專利名稱：蝦青素酯的制作方法
類胡蘿卜素是一組天然產生的有機顏料，它們是使水生動物的皮膚、肉、殼和外骨胳產生紅色、橙色和黃色的原因。
在水生體系中主要的胡蘿卜素是蝦青素，而水生養殖物(水生動物)中的蝦青素的功能有兩個方面。首先，它在成熟期和受某些魚類物種例如鮭鱒亞目魚(鮭魚和真鱒)應激時能被移動和利用，在它們的肉中已逐漸形成了蝦青素的沉積和貯存體系；因為是天然生物抗氧化劑，所以在這方面蝦青素比維生素E或β-胡蘿卜素更為有效。第二，在水生生物中蝦青素是天然的肉色素和皮膚色素。例如由于蝦青素的鮭魚和很多甲殼綱動物有特殊的粉紅色，在食物制成品的美觀誘人方面起著重要作用此顏色是例如鮭鱒亞目魚、小蝦以及紅海鯉科淡水魚的烹飪口感的一部分。蝦青素是產生這種顏色的原因，而因為魚和甲殼綱動物自身不能合成蝦青素，它們要著色就得依賴于飲食攝入。在精細培養條件下，通常將蝦青素加到鮭鱒亞目魚的復合飼料中以強化其肉所需的顏色。如果飼養的魚產品要模仿它的野生產品和要對購買者具有最大的吸引力，則這些購買者的選擇通常主要受這類產品的目視外觀的影響。
在水生動物的整個生長周期，肉的著色受眾多外部的和內源的因素影響。這些因素集中起來導致每一種魚或甲殼綱動物肉著色的高度變異。
已知在鮭鱒亞目魚的肉中蝦青素的沉積是受到若干內源因素的影響。這些因素包括蝦青素的可消化性、它被腸的吸收、它通過脂蛋白往血液中送入、它的代謝及它與肌肉纖維的連接。每一因素均能明顯影響肉中的蝦青素濃度及目測顏色，而且這些方法每一種的限制均會導致肉不能充分著色。
蝦青素的利用形式，即作為蝦青素源的此化合物本身或其衍生物，以及蝦青素在其中存在的原料基體(飼料)，均影響蝦青素的可消化性及它隨后在肉著色方面的功效。蝦青素或其衍生物的可消化性反過來又影響飲食的合適吸收速度和用于肉著色的攝生法。實際已表明，形狀及飲食組成能影響消化。已經確定用非配制蝦青素作為飼料幾乎沒有著色效果。
此外，現已表明，喂給紅鱒魚、大西洋鮭魚及海鮭魚的與天然物等同的蝦青素、蝦青素二棕櫚酸酯及雞油菌黃質的表觀可消化性系數，在消化方面有很大的變化，這種變化在飼料擠出和/或飼料貯存期間與類胡蘿卜素的降解有關，或者在喂養之后與腸子中的類胡蘿卜素的降解有關或者與來自腸內物的類胡蘿卜素的不完全萃取有關。
關于飼料擠出期間蝦青素的破壞(降解)，現已確定，在高溫下加工時發生明顯的破壞，而貯存期間的降解主要受曝露于空氣中的氧氣的影響。
在這些情況下，需要生產新的蝦青素衍生物其在制造飼料所需的高溫下擠出時以及在制得的飼料貯存時，具有高的穩定性，因而能在擠出和貯存期間避免活性物質的過度損失。此外，在水產養殖中使用更穩定的蝦青素作為顏料，正如過去常在鮭魚肉和鱒魚肉中觀察到的那樣能夠大大地減少甚至消除由使用性能較不穩定的蝦青素或其衍生物而導致的顏色質量變化。此外，與先前使用蝦青素本身或其衍生物所可能得到的結果相比，較穩定的顏料使魚或甲殼綱動物飼料制造者在飼料制造期間能在較大范圍內改變加工條件，也使在飼料貯存期間能在較大范圍改變環境條件。采用新蝦青素衍生物可以獲得的上述優點在很大程度上是基于先前的使用蝦青素時那些令人不滿意的經歷。因此，過去已觀察到在高溫下的擠出期間10-20％的顏料因為降解而損失；在已制出的飼料在貯存期間，因為在環境條件下的降解，每周約損失2％所含的顏料。
因此，本發明提供了通式I的新型蝦青素衍生物 式中，R在每種情況下是基團(a)、(b)或(c)-NH-CH(R1)-COOR2(a)-OR3(b)-(Y)n-Z (c)R1表示氫或形成蛋白質的氨基酸殘基，R2表示C1-6烷基或C3-8環烷基，
R3表示C1-12烷基或C3-8環烷基，n表示0或1，Y表示C1-7亞烷基或C2-7亞鏈烯基，以及Z，當n為0時，它表示C3-8環烷基，-CH(C6H5)OR4基，-COR5基，或-CH2N+(CH3)3Hal-基或者Z，當n為1時它表示氨基，-O-COR6基，-OR7基或-SR8基，或者Z，無論n是0或1，它可替換地表示芳基、雜芳基、-COOR5基或-CH(CH3)OR4基，R4表示氫或乙酰基，R5表示氫或C1-6烷基，R6表示C1-6烷基、芳基或雜芳基，R7表示氫、C1-6烷基或乙酰基，R8表示C1-6烷基，以及Hal-表示鹵素離子。
