專利名稱：針對sars冠狀病毒n蛋白抗原的抗體及其在sars冠狀病毒或者其抗原檢測中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及針對SARS冠狀病毒核衣殼蛋白-N蛋白(nucleocapsid protein)的抗體，利用該抗體檢測樣品中SARS冠狀病毒或者其抗原的存在情況的方法。本發明還涉及用于這些方法的試劑盒以及相應的產品。
背景技術：
重度急性呼吸綜合癥(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)是一種急性致死性病毒性感染性疾病。從首例感染在中國廣東省報道，僅只數月的時間即流行感染到世界上32個國家。至2003年6月11日為止，世界上有8400受染者，789例死亡(WHO統計結果)。由于其快速傳播、高死亡率和無有效治療方法，使其成為威脅全球的病毒性感染的疾病。這種疾病的傳染性強，嚴重影響患者的身體健康，并且有較高的致死率。
有確切的證據表明，SARS是由以前不知的、暫時命名為SARS冠狀病毒(SARS coronavirus，SARS-CoV)的病毒所引起的。從若干個(大約35個)SARS-CoV遺傳基因序列分析，以及與其它已知冠狀病毒對比的結果，SARS-CoV是一29.7kb的正鏈RNA基因組，具有系統發生性和可變性。其基因表達具有非常復雜的轉錄、翻譯和翻譯后修飾機制，其分子機理有待進一步闡明。
目前已經有的臨床SARS-CoV檢測試劑有對血清抗體檢測的酶聯免疫方法和對病毒遺傳物質檢測的RT-PCR方法。由于感染后抗體產生需要1-3周的窗口期，而從感染到發病的潛伏期在SARS感染時很短(一般一周之內)，所以抗體檢測對早期診斷沒有意義。加之目前的抗體檢測具有較高的假陽性率，特異性無法滿足需要。RT-PCR的方法技術要求高，操作時間長，標本需要特殊處理及相應的設備，也有其不足之處。因而目前上述兩種方法均未被WHO和美國CDC接受為SARS診斷的指標。現有技術中特別需要一種能在感染早期快速且靈敏地進行檢測的方法。特異性的抗原診斷方法，尤其是快速、敏感、特異的SARS-CoV抗原診斷方法在SARS診斷中具有無可取代的意義。目前世界上尚沒有關于SARS抗原診斷性試劑的報道。也未見以N抗原作為檢測抗原的報道。
本發明提供了可在感染早期測定患者樣品中的SARS抗原而診斷SARS的方法，從而滿足了現有技術中的這一需求。
發明內容
本發明一方面提供了針對SARS冠狀病毒N蛋白抗原的抗體。
本發明另一方面提供了利用所述抗體檢測樣品中SARS冠狀病毒或其抗原的存在情況或進行定量的方法。
在又一個方面，本發明提供了適用于上述方法的試劑盒。
圖1顯示了本發明的試紙條測試方法對各稀釋度的SARS冠狀病毒裂解液和重組N蛋白的檢測結果。其中山羊抗SARS-N蛋白多克隆抗體(4mg/ml)作為俘獲抗體，分別抗C端和N端的單克隆抗體(#1和#10)作為膠體金綴合抗體組合使用，羊抗鼠IgG作為陽性對照。
具體實施例方式
SARS-CoV(SARS coronavirus)的核衣殼蛋白核酸序列全長共有1269個堿基(base)，示于SEQ ID NO1中。蛋白質序列全長共有422個氨基酸，示于SEQ ID NO26。對其抗原特異性進行分析，將SARS病毒N蛋白的RNA序列(genbank locusAY307165，1269bp，RNA linear VRL 09-Jun-2003；definitionSARS coronavirusnucleocapsid protein(NP)gene，complete cds.；AccessionAY307165；VersionAY307165.1，GI31540948；Protein_IDAAP49024.1)與GenBank+EMBL+DDBJ+PDB中登記的所有已知的共1,878,949個核酸序列、8,890,866,776個堿基(base)進行對比分析，發現該蛋白質的核酸序列不與任何已知的核酸序列重復。在與所有已知的蛋白序列進行對比分析時，發現SARS N蛋白僅與鼠肝炎冠狀病毒的N蛋白在氨基酸序列位點40-175之間有35.7％的序列相同，在序列位點252-361之間有27.3％的序列相同。進一步地，在對已知的35種SARS病毒核酸序列進行比較后發現，N蛋白在所有病毒分離株中幾乎完全相同。
