水稻減數(shù)分裂基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法

專利名稱：水稻減數(shù)分裂基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中一種減數(shù)分裂基因及其編碼蛋白與應(yīng)用，特別涉及一種水稻減數(shù)分裂基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
減數(shù)分裂是真核生物形成正常雌雄生殖細胞、完成物種繁衍的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是作物形成經(jīng)濟產(chǎn)量的基礎(chǔ)。在細胞學(xué)上，減數(shù)分裂主要由同源染色體聯(lián)會、同源重組和染色體分離三個連續(xù)的過程組成，涉及到一個較復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。近幾年，國際上利用單細胞真核生物-酵母，克隆了一些重要的減數(shù)分裂基因，如SPO11，DMC1，ZIP1等，其中大多數(shù)基因的單基因突變能導(dǎo)致相應(yīng)的減數(shù)分裂過程異常，產(chǎn)生致死的孢子(王臺等，科學(xué)通報2002，46838-842；Merino et al.，PNAS 9710477-10482；Celerin et al.，EMBO 2000，192739-2750；Watanabe et al.，Nature 1999，400461-464)，在分子水平上表明減數(shù)分裂基因是調(diào)控生物生殖特性的關(guān)鍵基因。
SPO11最初是從酵母中克隆的一個在減數(shù)分裂細胞中特異性表達的基因，其編碼的蛋白是催化減數(shù)分裂同源染色體重組的關(guān)鍵蛋白(Atcheson et al.，Proc Natl AcadUSA 1987，848035-8039；Keeney et al.，Cell 88375-384)；SPO11單基因突變體的減數(shù)分裂同源染色體不能聯(lián)會與正常分離，減數(shù)分裂失敗，最終產(chǎn)生致死的孢子。在酵母rad50突變體中，由于產(chǎn)生的DNA雙鏈斷裂不能被正常的修復(fù)，Spo11被發(fā)現(xiàn)結(jié)合到斷裂鏈的5’端(Keeney S et al.，Cell 1997，88375-384)。雖然目前還沒有直接的生化證據(jù)證實Spo11直接參與了DNA雙鏈的剪切，但通過序列比較和結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，Spo11是Sulfolobus shibatae中拓撲酶(TopVIA)亞基A的同源蛋白(Bergerat et al.，Nature，1997，386414-417)。TopVIA是TopoII蛋白的一個新家族，有與TopoII蛋白有相似的生化特性。參與酯交換反應(yīng)的活性位點的Tyr在Spo11和TopoII中都是保守的(Keeney S et al.，Cell 1997，88375-384；Bergerat et al.，Nature 1997，386414-417)。DNA雙鏈斷裂產(chǎn)生以后，在內(nèi)切酶的作用下，斷裂鏈的5’端被剪切，從而產(chǎn)生不同長度的3’末端(Bishop DK et al.，Cell 1992，69439-456)。隨后3’末端在Dmcl，Rad51和其它相關(guān)蛋白的協(xié)助下，入侵到同源染色體，完成DNA雙鏈斷裂的修復(fù)(Hong et al，J Biol Chem 2001，27641906-1912；Shinohara，Cell1992，69457-470)。
目前，SPO11的同源基因也已經(jīng)分別從人，鼠，線蟲，果蠅和擬南芥中被分離出來(Cervante et al.，Mol Cell 2000，5883-888；McKim and Hayashi-Hagihara，Science 1998，279876-878；Derburg et al.，1998；Keeney S et al.，Genomics1999，61170-182；Hartung et al.，Nucleic Acids Res，2000，281548-54；Grelonet al.，EMBOJ 2001，20589-600)。但在植物中，目前在GenBank數(shù)據(jù)庫中只報道了擬南芥SPO11的同源基因。與動物細胞不同的是，擬南芥中有三個SPO11的同源基因，分別為AtSPO11-1，AtSPO11-2和AtSPO11-3，而且其表達也不是減數(shù)分裂特異的，在營養(yǎng)器官中也表達(Hartung F et al 2000，2001)。研究發(fā)現(xiàn)，盡管這些同源基因的序列同源性比較低，但在其功能中起關(guān)鍵作用的5個功能基元都是保守的。AtSPO11是酵母減數(shù)分裂基因SPO11的同源基因。在擬南芥AtSPO11-1缺失突變體中，減數(shù)分裂前期I聯(lián)會復(fù)合體的形成受影響，而且在減數(shù)分裂后期I，染色體的分離是隨機的，產(chǎn)生大量的不育配子體(EMBO J 2001，20589-600)。因此，AtSPO11-1在擬南芥減數(shù)分裂中可能是參與染色體DNA雙鏈斷裂的關(guān)鍵基因。AtSPO11-3缺失突變體的表型和油菜素內(nèi)酯的合成和感受缺陷突變體差不多，都表現(xiàn)為突變體植株的矮化和細胞不能進行伸長生長等特征，因此AtSpo11-3可能參與油菜素內(nèi)酯信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)(Yin Y et al.，2002)有關(guān)。因此，SPO11在植物的有性生殖中起重要作用。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種水稻減數(shù)分裂基因及其編碼蛋白。
