專利名稱：Hiv－1病毒tat－蛋白突變體的制作方法
技術領域：
本發明的一個主題是HIV-1病毒Tat-蛋白突變體，以及包含至少一種所述突變體的藥物組合物，特別是包含至少一種所述突變體的疫苗。
HIV病毒是產生AIDS的病因物質。HIV屬于人反轉錄病毒科(Retroviridae)慢病毒亞科。在兩種HIV類型(HIV-1和HIV-2)中，HIV-1更具細胞病變能力且在全球尤其是西方國家中占主導地位。HIV-1感染伴隨有被感染個體免疫系統早期功能障礙。
與其它反轉錄病毒一樣，HIV-1具有編碼病毒結構蛋白的基因。gag基因編碼形成病毒粒子核心的蛋白質，包括p24抗原。pol基因編碼負責反轉錄(反轉錄酶)及整合(整合酶)的酶。env基因編碼外殼糖蛋白。然而HIV-1比其它反轉錄病毒更復雜，它包含其它六個涉及病毒基因表達調控的蛋白質的編碼基因(tat、rev、nef、vif、vpr和vpu)。HIV-1基因組中還含有包括參與病毒基因表達的調控元件的5′和3′LTRs(長末端重復)。
在體內，Tat是HIV-1復制所必需的蛋白質。人們對Tat在轉錄中的功能已作了大量研究，現在非常清楚的是，Tat的主要作用之一是調控從5′LTR的轉錄。Tat是一種通過與其它細胞因子同時結合到TAR序列上來反式激活5′LTR的轉錄激活因子，從而導致病毒轉錄和延長的增加。LTR被Tat蛋白的反式激活對基因表達和病毒復制都是重要的。病毒啟動子被Tat蛋白反式激活(17、18)使病毒信使RNAs得以大規模生產，這些信使RNA向細胞質的轉移依賴于另一調控蛋白，Rev蛋白。Tat和Rev調控HIV-1的表達(7)。Tat蛋白由被HIV-1感染的細胞分泌。一旦達到細胞外，它就能被相鄰的感染或未感染細胞內化(9、14)，從而能誘導對未感染T淋巴細胞激活狀態的修飾。因此它直接涉及AIDS的發展以及可能涉及與AIDS有關的病理癥狀，例如卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma)。
完整的Tat蛋白由101個氨基酸組成，殘基1-72由第一個外顯子編碼，殘基73-101由第二個外顯子編碼。Tat蛋白高度保守。在一些經傳代培養得到的實驗株系中存在一種不同于天然形式的具有86個氨基酸的截斷形式。該截斷形式是由在傳代培養過程中向87位導入了一個終止密碼子而產生的，但是在所研究的Tat蛋白中超過90％都保持101個氨基酸的構型。盡管氨基酸87-101不能大大促進離體(exvivo)增殖，但是它們在能復制的HIV-1天然分離物中的保守性卻是它們生物學重要性的指征。具有101個氨基酸的HIV-1天然Tat蛋白由五個物理結構域組成，但是其作用分子機制還未得到完全闡明。簡言之，這五個結構域描述于Jeang，K.T等人(18)的出版物。在該出版物中，結構域1對應于酸性氨基酸富集的氨基酸1-20，結構域2對應于半胱氨酸殘基富集(7個半胱氨酸殘基，其中6個極度保守)的氨基酸21-40，結構域3對應于氨基酸41-48且包含HIV-1、HIV-2和SIV共有的RKGLGI基元，結構域4對應于氨基酸49-72且包含一個堿性RKKRRQRRR基元，以及結構域5對應于氨基酸73-101且包含一個RGD基元。沒有解釋結構域1的作用。只顯示出，該結構域中一個氨基酸的改變可以被良好耐受且不改變Tat蛋白的功能。所提出的一種假說是，結構域1可能涉及反式激活。改變結構域2的七個半胱氨酸中的六個抑制了Tat蛋白的功能。該結構域對于反式激活很重要。沒有闡述結構域3的作用。結構域4賦予Tat結合TAR RNA的特性，而且它對于核定位以及Tat蛋白的跨細胞運輸是重要的。結構域5也涉及Tat蛋白的跨細胞運輸。
在后面的發明詳述中，本發明人從ACH320.2A.2.1株的序列出發(NCBI accession no.U34604)，細化了Jeang，K.T等人的出版物(18)中給出的有關結構域的觀點。因此，對于這一特定株系，本發明中的結構域1對應于氨基酸1-21(作用未闡明)，結構域2對應于氨基酸22-37(涉及反式激活)，結構域3對應于氨基酸38-48(作用未知)以及結構域5對應于氨基酸73-101(跨細胞運輸)。在對應于氨基酸49-72的結構域4中，對結合TAR RNA、核定位以及Tat跨細胞運輸來說重要的是肽49-57(18)。
全世界都在等待HIV-1疫苗的開發。在被HIV-1感染的病人中，只在未發展成AIDS的個體中檢測到對Tat和Rev的免疫反應(26)。幾項用Tat和/或Rev對SIV動物模型進行的接種研究顯示出部分或完全預防感染保護(4-6，21)。然而，將這些方案直接應用于人類是不可能的。尤其已有顯示，Tat在體外具有毒性效應(19、22)。這些毒性效應包括(i)對涉及凋亡的細胞信號失調(28、30)，(ii)免疫系統中部分基因表達的失調，例如編碼白細胞介素-2的基因(29)，或編碼I型主要組織相容性復合物(MHC)的基因(16)，和/或(iii)誘導血管形成(1、2、20)。因此Tat蛋白在用作疫苗抗原之前必須先解毒。一個小組選擇通過化學滅活使Tat蛋白解毒(10)。然而，這樣的滅活只能在以重組蛋白為抗原時實施。為了能夠利用活或非活重組載體中核酸形式的Tat蛋白，只能設想采用遺傳解毒作用。因此本發明人選擇開發經定向誘變這一Tat蛋白解毒途徑以使其用作疫苗蛋白亞單位和/或接種載體的一部分。
本發明涉及制備解毒免疫原性野生型Tat-蛋白突變體的蛋白質突變方法的用途。
野生型Tat蛋白“突變體”意指通過一個或多個氨基酸的取代或置換獲得的突變體。
“解毒野生型Tat-蛋白突變體”意指不再具有以下毒性效應的Tat蛋白●當它由被感染細胞分泌時，由于具有通過與表面受體結合而誘導細胞信號傳遞、以及被未感染細胞內化并運輸至靶細胞核的能力，因而對于未被HIV-1感染的細胞來說其具有外源形式的毒性；●Tat蛋白以外源和內源形式定位于靶細胞核中并誘導對能夠參與Tat蛋白反式激活特性或結構域5的細胞基因的表達調控。
“免疫原性野生型Tat-蛋白突變體”意指注射入模型動物后能夠誘導抗體產生的突變體，這些抗體既能與Tat-蛋白突變體也能與野生型Tat蛋白反應。
本發明還涉及制備解毒免疫原性野生型Tat-蛋白突變體的方法，其特征在于它包括-制備野生型Tat-蛋白突變體的階段，特別是通過使編碼野生型Tat蛋白的核酸產生突變，-篩選解毒突變體的階段，該解毒突變體的特征在于無跨細胞活性且核定位發生改變、以及可選地無反式激活活性，和-篩選免疫原性突變體的階段，該免疫原性突變體的特征在于它們能誘導產生同時針對所述突變體和野生型Tat蛋白的抗體，最后兩個階段的順序可以調換。
