107個/ml。
2方法與結果2.1免疫缺陷肝損傷小鼠的制作使uPA-Tg小鼠(hemizygote，+/-)和SCID小鼠(homozygote，+/-)交配，獲取具有兩方性狀的小鼠uPA-Tg(+/-)/SCID(+/-)的幾率是35.2％。Tg(+/-)和Tg(-/-)的識別使用對Tg基因特異的序列作為引物，通過基因組PCR法進行。另外SCID(+/-)和SCID(-/-)的識別通過PCR-RFLP法進行。
使得到的Tg(+/-)/SCID(+/-)與SCID(+/+)逆轉交配，得到Tg(+/-)/SCID(+/+)。結果，出現37.9％的Tg(+/-)，和52.8％的SCID(+/+)。使Tg(+/-)/SCID(+/+)相互間交配，得到目的Tg(+/-)/SCID(+/+)和Tg(+/+)/SCID(+/+)。
而uPA基因的純合和雜合的識別通過以下方法進行。
將出生后8～10日的小鼠的尾巴切下5mm，使用Qiagen DNeasyTissue試劑盒提取基因組DNA。用分光光度計測定提取的DNA濃度和純度。向master mix 25μl，引物F 1μl，引物R 1μl，Taqman探針1μl中加入DNA和蒸餾水，將總量調整到50μl，進行定量性PCR(ABI7700，Sequencer Detector，PE Applied Biosystems)。引物和Taqman探針以用于uPA基因導入用載體中含有的人生長激素的編碼序列作為對象象下面那樣設計。
引物Fgtcttggctcgctgcaatc(SEQ ID No1)引物Rcgggagactgaggcaggag(SEQ ID No2)Taqman探針ccgcctcctgggttcaagcga(SEQ ID No3)作為對照，使用以小鼠G3PDH為對象的引物和Taqman探針。
引物Fggatgcagggatgatgttc(SEQ ID No4)引物Rtgcaccaccaactgcttag(SEQ ID No5)Taqman探針cagaagactgtggatggccctc(SEQ ID No6)PCR條件為95℃下變性10分鐘后，每一個循環為95℃下變性15秒鐘，60℃下延伸1分鐘，共進行50循環。通過用內部對照的小鼠G3PDH編碼序列的擴增片段量除人生長激素的編碼序列的擴增片段量得到的相對值，對基因組中導入DNA的量進行比較。標準曲線使用樣品中的雜合或純合小鼠的基因組的稀釋系列。將標準中使用的小鼠的值作為1，當該小鼠為雜合小鼠時，雜合表示接近1的數值，純合表示接近2的數值。當標準中使用的小鼠是純合時，純合表示接近1的數值，雜合表示接近0.5的數值。通過解剖時的肉眼所見，利用該方法的正確率推定為約90％。
2.2人肝細胞向uPA-Tg/SCID小鼠的移植將出生后14～48日的Tg(+/+)/SCID(+/+)小鼠用乙醚麻醉，將側腹切開約5mm，由脾頭一次注入4-8×107個/ml濃度的細胞懸浮液10-12.5μl(4-10×105個/ml)后，進行止血。向腹腔一次注入40μl的濃度為0.02g/ml的止血劑e-氨基己酸(SIGMA)，將脾臟放回腹腔、縫合。由于Tg小鼠肝細胞中產生的uPA向細胞外分泌，所以血中的uPA濃度高。uPA催化蛋白質分解和將纖溶酶原活化為纖溶原，具有分解血纖蛋白塊的作用。因此，出生后，許多小鼠在腸道或腹腔內發生出血，所以出生后4日以內就死了。為了避免由于手術時出血導致死亡，投給有抑制纖溶酶原激活物和纖溶原作用的止血效果的e-氨基己酸。