水稻減數(shù)分裂基因的名稱為OsSPO11-3，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由1898個堿基組成，包含66bp的5’非翻譯區(qū)，486bp的3’非翻譯區(qū)和1302bp的ORF。ORF自5’端112位堿基-1413位堿基。
水稻減數(shù)分裂基因OsSPO11-3編碼蛋白OsSPO11-3，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中SEQ ID №2由434個氨基酸殘基組成，分子量是48kDa，等電點為6.08，包含Spo11家族蛋白中保守的5個的功能基元，也包含功能基元I中與酶活性相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸殘基。
含有水稻減數(shù)分裂基因OsSPO11-3的細胞系和表達載體也屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明的水稻減數(shù)分裂基因OsSPO11-3表達分析已證明該基因在生殖器官和營養(yǎng)器官中均表達，用該cDNA序列進行的反義RNA分析證明OsSPO11-3也參與控制水稻減數(shù)分裂同源重組過程中DNA雙鏈斷裂的起始，基因功能缺失導(dǎo)致雌雄性不育。OsSPO11-3編碼的蛋白質(zhì)OsSpo11-3包含Spo11家族蛋白中保守的5個功能基元，也含有Motif I中參與酯交換反應(yīng)的關(guān)鍵氨基酸殘基Tyr(OsSpo11-3的Tyr213)。該cDNA與數(shù)據(jù)庫中的其它SPO11同源基因的同源性低于30％，所編碼的蛋白的相似性低于20％。
本發(fā)明利用原位雜交技術(shù)證明該基因在減數(shù)分裂的性細胞與有絲分裂的分生組織細胞中均表達，但在減數(shù)分裂的性細胞中表達量比較高，而且在減數(shù)分裂早期的花粉母細胞中表達量最高；通過RNAi技術(shù)進行的RNA干預(yù)實驗證明該基因具有調(diào)控減數(shù)分裂與有絲分裂的功能。
本發(fā)明的基因可用于與其它調(diào)控元件，如組成型啟動子(如35S啟動子)或器官特異性啟動子融合構(gòu)建基因表達載體，或通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)、反義RNA或RNAi等技術(shù)調(diào)控植物生殖特性(如雄性不育、雌性不育或雌雄不育)用于生產(chǎn)雜交種子以提高作物的產(chǎn)量，或根據(jù)需要控制植物的育性，如使楊樹不育，減少樹種子(白色的毛)對城市的污染；改良植物的品質(zhì)(如生產(chǎn)無子瓜果)、控制經(jīng)濟植物(如煙草)的生殖，提高其經(jīng)濟價值或控制外來入侵生物的生殖，降低其入侵性等；具有重要的應(yīng)用價值。
具體實施例方式
實施例1、水稻OsSPO11-3 cDNA的分離1)RNA的分離用Trizol試劑盒(GIBICO-BRL生物技術(shù)公司，美國)從花粉母細胞減數(shù)分裂期的穎花中提取總RNA，隨后用無RNase的DNase(TaRaKa生物技術(shù)有限公司(大連))除去RNA中殘留的DNA。除去DNA后的RNA用于反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。
2)cDNA片段的分離以已克隆的OsSPO11-1編碼的蛋白質(zhì)序列為探針，在TIGR基因組數(shù)序列數(shù)據(jù)庫中進行TBLASTN分析，得到一段水稻未知的基因組序列，推測其氨基酸序列與OsSpo11-1有30％的相似性，含有在該類蛋白中保守的功能基元I。以該基因組序列為基礎(chǔ)合成3’RACE引物WP69F15’-ggg ctg gat tga aca tct cg-3’和WP69F25’-agc gat caa tga cat ctg cg-3’以及5’RACE引物WP72R1(5’-GGAAATCCCTTGTTTGGA-3’)/WP72R2(5’-CCTGTGTGGTATCTGCACTCC-3’)，通過RACEs(rapidamplification of cDNA ends-RACEs)(Forhman MA.et al.Proc Natl Acad Sci USA，1988，858998-9002)分離相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本。