在通式I蝦青素衍生物的上述定義中，含3個或更多個碳原子的任何烷基或鏈烯基可以是直鏈的或支化的，這也可應用于以Y表示的C1-7亞烷基或C2-7亞鏈烯(雙價)基；因此，亞烷基可以是例如亞甲基或二、三、四、五、六或七亞甲基，或者分別是亞乙烯、亞丙基(乙基亞甲基)、1-或2-甲基取代的亞乙基，還可以是含總數高達七個碳原子的單個-或多個-支化的亞烷基，除了直鏈或支化的C2-7亞鏈烯基之外，當然還包括帶一個或(從C4開始)多個雙鏈的亞鏈烯基；這類亞鏈烯基的例子是通式-CH＝CH-，-CH＝CH-CH2-，-CH＝CH-(CH2)3-及-(CH＝CH)2-的那些。
任何芳基(Z或當n是1時以Z表示的-O-COR6中的R6)可以是未取代的苯基、萘基或還有多環芳香烴基，或者以一個或多個取代基為特征的基因，特別是選自C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵素和芐氧基的那些取代基。鹵素指氟、氯、溴或碘。取代苯基的例子是對-甲苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、2，5-二甲氧基苯基、3，4-二甲氧基苯基及4-芐氧基苯基。
“雜芳基”這一表示，以及Z或在-O-COR6基中R6的表示，意味著一種芳香雜環基團，其特征是作為環成員的一個雜原子或多個雜原子，這些雜原子選自氧、硫和氮。這類雜芳基的例子是2-或3-呋喃基、2-或3-噻吩基和4-吡啶基。與芳基的情況一樣，這些雜芳基可以是未取代的或被一個或多個上面對于取代芳基所述的那些基團所取代的。
至于“形成蛋白質的氨基酸的殘基”(當R1不是表示氫時R1所表示的)，這是指其中R1有如此表示的合適基團(a)，得自任何氨基酸H2N-CH(R1)-COOH，式中R1表示氨基酸分子的可變部分，氨基酸的很多例子同其他參考文獻一起，得自Organische Chemie，“Von den Grundlagen zurForschung”，Vol.1，Ed.Salle+Sauerlander，pages 302-304(Frankfurt 1998)，其內容在這里被相應引入。在氨基酸是最簡單的甘氨酸的情況，基團(a)表示-NH-CH2-COOR2，R1是氫(而R2是任何C1-6烷基或C3-8環烷基)。在苯基丙氨酸和蛋氨酸的情況，基團(a)和R1分別表示-NH-CH(C6H5)-COOR2和苯基(C6H5)，以及分別為-NH-CH(CH2CH2SCH3)-COOR2和2-甲硫基乙基(CH3CH2SCH3)。基團(a)和“形成蛋白質的氨基酸殘基”(R1的的含義)的其它例子將不需特別解釋。
最后，鹵素離子Hal-可以是氟、氯、溴和碘離子，優選氯離子Cl-。
通式I的蝦青素可以是任何可能的異構形式，或是異構體混合物例如外消旋物混合物的形式。
因此，根據本發明通式I(具有合適的R含義)的具體蝦青素衍生物例子是蝦青素-二碳酸二乙酯(R是乙氧基)，蝦青素-二草酸二乙酯(R是乙氧基羰基)，蝦青素-二(N-乙酰基甘氨酸酯)(R是乙酰氨基甲基)，蝦青素-二馬來酸酯(R是-CH＝CH-COOH)，蝦青素-二琥珀酸酯(R是-CH2-CH2-COOH)，蝦青素-二琥珀酸二甲酯(R是-CH2-CH2-COOCH3)，蝦青素-二琥珀酸二乙酯(R是-CH2-CH2-COOC2H5)，蝦青素-二甘氨酸二乙酯二氨基甲酸酯(R是-NH-CH2-COOC2H5)，蝦青素-二煙酸酯(R是3-吡啶基)，蝦青素-二蛋氨酸二氨基甲酸酯(R是-NHCH(CH2CH2SCH3)COOC2H5)，蝦青素-二乙酰基二甘醇酸酯(R是乙酰基氧甲基)，蝦青素-二苯基丙氨酸二氨基甲酸酯(R是-NHCH(CH2C6H5)COOC2H5)，蝦青素-二富馬酸二乙酯(R是-CH＝CH-COOC2H5)，蝦青素-二(2-糠酸酯)(R是2-呋喃基)，