已知用于交配的SCID/C.B-17小鼠不帶有T細胞、B細胞，但帶有NK細胞。因此，為了使移植的人肝細胞不受到NK細胞的攻擊，在移植前一天和移植翌日向腹腔內注入抑制NK活性的asialo GM1抗體。在出生后4周斷奶，從出生后5周開始在不同的籠子飼養雌雄。
2.3小鼠血中的人清蛋白的監測從移植人肝細胞后第1周開始，每周1次或2次從小鼠尾巴採取10μl血液，使用定量ELISA免疫分析(Bethyl laboratories Inc.)測定人清蛋白濃度。
移植了人肝細胞的19只Tg(+/+)/SCID小鼠中有11只小鼠血中人清蛋白增加(圖1)，高的可達到8mg/ml以上，該值相當于小鼠血中清蛋白的62％。
另外，對分別移植了人肝細胞經低速離心分離得到的上清中的細胞(小型肝細胞)和沉淀中的細胞(肝實質細胞)時的血中人清蛋白濃度進行比較時，發現與肝實質細胞移植小鼠相比，小型肝細胞移植小鼠一方清蛋白濃度的上升更多(圖2)。
2.4由人肝細胞產生的人補體和補體抑制劑的投給發現存在著血中人清蛋白超過3mg/ml的小鼠狀態急劇惡化后死亡的情況(圖1)。在死亡動物中觀察到肺出血，證實是由于人肝細胞的補體產生造成的影響。使用針對人補體C3的抗體對小鼠肝臟組織中的人肝細胞進行免疫染色時，確認在人肝細胞中存在C3。因此，將200μl的2mg/ml濃度的補體抑制劑(フサン(鐮菌素、鐮孢素))投給人清蛋白濃度變高了的小鼠。投給頻率開始為每2日一次。每日觀察體重的變化，如果發現體重減少，增加投給頻率和濃度(圖3)。結果對于血中人清蛋白濃度超過2mg/ml的小鼠隔日投給一次補體抑制劑(フサン)，對于超過4mg/ml的小鼠每日投給一次，對于超過6mg/ml的小鼠1日投給2次(圖3)。通過這樣處理，血中人清蛋白濃度即使超過3mg/ml，小鼠也能長期生存，高的可以檢測到8mg/ml的人清蛋白(圖1)。
另外，通過ELISA法分別測定了沒有投給補體抑制劑(フサン)的嵌合小鼠和投給抑制劑的嵌合小鼠的血中人補體(hC3a)。結果確認投給補體的嵌合小鼠的hC3a濃度比沒有投給的嵌合小鼠的低(圖4)。
2.5維生素C和SCID小鼠血清的投給由于人肝細胞不能合成維生素C，帶有用人肝細胞置換的肝臟的小鼠有成為維生素C缺乏癥的可能性。因此，對于移植了人肝細胞的小鼠要投給溶解了1mg/ml濃度的抗壞血酸-2-磷酸的飲料水(參考日本クレア、抗壞血酸合成能力缺乏大鼠的飼養方法)。
另外，移植了人肝細胞的Tg(+/+)/SCID小鼠與Tg(+/-)/SCID小鼠相比，體重增加緩慢，毛色也不好。由于認為可能是小鼠肝臟中的人肝細胞合成的蛋白質和酶等對小鼠的成長和身體的維持不充分，所以每周一次向小鼠皮下注射50μl的SCID小鼠血清。投給SCID小鼠血清的與沒有投給血清的Tg(+/+)/SCID小鼠的體重增加量進行比較，投給血清的小鼠一方體重增加。
2.6小鼠肝臟的肉眼病理檢查和組織學的病理檢查在乙醚麻醉下採集小鼠血，測定血清中的清蛋白和GPT值。摘出肝臟和脾臟，測定重量，拍照后取樣用于冷凍切片包埋、石蠟切片包埋，從剩下的樣品中提取微粒體級分。確認隨著人清蛋白濃度變高，血清清蛋白量增加和GPT值降低(圖5)。
在人清蛋白為高值的小鼠中，可以看到整個肝臟呈桃色，在一部分殘留著作為Tg(+/+)/SCID小鼠特征的白色部位的小鼠。另外。也看到了一部分呈紅色的肝臟，認為該部位可能是由于uPA導入基因的缺損而正常化的小鼠的肝細胞。
制作肝臟的各個葉的冷凍切片，與人特異的細胞角蛋白8/18抗體(ICN Pharmaceuticals，Inc，Ohio)反應后，用過氧化物酶標記DAKOEnvision+TM(DAKO CORPORATION，CA)染色。算出各個葉的每一切片面積的細胞角蛋白8/18陽性部位的比例(圖6、7)。在人清蛋白分泌量多的小鼠中細胞角蛋白8/18陽性肝細胞的面積的比例高。還觀察到陽性細胞超過80％的小鼠。