無跨細胞活性也意味著無跨細胞運輸，在已建立的細胞系中可通過LTR-報告基因結構中病毒啟動子的未被激活進行檢測，例如氯霉素乙酰基轉移酶(CAT)的病毒啟動子，氯霉素乙酰基轉移酶的表達依賴于已建立的細胞系中的病毒啟動子(LTR)(31)，并且在這之前將細胞與以外源方式產生的Tat-蛋白突變體接觸，例如由不同于包含病毒LTR依賴性報告基因的細胞系的細胞系(32)產生的Tat-蛋白突變體。
核定位的改變可以定義為用編碼野生型Tat-蛋白突變體的核酸轉染的細胞其細胞質區室中Tat蛋白的存在，例如在轉染后72小時內，可以在用編碼Tat-蛋白突變體的核酸轉染細胞系后通過這些基因產物的免疫標記技術用光學顯微鏡進行檢測，也可以在轉染后通過檢測包含與自發熒光蛋白例如EGFP蛋白的編碼基因融合的Tat突變體編碼基因的核酸的翻譯產物而進行檢測(33，34)。
無反式激活活性對應于病毒啟動子的未被激活，且用編碼野生型Tat-蛋白突變體的核酸轉染已建立的細胞系后可以通過報告基因的未表達來進行檢測，報告基因例如是其在該細胞系中的表達依賴于病毒啟動子(LTR)的氯霉素乙酰基轉移酶(CAT)(31)。
本發明還涉及HIV-1病毒的解毒免疫原性Tat蛋白突變體，其特征在于它在野生型Tat蛋白的區域4和/或5中至少含有兩個突變，且其中，當突變處于結構域4區域時它位于從氨基酸位置49至氨基酸位置57這部分中，且其中，當突變處于結構域5中時它或者位于RGD基元中或者在88-92區中，優選在位置89和/或92，突變是由一個氨基酸被另一氨基酸置換形成的突變。
一種根據本發明的有利突變體是如上述所定義的突變體，其特征在于它在區域4中至少含有一個突變。
本發明還涉及如上述所定義的突變體，其特征在于結構域4和/或5中的突變能帶來以下特征中的至少一種-廢除野生型Tat蛋白的跨細胞效應，-改變野生型Tat蛋白的核定位。
本發明涉及如上述所定義的突變體，其特征在于它含有能夠使野生型Tat蛋白反式激活活性喪失的附加突變。
因此可用作免疫接種抗原的Tat蛋白將滿足下列大部分標準-廢除Tat的跨細胞效應(結構域4和/或5)-改變Tat的核定位(結構域4)-喪失反式激活活性(結構域2)-保持蛋白質的抗原性(至多4或5個突變，盡可能少的改變CTL表位)根據一種有利實施方式，本發明涉及如上述所定義的突變體，其特征在于它在野生型Tat蛋白結構域4的N-末端區域中，特別是在從氨基酸位置49至氨基酸位置57這部分中，含有突變。
一種根據本發明的有利突變體是如上述所定義的突變體，其特征在于它在野生型Tat蛋白結構域4的N-末端區域從氨基酸位置49至氨基酸位置55這部分中含有突變。
一種根據本發明的有利突變體是如上述所定義的突變體，其特征在于它在野生型Tat蛋白結構域5中的下列至少一個區域內含有突變-RGD基元，
-區域88-92，優選在位置89和/或92。
一種根據本發明的有利突變體是如上述所定義的突變體，其特征在于它在野生型Tat蛋白結構域2中包含突變，特別是對任一半胱氨酸的置換，有利地是被絲氨酸置換。
本發明還涉及如上述所定義的突變體，其特征在于它含有以下至少一種突變-第27位的半胱氨酸被絲氨酸取代，-第51位的賴氨酸被蘇氨酸取代，-第52位的精氨酸被亮氨酸取代，-第55位的精氨酸被亮氨酸取代，-第57位的精氨酸被亮氨酸取代，-第79位的甘氨酸被丙氨酸取代，-第89位的賴氨酸被亮氨酸取代，-第92位的谷氨酸被谷氨酰胺取代。
本發明還涉及如上述所定義的突變體，其特征在于它選自具有下述兩種突變的突變體，各突變用三聯體表示字母-數字-字母，其中的數字表示突變氨基酸的位置，數字前的字母對應突變所涉及的氨基酸，數字后的字母表示用于置換數字前氨基酸的氨基酸K51T-R52L(SEQ ID NO2)K51T-R55L(SEQ ID NO3)K51T-R57L(SEQ ID NO4)K51T-G79A(SEQ ID NO5)K51T-K89L(SEQ ID NO6)K51T-E92Q(SEQ ID NO7)R52L-R55L(SEQ ID NO8)R52L-R57L(SEQ ID NO9)R52L-G79A(SEQ ID NO10)R52L-K89L(SEQ ID NO11)R52L-E92Q(SEQ ID NO12)
R55L-R57L (SEQ ID NO13)R55L-G79A (SEQ ID NO14)R55L-K89L (SEQ ID NO15)R55L-E92Q (SEQ ID NO16)R57L-G79A (SEQ ID NO17)R57L-K89L (SEQ ID NO18)R57L-E92Q (SEQ ID NO19)G79A-K89L (SEQ ID NO20)G79A-E92Q (SEQ ID NO21)K89L-E92Q (SEQ ID NO22)一種根據本發明的有利突變體是如上述所定義的突變體，其特征在于它選自下列突變體K51T-R55L (SEQ ID NO3)R52L-R55L (SEQ ID NO8)R52L-G79A (SEQ ID NO10)R55L-R57L (SEQ ID NO13)G79A-K89L (SEQ ID NO20)本發明還涉及如上述所定義的突變體，其特征在于它選自具有下述三種突變的突變體，各突變用三聯體表示字母-數字-字母，其中的數字表示突變氨基酸的位置，數字前的字母對應突變所涉及的氨基酸，數字后的字母表示用于置換數字前氨基酸的氨基酸C27S-K51T-R52L(SEQ ID NO23)C27S-K51T-R55L(SEQ ID NO24)C27S-K51T-R57L(SEQ ID NO25)C27S-K51T-G79A(SEQ ID NO26)C27S-K51T-K89L(SEQ ID NO27)C27S-K51T-E92Q(SEQ ID NO28)C27S-R52L-R55L(SEQ ID NO29)C27S-R52L-R57L(SEQ ID NO30)
