專利名稱：一種抗旱相關基因及其編碼蛋白與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域中一種抗旱相關基因及其編碼蛋白與應用，特別涉及擬南芥的一種抗旱相關基因及其編碼蛋白與應用。
背景技術：
糧食問題是當今世界所面臨的幾大難題之一。通過提高單產或擴大種植面積、增加農業投入改造中低產田等途徑來增加糧食產量都會遇到需要克服逆境限制或減輕逆境危害的問題。因此，認識植物對逆境的反應機制，提高植物的抗逆性，已成為農業進一步增產的重要基礎研究，倍受世界各國政府和科學家的關注，也是當前生命科學研究的熱點。
隨著人類的經濟發展和人口膨脹，水資源短缺現象日趨嚴重，直接導致了干旱地區的擴大與干旱化程度的加重，干旱化趨勢已成為全球關注的問題。面對日益嚴重的全球干旱化趨勢，尋求植物特別是農作物抗旱途徑是十分必要的。
擬南芥是一種典型的模式植物，其作用與實驗鼠相當，廣泛用于植物遺傳學、發育生物學和分子生物學的研究。擬南芥的大多數基因在其他植物中都能找到，有關擬南芥的任何發現都能應用于其他植物研究，專家指出，對擬南芥的研究將幫助科學家找到提高農作物產量的方法。
擬南芥共有約1.3億個堿基對，2.5萬個基因。目前大部分基因的功能還不知道，利用突變技術研究基因功能已成為一種有效方法。對雙子葉植物(主要是擬南芥)而言，T-DNA插入突變是主要途徑，并且已經得到大量T-DNA插入突變體。通過對突變體的研究，獲知了一些逆境基因的功能，如AB13(增加抗凍性)Steponkus，1998)，COR15a(冷誘導基因)(Steponkus，1998)，CBF(耐冷性)(Jaglo-Ottosen，1998)，DREB(增加抗早、抗冷、抗鹽性)(Kasuga，1999)，Apx1(耐熱性)(Shi，2001)，AtNHX1(耐鉀鹽)(Yokoi，2002)等。
目前，還未找到有效的抗旱基因，面對日益嚴重的干旱問題，抗旱基因及抗旱相關基因的尋求勢在必行。
發明創造內容本發明的目的是提供一種抗旱相關基因及其編碼蛋白。
本發明所提供的抗旱相關基因，名稱為ADT(Arabidopsis Drought Tolerance)，來源于哥倫比亞生態型的擬南芥(Columbia)，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；
2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由1164個堿基組成，該基因的讀碼框為自5’端第1到第1164位堿基，不含內含子。
擬南芥抗旱相關基因ADT編碼蛋白ADT，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQID №2衍生的蛋白質。
序列表中序列2氨基酸殘基序列是由387個氨基酸殘基組成的蛋白質。
含有本發明基因的表達載體及細胞系均屬于本發明的保護范圍。
利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發明所提供的ADT基因的antisense導入植物細胞，或者在其他植物中找到與ADT同源的基因然后敲除掉，或者通過RNAi的方法將ADT基因保持沉默，植物就表現為抗旱。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記或具有抗性的抗生素標記物。被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。本發明的基因可廣泛用于培育抗旱植物品種。
下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。
圖1為ADT的熒光實時定量PCR(Real-Time PCR)直方2為野生型和突變體S29的RT-PCR電泳圖譜圖3為野生型和突變體S29的Southern分析結果電泳圖譜圖4為野生型和突變體S29的Northern分析結果電泳圖譜圖5a為野生型和突變體S29的離體葉片照片圖5b為野生型和突變體S29在MS+2.5％甘油培養基中的照片圖5c為野生型和突變體S29盆栽正常條件下的照片圖5d為野生型和突變體S29盆栽干旱條件下的照片具體實施方式
實施例1、ADT的克隆把60個篩選后T-DNA插入的擬南芥突變體(有的為雜合體，有的為純合體)和哥倫比亞野生型種子經過消毒，4℃春化三天后播種于土壤(營養土與跖石以1∶1比例混合均勻)中。在溫度22℃、光照強度120umol/m2/s(光暗周期16h/8h)、相對濕度保持在60％-70％(幼苗時期保持80-90％的相對濕度)的條件下培養，期間一直用PEG+B5營養液澆，四周后觀察表型。結果發現，突變體S29和野生型相比，表現為抗旱。把突變體S29相對應的基因進一步驗證(Real-Time PCR、RT-PCR、Southern、Northern、表型觀察)，最后命名為ADT。