2.7微粒體中P450分子種類的解析使用針對P450分子種類的抗體(第一化學藥品株式會社，東京)，通過Western blot分析檢測在從小鼠採取的微粒體級分中的P450分子種類的表達。結果在人清蛋白高的小鼠中，作為P450的人特異的分子種類的CYP2C9的表達被證實(圖8)。
另外，為了研究從小鼠採取的微粒體級分中的CYP2C9的活性，向微粒體中添加雙氯酚酸鈉，測定雙氯酚酸鈉的羥基化。結果在uPA(-/-)/SCID小鼠中幾乎看不到雙氯酚酸鈉的羥基化活性，也沒有看到投給補體抑制劑引起的誘導。然而，在移植了人肝細胞的嵌合小鼠中，看到向人細胞的置換率越高，雙氯酚酸鈉的羥基化活性也越高，在置換率89％的嵌合小鼠中，看到超過供體(人)的微粒體中的活性(圖9)。
2.8嵌合小鼠肝臟中的P450各個分子種類的mRNA表達和用利福平的誘導從嵌合小鼠肝臟提取總RNA，通過逆轉錄合成cDNA。合成針對6種人型P450分子種類(CYP1A1、1A2、2C9、2C19、2D6、3A4)的各個基因cDNA的引物，使用PRISM7700 Sequence Detector(ABI公司)，對各個mRNA的表達量進行定量。結果置換率0％的對照小鼠幾乎沒有表達人型P450，而在嵌合小鼠肝臟中所有的人型P450分子種類都表達，他們的表達圖式近似于供體(人)的表達圖式(圖10)。
另外，在4日內向3只嵌合小鼠腹腔內注入利福平(50μg/kg b.w.)，在第5天採取肝臟，向上述那樣對6種人型P450的各個表達進行定量。眾所周知利福平只誘導人的CYP3A4表達。結果，確認在投給利福平的嵌合小鼠的肝臟中與沒有投給利福平的小鼠相比，前者的人型CYP3A4的表達大約是后者的5.7倍(圖10)。
實施例2嵌合小鼠的人肝細胞的分離和通過單克隆抗體進行人肝細胞純化通過膠原酶灌流法從實施例1作成的嵌合小鼠分離肝細胞。膠原酶的濃度為0.05％，處理時間為9分鐘。認為肝細胞中可能混入人肝細胞和小鼠肝細胞，但小鼠肝細胞與人肝細胞相比，由于膠原酶造成的毒性高，所以分離的許多肝細胞(80％)都是人肝細胞。
另外，為了提高人肝細胞的純度，使用不識別小鼠肝細胞，而特異識別人肝細胞的表面的小鼠單克隆抗體(實施例6作成的雜交瘤K8216產生的單克隆抗體)，只分離人肝細胞。使上述抗體與通過膠原酶灌流分離的人肝細胞占有的比例約為80％的小鼠肝細胞反應，再使FITC標記小鼠IgG抗體反應，使用FACS分離與FITC標記小鼠IgG抗體反應的細胞。結果人肝細胞的純度達到95％以上。
實施例3由嵌合小鼠分離的人肝細胞向uPA-Tg/SCID小鼠的再移植將實施例2分離的肝細胞與實施例1一樣移植到另外的uPA-Tg(+/+)/SCID小鼠，進行飼養。結果發現小鼠血中人清蛋白量增加(圖11)。
實施例4由于uPA導入基因的缺失導致的正常化小鼠肝細胞的增殖抑制向uPA-Tg(+/-)/SCID和uPA-Tg(+/+)/SCID腹腔內注入倒千里光堿30或60mg/kg。結果發現在uPA-Tg(+/-)/SCID小鼠中由于uPA導入基因的缺失(uPA-Tg(-/-)/SCID)造成的正常化肝細胞的集落減少(圖12)。
接下來，與實施例1同樣操作將人肝細胞移植到腹腔內注入了60mg/kg的倒千里光堿的uPA-Tg(+/-)/SCID和uPA-Tg(+/+)/SCID小鼠中，作成嵌合小鼠。結果發現即使在接受uPA-Tg(+/-)/SCID小鼠的嵌合小鼠中血中人清蛋白濃度增加的程度與來自uPA-Tg(+/+)/SCID小鼠的嵌合小鼠同等程度。