而且，有數據表明，N蛋白在表達過程具有兩種分子量(分子大小)，都可以與抗N蛋白的單克隆抗體反應。其中較短的N蛋白是與病毒的組成有關，較長的分子存在于細胞漿內，不參與病毒的組裝，稱為剩余N蛋白。二者在病毒感染的細胞內的表達量幾乎相同。在對病毒裂解液進行Westerm Blot分析中，長和短型N蛋白表達量是棘突蛋白(Spike protein，S蛋白)和膜蛋白(M蛋白)表達量的25-50倍。以上現象使N蛋白有可能作為比較有利的病毒抗原免疫檢測對象。不僅由于其在病毒組成中所占的蛋白含量高，易于檢出；同時由于病毒感染細胞中含有較高的不參與病毒組裝的剩余N蛋白的表達，有可能在病毒株釋放的過程中，或在被感染細胞死亡過程中，此型的N蛋白會隨之釋放到細胞外，進入體液及血液，作為檢測病毒感染及復制的免疫學指標。
本發明出乎意料地發現，針對SARS冠狀病毒N蛋白的特異性抗體可以用于測定樣品中SARS冠狀病毒或其相應抗原的存在情況或者含量，并可達到很高的靈敏度和穩定性。
在本發明中，除了可使用具有具體公開序列的N蛋白作為抗原產生本發明的抗體之外，還可以采用其變體或融合多肽或免疫原性片段來產生。
在本發明的上下文中，SARS冠狀病毒N蛋白的“免疫原性部分”是指在接種到個體體內后能夠引起免疫應答、并且同樣能夠與針對SARS冠狀病毒N蛋白產生的抗體結合的部分。因此，此處所述的蛋白質免疫原性部分可用抗體結合試驗鑒定。這些試驗通常可用本領域普通技術人員已知的多種方法中的任何一種進行，例如，在Harlow和Lane，《抗體實驗室手冊》(冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1988)中所述的方法。例如，可利用所述蛋白來產生單克隆和多克隆抗體，以用于檢測SARS患者或疑似患者血液或其它樣品中該蛋白的存在情況。
此處所用的多肽“變體”是與所述多肽區別僅在于保守性替代和/或修飾、而仍保留了多肽的免疫原性的多肽。多肽變體與已鑒定的多肽優選有至少約80％、更優選至少約90％、最優選至少約95％同一性。對于有免疫活性的N蛋白，其變體可通過例如修飾上述多肽之一的氨基酸序列并評估此修飾多肽的免疫活性而得以鑒定。
此處所用的“保守性替代”是指某一氨基酸被另一具相似特性的氨基酸所替代，肽化學領域內的技術人員可預知此多肽的二級結構和親水特性并未實質性改變。通常說來，下述氨基酸組代表了保守性改變(1)丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸；(2)半胱氨酸、絲氨酸、酪氨酸、蘇氨酸；(3)纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸；(4)賴氨酸、精氨酸、組氨酸；和(5)苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、組氨酸。
變體可同時或只包含其它的修飾，包括刪除或添加對該多肽抗原性、二級結構和親水特性影響微小的氨基酸。例如，可將信號(或前導)序列在蛋白質的氨基末端與多肽綴合，該序列可以與蛋白質一起翻譯，并在翻譯后指導蛋白質的轉移。多肽也可與接頭或其它序列綴合，以易于多肽合成、純化或鑒定(如多聚組氨酸)、或者增強多肽與固相支持物的結合。例如，可以將多肽與免疫球蛋白的FC區綴合。
此處所用的“多肽”還包括組合或融合多肽。“組合多肽”是含有至少一個上述免疫原性部分及一種或多種額外的免疫原性的SARS抗原性多肽，它們通過肽鍵連接成一條氨基酸單鏈。這些序列可直接連接在一起(即無插入的氨基酸)，或可通過不會明顯削弱多肽組分免疫原性的連接序列(如Gly-Cys-Gly)連接在一起。