C27S-R52L-G79A(SEQ ID NO31)C27S-R52L-K89L(SEQ ID NO32)C27S-R52L-E92Q(SEQ ID NO33)C27S-R55L-R57L(SEQ ID NO34)C27S-R55L-G79A(SEQ ID NO35)C27S-R55L-K89L(SEQ ID NO36)C27S-R55L-E92Q(SEQ ID NO37)C27S-R57L-G79A(SEQ ID NO38)C27S-R57L-K89L(SEQ ID NO39)C27S-R57L-E92Q(SEQ ID NO40)C27S-G79A-K89L(SEQ ID NO41)C27S-G79A-E92Q(SEQ ID NO42)C27S-K89L-E92Q(SEQ ID NO43)本發明還涉及如上述所定義的突變體，其特征在于它選自下列突變體C27S-K51T-R55L(SEQ ID NO24)C27S-R52L-R55L(SEQ ID NO29)C27S-R52L-G79A(SEQ ID NO31)本發明還涉及如上述所定義的突變體，其特征在于它選自具有下述四種突變的突變體，各突變用三聯體表示字母-數字-字母，其中的數字表示突變氨基酸的位置，數字前的字母對應突變所涉及的氨基酸，數字后的字母表示用于置換數字前氨基酸的氨基酸C27S-K51T-R52L-G79A(SEQ ID NO44)C27S-K51T-R52L-K89L(SEQ ID NO45)C27S-K51T-R52L-E92Q(SEQ ID NO46)C27S-K51T-R55L-G79A(SEQ ID NO47)C27S-K51T-R55L-K89L(SEQ ID NO48)C27S-K51T-R55L-E92Q(SEQ ID NO49)C27S-K51T-R57L-G79A(SEQ ID NO50)
C27S-K51T-R57L-K89L(SEQ ID NO51)C27S-K51T-R57L-E92Q(SEQ ID NO52)C27S-K51T-G79A-K89L(SEQ ID NO53)C27S-K51T-G79A-E92Q(SEQ ID NO54)C27S-K51T-K89L-E92Q(SEQ ID NO55)C27S-R52L-G79A-K89L(SEQ ID NO56)C27S-R52L-G79A-E92Q(SEQ ID NO57)C27S-R52L-K89L-E92Q(SEQ ID NO58)C27S-R52L-R55L-G79A(SEQ ID NO59)C27S-R52L-R55L-K89L(SEQ ID NO60)C27S-R52L-R55L-E92Q(SEQ ID NO61)C27S-R52L-R57L-G79A(SEQ ID NO62)C27S-R52L-R57L-K89L(SEQ ID NO63)C27S-R52L-R57L-E92Q(SEQ ID NO64)C27S-R55L-G79A-K89L(SEQ ID NO65)C27S-R55L-G79A-E92Q(SEQ ID NO66)C27S-R55L-K89L-E92Q(SEQ ID NO67)C27S-R55L-R57L-G79A(SEQ ID NO68)C27S-R55L-R57L-K89L(SEQ ID NO69)C27S-R55L-R57L-E92Q(SEQ ID NO70)C27S-R57L-G79A-K89L(SEQ ID NO71)C27S-R57L-G79A-E92Q(SEQ ID NO72)C27S-R57L-K89L-E92Q(SEQ ID NO73)C27S-G79A-K89L-E92Q(SEQ ID NO74)一種根據本發明的有利突變體是如上述所定義的突變體，其特征在于它選自下列突變體C27S-K51T-R55L-G79A(SEQ ID NO47)C27S-K51T-R55L-K89L(SEQ ID NO48)C27S-K51T-R55L-E92Q(SEQ ID NO49)
C27S-R52L-R55L-G79A(SEQ ID NO59)本發明還涉及如上述所定義的突變體，其特征在于它選自具有下述五種突變的突變體，各突變用三聯體表示字母-數字-字母，其中的數字表示突變氨基酸的位置，數字前的字母對應突變所涉及的氨基酸，數字后的字母表示用于置換數字前氨基酸的氨基酸C27S-K51T-G79A-K89L-E92Q (SEQ ID NO75)C27S-K51T-R52L-R55L-G79A (SEQ ID NO76)C27S-K51T-R52L-R55L-K89L (SEQ ID NO77)C27S-K51T-R52L-R55L-E92Q (SEQ ID NO78)C27S-K51T-R52L-R57L-G79A (SEQ ID NO79)C27S-K51T-R52L-R57L-K89L (SEQ ID NO80)C27S-K51T-R52L-R57L-E92Q (SEQ ID NO81)C27S-K51T-R52L-G79A-K89L (SEQ ID NO82)C27S-K51T-R52L-G79A-E92Q (SEQ ID NO83)C27S-K51T-R52L-K89L-E92Q (SEQ ID NO84)C27S-K51T-R55L-R57L-G79A (SEQ ID NO85)C27S-K51T-R55L-R57L-K89L (SEQ ID NO86)C27S-K51T-R55L-R57L-E92Q (SEQ ID NO87)C27S-K51T-R55L-G79A-K89L (SEQ ID NO88)C27S-K51T-R55L-G79A-E92Q (SEQ ID NO89)C27S-K51T-R55L-K89L-E92Q (SEQ ID NO90)C27S-K51T-R57L-G79A-K89L (SEQ ID NO91)C27S-K51T-R57L-G79A-E92Q (SEQ ID NO92)C27S-K51T-R57L-K89L-E92Q (SEQ ID NO93)C27S-R52L-R55L-R57L-G79A (SEQ ID NO94)C27S-R52L-R55L-R57L-K89L (SEQ ID NO95)C27S-R52L-R55L-R57L-E92Q (SEQ ID NO96)C27S-R52L-R55L-G79A-K89L (SEQ ID NO97)C27S-R52L-R55L-G79A-E92Q (SEQ ID NO98)