實施例5將抗小鼠Fas抗體投給人肝細胞嵌合小鼠對于1只實施例1制作的嵌合小鼠，在從人肝細胞移植后經過100天時，每隔1周腹腔內注入與小鼠肝細胞的Fas抗原反應，誘導小鼠肝細胞凋亡的抗小鼠Fas抗體(0.2μg/g b.w.)，共注入2次。
結果就象圖13所表示的那樣。該嵌合小鼠從人肝細胞移植后約80天以后，血中的人清蛋白表現出減少的傾向，但通過投給抗小鼠Fas抗體，血中人清蛋白濃度顯著上升。
以上結果確認在本發明的方法中，將抗小鼠Fas抗體投給人肝細胞移植后的嵌合小鼠對于人肝細胞的增殖和/或活化是有效的。
實施例6識別人增殖性肝細胞的單克隆抗體的制作1.人肝細胞的培養通過膠原酶灌流法從人肝臟組織得到細胞分散液。將細胞分散液經低速離心分離(50g，2分鐘)，將該沉淀級分用添加了胎牛血清、人血清、EGF、尼克酰胺、活性持續型維生素C的Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)，與經絲裂霉素C處理后的Swiss 3T3細胞進行混合培養。Swiss 3T3細胞每10日添加一次。從培養第7天時開始觀察到人肝細胞的集落。將增殖到鋪滿的肝細胞用EDTA/Trypsin進行傳代。傳代如用小孩的肝細胞可以傳代6-9次，而60歲以上的患者的肝細胞只能傳代3-4次(圖14)。將表現出更高增殖能力的小孩(12歲)的肝細胞用作抗原(圖15)。
2.動物的免疫利用上述方法，在培養皿上使3-5次傳代培養的小孩(12歲)肝細胞增加。將增殖至鋪滿的細胞(約1×107個)用PBS(磷酸緩沖鹽溶液)洗凈后，除去PBS，用細胞刮棒攪和回收，懸浮于約1ml PBS中。然后將他注入6周齡的Balb/c小鼠的腹腔內。再于20天后或30天后用同樣方法進行免疫。
3.細胞融合經2次免疫后，看到抗體效價上升，第3次免疫(boost)72小時后，從1只免疫動物摘出脾臟，採取脾臟細胞。對該脾臟細胞和小鼠骨髓瘤細胞(細胞名NS-1)進行細胞融合，于96孔板播種372孔進行培養。
4.雜交瘤的篩選1次篩選(ELISA、組織染色)通過ELISA測定得到的融合細胞的培養上清對抗原的反應性。測定通過以下方法實施。將作為抗原使用的傳代培養肝細胞播種到96孔板，培養后用PBS洗凈，使其干燥，保存在-80℃下，使培養上清與其反應。然后使酶標記的抗小鼠IgG或抗小鼠IgM抗體反應，加入底物，發色，測定其吸光度。結果融合細胞372個樣品的吸光度的平均值為0.149(SD0.099)，將其中吸光度在0.20以上(81個樣品，約20％)的樣品作為陽性。另外通過目視，吸光度在0.15以上就可確認發色，所以對于0.15～0.20的樣品(46樣品)進行組織染色確認了反應性。只將其中感興趣的表現出深的染色帶作為陽性樣品13。將選擇的陽性樣品的94個樣品進一步培養、擴大，回收培養上清后，將細胞冷凍保存。
5. 2次篩選(ELISA、組織染色)通過與1次篩選同樣的ELISA測定來自在1次篩選中選擇的94樣品的擴大后培養上清對抗原的反應性，選擇陽性樣品88個。再通過組織染色研究這些樣品在組織中的反應性。就其中含有與肝細胞的細胞膜或門靜脈區的肝細胞特異反應的雜交瘤的樣品，或通過從其中克隆得到的集落的培養上清對剛分離的人肝細胞的反應性進行研究。