蝦青素-二丙二酸二甲酯(R是-CH2-COOCH3)，蝦青素-二(3-甲硫丙酸酯)(R是3-甲硫乙基)，蝦青素-二甲氧基乙酸酯(R是甲氧基甲基)，蝦青素-二-[(2-噻吩基)乙酸酯][R是(2-噻吩基)甲基]，蝦青素-二乳酸酯(R是1-羥乙基)，蝦青素-二(乙酰基扁桃酸酯)(R是α-乙酰基氧芐基)，以及蝦青素-二甜菜酸酯[R是-CH2N+(CH3)3Cl-]。
上述命名的每一種蝦青素衍生物優選的是處于(全E)-3，3′-外消旋異構形式。
從穩定性及著色性考慮，特別優選的是六種蝦青素衍生物蝦青素-二碳酸二乙酯、-二琥珀酸二甲酯、-二琥珀酸二乙酯、-二煙酸酯、-二甲氧基乙酸酯及-二-[(2-噻吩基)-乙酸酯]。
本發明的蝦青素原則上可以根據R基的性質按照酯化反應或酰胺化反應本身公知的合成方法進行制備，其中由蝦青素與適當的酸ROOH本身或其酰氯(RCOCL)或其酸酐(RCO)2O起反應，或者在R表示(a)基團的情況下，蝦青素與通式OCNCH(R1)COOR2的合適N-羰基-氨基酸酯起反應。這些生產通式I蝦青素衍生物的方法代表本發明的又一方面。
在與酰氯或酸酐發生酯化的情況下，反應通常在惰性溶劑中和在有機堿存在下進行。作為溶劑(在懸浮液而不是溶液的情況下，溶劑可代替起分散介質的作用)，可方便地使用低級鹵化烴，例如二氯甲烷或氯仿；低級脂族醚或環醚，分別例如乙醚、四氫呋喃或二噁烷；芳烴例如甲苯；或低級脂肪酮例如甲酮。適用的堿是低級三烷基胺例如三乙胺；吡啶；或二(低級烷基)氨基吡啶例如二甲氨基吡啶。蝦青素∶酰氯或酸酐∶堿的摩爾比通常在1∶2～6∶2～10的范圍內。此外，酯化反應通常在約-10℃～約+100℃、優選在約25℃～約60℃，最優選在約25℃～40℃的溫度范圍下進行。在這些條件下，酯化反應一般在約1～24小時內，常常在約2-6小時內完成(從反應開始計算)。業已發現，在惰性氣氛下發生酯化反應是有好處的，優選使用氮氣或氬氣作為惰性氣體。此外，在使用堿三乙胺(通常是優選的)的情況下，業已發現，在特別慢的反應時，用高達其摩爾數的約20％的4-二甲氨基吡啶來增強所述的堿，是有好處的。
在用酸本身使蝦青素酯化的情況下，相對于溶劑/分散介質和反應溫度，其反應條件相似于用酰氨或酸酐進行酯化反應時所采用的那些反應條件。但是，在本情況下，通常用脫水劑代替堿。特別適用的脫水劑是雙環己基碳化二亞胺。蝦青素∶羧酸∶脫水劑的摩爾比通常在1∶2-6∶2-7的范圍內。采用合適羧酸進行的酯化反應通常在幾分鐘至約18小時內完成。
最后，采用上述N-羰基-氨基酸酯作為一種原料來生產通式I中的R表示(a)組的蝦青素衍生物可同樣使用上面另外兩種情況給出的那種溶劑/分散介質來進行，反應溫度通常也是相似的，即通常在約-10℃～約+120℃，優選約25℃～約60℃，最優選約25～約40℃的范圍內，但是，在本情況下，可以用路易斯酸例如三氟化硼乙醚化物或者錫鹽或鋅鹽(例如相關的氯化物)，作為用酰氯或酸酐進行的酯化反應所用的這類堿的替代物，蝦青素∶N-羰基-氨基酸酯的摩爾比通常是1∶2-4，優選1∶2.2-2.4。在使用堿、特別是三乙胺或4-二甲氨基吡啶的情況下，相對于蝦青素原料的數量，這種堿性催化劑的數量，以當量表示(以1當量蝦青素計算)，通常為約0.5～約10.0(三乙胺)或約0.1～約10.0(4-二甲氨基吡啶)的范圍內。在使用路易斯酸特別是氯化鋅而不是堿性催化劑的情況下，相對于蝦青素的數量(1當量)，該路易斯酸的數量通常在約0.05～約0.5，優選在約0.1～約0.2當量的范圍內。在這些反應條件下，此反應在這一情況下，一般在很長時間內，通常在高達72小時內完成。但是，例如在用氯化鋅作為路易斯酸時，此反應一般在約1小時～約3小時這么短的時間內完成。
在所有這些情況下，此產物即通式I的蝦青素衍生物能用本來公知的方法進行分離和提純，例如通過加溶劑如甲醇以便在反應之后使粗產物從反應混合物中分離出來，并將收集到的粗產品結晶。
在上述生產通式I蝦青素的方法中，用作原料的恰當羧酸RCOOH、酰氯RCOCl、酸酐(RCO)2O及通式為OCNCH(R1)COOR2的N-羰基-氨基酸酯，或者是已知化合物，或者可容易地使用與生產已知的相關原料相似的方法來制得。