實施例2、ADT的表達分析一熒光實時定量PCR(Real-Time PCR)實施例中所用的擬南芥材料是在培養基MS+0，MS+3.0％PEG，MS+3.5％PEG，MS+4.0％PEG上生長四周的幼苗各100-200mg(PEG-6000作為滲透脅迫劑，可人為造成干旱環境)(Plant Physiol，1973)，用Plant RNeasy試劑盒(QIAGEN)提取總RNA，經1％瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性。使用TaqMan Reverse TranscriptionRegents試劑盒(Applied Biosystems)進行反轉錄，所得到cDNA樣品分別稀釋為1，0.5，和0.1ng/μl三個濃度梯度，各取一微升樣品進行檢測，在實驗中每個濃度設三次重復。基因特異引物的設計使用PRIMEREXPRESS軟件(Applied Biosystems)。PCR反應及其檢測分別使用SYBR Green Master mix和ABI 7900序列檢測系統(Applied Biosystems)。數據的處理采用Comparative CT方法(User Bulletin #2，ABI PRISM 7700序列檢測系統)。以18S rRNA作為內對照對數據進行歸一化。
結果如圖1所示，從圖中可以看出，隨著PEG濃度增高，ADT的表達逐漸降低，和對照相比分別降低2.52倍、9.81倍、22.07倍和43.44倍，說明ADT是一種抑制基因。
實施例3、ADT和突變體的RT-PCR1)突變體S29的制備按照常規方法，通過T-DNA插入野生型擬南芥ADT基因后，得到的純合突變體擬南芥的名稱為S29。
2)野生型和突變體S29的RT-PCR以野生型擬南芥和突變體S29擬南芥兩個品種在MS培養基生長四周的幼苗各100-200mg為材料，如實施例1分別提取擬南芥的總RNA。經1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性。ss cDNA(single strand cDNA，單鏈cDNA)的合成按照SMARTTMPCR cDNA Library Construction Kit(CLONTECH)的方法，合成單鏈(single strand)cDNA。
將合成的單鏈cDNA稀釋10倍，作為以下PCR反應的模板20μl體系，內含10×PCR緩沖液2μl，2.5mM dNTP mix 1.6μl，5μM的引物1和引物2各1.0μl，TAQ酶(15U/μl)0.1μl。在PE9600或9700或MJ PCR儀上擴增94℃預變性3min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，共計34個循環；72℃延伸10min，將獲得的PCR產物，作1％瓊脂糖凝膠電泳。引物15’acc-cta-ttc-ttc-ata-tcg-ttc-c3’，引物25’agg-gtt-aca-tat-cgc-cga-gac 3’。結果如圖2所示，表明ADT基因在野生型中表達，大小為496bp，而突變體S29中不表達，圖2中，“+”表示加反轉錄酶，“-”表示不加反轉錄酶。
實施例4、野生型和突變體S29的Southern分析結果野生型擬南芥和突變體S29擬南芥基因組DNA的提取按Paterson et al(1993)的方法進行。取1μg基因組DNA，分別用BamHI和HindIII(Takara產品)酶切。酶切產物經0.7％瓊脂糖凝膠電泳(30-50V，O/N)分離，然后用常規方法在搖床上處理電泳膠經0.125N HCl浸洗15min，變性液(1.5M NaCl，0.5N NaOH)浸洗30min，中和液(1.5M NaCl，0.5M Tris-HCl pH 7.2)浸洗30min。最后用20×SSC將DNA印跡到HybondN+尼龍膜上。
預雜交、雜交均按常規方法進行(金冬燕等，1996；Hybond N+mannual，Amersham)。
探針及其標記雜交探針為NPTII，其中引物15’ggg-cgc-ccg-gtt-ctt-ttt-g 3’，引物25’aca-ccc-agc-cgg-cca-cag-tcg，3’。用Promega公司的Primer-a-Gene試劑盒進行標記過夜。雜交前用Qiagen公司的PCR純化試劑盒進行探針純化。