就組織中門靜脈區的肝細胞膜染色的雜交瘤培養上清(No.23)(圖16)在剛分離的肝細胞表面中的反應性使用FACS(Fluorescenceactivated cell sorting)進行解析。將通過膠原酶灌流、低速離心從成年人男性(46歲和49歲)肝臟得到的細胞用該樣品的培養上清在4℃下處理30分鐘，然后再于4℃下進行30分鐘FITC標記小鼠IgG抗體處理，可以用FACS進行檢測。結果發現肝細胞集團的一部分(1～2％)細胞與該樣品反應(圖17)。在此將這些細胞集團作為R2收集，沒有反應的細胞集團作為R3收集，進行培養。另外分類收集前的肝細胞也同樣進行培養。結果在分類收集前的肝細胞中，就象上述那樣，從培養到第7天時觀察到集落形成。而在R3級分中沒有觀察到形成集落的細胞，但在與No.23反應的R2級分中，觀察到許多集落(圖18)。另外，通過FACS研究對傳代培養的人肝細胞的反應性時，約80％的細胞呈陽性(圖19)。即，認為不識別傳代培養細胞中在培養過程中分化的細胞，只識別增殖性肝細胞。由此表明，在No.23中可能含有特異識別形成集落的細胞的雜交瘤。就通過克隆從No.23樣品得到的集落也利用FACS對在剛分離的肝細胞表面的反應性進行解析。結果得到3個表現出同樣反應性的克隆。將來自其中的一個克隆(小鼠-小鼠雜交瘤K8223)作為專利微生物于2002年3月6日保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(委托號FERMP-18752)，另外于2003年3月20日進行了國際保藏(委托號FERM BP-8334)。
6.單克隆抗體的制作通過培養上述的雜交瘤(K8223)細胞，再將雜交瘤細胞注射到小鼠腹腔內，通過從腹水採集單克隆抗體，得到與增殖性人肝細胞特異結合的單克隆抗體。
實施例7特異識別人肝細胞的單克隆抗體的制作通過肝臟組織的組織染色從實施例6的1次篩選選擇的94個樣品中ELISA為陽性的88個樣品中選擇產生不識別非人肝細胞，只識別人肝細胞的單克隆抗體的雜交瘤。就肝細胞的細胞膜與區域沒有關系一樣染色的雜交瘤培養上清3樣品利用FACS對培養人肝細胞或剛分離的人肝細胞和非人動物(小鼠、大鼠)肝細胞的細胞表面的反應性進行解析。將通過膠原酶灌流、低速離心從成年人男性(46歲或68歲)肝臟得到的細胞用選擇的3個樣品的培養上清在4℃下處理30分鐘，然后于4℃下進行30分鐘FITC標記小鼠IgG抗體處理，可以用FACS進行檢測。利用FACS篩選，結果選擇出1個只與人的肝細胞反應，不與小鼠和大鼠肝細胞反應的雜交瘤(克隆前)樣品。由此得到的單克隆的雜交瘤培養上清、2克隆都表現出同樣的反應性(圖20)。在用選擇的雜交瘤培養上清的組織染色中，認為是人肝組織的毛細膽管的部位染色，在其染色性中看不到區域差別。另外小鼠和大鼠肝組織無論哪一個對該雜交瘤培養上清都表現為陰性。由以上結果得到產生不識別非人動物的肝細胞，而特異識別人肝細胞的抗人肝細胞單克隆抗體的雜交瘤。這個雜交瘤K8216株作為專利微生物于2002年3月6日保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(委托號FERM P-18751)，另外于2003年3月20日進行了國際保藏(委托號FERM BP-8333)。
用與實施例6同樣的方法從該K8216株得到了單克隆抗體。
產業上利用的可能性就象以上詳細說明的那樣，通過本申請發明，可以以保持其功能的狀態使人肝細胞大量增殖。另外提供肝臟內的許多細胞置換為人肝細胞的嵌合小鼠。可以使用該嵌合小鼠和人肝細胞進行化合物的藥物代謝試驗和安全性試驗。