C27S-R52L-R55L-K89L-E92Q(SEQ ID NO99)C27S-R52L-R57L-G79A-K89L(SEQ ID NO100)C27S-R52L-R57L-G79A-E92Q(SEQ ID NO101)C27S-R52L-R57L-K89L-E92Q(SEQ ID NO102)C27S-R52L-G79A-K89L-E92Q(SEQ ID NO103)C27S-R55L-R57L-G79A-K89L(SEQ ID NO104)C27S-R55L-R57L-G79A-E92Q(SEQ ID NO105)C27S-R55L-R57L-K89L-E92Q(SEQ ID NO106)C27S-R55L-G79A-K89L-E92Q(SEQ ID NO107)C27S-R57L-G79A-K89L-E92Q(SEQ ID NO108)一種根據本發明的有利突變體是如上述所定義的突變體，其特征在于它選自下列突變體C27S-K51T-R55L-G79A-K89L(SEQ ID NO88)C27S-K51T-R55L-G79A-E92Q(SEQ ID NO89)本發明還涉及編碼如上述所定義突變體之一的核苷酸序列。
本發明還涉及用本發明的核苷酸序列轉染的細胞系。
本發明還涉及針對如上述所定義突變體的抗體，其不識別野生型蛋白質結構域D1。
這樣的抗體通過，例如在Elisa檢測中檢測并除去與對應于Tat結構域D1的肽有親和力的抗體而進行選擇，其中該肽至少包含序列EPVDPKLEPWKHPGS(殘基2-16)。
根據本發明的抗體識別或不識別野生型蛋白質。
一種根據本發明的有利抗體類別包括識別野生型蛋白質的如上述所定義的抗體。
根據本發明的抗體是多克隆或單克隆抗體。
上述多克隆抗體通過用至少一種根據本發明的突變體免疫動物獲得，之后通過取所述動物的血清樣品、從血清中的其它成分中分離出所述抗體，特別是通過過柱親和層析，回收純化形式的抗體，其中柱中固定有被抗體特異識別的抗原，特別是根據本發明的突變體。
根據本發明的單克隆抗體可以通過雜交瘤技術獲得，下文重述了其原理。
第一階段中，用根據本發明的突變體免疫接種動物，通常為小鼠(或在免疫接種框架中體外培養的細胞)，之后其B淋巴細胞就能夠產生針對所述突變體的抗體。之后將這些產抗體淋巴細胞與“永生”骨髓瘤細胞(實施例中為鼠科)融合以產生雜交瘤。之后從如此獲得的異源細胞混合物中選擇能夠產生特定抗體并無限增殖的細胞。各雜交瘤以克隆形式增殖，各自導致單克隆抗體的產生，這些單克隆抗體對本發明突變體的識別特性可以用例如ELISA、一或二維的免疫轉移、免疫熒光、或用biocaptor進行檢測。隨后純化如此選擇的單克隆抗體，特別是根據上述親和層析技術。
本發明還涉及藥物組合物，特別是疫苗，它包含作為活性成分的至少一種如上述所定義的突變體或至少一種如上述所定義的核苷酸序列或至少一種如上述所定義抗體以及藥學適宜載體，其中核酸位于如上述所定義突變體之一的組成型表達所必需的元件控制之下。
當然，本領域技術人員易于決定用作藥物組合物功能組分的突變體的量。
本發明還涉及含有至少一種如上述所定義突變體、或至少一種如上述所定義抗體的檢測和/或定量HIV-1病毒的診斷組合物。
當然，本領域技術人員易于決定用作診斷技術所用功能的突變體的量。
本發明還涉及檢測和定量取自能被HIV-1感染的個體的生物樣品中HIV-1病毒的方法，例如血漿、血清或組織，其特征在于它包括下列階段-在預定條件下將所述生物樣品與含有如上述所定義突變體或如上述所定義抗體的診斷組合物接觸，如果需要的話該預定條件允許上述定義的突變體與針對野生型Tat蛋白的抗體之間、或上述定義的抗體與野生型Tat蛋白之間形成抗體/抗原復合物，和-用任何適當的方法檢測和/或定量所述復合物的形成。
檢測和/或定量病毒的方法用本領域技術人員熟知的標準技術完成，例如印跡法，所謂的三明治技術和競爭技術。
本發明還涉及至少一種如上述所定義的突變體或至少一種如上述所定義的抗體的用途，用于體外診斷生物樣本或樣品中HIV-1病毒。
本發明還涉及至少一種如上述所定義的突變體或至少一種如上述所定義的抗體的用途，用于制備疫苗組合物。
發明人因此指出，為上述用途必須在Tat蛋白結構域4產生至少一個突變和/或在Tat蛋白結構域5產生至少一個突變。他們通過定向誘變得到了Tat-蛋白突變體，之后根據這些突變體的特性進行選擇。保留的突變體選自具有以下至少一個突變的突變體K51T(結構域4中第51位的賴氨酸被蘇氨酸取代)，R52L(結構域4中第52位的精氨酸被亮氨酸取代)，R55L(結構域4中第55位的精氨酸被亮氨酸取代)，R57L(結構域4中第57位的精氨酸被亮氨酸取代)，G79A(結構域5中第79位的甘氨酸被丙氨酸取代)，K89L(結構域5中第89位的賴氨酸被亮氨酸取代)和E92Q(結構域5中第92位的谷氨酸被谷氨酰胺取代)。上述及后述所有氨基酸位置根據ACH320.2A.2.1株的101個氨基酸完整序列給出。本發明的一個主題是上述突變體。但是本發明還涉及在Tat蛋白結構域4中具有兩個突變的突變體。這些“雙重”突變體選自突變體K51T-R55L、R52L-R55L、R52L-G79A、R55L-R57L和G79A-K89L。發明人之后顯示，通過將結構域4中的這些雙重突變與結構域2中的附加突變C27S(用絲氨酸取代半胱氨酸)組合，他們獲得了令人非常滿意的結果。因此，本發明還包括選自“三重”突變體C27S-K51T-R55L、C27S-R52L-R55L和C27S-R52L-G79A的突變體。優選所選突變體為突變體C27S-K51T-R55L。最后，他們證實組合有結構域2中至少一個突變、結構域4中至少兩個突變以及結構域5中至少一個突變的“四重”突變體對獲得非毒性Tat蛋白具有極端良好的表現。該“四重”突變體選自突變體C27S-K51T-R55L-G79A，C27S-K51T-R55L-K89L，C27S-K51T-R55L-E92Q和C27S-R52L-R55L-G79A。優選所選突變體為突變體C27S-K51T-R55L-G79A。
圖1是PCR定點誘變技術的圖形表示。
圖2示出毒株ACH320.2A.2.1 Tat蛋白的蛋白質序列(SEQ IDNO1)與本發明突變Tat蛋白的蛋白質序列的比較。
圖3a和3b是表示ACH320.2A.2.1或其突變體反式激活能力的圖表。各構建體的結果是兩個獨立試驗的平均值。圖3a中，NT(未轉染)柱表示LTR-CAT構建體的基線活性。
y-軸表示反式激活的倍增因子。