如上面指出的，本發明的蝦青素衍生物在水生養殖用顏料、特別在水生動物飼料中是有用的，因此它們在這種飼料中適用作為著色劑。
在本發明中的水生動物是魚類(特別是海魚、淡水魚、溯河鰭魚(anadromous)或入海產卵鰭魚(catadromous))及甲殼綱動物類。很適用于上述水生動物飼料的優選的魚是紅海鯉科淡水魚、黃尾魚、鱒魚、鮭魚、羅非魚、鲇魚和金魚、大西洋和太平洋鮭魚，而鱒魚是特別優選的。優選的甲殼綱動物是對蝦、河蝦及小龍蝦。
為了實現它們作為水生動物飼料的著色劑的用途，可以用飼料配制及加工的技術領域公知的方法將蝦青素衍生物加入飼料中，原則上是在其制造的合適階段與至少一部分最終飼料組份混合。蝦青素酯通常作為配料，特別是水分散配料而加入。這種配料原則上能通過首先將蝦青素衍生物溶解于植物的或蔬菜的油或脂例如玉米油中、或溶解在有機溶劑例如醇、脂族醚、鹵化脂族烴如二氧甲烷、或脂族酯中，或者溶解在植物的或蔬菜的油或脂與有機溶劑的混合物中而制得。溶解可以在寬的溫度范圍內例如從室溫至約150℃的范圍內進行。在使用二氯甲烷作為溶解用有機溶劑的情況下，這可以在室溫或高達30℃的溫度下進行，或者，在應用高壓時則在更高溫度下進行。在使用二氯甲烷或替代溶劑時，采用相對低的溫度對于防止蝦青素遭受不必要的高溫溶解溫度是特別有好處的，因而這代表了一種經濟的和溫和的處理方法。此外，特別是因為二氯甲烷溶解蝦青素衍生物如此容易，因而通過使用相當小體積的這一溶劑還能獲得經濟上的收益；作為其一個結果，是較少的溶劑需要蒸發除去以及隨后的處理或循環，而作為另一結果，是能夠對較小體積的溶液能更快地進行處理。在溶解完成之后，通常用保護膠體，例如植物或動物蛋白如明膠特別是魚明膠、碳水化合物、多糖或木素磺酸鹽的水溶液，進行乳化。然后至少將一部分溶劑及水除去，從而得到以濃乳化液形式的配料。在確實加到飼料中之前，可以把此濃乳化液或者用通常的噴霧干燥技術進行噴霧干燥，或者將它噴霧干燥到液態化淀粉或代替的載體例如硅酸鈣之上，然后再用通常的技術進行處理。這種噴霧干燥的產品由小珠組成，這些小珠除含有蝦青素衍生物本身之外，還含有來自先前處理時的組份例如油、保護膠體、淀粉等，而且它們還可含有高達25％重量的該衍生物；存在的任何油的數量通常在約0.5％～約50％重量的范圍內，基質(主要是保護膠體)的數量通常在約50％～約80％重量的范圍內，而來自噴霧干燥的任何載體物質(淀粉、硅酸鈣等)的含量通常在約10％～約25％重量的范圍內。除了上述的物質之外，小珠還可含有相當小量的穩定劑、乳化劑及別的常用配制助劑。然后將此制劑與飼料的別的組份如魚油和魚肉混合，并利用高剪切力將此混合物進行水熱加工，如成粒或擠出，生成補充了蝦青素衍生物的粒狀水生動物用飼料。在這種加工(造料、擠出)的過程中，溫度可能達到約70℃～約150℃，特別是約90℃～約130℃的范圍內，壓力可能達到約10巴～約100巴，特別是約20巴～約40巴的范圍內。因此，重要的是，加入的顏料(在此情況下是通式I的蝦青素衍生物)能忍受這種高溫和高壓而沒有過度的降解。在如此制得的魚飼料中的顏料含量通常在約30～約100ppm的范圍內。
關于魚飼料配料及加工的其他信息提供在例如American Feed IndustryAss.，Feed Manufacturing Technology IV，1994，pp.509-515之中。
作為促使所加的蝦青素衍生物遭受上述水熱法涉及的苛刻溫度和壓力的一種替代辦法，加入的配料可以用水稀釋，并且將它加至已進行水熱處理之后的水生動物飼料之中，并混合之。
本發明的又一方面是含有加到水生動物飼料用的本發明蝦青素衍生物，而這種飼料含有有效量的作為顏料的蝦青素衍生物，特別是那種含有約30ppm至約100ppm這種蝦青素衍生物的水生動物飼料。
本發明將用下面制備通式I蝦青素衍生物的實施例予以說明。