序列表<110>Japan Science and Technology Corporation andHiroshima Industrial Technology Organization<120>人肝細胞增殖方法和人肝細胞的獲取方法<130>03-F-014<150>JP 2002-84280<151>2002-03-25<160>6<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>1gtcttggctc gctgcaatc 19<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>2cgggagactg aggcaggag 19<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>3ccgcctcctg ggttcaagcg a 21<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>4ggatgcaggg atgatgttc 19<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>5tgcaccacca actgcttag 19<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>6cagaagactg tggatggccc tc 2權利要求
1.一種人肝細胞增殖方法，其特征是是通過將人肝細胞移植到免疫缺陷肝損傷小鼠的肝臟中，使人肝細胞移植小鼠在防御來自人肝細胞產生的人補體的攻擊的狀態下進行飼養，使移植的人肝細胞在小鼠肝臟中增殖。
2.權利要求1的人肝細胞增殖方法，其中防御來自人補體的攻擊的狀態至少是以下的(a)和(b)中的一種狀態，(a)至少投給人肝細胞移植小鼠1次補體抑制劑；(b)作為免疫缺陷肝損傷小鼠，使用免疫缺陷肝損傷小鼠和衰變加速因子(DAF/CD55)轉基因小鼠交配后得到的后代小鼠。
3.權利要求1或2的人肝細胞增殖方法，其中免疫缺陷肝損傷小鼠是遺傳性免疫缺陷小鼠和遺傳性肝損傷小鼠交配后得到的后代小鼠。
4.權利要求3的人肝細胞增殖方法，其中后代小鼠是半合子免疫缺陷肝損傷小鼠。
5.權利要求4的人肝細胞增殖方法，在將肝細胞增殖抑制物質投給半合子免疫缺陷肝損傷小鼠后，進行人肝細胞移植。
6.權利要求1至5中的任一項的人肝細胞增殖方法，將抗小鼠Fas抗體投給移植了人肝細胞的免疫缺陷肝損傷小鼠。
7.權利要求1的人肝細胞增殖方法，其中移植到免疫缺陷肝損傷小鼠的人肝細胞是增殖性人肝細胞。
8.權利要求7的人肝細胞增殖方法，其中增殖性人肝細胞是被特異識別形成集落的同時增殖的人肝細胞的單克隆抗體識別的人肝細胞。
9.權利要求8的人肝細胞增殖方法，其中單克隆抗體是小鼠-小鼠雜交瘤K8223(FERM BP-8334)產生的單克隆抗體。
10.人肝細胞大量增殖方法，其特征是由以下步驟(1)～(3)組成，并且將步驟(2)和(3)重復一次以上，(1)通過將人肝細胞移植到免疫缺陷肝損傷小鼠的肝臟，在防御來自人肝細胞產生的人補體的攻擊的狀態下對人肝細胞移植小鼠進行飼養，使移植的人肝細胞在小鼠肝臟中增殖的步驟；(2)從小鼠肝臟分離增殖的人肝細胞的步驟；以及(3)將分離的人肝細胞移植到免疫缺陷肝損傷小鼠的肝臟，使人肝細胞移植小鼠在防御來自人肝細胞產生的人補體的攻擊的狀態下飼養50天以上的步驟。
11.權利要求10的人肝細胞大量增殖方法，其中防御來自步驟(1)和/或步驟(3)的人補體的攻擊的狀態至少是以下的(a)和(b)中的一種狀態，(a)至少投給人肝細胞移植小鼠一次補體抑制劑；(b)作為免疫缺陷肝損傷小鼠使用免疫缺陷肝損傷小鼠和衰變加速因子(DAF/CD55)轉基因小鼠交配后得到的后代小鼠。