圖4a和4b表示ACH320.2A.2.1構建體或其突變體的細胞內定位。
圖5表示ACH320.2A.2.1構建體或其突變體的轉導能力。所示數值為兩個獨立試驗的平均值。測定pEGFP的反式激活百分數，通過計算該百分數的平均值+3SD(標準差)來確定分隔線。
白柱對應293T/HL3T1共培養，黑柱對應HL3T1細胞轉染。
y-軸對應相對于野生型ACH320.2A.2.1的反式激活百分數。
圖6表示另一種篩選表達本發明突變體的細胞系的方法(描述于實施例5)。
表1代表用于Tat PCR定向誘變的寡核苷酸。
實施例1構建編碼突變Tat蛋白的突變DNA。
用商業試劑盒(Clontech)和表1中所述的核苷酸引物使一段含有306個堿基對的cDNA片段產生突變，該cDNA片段對應于分離的HIV-1 ACH320.2A.2.1野生型Tat基因的兩個外顯子。PCR定點誘變的原理描述于圖1。
如圖1所示，從野生型Tat基因的cDNA出發，用一個位于末端(E5′或E3′)的末端引物和一個位于基因內部且帶有所需突變的引物(分別為M3′和M5′)進行兩次獨立的PCR(第一個PCR循環)。然后以等摩爾混合兩個PCR產物，并用5′端包含EcoRI限制位點和3′端包含SaII限制位點的末端引物進行第二個PCR循環。由此獲得了在所需位點產生突變的cDNA。
該操作原理用于所有突變體，除了K89L和E92Q。對于后者，所要突變的核苷酸幾乎位于cDNA的一個末端，這樣可以直接進行半巢式PCR定向誘變，在第一個PCR循環中分別用以下引物對E5′/K89L(M3′)和E5′/E92Q(M5′)。
用下列引物進行包含兩個突變的單次誘變以產生雙重突變體R52L-R55LR52L-R55L(M5′)5′-GGCAGGAAGCTTAGACAGCTGCGAAGATC-3′R52L-R55L(M3′)5′-GATCTTCGCAGCTGTCTAAGCTTCTTCCTGCC-3′以突變體G79A的cDNA為模板(matrix)、R52L(M5′)/R52L(M3′)為引物對進行PCR定向誘變得到雙重突變體R52L-G79A。
以突變體G79A的cDNA為模板、E5′/K89L(M3′)為第一個PCR循環的引物對進行半巢式PCR產生雙重突變體G79A-K89L。
以雙重突變體K51T-R55L的cDNA為模板、C27S(M5′)/C27S(M3′)為引物對進行PCR定向誘變得到三重突變體C27S-K51T-R55L(STL)。
以突變體R52L-G79A的cDNA為模板、C27S(M5′)/C27S(M3′)為引物對進行PCR定向誘變得到三重突變體C27S-R52L-G79A。
用STL的cDNA作為模板以及引物G79A(M5′)/G79A(M3′)進行誘變產生四重突變體C27S-K51T-R55L-G79A(STLA)。
所有的第一個PCR循環都用0.5μg質粒和0.29ng/ml各自引物在下列條件下進行1×94℃5′1×[94℃2′50℃2′72℃4′] 25×[94℃1′50℃1′72℃4′]1×72℃5′。
引物對EcoRI/SalI用于所有PCR定向誘變的第二個循環，除了突變體R52L、R55L和雙突變體R52L-R55L，對它們用引物E6854替換引物SalI 3′。在所有例子中第二個循環都用與第一個循環相同的條件進行，其中使用0.5μl第一個循環的5′和3′PCR產物(圖1)。形成一個323堿基對的條帶，之后根據生產者的說明將其結合于pCR2，1-Topo(Invitrogen，K4500-40)質粒以產生pCR-TEX構建體。
用DyeTerminator(商標)測序混合物在377X自動測序儀(Applied Biosystems)上自動測序后選擇陽性克隆。用MacVector 7.0軟件(Oxford Molecular)分析序列。在所有測序的構建體中，全都僅含所需突變，除了一個衍生自PCR-R55L產物的克隆，其在位置51表現出一個附加突變K-＞T。因此保存該雙重突變體K51T-R55L作另外的分析，并用引物K51T(M5′)和K51T(M3′)產生單突變體K51T。
將pCR-TEX構建體的EcoRI-SalI或EcoRI-EcoRI片段亞克隆進真核載體pEGFP-C2(Clontech)，其中Tat突變體在C末端與EGFP(增強的綠色熒光蛋白)融合。以前顯示，EGFP與Tat融合既不改變Tat的反式激活能力，也不改變其細胞定位(25)。根據標準的分子生物學技術(23)在大腸桿菌(Escherichia coli，E.Coli)DH5α中完成克隆。通過對陽性克隆自動測序篩選并獲得pEGFP-TEX構建體，其中融合蛋白的表達受巨細胞病毒(CMV)啟動子的控制。所選擇的陽性克隆的氨基酸序列示于圖2。擴增這些克隆的DNA，并按照生產者的說明用Nucléobond AX試劑盒(商標)(Macherey-Nagel)純化。
實施例2Tat突變體的反式激活能力。
為了研究EGFP-Tat融合蛋白的反式激活能力，使用了細胞系HL3T1。該細胞系是HeLa細胞的一個用氯霉素乙酰基轉移酶(CAT)基因穩定轉染的衍生物，該氯霉素乙酰基轉移酶依賴于病毒HIV-1啟動子(LTR)(8)。在6孔板中接種2.5×105HL3T1細胞一天后，用2μg pEGFP-TEX構建體按照生產者推薦的程序用Exgen 500試劑盒(由Euromedex銷售)轉染細胞。培養48至72小時后，用胰蛋白酶消化細胞并借助熒光顯微鏡估測被轉染細胞的量。在100μl Tris0.01M-EDTA 1nM-NaCl 150mM(TEN)中酶解1.5×103的熒光細胞，并將其經過一個凍/融階段后于65℃下處理20分鐘。之后根據前人的描述(24)在相提取測試中測定CAT活性。簡言之，37℃下將70μl裂解物與130μl CAT反應混合物(Tris-HCl pH＝7.5 150mM，EDTA0.2nM，NaCl 30mM，丁酰輔酶A 0.3mg/ml，丙三醇3％，D-蘇-[二氯乙酰-l-14C]氯霉素0.08μCi)孵育2小時。之后用400μl體積/體積比為2∶1的樸日斯烷(2，6，10，14-四甲基十五烷)與二甲苯的混合物抽提反應混合物。用閃爍計數器測定300μl所得有機相的放射活性。