實施例1(全-E)-3，3′-外消旋-蝦青素-二(L-乳酸酯)將212g乳酸及0.84g對-甲苯磺酸在4℃下稀釋到2.3二氯甲苯之中，然后在28分鐘內加入260.3g二氫吡喃。在將此混合物再攪拌10分鐘后，把溫度升至20℃并再繼續攪拌1.5小時。然后將此溶液用三份每份900ml的0.2M氫氧化鉀水溶液進行洗滌。除去堿水相，用兩份每份350ml水進行洗滌。水相用二氯甲烷進行洗滌。然后將有機相合并并用無水硫酸鈉進行干燥。蒸發掉溶劑直到留下含有四氫吡喃基乳酸為止。
將73.26g四氫吡喃-乳膠、47.22g二環己基碳化二亞胺及0.84g 4-二甲氨基吡啶，于惰性及干燥條件下，在25℃加至攪拌下的9.2g蝦青素在1782.4g四氫呋喃之中。攪拌約16小時后，用過濾法把沉出的二環己基脲除去。在減壓下把所余溶液中的溶劑除掉。然后把殘留物溶于615.8g二氯甲烷之中，把此溶液加到已熱至27℃的750ml 2摩爾硫酸溶液中，攪拌1.5小時后，把兩相混合物的有機相分開，水相用二份每份75ml二氯甲烷萃取，把合并的有機相用95.8g無水硫酸鈉干燥，過濾，蒸發至干。
在22℃下把殘留物用385.9g吡啶稀釋，并在7分鐘內中入210g水。把溫度升至32℃。在再加入298.9g水后，沉淀出紫色結晶。攪拌2小時后，濾出結晶，并在減壓下干燥約16小時。
用291g二氯甲烷將結晶稀釋，把此溶液加至已加熱至27℃的7.9摩爾硫酸水溶液中。攪拌1.5小時后，加入350ml水，分出有機相。有機相用兩份每份200ml水洗滌。水相用200ml二氯甲烷洗滌，并把有機相合并。然后將合并后的有機相用104.8g無水硫酸鈉干燥，過濾并蒸發至干。
在室溫下把所得結晶稀釋到228g甲苯之中。在加入35.2g己烷及攪拌10分鐘后，沉淀出紅色結晶。隨后加入第二份14g己烷，把懸浮液攪拌、過濾、用22g己烷洗滌，并在高度減壓下干燥約16小時。
此結晶用246g二氯甲烷稀釋。把276g己烷分6份加入，直到紅色結晶沉淀出。在過濾及干燥后，得到6g(全-E)-3，3′-外消旋-蝦青素-二(L-乳酸酯)(HPLC面積％95％)。
實施例2(全-E)-3，3′-外消旋-蝦青素-二草酸二乙酯將56ml三乙胺及4.99g 4-二甲氨基吡啶在25℃下于惰性和干燥條件下加到攪動下的47.75g蝦青素在1.6升二氯甲烷的淤漿中。在25℃下滴加完45.9ml草酸乙酯酰氯之后30分鐘，反應完成。然后通過加入甲醇而將過量酰氯破壞掉。用12ml乙酸中和后，把反應混合物蒸發至干。把殘留物溶在1升二氯甲烷中，用三份每份500ml水進行萃取，有機相用無水硫酸鈉干燥。加入1升甲醇使產物從已干燥溶液中沉出。過濾后，用甲醇洗滌，干燥，得到53.2g深紅色(全-E)-3，3′-外消旋-蝦青素-二草酸二乙酯結晶(HPLC面積％98.1％)。
實施例3(全-E)-3，3′-外消旋-蝦青素-二碳酸二乙酯將105ml三乙胺及9.35g 4-二甲氨基吡啶在回流溫度下于干燥和惰性條件下加至攪動下的29.84g蝦青素在1升二氯甲烷的溶液中。在15分鐘的時限內將24.31ml氯甲酸乙酯分六等份加入。經過整整2.5小時后，將反應混合物冷至25℃，通過加入甲醇而將過量酰氯破壞。蒸發至干后，殘留物溶于500ml二氯甲烷之中，用水萃取三次，有機相用無水硫酸鈉干燥，通過加入100ml甲醇而將產物從250ml的小體積中沉淀出。過濾后，用甲醇洗滌，干燥，得33.69g(產率90.9％)暗紅色結晶(全-E)-3，3′-外消旋-蝦青素-二碳酸二乙酯(HPLC面積％89.8％)。
實施例4(全-E)-3，3′-外消旋-蝦青素-二(N-乙酰基甘氨酸酯)在干燥和惰性條件下將4.73g N-乙酰基甘氨酸、5.97g蝦青素、249g 4-二甲氨基吡啶及40ml二氯甲烷混合。然后于25℃在攪拌下加入N，N-二環己基碳化二亞胺在40ml二氯甲烷中的溶液。17小時后，用氯仿將二氯甲烷置換(將105ml溶劑混合物蒸去)。然后所得的熱的(內溫為60℃)結晶懸浮液過濾，并用總量為100ml氯仿將結晶(二環己基脲)洗滌。把濾液濃縮到75g的體積，通過加入150ml甲醇而將產物結晶出來，洗滌和干燥后得到6.34g(79.7％的產率)(全-E)-3，3′-外消旋-蝦青素-二(N-乙酰基甘氨酸酯)(HPLC面積％95.5％)。