洗膜用高嚴緊方法進行(Hybond N+mannual，Amersham)2×SSC，0.1％SDS，15min；1×SSC，0.1％SDS，65℃，15min；2×SSC，0.1％SDS，65℃，15min。
保鮮膜包裹雜交膜，-70℃下對X光片曝光。
結果如圖3所示，從圖中可以看出，該基因在BamHI的酶切泳道中雜交到一條約20kb帶；在HindIII的酶切泳道中雜交到一條約3.3kb帶；可以確定，T-DNA是以單拷貝的形式插入基因組的ADT基因后形成的突變體S29。
實施例5、野生型擬南芥和突變體S29擬南芥的Northern分析結果實施例中所用的擬南芥材料是在培養基MS+0，MS+3％PEG，MS+3.5％PEG(PEG-6000作為滲透脅迫劑，可人為造成干旱環境)中，生長四周的幼苗各100-200mg，用PlantRNeasy試劑盒(QIAGEN)提取總RNA，經1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性后，用紫外分光光度計和電泳方法相結合作精確定量。調整各樣品上樣量均為20μg，然后進行1.2％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳。
甲醛變性膠的制作1.2％FA凝膠150ml是由1.5g瓊脂糖加15ml10×FA凝膠緩沖液配置，在微波爐中熔化后，65℃水浴中冷卻，再加2.7ml 37％的甲醛原液制成的。電泳前須在1×FA緩沖液中平衡至少30min。1×FA緩沖液600ml的配方為50ml 10×FA緩沖液、10ml 37％甲醛原液和440ml DEPC處理的SDW。上樣時，每4份RNA樣品加1份5×RNA上樣緩沖液，混勻后65℃水浴中加熱3-5min，冰浴冷卻。5×RNA上樣緩沖液10ml，內含16μl飽和溴酚藍溶液、80μl 500mM EDTA pH8.0、720μl 37％甲醛原液、2ml甘油、3084μl甲酰胺和4ml10×FA緩沖液。
電泳結束后，切下分子標記泳道用EB染色，旁邊放一熒光尺精確指示位置。樣品部分的膠用DEPC處理的SDW搖床上浸洗30min，再用DEPC處理的10×SSC浸洗30min。然后將RNA用DEPC處理的20×SSC轉至Hybond N+膜上，膜經預雜交，放射性探針雜交，高嚴緊性洗膜后，于-70℃下對X光片曝光。
探針為RD29A基因，該基因為脅迫基因，比如在干旱、高鹽、寒冷等環境的脅迫下產生(Plant Journal，2003)。結果如圖4所示，表明沒有PEG脅迫的對照中，植株野生型擬南芥和突變體S29擬南芥中RD29A基因表達很少；3.0％PEG脅迫后，二者都表達但差異不明顯；3.5％PEG脅迫后，突變體S29擬南芥中RD29A基因的表達量明顯高于野生型。
實施例6、野生型擬南芥和突變體S29擬南芥的表型觀察結果a、野生型擬南芥和突變體S29擬南芥離體葉片的觀察結果離體葉片失水率與抗旱性是有關的。葉片失水率可作為植物抗旱鑒定快速、易行、簡便的生理指標(趙微平1993，劉學義1995)。在失水率與抗旱性的研究中，發現第6h是失水率轉折的關鍵時間，6h以前抗旱類型的失水率低于敏感類型，以后抗旱類型高于敏感類型，而且在不同抗旱類型或同一類型的不同生育時期所測結果均符合這個規律。結果如圖5a所示，表明突變體S29擬南芥的抗旱性高于野生型。
b、野生型擬南芥和突變體S29擬南芥在MS+2.5％甘油培養基上的觀察結果野生型擬南芥和突變體S29擬南芥種子在MS培養基上萌發并長成四葉期幼苗后，轉移到MS+2.5％甘油培養基上(甘油可造成干旱環境)(Plant Physiol，2003)。結果如圖5b所示，表明野生型擬南芥植株已經死亡，突變體S29擬南芥植株由于抗旱而正常生長。
c、野生型擬南芥和突變體S29擬南芥盆栽正常條件下的觀察結果在正常條件下，抗旱品種和不抗旱品種比較，抗旱品種表現為晚花，生活周期長。結果如圖5c所示，表明野生型擬南芥植株早已開花結子趨于死亡，突變體S29擬南芥植株由于抗旱而正常生長，和培養基上處理結果吻合。
d、野生型擬南芥和突變體S29擬南芥盆栽干旱條件下的觀察結果結果如圖5d所示，表明盆栽干旱試驗的結果與植株離體葉片失水率、盆栽正常條件下的測定結果趨勢完全相符。突變體S29擬南芥因失水率低、保水力強而葉片萎蔫出現得晚，受害輕。