可用本領域熟知的多種方法中的任一種獲得本發明的SARS蛋白和編碼此類蛋白質的DNA分子。相當于編碼本發明SARS病毒N蛋白之一的基因(或其一部分)的DNA序列可通過對經逆轉錄的SARS病毒RNA進行測序并與已知的SARS病毒核酸序列進行比對后得到。這樣得到的部分DNA序列可用于設計寡核苷酸引物，以在RT-PCR中擴增全長DNA序列，所用技術在本領域是眾所周知的(可見如Mullis等人，Cold Spring Harber Symp.Quant.Biol.，51263，1987；Erlich編，PCR技術，Stockton Press，紐約，1989)。一旦獲得了編碼多肽的DNA序列，即可用標準的誘變技術，如Adelman等(DNA，2183，1983)中所教導的寡核苷酸介導的定點誘變，輕易地引入上述任何一種修飾。本發明的序列也可以直接合成。
還可用合成或重組方式產生本文公開的SARS冠狀病毒N蛋白或者其免疫原性部分。少于約100個氨基酸及通常少于約50個氨基酸的合成多肽可用本領域普通技術人員熟知的技術制備。例如，這類多肽可用任何可供利用的固相技術合成，如Merrifield固相合成方法，其中氨基酸被依次加到正在延長的氨基酸鏈上(可見于如，Merrifield，美國化學學會雜志(J.Am.Chem.Soc.852149-2146，1963)。多肽自動合成儀可購自如Perkin Elmer/應用生物系統分部(Foster城，CA)等廠家，并可按制造商的指示進行操作。
任何上述多肽均可重組產生，即將編碼多肽的DNA序列插入表達載體中，并在適當的宿主中表達蛋白質。本領域普通技術人員所知的種種表達載體中的任一種均可用來表達本發明的重組多肽。在轉化或轉染了含有重組多肽編碼DNA分子之表達載體的任何適當宿主細胞中均可進行表達。合適的宿主細胞包括原核細胞、酵母和高等真核細胞。優選所用的宿主細胞是大腸桿菌、酵母或哺乳類細胞系，如CHO細胞。以此方式表達的DNA序列可編碼天然存在的多肽、天然存在多肽的部分，或它們的其它變體。
可通過本領域已知的多種方法，利用本發明的SARS冠狀病毒N蛋白或其變體或者免疫原性部分來制備其特異性抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體。本發明的抗體也可以是單鏈的、嵌合的、移植CDR的或人源化的。這樣的抗體可由本領域技術人員已知的眾多技術制備。參閱，如Harlow和Lane，《抗體實驗室手冊》，冷泉港實驗室，1988。在一種此類技術中，首先將含抗原性多肽的免疫原注射入多種哺乳動物(如兔、綿羊、馬、驢和山羊等)的任一種中或者雞中。在這一步中，本發明的多肽不需修飾即可作為免疫原。或者，特別是對于相對短的多肽而言，可將多肽與載體蛋白(如牛血清白蛋白或匙孔蟲戚血藍蛋白)連接在一起，以激發更強的免疫應答。將免疫原注射入動物宿主，優選根據預定的時間表，再注射一次或多次加強免疫，并定時對動物取血。對多肽特異的多克隆抗體可以從抗血清中，通過例如利用了偶聯至合適固相支持物上的多肽的親和層析法純化得到。
不同于在實驗動物和家畜中制備多克隆抗體的常規方法，可以利用已知的雜交瘤細胞培養技術制備抗N蛋白的單克隆抗體。一般來講，這一方法包括制備產生抗體的融合細胞系，如將原代脾細胞與相容的骨髓瘤連續培養細胞系融合，通過細胞大量培養技術或轉入骨髓瘤細胞來源動物或兼容動物品系中培養，使融合細胞生長。與免疫動物產生的抗體相比，此種抗體有較多優勢，例如它們有很好的特異性、敏感性、在免疫化學上相比單純。這些抗體的免疫活性片段也屬于本發明的范圍之內，如部分人源化的單克隆抗體F(ab)片段。