3′端的分離將5μgRNA和oligo-dT adapter(CTGATCTAGAGGTAC CGGATCTTTTTTTTTTTTTTTTT)引物混合，加無菌水使混合物體積達到12μl，70℃保溫10min，轉(zhuǎn)至冰浴中，加入4μl 5×第一鏈緩沖液(first strand buffer)，1μl 10mM dNTPs，2μl 0.1mM DTT，42℃預(yù)熱2min后，加入1μl SuperScript II RNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μl，GIBCO-BRL，Life Technologies，USA)，42℃反應(yīng)50min，合成第一鏈cDNA，最后在70℃加熱15min，失活逆轉(zhuǎn)錄酶。該cDNA用作PCR模板。第一次PCR混合物的體積50μl，含10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，2mM MgCl2，0.05％Nonidet P-40，1μl cDNA，10 pmoles WP69F1，10 pmoles adapter引物(CTGATCTAGAGGTACCGGATC)，200μM dNTPs和2.5 U Pfu DNA polymerase(5U/μl，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。反應(yīng)條件是94℃預(yù)變性1min；隨后在94℃變性1min，52-60℃退火1min，72℃延伸2min 3sec，共進行30個循環(huán)；最后在72℃保溫10min。第二次PCR使用1μl第一次PCR的產(chǎn)物作模板和WP69F2與adapter引物對，其它條件與第一次PCR的相同。第二次PCR擴增后得到OsSPO11-3cDNA的3′端cDNA片段，瓊脂糖電泳純化后，按常規(guī)方法將其克隆到pGEM-T載體上，得到重組質(zhì)粒W57，按常規(guī)方法測序，W57插入片段的長度為781bp。
5′端片段克隆將5μgRNA與2.5 pmoles WP72R1混合，加無菌水使混合物體積達到12μl，70℃保溫10min，迅速轉(zhuǎn)至冰浴中，加入4μl 5×第一鏈緩沖液(firststrand buffer)，1μl 10mM dNTPs，2μl 0.1mM DTT，42℃預(yù)熱2min后，加入1μlSuperScript II RNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μl，GIBCO-BRL生物技術(shù)公司，美國)，42℃反應(yīng)50min，合成第一鏈cDNA，最后在70℃加熱15min，失活逆轉(zhuǎn)錄酶。用GlassMaxcartridge(GIBCO-BRL生物技術(shù)公司，美國)純化第一鏈cDNA，除去多余的引物。按GIBCO-BRL 5，RACE試劑盒(GIBCO-BRL生物技術(shù)公司，美國)的指導(dǎo)，在第一鏈cDNA的5′端加多聚G尾。加尾的cDNA用作PCR模板。第一次PCR混合物的體積50μl，含10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，2mM MgCl2，0.05％Nonidet P-40，1μl加尾的cDNA，10 pmolesWP72R1，10 pmoles UAP引物，200uM dNTPs和2.5 U Pfu DNApolymerase(5U/μl，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。反應(yīng)條件是94℃預(yù)變性1min；隨后在94℃變性1min，52-60℃退火1min，72℃C延伸2min 3sec，共進行30個循環(huán)；最后在72℃保溫10min。第二次PCR使用1μl第一次PCR的產(chǎn)物作模板和WP72R2與UAP引物對，其它條件與第一次PCR的相同。第二次PCR擴增后得到cDNA的5′端cDNA片段，瓊脂糖電泳純化后，按常規(guī)方法將其克隆到pGEM-T載體上，得到重組質(zhì)粒W67，按常規(guī)方法測序，重組質(zhì)粒W67插入片段的長度為942bp。
測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒W57和W67插入片段的長度分別是781和942bp，利用它們與EST(expressed sequence tags，表達序列標簽)的重疊區(qū)，通過組裝獲得了一個全長的轉(zhuǎn)錄本，其編碼的蛋白質(zhì)含有在Spo11家族蛋白質(zhì)中保守的5個功能基元，因此該蛋白是一個新的Spo11蛋白，與之對應(yīng)的cDNA被命名為OsSPO11-3(SEQ ID NO.1) 。
3)OsSPO11-3基因及編碼蛋白的分子結(jié)構(gòu)分析OsSPO11-3 cDNA全長1898bp，包含66bp的5’非翻譯區(qū)，486bp的3’非翻譯區(qū)和1302 bp的ORF。ORF從核苷酸112的起始密碼ATG開始到核苷酸1413結(jié)束，終止密碼是TGA。其編碼的多肽OsSpo11-3由434個氨基酸組成，分子量是48kDa，等電點為6.08，包含Spo11家族蛋白中保守的5個的功能基元，也包含功能基元I中與酶活性相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸殘基。通過與國際數(shù)據(jù)庫Genbank/DDBJ/EMLK聯(lián)網(wǎng)，用BLAST軟件分析證明OsSPO11-3與數(shù)據(jù)庫中已知的基因同源性低于30％，其編碼的蛋白質(zhì)OsSpo11-3序列與其它同源蛋白氨基酸序列的同源性低于20％。因此該基因是一個新的編碼Spo11蛋白的基因。