圖3a和3b顯示，沒有一個單突變能夠單獨完全破壞ACH320.2A.2.1 Tat蛋白的反式激活活性，除了突變體C27S。突變體R55L并不非常顯著地改變ACH320.2A.2.1 Tat的反式激活活性。但是該突變與突變K51T或R52L之一組合則顯示出對Tat反式激活活性非常顯著的抑制。該抑制是三重和四重突變體STL和STLA的總和。
實施例3Tat-EGFP融合蛋白的細胞內定位。
堿性Tat結構域負責Tat的核定位。確信所構建的某些突變影響該堿性結構域。同樣，發明人想要鑒定影響Tat細胞內定位的突變。在顯微鏡玻片上接種2.5×105HL3T1細胞后，用2μg各pEGFP-TEX構建體按照生產者推薦的程序用Exgen 500試劑盒(由Euromedex銷售)轉染細胞。1、2或3天后回收玻片，并在用Axioplan 2(商標)熒光顯微鏡(Zeiss)觀察前用4％多聚甲醛將其固定。如圖4a或b(A和B)中所述以及已有的描述(25)，野生型Tat-EGFP融合蛋白在培養3天后顯示核定位。單一Tat突變不影響該定位(圖4a，C至H)，雙重突變R52L-R55L(圖4a，I)、R52L-G79A(圖4b，C)、G79A-K89L(圖4b，D)、和三重突變體C27S-R52L-G79A(圖4b，E)也不影響。然而，K51T-R55L組合或包含它的多重突變體(STL，STLA)在第三天顯示Tat蛋白-EGFP的核定位和細胞質定位(圖4a，J to L)，而在轉染后第一和第二天信號嚴格限制于核。因此，看來Tat的核定位信號似乎是不連續的且至少包含殘基K51和R55，但是不含R52。
實施例4Tat突變體的跨細胞活性。
不同的研究顯示，堿性Tat結構域中的堿性殘基總數對由被感染細胞分泌而存在于胞外介質中的Tat被未感染細胞內化的能力(這一現象也稱作轉導)起作用。發明人評估了在堿性結構域中含有突變的構建體的轉導能力。用生產細胞和效應細胞進行了共培養試驗。采用磷酸鈣技術(23)以3μg pEGFP-TEX構建體轉染293T細胞。轉染后24小時，將轉染的293T細胞用胰蛋白酶消化，并在100μM氯喹存在下與2.5×105HL3T1細胞再共培養48小時。之后根據前人所述，收集細胞并在評估CAT活性前于TEN中裂解。由于該系統同時依賴于轉導效果和反式激活活性，因此發明人著手于這樣一個前提，也就是，與標準化陽性對照相比，直接轉染后測定的活性與共培養后測定的活性之間的顯著差異反映了轉導能力的急劇變化。這就是為什么所有數據都以分離的ACH320.2A.2.1的野生型蛋白的反式激活活性百分數表示的原因，以及為什么比較各構建體獲自HL3T1細胞轉染和293T/HL3T1細胞共培養的數據的原因。如圖5所示，R55L突變并不顯著改變蛋白質的轉導能力。突變R52L顯著降低蛋白質的轉導能力(用該構建體轉染的HL3T1細胞和與表達pEGFP-TEX-R52L的293T細胞共培養的HL3T1細胞間的CAT活性降低5倍)。正如共培養后測定的CAT活性背景噪音所示，雙重突變體R52L-R55L顯示轉導能力的完全丟失。用R52L和R52L-R55L突變體獲得的結果都暗示，Tat的轉導能力與堿性結構域中精氨酸殘基的數量有關(27)。看來對于Tat的轉導能力殘基R55似乎不及殘基R52重要。因此，精氨酸殘基的定位可能也在整個轉導機制中起作用。
實施例5克隆用本發明核苷酸序列轉染的細胞系。
許多有關HIV-1 Tat蛋白對細胞基因調控的功能試驗涉及使用組成型表達該蛋白質的細胞系。因此發明人建立了表達不同Tat-蛋白突變體的細胞系。為此，將HeLa細胞以2.5×105細胞每孔接種于6孔板，之后于第二天以2μg編碼各種Tat突變體的DNA用試劑Exgen 500(由Euromedex銷售)轉染。為對這些轉染細胞進行生物克隆，細胞轉染3天后用胰蛋白酶消化并計數，之后以3至30個細胞每孔的濃度、每次轉染3至5個96孔板的比率(每次轉染的總數為288至480孔)接種于平底96孔板。之后在500μg/ml geneticin(Geneticin硫酸鹽，Gibco-BRL)存在下于96-孔板中培養15天。15天后，將細胞仍然存活并顯著增殖的孔視為陽性。在標準方法中，當來自相同轉染的各96孔板中含有少于10個陽性孔每板，則認為該生物克隆是成功的。之后在geneticin存在下將每次轉染的3至15個陽性孔增殖六代以獲得充足的用于冷凍的細胞量。第六代時，用免疫轉移(蛋白質印跡)驗證各克隆的Tat的表達。
用免疫轉移證實了如此產生的細胞系中的Tat表達之后，發明人使用了含有依賴于病毒HIV啟動子(LTR-CAT構建體)的CAT基因的質粒構建體，以轉染由此獲得的不同的細胞系克隆。從而有可能顯示，該細胞系中Tat突變體的穩定表達不改變它們的反式激活活性(圖6)。
實施例6位置58的突變體以ACH.320.2A.2.1株野生型Tat基因的cDNA為模板、S58A(M5′)/S58A(M3′)為引物對獲得單突變體S58A。然而，存在其它的在位置58天然帶有丙氨酸且具有功能性(核定位、反式激活等)Tat所有特性的其它HIV-1株，例如HXB2株。ACH320.2A.2.1株上這樣的突變S58A不改變蛋白質的行為且不可能實現Tat解毒。
表1
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權利要求
1.HIV-1病毒Tat蛋白的解毒免疫原性突變體，其特征在于它在野生型Tat蛋白的區域4和/或5中至少含有兩個突變，且其中，當突變處于結構域4區域時它位于從氨基酸位置49至氨基酸位置57這部分中，且其中，當突變處于結構域5中時它或者位于RGD基元中或者在88-92區中，優選在位置89和/或92，突變是由一個氨基酸被另一氨基酸置換形成的突變。
2.根據權利要求1的突變體，其特征在于它在區域4中至少含有一個突變。
3.根據權利要求1或2之一的突變體，其特征在于結構域4和/或5中的突變能帶來以下特征中的至少一種-廢除野生型Tat蛋白的跨細胞效應，-改變野生型Tat蛋白的核定位。
4.根據權利要求1至3之一的突變體，其特征在于它含有能夠使野生型Tat蛋白反式激活活性喪失的附加突變。
5.根據權利要求1至4的突變體，其特征在于它在野生型Tat蛋白結構域4的N-末端區域從氨基酸位置49至氨基酸位置55這部分中含有突變。
6.根據權利要求1至5之一的突變體，其特征在于它在野生型Tat蛋白結構域2中包含突變，特別是對任一半胱氨酸的置換，有利地是被絲氨酸置換。