嵌合和修飾抗體嵌合抗體包括從一個免疫球蛋白來源的可變區與另一個免疫球蛋白來源的不變區之間的融合。可變區通常來源于另一個種的免疫球蛋白，也許是人。這一技術在本領域所通曉。例如歐洲專利申請EP-A-0125，023(Cabilly/Genetech)和EP-A-0120,694以及美國專利NO4,816,567。這些專利揭示了用重組DNA方法制備免疫球蛋白類分子變異體。
另一種制備嵌合或修飾抗體的途徑是將單克隆抗體的免疫區與另一個非免疫球蛋白分子連接，產生嵌合分子衍生物(參見WO86/01533，(Veuberger and Rabbits/Celltech)。另一種方法是制備一個嵌合免疫球蛋白，使其在不同的可變區具有不同的特異性(參見EP68763)，還有一種方法是向編碼單克隆抗體的DNA中引入一個突變，在不改變其基本特異性的情況改變它的某些性質，這個方面可以通過定點突變和其它在本領域內所通曉的技術完成。
利用重組DNA技術，Winter專利申請EP-A-0239400揭示了另一種制備抗體衍生物的方法，用另一種特異性免疫球蛋白的補體決定區替代一種免疫球蛋白可變區的補體決定區(CDRs)。這樣，與讀框區域的改變相結合，CDR移植技術可以使抗體人源化。
制備人抗體也可以在缺乏其天然免疫系統的小鼠體內重建人類的免疫系統，然后免疫小鼠以產生對抗原特異的人類抗體。
操作或改變任何已知抗體或編碼抗體的基因，產生衍生抗體的技術，為本領域所通曉。
特異于目的抗原性多肽的單克隆抗體，舉例而言，可以用Kohler和Milstein，歐洲免疫學雜志，6511-519，1976的技術和改進方法制備。簡單的說，這些方法涉及制備能產生具有所需特異性(也就是與目的多肽的反應性)的抗體的永久細胞系。這種細胞系，可以由例如上述免疫動物的脾臟細胞獲取。接著將脾臟細胞永生化，例如通過與骨髓瘤細胞融合伙伴、最好是與免疫動物同系的骨髓瘤細胞融合伙伴融合。可以采用多種融合技術。例如，將脾臟細胞和骨髓瘤細胞與非離子型表面活性劑混合幾分鐘，然后以低密度平鋪在能夠支持雜合細胞生長而不能支持骨髓瘤細胞生長的選擇性培養基上。優選的選擇技術中利用了HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤、胸苷)篩選。經過足夠時間，通常大約1到2周后，就可觀察到雜合體集落。挑取單個集落，檢測其與多肽的結合活性。優選具有高反應活性和特異性的雜交瘤。
單克隆抗體可以從正在生長的雜交瘤集落上清液中分離得到。此外，可采用多種技術提高產量，例如將雜交瘤細胞系注射到合適的脊椎動物宿主如小鼠的腹腔中，然后可從腹水或血液中收獲單克隆抗體。抗體中的污染物可以用常規技術除去，如層析法、凝膠過濾、沉淀和抽提。本發明的多肽可在純化過程中用于例如親和層析步驟。
本領域常規技術人員已知多種使用抗體檢測樣品中的多肽標記的測定方式。見例如，Harlow和Lane，《抗體實驗室手冊》，冷泉港實驗室，1988。在一優選實施方案中，測定包括使用固定在固相支持物上的抗體來結合N蛋白抗原并將其與樣品的其余部分分開。結合的N蛋白-抗體復合物隨后可用含報告基團的第二抗體檢測。或者，可利用競爭性分析，其中多肽被報告基團所標記，并在樣品與抗體共同保溫后使其結合到固定化的抗體上。樣品中組分抑制標記多肽與抗體結合的程度預示了樣品與固定化的抗體的反應活性。
固相支持物可以是本領域普通技術人員所已知的、抗體可附著于其上的物質。例如，固相支持物可以是微量滴定板上的檢驗孔或硝酸纖維素膜或其它合適的膜。或者，支持物可以是珠子或盤，諸如玻璃、纖維玻璃、乳膠、膠體金或塑料材料，如聚苯乙烯或聚氯乙烯。支持物也可以是磁性顆粒或纖維光學傳感器，例如公開于美國專利號5,359,681中的那些材料。抗體可用本領域技術人員已知的多種技術固定在固相支持物上，這些技術在專利和科學文獻中有充分的描述。在本發明的上下文中，“固定化”一詞指非共價結合(如吸附)，及共價結合(可為抗體與支持物上官能團間的直接連接，或通過交聯試劑的連接)。通過吸附到微量滴定板的孔上或膜上而固定化的方法是優選的。在這類情形中，可通過在適合的緩沖液中，使抗體與固相支持物接觸一段合適的時間而完成吸附。接觸時間隨溫度而變化，但通常是在約1小時到1天之間。一般說來，將塑料微量滴定板(如聚苯乙烯或聚氯乙烯)小孔與約10ng-10μg、優選約100ng-1μg的抗體接觸，足以固定適當量的結合劑。