實施例5(全-E)-3，3′-外消旋-蝦青素-二琥珀酸二甲酯在干燥和惰性條件下，于回流溫度下將17.5ml三乙胺和1.56g 4-二甲氨基吡啶加到14.92g蝦青素在500ml四氫呋喃的攪拌下的溶液之中。在70分鐘內連續加入11.0ml甲基琥珀酰氯。再過1小時后，把反應混合物冷至25℃，加入125ml甲醇以便將過量酰氯破壞。在用二氯甲烷/水(1∶1)進行萃取并在二氧化硅凝膠上用比例為2∶2∶1的甲苯/正己烷/乙酸乙酯這種洗脫劑進行色譜后，用結晶法自甲醇把產物分離。干燥后，得10.29(產率49.9％)暗紅色結晶(全-E)-3，3′-外消旋-蝦青素-二琥珀酸二甲酯(HPLC面積％79.3％)。從二氯甲烷/甲醇重結晶后，用HPLC法得到純度為98％的產品。
實施例6(全-E)-3，3′-外消旋-蝦青素-二甘氨酸乙酯氨基甲酸酯在惰性及干燥的條件下，于25℃用攪拌方法將1.19g蝦青素、0.55ml異氰酸乙酸乙酯及65mg二氯化鋅在10ml二氯甲烷中的溶液混合，成為淤漿。一小時后反應完成。加入25ml使產物結晶出來。過濾分離出所得的紫色結晶。用比例為5∶2的丙酮/二氯甲烷洗滌及干燥后，得1.59g(產率91.8％)(全-E)-3，3′-外消旋-蝦青素-二甘氨酸乙酯氨基甲酸酯(HPLC面積％98.4％)。
實施例7(全-E)-3，3′-外消旋-蝦青素-二乙酰基二甘醇酸酯在惰性及干燥的條件下，于25℃用攪拌方法將30.44g蝦青素、24.33g乙酰基甘醇及1.27g 4-二甲氨基吡啶在200ml二氯甲烷中混合，成為淤漿。在10分鐘內加入46.77g N，N-二環己基碳化二亞胺在200ml二氯甲烷中的溶液，引起放熱反應。一小時后，反應完成。濾出二環己基脲，將濾液濃縮，通過加入甲醇將產物結晶出來。過濾和干燥后，以暗紅結晶分離出38.96g(產率95.8％)(全-E)-3，3′-外消旋-蝦青素-二乙酰基二甘醇酸酯(HPLC面積％95.8％)。
實施例8蝦青素-二琥珀酸二乙酯在干燥和惰性的條件下，在25℃用攪拌方法將2.98g蝦青素和1.0ml吡啶加至25ml二氯甲烷之中。然后在25℃下在15分鐘內將1.8ml乙基琥珀酰氯加至此攪拌下的懸浮液中。3小時酯化反應完成。以共沸蒸餾法用甲醇將溶劑二氯甲烷置換。將50ml水加至在約50ml甲醇中的余下的結晶懸浮液中。在回流溫度下將此懸浮液加熱1小時(以促進Z，E-異構化反應)，冷至25℃后，濾出結晶體，用20ml甲醇洗滌，干燥。得到3.66g(產率85.9％)暗紫色結晶的粗蝦青素-二琥珀酸二乙酯(HPLC面積％91.8％全-E，50％Z-異構體)。
實施例9蝦青素-二馬來酸酯在干燥和惰性條件下，于25℃下將17g三乙胺在200ml二氯甲烷中的溶液，加到攪拌下的10g馬來酸酐和20g蝦青素在300ml二氯甲烷中的懸浮液之中。90分鐘后反應完成，連續用250ml 3N鹽酸及鹽水萃取所得的溶液。通過加入足夠的正己烷將最終產物沉淀出。過濾后，用正己烷洗滌，干燥，以暗紅色結晶得到27g(幾乎100％的產率)純蝦青素二馬來酸酯(HPLC面積％約97.7％全-E)。
實施例10
蝦青素-二琥珀酸酯在干燥和惰性條件下，在25℃下將59.69g蝦青素、25.27g琥珀酸酐、70.04ml三乙胺及3.12g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)懸浮在500ml二氯甲烷之中。攪拌約16小時后，蝦青素轉變為其二酯的反應結束。用500ml 1N鹽酸將所得溶液酸化，并用420ml二氯甲烷進行萃取。通過用750ml水洗滌而將有機層中和，用無水硫酸鈉干燥，然后通過蒸發而濃縮，往粘稠殘留物中加入足夠的正己烷而將產物結晶。過濾后，用正己烷洗滌，以暗紅色結晶得到79.06g(99.2％的產率)純蝦青素-二琥珀酸酯(HPLC面積％97.4％全-E)。