實施例2、OsSPO11-3的表達分析用RT-PCR檢測OsSPO11-3在水稻穎花、葉、幼芽和根中的表達。RT-PCR引物是WP79F(5’-AATTTCTTGCCTCTCGCTCAG-3’)和WP79R(5’-CAGACAGAAAGGTACTTAGGAG-3’)。用水稻微管蛋白基因tubA作對照，所用的正義和反義引物分別是TCAGATGCCCAGTGACAGA和TTGGTGATCTCGGCAACAGA。
按照實施例1步驟1)中的方法提取穎花、葉、幼芽和根的總RNA，然后進行cDNA的合成。將4μgRNA和0.5μg oligo-(dT)15引物混合，加無菌水使混合物體積達到12μl，70℃保溫10min，轉(zhuǎn)至冰浴中，加入4μl 5×第一鏈緩沖液(first strandbuffer)，1μl 10mM dNTPs，2μl 0.1mM DTT，42℃預(yù)熱2min后，加入1μl SuperScriptII RNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/μl，GIBCO-BRL生物技術(shù)公司，美國)，42℃反應(yīng)50min，合成第一鏈cDNA，最后在70℃加熱15min，失活逆轉(zhuǎn)錄酶。第一鏈cDNA用作PCR的模板。50μl的PCR反應(yīng)混合物含1μl cDNA模板、10 pmoles正義引物、10 pmoles反義引物，400μM dNTPs、1×GC PCR緩沖液和2.5 U的LATaq DNA聚合酶(TaRaKa生物技術(shù)有限公司(大連))。PCR反應(yīng)條件是94℃預(yù)變性1min；94℃ 1min，55-60℃1min，72℃ 2min 30sec，30個循環(huán)；72℃ 10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖電泳進行檢測。實驗結(jié)果表明，OsSPO11-3在減數(shù)分裂早期的穎花中表達量最高，在葉片中表達量也較高，在幼芽中表達量較低，在根中表達量最低。
為了精確定位SPO11-3在花中表達組織與細胞位點，取各個發(fā)育時期的水稻穎花在室溫下，用FAA(50％乙醇，5％丙酸和3.7％甲醛)固定液固定花藥16小時，隨后逐級脫水至100％乙醇，按標準方法浸蠟，最后將材料包埋在paraffin(Sigma，St.Louis，美國)中。切片厚度為10毫米。切片被貼在經(jīng)賴氨酸包被的載玻片上(Sigma，St.Louis，美國)。
脫蠟、復(fù)水和原位雜交按Meyerowitz(Meyerowitz，Plant Mol Biol Rep，1988，5242-250)的方法進行。以線性化的W57作模板，用T7或SP6 RNA聚合酶(Boehringermannheim，Indianapolis，IN，美國)合成地高辛標記的正義和反義探針。在42℃雜交20小時。雜交液成分是50％formamide(甲醛)，5％dextran sulfte(硫酸葡聚糖)，1％block reagent(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN，美國)，150mg/mltRNA(Sigma，St.Louis，美國)，300mM NaCl，1mM EDTA和10mM Tris pH7.5。
使用DIG檢測試劑盒(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN，USA)檢測雜交信號。實驗結(jié)果表明，OsSPO11-3在花粉母細胞形成期就有很強的表達信號，到減數(shù)分裂早前期，OsSPO11-3的表達量達到最高。以后，隨著發(fā)育時期的進行，表達量逐漸降低，到單核晚期，幾乎看不到其表達信號。在大孢子母細胞和子房中也有很強的表達信號。另外，發(fā)育早期的絨氈層細胞和不同花器官的維管束細胞中也檢測到OsSPO11-3的表達。同時，用正義探針雜交時，各種組織都沒有雜交信號。初步說明水稻的OsSPO11-3基因具有酵母和動物SPO11基因調(diào)節(jié)減數(shù)分裂同源染色體重組的功能外，可能和體細胞發(fā)育的調(diào)節(jié)也有關(guān)。
實施例3、利用OsSPO11-3構(gòu)建的RNAi表達載體調(diào)控水稻育性1)RNA的分離用Trizol試劑盒(GIBICO-BRL生物技術(shù)公司，美國)從花粉母細胞減數(shù)分裂期的穎花中提取總RNA，隨后用無RNase的DNase(TaRaKa生物技術(shù)有限公司(大連))除去RNA中殘留的DNA。除去DNA后的RNA用于反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。