序列表<160>2<210>1<211>1164<212>DNA<213>擬南芥(Columbia)<400>1atgaaatcac ggcgacagaa tgtgtccgtg gctcgacaaa ccatccttgg acgcgacgaa 60aactttgaac caatcccaat tgatctcgtt atcgagatat tctcaaggtc gcctgtgaag 120tctatagcaa gatgtcgttg cgtatcaaag ctttgggcct ccatactccg cctaccctat 180ttcacggagt tgtacttgac caaatcttgt gctcgcccga ggctcttgtt cgcctgccaa 240aaacacagag agttgttctt cttctcgaca cctcagcctc ataatcctaa tgagagctcg 300tctcctttag ctgccagttt tcatatgaaa attccctttg atggtcgctt taatattatc 360agtcctatcg gtggccttgt ctttgttaga tatgaacaga tcttaaaggg aaggaaaact 420ccagaatttg tctcggcgat atgtaaccct agcacgggac aatccttaac cttaccaaaa 480cctaagacaa ggaagaggat ttggggtaca agccattttg ggtatgatcc tattgagaaa 540caattcaagg tattgtcaat gaatataggt gatggggtct ataaagagca ttatgttctg 600acattaggaa ctgagaacct ctcttggaga aggatcgaat gttctatacc ccatgttcat 660ggttctaaag ggatatgcat caatggtgtt ttgtattatc gagcaaaggc tgacatgttt 720tcaggtactt taatgatagt ttgctttgat gttaggtttg agaagttcag ctatattaaa 780atcttgaaac ctacaacaac tctgattagc tacaacggta aattggcttc actagtgtgg 840gaagggccta gttatatttg tggaaaacgt tttgaaatgt gggttttagg agaccccgaa 900aaacatgaat ggttgaagca tacttacgaa ttgcgtcctc ggtggcagaa tgtacttgga 960gaggacttgt taatttttgc tggaatgact ggtacaaatg aaattgtgtt gtcgccaaag1020tatccatctc accctttcta tgttttctac tacaatttgg agaggaatac tatcagaaga1080gttgaaatcc aaggaatggg agcgtttaag gttaatgaag attacatctt tctagaccat1140gtagaggatg tgaagcttat ataa 1164<210>1<211>387<212>PRT<213>擬南芥(Columbia)
<400>1Met Lys Ser Arg Arg Gln Asn Val Ser Val Ala Arg Gln Thr Ile1 5 10 15Leu Gly Arg Asp Glu Asn Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Leu Val20 25 30Ile Glu Ile Phe Ser Arg Ser Pro Val Lys Ser Ile Ala Arg Cys35 40 45Arg Cys Val Ser Lys Leu Trp Ala Ser Ile Leu Arg Leu Pro Tyr50 55 60Phe Thr Glu Leu Tyr Leu Thr Lys Ser Cys Ala Arg Pro Arg Leu65 70 75Leu Phe Ala Cys Gln Lys His Arg Glu Leu Phe Phe Phe Ser Thr80 85 90Pro Gln Pro His Asn Pro Asn Glu Ser Ser Ser Pro Leu Ala Ala95 100 105Ser Phe His Met Lys Ile Pro Phe Asp Gly Arg Phe Asn Ile Ile110 115 120Ser Pro Ile Gly Gly Leu Val Phe Val Arg Tyr Glu Gln Ile