實施例11蝦青素-二煙酸酯在干燥和惰性條件下，在稍高于25℃的溫度下，將28.05g煙酰氯鹽酸鹽逐份加至35.81g蝦青素、65.9ml三乙胺及5.83g 4-二甲氨基吡啶在300ml二氯甲烷中的淤漿之中。在25-30℃下攪拌整整5小時后，通過加入26.8ml乙酸而將三乙胺中和，然后用三份每份400ml的水進行萃取，而有機層用兩份每份200ml二氯甲烷進行反洗滌。將收集的有機層濃縮至240g重后，通過加入480ml甲醇而促進產物的結晶化。在25℃將此懸浮液攪拌約16小時使結晶的沉出結束。過濾之后，用兩份每份30ml甲醇洗滌，干燥，得53.02g暗灰色結晶粗品。通過從二氯甲烷/甲醇重結晶而將結晶粗品提純，得48.83g(約為100％的產率)純蝦青素-二煙酸酯(HPLC面積％98.9％全-E；9％二氯甲烷)。
實施例12蝦青素-二[(R)-O-乙酰基扁桃酸酯]在干燥和惰性條件下，在25℃下將24.8g N，N-二環己基碳化二亞胺在120ml二氯甲烷中的溶液，在30分鐘內加至攪拌下的25.36g蝦青素、20g(R)-O-乙酰基扁桃酸及1.5g4-二甲氨基吡啶在250ml二氯甲烷中的淤漿之中。在25℃下再攪拌30分鐘后，反應完成，將所得的結晶體淤漿過濾(干燥后得23.31g N，N-二環己基脲)。把濾液濃縮至250g重。通過在0℃下加入750ml甲醇而將粗產物結晶。在0℃再攪拌30分鐘后，將懸浮液過濾，在0℃下用兩份每份70ml的甲醇/二氯甲烷(8∶2)將結晶洗滌，通過從甲醇/二氯甲烷重結晶而將已干燥的結晶粗品提純。以紅色結晶得到32.09g(產率79.6％)純的蝦青素-二[(R)-O-乙酰基扁桃酸酯](HPLC面積％99.6％全-E)。
實施例13蝦青素-二-[(2-噻吩基)乙酸酯]在干燥和惰性條件下，于25℃將45.52g N，N-二環己基碳化二亞胺在240ml二氯甲烷中的溶液，在30分鐘內加至攪拌下的35.81g蝦青素、26.1g(2-噻吩基)乙酸及1.5g 4-二甲氨基吡啶在360ml二氯甲烷中的淤漿之中。在25℃下再攪拌3小時后反應結束，而N，N-二環己基脲可通過過濾分離。在將溶劑二氯甲烷轉換為甲醇之后，把所得懸浮液過濾，用甲醇洗滌結晶，干燥，分離出50.73g結晶粗品。通過將結晶溶于200ml二氯甲烷及隨后把溶劑轉換為甲醇而將結晶提純。過濾用甲醇洗滌及干燥后分離出46.9g(產率92.6％)純的蝦青素-二[(2-噻吩基)乙酸酯](HPLC面積％99.5％全-E)。
實施例14蝦青素-二(3-甲硫丙酸酯)在干燥和惰性條件下，在25℃下將45.52g N，N-二環己基碳化二亞胺在240ml二氯甲烷中的溶液，在30分鐘內加至攪拌下的35.81g蝦青素、21.8g3-甲硫丙酸及1.5g 4-二甲氨基吡啶在360ml二氯甲烷中的淤漿之中。在25℃下攪拌1小時后反應結束，而N，N-二環己基脲可通過過濾分離。在將溶劑由二氯甲烷轉換為甲醇之后，把所得懸浮液過濾，用甲醇洗滌結晶，干燥，分離出47.75g粗產品，從二氯甲烷/甲醇提純后，以暗紅色結晶體得到44.98g(產率93.6％)純的蝦青素-二(3-甲硫丙酸酯)(HPLC面積％約100％全-E)。
實施例15蝦青素-二(2-糠酸酯)在干燥和惰性條件下，將21.09ml 2-糠酰氯于25℃在30分鐘內加至41.78g蝦青素、29.42ml三乙胺及2.62g 4-二甲氨基吡啶在1.4升二氯甲烷中的攪拌下的懸浮液之中。在25℃下攪拌2小時之后反應完成。然后小心地加入500ml甲醇，蒸去二氯甲烷并用甲烷進行置換。將所得的結晶體懸浮在25℃攪拌約16小時，然后過濾。用100ml甲醇洗滌及干燥后，得52.76g(產率96.0％)純的蝦青素-二(2-糠酸酯)(HPLC面積％約100％)。
權利要求
1.通式I的蝦青素衍生物 式中，R在每種情況下是基團(a)、(b)或(c)-NH-CH(R1)-COOR2(a)-OR3(b)-(Y)n-Z (c)R1表示氫或形成蛋白質的氨基酸殘基，R2表示C1-6烷基或C3-8環烷基，R3表示C1-12烷基或C3-8環烷基，n表示0或1，Y表示C1-7亞烷基或C2-7亞鏈烯基，以及Z，當n為0時，它表示C3-8環烷基，-CH(C6H5)OR4基，-COR5基，或-CH2N+(CH3)3Hal-基或者Z，當n為1時它表示氨基，-O-COR6基，-OR7基或-SR8基，或者Z，無論n是0或1，它可替換地表示芳基、雜芳基、-COOR5基或-CH(CH3)OR4基，R4表示氫或乙酰基，R5表示氫或C1-6烷基，R6表示C1-6烷基、芳基或雜芳基，R7表示氫、C1-6烷基或乙酰基，R8表示C1-6烷基，以及Hal-表示鹵素離子。