7.根據權利要求1至6之一的突變體，其特征在于它含有以下至少一種突變-第27位的半胱氨酸被絲氨酸取代，-第51位的賴氨酸被蘇氨酸取代，-第52位的精氨酸被亮氨酸取代，-第55位的精氨酸被亮氨酸取代，-第57位的精氨酸被亮氨酸取代，-第79位的甘氨酸被丙氨酸取代，-第89位的賴氨酸被亮氨酸取代，-第92位的谷氨酸被谷氨酰胺取代。
8.根據權利要求1至7之一的突變體，其特征在于它選自下述具有兩種突變的突變體，各突變用三聯體表示字母-數字-字母，其中的數字表示突變氨基酸的位置，數字前的字母對應突變所涉及的氨基酸，數字后的字母表示用于置換數字前氨基酸的氨基酸K51T-R52L(SEQ ID NO2)K51T-R55L(SEQ ID NO3)K51T-R57L(SEQ ID NO4)K51T-G79A(SEQ ID NO5)K51T-K89L(SEQ ID NO6)K51T-E92Q(SEQ ID NO7)R52L-R55L(SEQ ID NO8)R52L-R57L(SEQ ID NO9)R52L-G79A(SEQ ID NO10)R52L-K89L(SEQ ID NO11)R52L-E92Q(SEQ ID NO12)R55L-R57L(SEQ ID NO13)R55L-G79A(SEQ ID NO14)R55L-K89L(SEQ ID NO15)R55L-E92Q(SEQ ID NO16)R57L-G79A(SEQ ID NO17)R57L-K89L(SEQ ID NO18)R57L-E92Q(SEQ ID NO19)G79A-K89L(SEQ ID NO20)G79A-E92Q(SEQ ID NO21)K89L-E92Q(SEQ ID NO22)。
9.根據權利要求8的突變體，其特征在于它選自下列突變體K51T-R55L (SEQ ID NO3)R52L-R55L (SEQ ID NO8)R52L-G79A (SEQ ID NO10)R55L-R57L (SEQ ID NO13)G79A-K89L (SEQ ID NO20)。
10.根據權利要求1至7之一的突變體，其特征在于它選自下述具有三種突變的突變體，各突變用三聯體表示字母-數字-字母，其中的數字表示突變氨基酸的位置，數字前的字母對應突變所涉及的氨基酸，數字后的字母表示用于置換數字前氨基酸的氨基酸C27S-K51T-R52L(SEQ ID NO23)C27S-K51T-R55L(SEQ ID NO24)C27S-K51T-R57L(SEQ ID NO25)C27S-K51T-G79A(SEQ ID NO26)C27S-K51T-K89L(SEQ ID NO27)C27S-K51T-E92Q(SEQ ID NO28)C27S-R52L-R55L(SEQ ID NO29)C27S-R52L-R57L(SEQ ID NO30)C27S-R52L-G79A(SEQ ID NO31)C27S-R52L-K89L(SEQ ID NO32)C27S-R52L-E92Q(SEQ ID NO33)C27S-R55L-R57L(SEQ ID NO34)C27S-R55L-G79A(SEQ ID NO35)C27S-R55L-K89L(SEQ ID NO36)C27S-R55L-E92Q(SEQ ID NO37)C27S-R57L-G79A(SEQ ID NO38)C27S-R57L-K89L(SEQ ID NO39)C27S-R57L-E92Q(SEQ ID NO40)C27S-G79A-K89L(SEQ ID NO41)C27S-G79A-E92Q(SEQ ID NO42)C27S-K89L-E92Q(SEQ ID NO43)。
11.根據權利要求10的突變體，其特征在于它選自下列突變體C27S-K51T-R55L(SEQ ID NO24)C27S-R52L-R55L(SEQ ID NO29)C27S-R52L-G79A(SEQ ID NO31)。
12.根據權利要求1至7之一的突變體，其特征在于它選自下述具有四種突變的突變體，各突變用三聯體表示字母-數字-字母，其中的數字表示突變氨基酸的位置，數字前的字母對應突變所涉及的氨基酸，數字后的字母表示用于置換數字前氨基酸的氨基酸C27S-K51T-R52L-G79A(SEQ ID NO44)C27S-K51T-R52L-K89L(SEQ ID NO45)C27S-K51T-R52L-E92Q(SEQ ID NO46)C27S-K51T-R55L-G79A(SEQ ID NO47)C27S-K51T-R55L-K89L(SEQ ID NO48)C27S-K51T-R55L-E92Q(SEQ ID NO49)C27S-K51T-R57L-G79A(SEQ ID NO50)C27S-K51T-R57L-K89L(SEQ ID NO51)C27S-K51T-R57L-E92Q(SEQ ID NO52)C27S-K51T-G79A-K89L(SEQ ID NO53)C27S-K51T-G79A-E92Q(SEQ ID NO54)C27S-K51T-K89L-E92Q(SEQ ID NO55)C27S-R52L-G79A-K89L(SEQ ID NO56)C27S-R52L-G79A-E92Q(SEQ ID NO57)C27S-R52L-K89L-E92Q(SEQ ID NO58)C27S-R52L-R55L-G79A(SEQ ID NO59)C27S-R52L-R55L-K89L(SEQ ID NO60)C27S-R52L-R55L-E92Q(SEQ ID NO61)C27S-R52L-R57L-G79A(SEQ ID NO62)C27S-R52L-R57L-K89L(SEQ ID NO63)C27S-R52L-R57L-E92Q(SEQ ID NO64)C27S-R55L-G79A-K89L(SEQ ID NO65)C27S-R55L-G79A-E92Q(SEQ ID NO66)C27S-R55L-K89L-E92Q(SEQ ID NO67)C27S-R55L-R57L-G79A(SEQ ID NO68)C27S-R55L-R57L-K89L(SEQ ID NO69)C27S-R55L-R57L-E92Q(SEQ ID NO70)C27S-R57L-G79A-K89L(SEQ ID NO71)C27S-R57L-G79A-E92Q(SEQ ID NO72)C27S-R57L-K89L-E92Q(SEQ ID NO73)C27S-G79A-K89L-E92Q(SEQ ID NO74)。