2)第一鏈cDNA的合成將5μg RNA和10μM oligo-dT adapter(CTGATCTAGAGGTACCGGATCTTTTTTTTTTTTTTTTT)引物混合，加無菌水使混合物體積達到12μl，70℃保溫10min，轉(zhuǎn)至冰浴中，加入4μl 5×第一鏈緩沖液(first strand buffer)，1μl 10mM dNTPs，2μl 0.1mMDTT，42℃預(yù)熱2min后，加入1μl SuperScript II RNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μl，GIBCO-BRL生物技術(shù)公司，美國)，42℃反應(yīng)50min，合成第一鏈cDNA，最后在70℃加熱15min，失活逆轉(zhuǎn)錄酶。
3)目的cDNA片段的獲得依據(jù)序列表中SEQ ID №1的OsSPO11-3全長cDNA序列，合成引物WP192F5’-CGT CTAGAT GGG AAC TGC CAG AGG AGA A-3’(含XbaI切點)/WP192R5’-ATGGTA CCA CCC AAC AAA TAG ATG GCA CG-3’(含KpnI切點)和WP193F5’-ATG GTA ACCGCC AGA GGA GAA GGT CCA A-3’(含BstEII切點)/WP193R5’-CTG TCG ACA CCC AACAAA TAG ATG GCA CG-3’(含SalI切點)。將用引物WP192F和WP192R以本實施例步驟2)中第一鏈cDNA為模板擴增的產(chǎn)物經(jīng)相應(yīng)的酶切后正向連接RNAi載體p1300MGM(由pCAMBIA1300，CAMBIA，Australia)；而用引物WP193F和WP193R以本實施例步驟2)中第一鏈cDNA為模板擴增的產(chǎn)物經(jīng)相應(yīng)的酶切后反向連接到相同的載體上，兩者之間由一個linker分隔，啟動子為35S。上述PCR反應(yīng)混合物為50μl，含1×PCR緩沖液，1μl第一鏈cDNA，10 pmoles正義引物，10 pmoles反義引物，200 uM dNTPs，2.5單位Taq DNA聚合酶(5U/μl，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，混合物在94℃預(yù)變性1min，隨后在94℃ 1min，55-60℃ 1min和72℃ 2min 30sec，30個循環(huán)，最后在72℃延伸10min。
4)RNAi表達載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶XbaI和KpnI在37℃酶切由WP192F和WP192R擴增的cDNA片段，將其正向連接到經(jīng)相同酶切的RNAi載體p1300MGM上，啟動子為35S；用限制性內(nèi)切酶BstEII和SalI分別在60℃或37℃酶切由WP193F和WP193R擴增的cDNA片段，將其反向連接到經(jīng)相同酶切的RNAi載體p1300MGM上，與正向連接的cDNA片段中間相隔一個700bp長的linker，且共用一個啟動子，得到表達載體p1300MGMS3。
5)遺傳轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因植株的獲得用構(gòu)建好的RNAi表達載體p1300MGMS3，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，經(jīng)卡娜霉素抗性篩選獲得轉(zhuǎn)化的愈傷組織。進一步培養(yǎng)得到再生植株。按照常規(guī)方法進行PCR和northern blot雜交，進一步檢測得到轉(zhuǎn)OsSPO11-3 RNAi的植株。
6)轉(zhuǎn)基因植株的育性檢測用I2-KI和TTC染色檢查花粉活性，結(jié)合結(jié)實率的統(tǒng)計分析證明RNAi能導(dǎo)致植株雄性不育。
序列表<160>2<210>1<211>1898<212>DNA<213>水稻屬水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>1ggaggggaat ttcttgcctc tcgctcagat ccgttcctcc gcgaaaagcg acggcgactt60tgttgacgct gcggcctctt cccgaccgcg cagaaagatt tgaggtcacc aatggatgat120tcaacggatg acgattcgta tcatccaaga aaacactatg cttatgatcg tcaggtttct180tcaagcagat ggcgtaccag ccgcgagtat atcagaggtc ccggccccga aactcatact240actgagagtg cgcaagatgg acaggatcca cctgctggag tatattccta tggttatttt300tctggcagtg gtaatgatcc tcaggttcaa ggacactttg ttccggagat tcaaaagtac360aacccttacg tgattttcaa aggtgaacaa ctcccggttc ctatatggga actgccagag420gagaaggtcc aagattttca tgataggtac tttattgcaa aagacaagag tcgagttgaa480gccaggaaga ctctgaatag gttgttagag gggaacatca atacaattga