2.根據權利要求1的蝦青素衍生物，它是下列這種通式I衍生物中的一種蝦青素-二碳酸二乙酯(R是乙氧基)，蝦青素-二草酸二乙酯(R是乙氧基羰基)，蝦青素-二(N-乙酰基甘氨酸酯)(R是乙酰氨基甲基)，蝦青素-二馬來酸酯(R是-CH＝CH-COOH)，蝦青素-二琥珀酸酯(R是-CH2-CH2-COOH)，蝦青素-二琥珀酸二甲酯(R是-CH2-CH2-COOCH3)，蝦青素-二琥珀酸二乙酯(R是-CH2-CH2-COOC2H5)，蝦青素-二甘氨酸二乙酯二氨基甲酸酯(R是-NH-CH2-COOC2H5)，蝦青素-二煙酸酯(R是3-吡啶基)，蝦青素-二蛋氨酸二氨基甲酸酯(R是-NHCH(CH2CH2SCH3)COOC2H5)，蝦青素-二乙酰基二甘醇酸酯(R是乙酰基氧甲基)，蝦青素-二苯基丙氨酸二氨基甲酸酯(R是-NHCH(CH2C6H5)COOC2H5)，蝦青素-二富馬酸二乙酯(R是-CH＝CH-COOC2H5)，蝦青素-二(2-糠酸酯)(R是2-呋喃基)，蝦青素-二丙二酸二甲酯(R是-CH2-COOCH3)，蝦青素-二(3-甲硫丙酸酯)(R是3-甲硫乙基)，蝦青素-二甲氧基乙酸酯(R是甲氧基甲基)，蝦青素-二-[(2-噻吩基)乙酸酯][R是(2-噻吩基)甲基]，蝦青素-二乳酸酯(R是1-羥乙基)，蝦青素-二(乙酰基扁桃酸酯)(R是α-乙酰基氧芐基)，以及蝦青素-二甜菜酸酯[R是-CH2N+(CH3)3Cl-]。
3.根據權利要求2的蝦青素衍生物，每一種均處于(全-E)-3，3′-外消旋異構形式。
4.根據權利要求2或權利要求3的蝦青素衍生物，它是蝦青素-二碳酸二乙酯、-二琥珀酸二甲酯、-二琥珀酸二乙酯、-二煙酸酯、-二甲氧基乙酸酯及-二-[(2-噻吩基)乙酸酯]中的一種。
5.根據權利要求1至4中的任一項所定義或指定的蝦青素衍生物的制備方法，其特征在于蝦青素與適當的酸RCOOH本身或其酰氯RCOCl或酸酐(RCO)2O進行反應，或者在R表示(a)基團的情況下與合適的通式為OCNCH(R1)COOR2的N-羰基-氨基酸酯進行反應。
6.用于水生動物飼料的含有著色類胡蘿卜素的配料，其特征在于含有如權利要求1至4中的任一項所定義或指定的作為類胡蘿卜素的蝦青素衍生物。
7.生產如權利要求6所要求的配料的方法，其特征在于，將蝦青素衍生物溶于植物的或蔬菜的油或脂中，或溶于有機溶劑中，或溶于植物的或蔬菜的油或脂與有機溶劑的混合物中；將此溶液用保護膠體的水溶液進行乳化；至少部分除去溶劑和水，得到濃乳化液；以及將此濃乳化液噴霧干燥以便最終生成適合于加至水生動物飼料中的配料。
8.根據權利要求7的制法，其特征在于將蝦青素衍生物溶于作為溶劑的二氯甲烷之中。
9.含有著色類胡蘿卜素的水生動物飼料，其特征在于含有如權利要求1至4中的任一項所定義或指定的作為類胡蘿卜素的蝦青素衍生物。
11.如權利要求9或權利要求10所要求的水生動物飼料的制備方法，其特征在于在飼料中加入蝦青素衍生物作為配料，特別是水可分散的配料，它是通過在該飼料制備的適當階段將該配料與最終飼料的至少一些組份混合，以及將此含有蝦青素衍生物的混合物進行水熱處理，從而生成有蝦青素衍生物補充的飼料。
12.如權利要求1至4中的任一項所定義或指定的蝦青素衍生物作為水生動物飼料中的著色類胡蘿卜素的應用。
全文摘要
通式(I)的蝦青素衍生物，式中R每種情況是基團－NH－CH(R
文檔編號C07D333/22GK1628097SQ03803401
公開日2005年6月15日 申請日期2003年1月29日 優先權日2002年2月6日
發明者阿諾德·格洛爾, 沃納·西蒙 申請人:Dsm Ip資產公司