12.權利要求10或11的人肝細胞大量增殖方法，其中在步驟(1)和/或步驟(3)中，免疫缺陷肝損傷小鼠是遺傳性免疫缺陷小鼠和遺傳性肝損傷小鼠交配得到的后代小鼠。
13.權利要求12的人肝細胞大量增殖方法，其中后代小鼠是半合體免疫缺陷肝損傷小鼠。
14.權利要求13的人肝細胞大量增殖方法，其中，將肝細胞增殖抑制物質投給半合體免疫缺陷肝損傷小鼠后，進行肝細胞移植。
15.權利要求10至14中的任一項的人肝細胞大量增殖方法，其中在步驟(1)和/或步驟(3)中，將抗小鼠Fas抗體投給移植了人肝細胞的免疫缺陷肝損傷小鼠。
16.權利要求10的人肝細胞大量增殖方法，其中在步驟(1)和/或步驟(3)中向免疫缺陷肝損傷小鼠的肝臟進行移植的人肝細胞是增殖性人肝細胞。
17.權利要求16的人肝細胞大量增殖方法，其中增殖性人肝細胞是被特異識別形成集落的同時增殖的人肝細胞的單克隆抗體識別的人肝細胞。
18.權利要求17的人肝細胞大量增殖方法，其中單克隆抗體是小鼠-小鼠雜交瘤K8223(FERM BP-8334)產生的單克隆抗體。
19.權利要求10的人肝細胞大量增殖方法，其中，通過在步驟(2)中至少進行以下的(a)和(b)中的一種操作，實質上只分離人肝細胞，(a)對從小鼠肝臟分離的肝臟組織進行膠原酶處理，以及(b)對不識別非人肝細胞，而特異識別人肝細胞的單克隆抗體識別的細胞進行分離。
20.權利要求19的人肝細胞大量增殖方法，其中，單克隆抗體是小鼠-小鼠雜交瘤K8216(FERM BP-8333)產生的單克隆抗體。
21.一種嵌合小鼠，其在肝臟內含有通過權利要求1至9中任一項的人肝細胞增殖方法、或權利要求10至20中任一項的人肝細胞大量增殖方法增殖的人肝細胞。
22.權利要求21的嵌合小鼠，其中增殖的人肝細胞占肝臟內細胞的70％以上。
23.權利要求21或22的嵌合小鼠，具有人型P450活性。
24.人肝細胞獲取方法，其特征是從權利要求21、22或23的嵌合小鼠的肝臟分離人肝細胞。
25.權利要求24的人肝細胞獲取方法，其中，至少進行以下的(a)和(b)中的一種操作，實質上只分離人肝細胞，(a)對從小鼠肝臟分離的肝臟組織進行膠原酶處理，以及(b)對由不識別非人肝細胞，而特異識別人肝細胞的單克隆抗體識別的細胞進行分離。
26.權利要求25的人肝細胞獲取方法，其中，單克隆抗體是小鼠-小鼠雜交瘤K8216(FERM BP-8333)產生的單克隆抗體。
27.通過權利要求24至26中任一項的方法獲取的人肝細胞。
28.含有權利要求27的人肝細胞的細胞試劑盒。
29.充填了權利要求27的人肝細胞的雜交型人工肝臟。
30.一種不識別非人肝細胞，特異識別人肝細胞的單克隆抗體。
31.權利要求30的單克隆抗體，是由小鼠-小鼠雜交瘤K8216(FERMBP-8333)產生的。
32.一種小鼠-小鼠雜交瘤K8216(FERM BP-8333)。
33.將候補物質全身投給權利要求21、22或23的嵌合小鼠，試驗候補物質的藥物動力學或毒性的方法。
全文摘要
本發明涉及人肝細胞增殖方法和人肝細胞的獲取方法，通過將人肝細胞移植到免疫缺陷肝損傷小鼠的肝臟中，在防御來自人肝細胞產生的人補體的攻擊的狀態下，對人肝細胞移植小鼠進行飼養，使移植的人肝細胞在小鼠肝臟中大量增殖。進一步利用這樣增殖的人肝細胞反復進行上述操作，可以得到大量的人肝細胞。
文檔編號C07K16/18GK1643136SQ0380698
公開日2005年7月20日 申請日期2003年3月25日 優先權日2002年3月25日
發明者向谷知世, 吉里勝利 申請人:獨立行政法人科學技術振興機構, 財團法人廣島縣產業振興機構