agggggacat540ggatataaat tcaatattcc aaaatataca gataacatgg agtttaatga ggaagtcaag600gtttctctag caaaagcagg caagaccata agccgttcct tttgcaatgc gaatcagcgg660gaagttgcat ctaggactgg ccataccatt gatctaatag aacggacact tggggctgga720ttgaacatct cgaagagaac tgtcttatac acaaacaagg atctgtttgg ggatcaaagt780aaatcagatc aagcgatcaa tgacatctgc gctttgacaa atatcagaag gggctctttg840ggtataatag cagctgaaaa aggaattgta gttggaaaca ttttcctgga attgacaaat900ggcaartcga ttagttgttc tattggagtg cagataccac acaggcttga ccagatcaaa960gatgtttgtg ttgaaatagg ttcacgcaac atagagtata ttcttgttgt ggaaaagcat1020acaatgttga attatctact agagatggac tatcacacca ataacaactg tataattctg1080acaggatgtg gcatgccaac cctccaaaca agggatttcc tcagattctt gaaacaacgc1140actggactac ctgtctttgg actttgtgat ccagatcctg aaggtataag tattcttgct1200acgtatgcta gagggtcttg caattcagca tatgacaatt tcaatatttc cgtgccatct1260atttgttggg ttggattgtc atcctcagac atgataaagt tgaatttgtc tgagaccaac1320tactccacgt ttgtctcgcg aggacaaaac tatgttgaag aacctttggc aggacgattt1380
gtcccgatgt atggaaacgc agaatcgaag aaatgataag ttttgacaag aaggcctctt1440ttgaagctat tcatagtttg gggtttgatt attttgcaac caatttgctt ccggatatga1500ttaacaaagt acgagaaggc tatgttcagg ttcaagagaa aaaagagcct caagacactg1560aagccagtga ggactgattt ggaggactct aatgcagcta gagattcaga tccataagtt1620tctacaagta aaagttggag cagcagattg gaactgcatg ttgatttttg tggatgctca1680agcttcactc gtatgtttgg cttctgataa gtctgtaata gcttagcagc acaattatta1740tagttgtctt ctaggtgatc gatctcctaa atacttgcac cactattatt gtagttgtct1800tttatgtgat cgatctccta agtacctttc tgtctgtaat agtttagcaa caccattatt1860atagtactag ttatcgtcta aaaaaaaaaa aaaaaaaa1898<210>2<211>434<212>PRT<213>水稻屬水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<220>
<22 1>misc-feature<222>(273，279)<223>Xaa＝………<400>2Met Asp Asp Ser Thr Asp Asp Asp Ser Tyr His Pro Arg Lys His Tyr1 5 10 15Ala Tyr Asp Arg Gln Val Ser Ser Ser Arg Trp Arg Thr Ser Arg Glu20 25 30Tyr Ile Arg Gly Pro Gly Pro Glu Thr His Thr Thr Glu Ser Ala Gln35 40 45Asp Gly Gln Asp Pro Pro Ala Gly Val Tyr Ser Tyr Gly Tyr Phe Ser50 55 60Gly Ser Gly Asn Asp Pro Gln Val Gln Gly His Phe Val Pro Glu Ile65 70 75 80Gln Lys Tyr Asn Pro Tyr Val Ile Phe Lys Gly Glu Gln Leu Pro Val85 90 95