13.根據權利要求12的突變體，其特征在于它選自下列突變體C27S-K51T-R55L-G79A(SEQ ID NO47)C27S-K51T-R55L-K89L(SEQ ID NO48)C27S-K51T-R55L-E92Q(SEQ ID NO49)C27S-R52L-R55L-G79A(SEQ ID NO59)。
14.根據權利要求1至7之一的突變體，其特征在于它選自下述具有五種突變的突變體，各突變用三聯體表示字母-數字-字母，其中的數字表示突變氨基酸的位置，數字前的字母對應突變所涉及的氨基酸，數字后的字母表示用于置換數字前氨基酸的氨基酸C27S-K51T-G79A-K89L-E92Q(SEQ ID NO75)C27S-K51T-R52L-R55L-G79A(SEQ ID NO76)C27S-K51T-R52L-R55L-K89L(SEQ ID NO77)C27S-K51T-R52L-R55L-E92Q(SEQ ID NO78)C27S-K51T-R52L-R57L-G79A(SEQ ID NO79)C27S-K51T-R52L-R57L-K89L(SEQ ID NO80)C27S-K51T-R52L-R57L-E92Q(SEQ ID NO81)C27S-K51T-R52L-G79A-K89L(SEQ ID NO82)C27S-K51T-R52L-G79A-E92Q(SEQ ID NO83)C27S-K51T-R52L-K89L-E92Q(SEQ ID NO84)C27S-K51T-R55L-R57L-G79A(SEQ ID NO85)C27S-K51T-R55L-R57L-K89L(SEQ ID NO86)C27S-K51T-R55L-R57L-E92Q(SEQ ID NO87)C27S-K51T-R55L-G79A-K89L(SEQ ID NO88)C27S-K51T-R55L-G79A-E92Q(SEQ ID NO89)C27S-K51T-R55L-K89L-E92Q(SEQ ID NO90)C27S-K51T-R57L-G79A-K89L(SEQ ID NO91)C27S-K51T-R57L-G79A-E92Q(SEQ ID NO92)C27S-K51T-R57L-K89L-E92Q(SEQ ID NO93)C27S-R52L-R55L-R57L-G79A(SEQ ID NO94)C27S-R52L-R55L-R57L-K89L(SEQ ID NO95)C27S-R52L-R55L-R57L-E92Q(SEQ ID NO96)C27S-R52L-R55L-G79A-K89L(SEQ ID NO97)C27S-R52L-R55L-G79A-E92Q(SEQ ID NO98)C27S-R52L-R55L-K89L-E92Q(SEQ ID NO99)C27S-R52L-R57L-G79A-K89L(SEQ ID NO100)C27S-R52L-R57L-G79A-E92Q(SEQ ID NO101)C27S-R52L-R57L-K89L-E92Q(SEQ ID NO102)C27S-R52L-G79A-K89L-E92Q(SEQ ID NO103)C27S-R55L-R57L-G79A-K89L(SEQ ID NO104)C27S-R55L-R57L-G79A-E92Q(SEQ ID NO105)C27S-R55L-R57L-K89L-E92Q(SEQ ID NO106)C27S-R55L-G79A-K89L-E92Q(SEQ ID NO107)C27S-R57L-G79A-K89L-E92Q(SEQ ID NO108)。
15.根據權利要求14的突變體，其特征在于它選自下列突變體C27S-K51T-R55L-G79A-K89L(SEQ ID NO88)C27S-K51T-R55L-G79A-E92Q(SEQ ID NO89)。
16.編碼根據權利要求1至15任一項的突變體之一的核苷酸序列。
17.用根據權利要求16的核苷酸序列轉染的細胞系。
18.針對根據權利要求1至15任一項的突變體之一的抗體，其不識別野生型蛋白質結構域D1。
19.根據權利要求18的抗體，其識別野生型蛋白質。
20.根據權利要求18的抗體，其不識別野生型蛋白質。
21.藥物組合物，特別是疫苗，它包含作為活性成分的至少一種根據權利要求1至15任一項的突變體或至少一種根據權利要求16的核苷酸序列或至少一種根據權利要求18-20任一項的抗體以及藥學適宜載體，其中的核酸位于權利要求1-15任一項的突變體之一的組成型表達所必需的元件控制之下。
22.含有至少一種如權利要求1至15任一項中所定義的突變體、或至少一種根據權利要求18至20任一項的抗體的檢測和/或定量HIV-1病毒的診斷組合物。
23.檢測和/或定量取自能被HIV-1感染的個體的生物樣品中HIV-1病毒的方法，該生物樣品例如是血漿、血清或組織，其特征在于該方法包括下列階段-在預定條件下將所述生物樣品與含有如權利要求1至15任一項所定義的突變體或如權利要求18至20任一項所定義的抗體的診斷組合物接觸，如果必要的話，該預定條件允許上述定義的突變體與針對野生型Tat蛋白的抗體之間、或上述定義的抗體與野生型Tat蛋白之間形成抗體/抗原復合物，和-用適當的手段檢測和/或定量所述復合物的形成。
24.至少一種如權利要求1至15任一項所定義的突變體或至少一種根據權利要求18至20任一項的抗體在體外診斷生物樣本或樣品中HIV-1病毒中的用途。
25.至少一種如權利要求1至15任一項所定義的突變體或至少一種根據權利要求18至20任一項的抗體在制備疫苗組合物中的用途。
全文摘要
本發明涉及用于制備野生型HIV－1病毒Tat蛋白的解毒免疫原性突變體的蛋白質突變方法的用途。本發明還涉及制備野生型HIV－1病毒Tat蛋白的解毒免疫原性突變體的方法，包括第一步制備野生型Tat蛋白質突變體、第二步篩選沒有跨細胞活性但是核定位被改變的解毒突變體、以及第三步篩選能誘導同時針對所述突變體和野生Tat蛋白的抗體的免疫原性突變體。步驟二和三可以調換。
文檔編號C07K14/16GK1615364SQ03802072
公開日2005年5月11日 申請日期2003年1月9日 優先權日2002年1月11日
發明者C·吉隆, A·徹達爾－博努, B·沃里爾, B·曼德蘭德 申請人:拜奧默里克斯股份有限公司