Leu125 130 135Lys Gly Arg Lys Thr Pro Glu Phe Val Ser Ala Ile Cys Asn Pro140 145 150Ser Thr Gly Gln Ser Leu Thr Leu Pro Lys Pro Lys Thr Arg Lys155 160 165Arg Ile Trp Gly Thr Ser His Phe Gly Tyr Asp Pro Ile Glu Lys170 175 180Gln Phe Lys Val Leu Ser Met Asn Ile Gly Asp Gly Val Tyr Lys185 190 195Glu His Tyr Val Leu Thr Leu Gly Thr Glu Asn Leu Ser Trp Arg200 205 210Arg Ile Glu Cys Ser Ile Pro His Val His Gly Ser Lys Gly Ile215 220 225Cys Ile Asn Gly Val Leu Tyr Tyr Arg Ala Lys Ala Asp Met Phe
230 235 240Ser Gly Thr Leu Met Ile Val Cys Phe Asp Val Arg Phe Glu Lys245 250 255Phe Ser Tyr Ile Lys Ile Leu Lys Pro Thr Thr Thr Leu Ile Ser260 265 270Tyr Asn Gly Lys Leu Ala Ser Leu Val Trp Glu Gly Pro Ser Tyr275 280 285Ile Cys Gly Lys Arg Phe Glu Met Trp Val Leu Gly Asp Pro Glu290 295 300Lys His Glu Trp Leu Lys His Thr Tyr Glu Leu Arg Pro Arg Trp305 310 315Gln Asn Val Leu Gly Glu Asp Leu Leu Ile Phe Ala Gly Met Thr320 325 330Gly Thr Asn Glu Ile Val Leu Ser Pro Lys Tyr Pro Ser His Pro335 340 345Phe Tyr Val Phe Tyr Tyr Asn Leu Glu Arg Asn Thr Ile Arg Arg350 355 360Val Glu Ile Gln Gly Met Gly Ala Phe Lys Val Asn Glu Asp Tyr365 370 375Ile Phe Leu Asp His Val Glu Asp Val Lys Leu Ile380 385 38權利要求
1.一種擬南芥抗旱相關基因ADT，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
2.根據權利要求1所述的基因，其特征在于所述擬南芥抗旱相關基因ADT是序列表中SEQ ID №1。
3.擬南芥抗旱相關基因ADT編碼蛋白ADT，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質。
4.根據權利要求3所述的蛋白質，其特征在于所述擬南芥抗旱相關基因ADT編碼蛋白ADT是序列表中SEQ ID №2。
5.含有權利要求1所述基因的表達載體。
6.含有權利要求1所述基因的細胞系。
7.權利要求1所述基因在培育抗旱植物品種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種擬南芥抗旱相關基因及其編碼蛋白與應用。本發明所提供的擬南芥抗旱相關基因ADT，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID№1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。本發明所提供的擬南芥抗旱相關基因ADT編碼蛋白ADT，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質。本發明的基因可廣泛用于培育抗旱植物品種。
文檔編號C07K14/415GK1597949SQ03157198
公開日2005年3月23日 申請日期2003年9月18日 優先權日2003年9月18日
發明者張玉娥, 薛勇彪, 董麗, 王蕾, 武維華 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所