Pro Ile Trp Glu Leu Pro Glu Glu Lys Val Gln Asp Phe His Asp Arg100 105 110Tyr Phe Ile Ala Lys Asp Lys Ser Arg Val Glu Ala Arg Lys Thr Leu115 120 125Asn Arg Leu Leu Glu Gly Asn Ile Asn Thr Ile Glu Gly Gly His Gly130 135 140Tyr Lys Phe Asn Ile Pro Lys Tyr Thr Asp Asn Met Glu Phe Asn Glu145 150 155 160Glu Val Lys Val Ser Leu Ala Lys Ala Gly Lys Thr Ile Ser Arg Ser165 170 175Phe Cys Asn Ala Asn Gln Arg Glu Val Ala Ser Arg Thr Gly His Thr180 185 190Ile Asp Leu Ile Glu Arg Thr Leu Gly Ala Gly Leu Asn Ile Ser Lys195 200 205Arg Thr Val Leu Tyr Thr Asn Lys Asp Leu Phe Gly Asp Gln Ser Lys210 215 220Ser Asp Gln Ala Ile Asn Asp Ile Cys Ala Leu Thr Asn Ile Arg Arg225 230 235 240Gly Ser Leu Gly Ile Ile Ala Ala Glu Lys Gly Ile Val Val Gly Asn245 250 255Ile Phe Leu Glu Leu Thr Asn Gly Lys Ser Ile Ser Cys Ser Ile Gly260 265 270Val Gln Ile Pro His Arg Leu Asp Gln Ile Lys Asp Val Cys Val Glu275 280 285Ile Gly Ser Arg Asn Ile Glu Tyr Ile Leu Val Val Glu Lys His Thr290 295 300Met Leu Asn Tyr Leu Leu Glu Met Asp Tyr His Thr Asn Asn Asn Cys305310 315 320Ile Ile Leu Thr Gly Cys Gly Met Pro Thr Leu Gln Thr Arg Asp Phe325 330 335Leu Arg Phe Leu Lys Gln Arg Thr Gly Leu Pro Val Phe Gly Leu Cys340 345 350Asp Pro Asp Pro Glu Gly Ile Ser Ile Leu Ala Thr Tyr Ala Arg Gly
355 360 365Ser Cys Asn Ser Ala Tyr Asp Asn Phe Asn Ile Ser Val Pro Ser Ile370 375 380Cys Trp Val Gly Leu Ser Ser Ser Asp Met Ile Lys Leu Asn Leu Ser385 390 395 400Glu Thr Asn Tyr Ser Thr Phe Val Ser Arg Gly Gln Asn Tyr Val Glu405 410 415Glu Pro Leu Ala Gly Arg Phe Val Pro Met Tyr Gly Asn Ala Glu Ser420 425 430Lys Lys43權(quán)利要求
1.一種水稻減數(shù)分裂基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于所述水稻減數(shù)分裂基因是序列表中SEQ ID №1的DNA序列。
3.水稻減數(shù)分裂基因的編碼蛋白，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白，其特征在于它是序列表中的SEQ ID №2。
5.含有權(quán)利要求1所述基因的細胞系和表達載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達載體，其特征在于所述載體為RNAi表達載體。
7.權(quán)利要求1所述基因在調(diào)控植物花藥發(fā)育中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述基因在調(diào)控植物生殖特性中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述基因在控制外來入侵生物的生殖特性中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述基因在改良植物品質(zhì)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻減數(shù)分裂基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。水稻減數(shù)分裂基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。水稻減數(shù)分裂基因編碼的蛋白，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的基因可廣泛用于調(diào)控植物生殖特性、改良植物品質(zhì)和控制外來入侵生物的生殖等，具有重要的應(yīng)用價值。
文檔編號C07K14/415GK1600860SQ0316009
公開日2005年3月30日 申請日期2003年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月27日
發(fā)明者王臺, 丁兆軍 申請人:中國科學(xué)院植物研究所