一般可通過將雙功能試劑與支持物首先反應來完成抗體與固相支持物的共價附著，所述雙功能劑可與支持物及結合劑上的官能團(如羥基或氨基)二者反應。例如，利用苯醌，或通過在固相支持物上的醛基與抗體上的胺基和活性氫之間發生縮合，可以將抗體與具有適當聚合物包被的支持物共價連接起來。[參閱Pierce ImmunotechndogyCatalog and Handbook，1991，于A12-A13]。
在某些實施方案中，可通過雙抗體夾心分析對樣品中的SARS冠狀病毒或者其相應抗原的存在情況或者含量進行測定。首先將固定在固相支持物(常為微量滴定板的孔)上的抗體與樣品接觸，以使樣品中的多肽結合到固定化的抗體上，從而完成這一分析。隨后將未結合的樣品從固定化多肽-抗體復合體中去除，并加入能結合多肽上另一位點的第二抗體(含一報道基團)。然后用適于特定報告基團的方法測定依然結合于固相支持物上的第二抗體的量。
更具體地說，一旦抗體如上所述被固定于支持物上，通常封閉支持物上殘余的蛋白質結合位點。許多適合的封閉劑對本領域普通技術人員是已知的，如小牛血清白蛋白或吐溫20TM(Sigma化學公司，圣路易斯，MO)。然后將固定化抗體與樣品共同保溫，使多肽與抗體結合。溫育前可用合適的稀釋液稀釋樣品，如磷酸鹽緩沖液(PBS)。一般說來，合適的接觸時間(即保溫時間)是足以確定樣品中SARS冠狀病毒N蛋白存在情況的時間。優選的接觸時間是足以使結合水平達到結合和未結合多肽平衡時結合水平的至少95％的時間。本領域普通技術人員會認識到，通過一段時間內的結合水平，可以很方便地測定達到平衡所必需的時間。室溫時，大約30分鐘的保溫時間通常就足夠了。
然后，可用適合的緩沖液(如含0.1％吐溫20TM的PBS)清洗固相支持物而去除未結合樣品。含報告基團的第二抗體可隨后加到固相支持物上。優選的報告基團包括酶(如辣根過氧化物酶)、底物、輔助因子、抑制劑、染料、放射性核素、發光基團、熒光基團和生物素。抗體與報告基團的綴合可用本領域普通技術人員所知的標準方法完成。
然后將第二抗體與固定化的抗體-多肽復合體溫育足夠長時間，以檢測相關多肽。通常根據試驗一段時間后的結合水平來確定適當的溫育時間。接著除去未結合的第二抗體，并通過報告基團檢測結合的第二抗體。檢測報告基團的方法取決于報告基團的性質。對于放射性基團，閃爍計數法或放射自顯影方法通常是可行的。光譜法可用來檢測染料、發光基團和熒光基團。生物素可用偶聯了其它報告基團(通常是放射性或熒光基團或酶)的抗生物素蛋白來檢測。通常通過加入底物(一般持續特定時間)、再用光譜法或其它方法分析反應產物而對酶報告基團進行檢測。
為了確定樣品中SARS冠狀病毒或者其相應抗原的存在情況或者含量，通常將測得的仍結合于固相支持物的報告基團的信號與標準曲線進行比較。在一個優選的實例中，標準曲線是通過將固定化的抗體與系列稀釋的SARS冠狀病毒裂解液或者相應抗原一起溫育，并將檢測到的信號與病毒裂解液或抗原滴度/濃度進行作圖而得到的。
在一個相關實例中，可以流通形式進行該分析。其中抗體被固定在膜，如硝酸纖維素上。在試驗過程中，當樣品流經膜時，樣品中的多肽即與固定化的抗體相結合。然后，當含有第二抗體的溶液流經膜時，標記的第二抗體即與抗體-多肽復合體相結合。結合的第二抗體的檢測可依上述方法進行。
在另一個相關實例中，可以試紙條試驗形式進行該分析。其中，將結合了抗體的膜的一端浸入含樣品的溶液中。樣品沿著膜遷移，經過含第一抗體的區域，至俘獲抗體(第二抗體)的區域。第一抗體在俘獲抗體的區域的集中說明病毒或相應抗原的存在。通常，第一抗體在該位點的集中產生了可見的樣式，如一條線。沒有這種樣式說明是陰性結果。在一個實施方案中，用于試紙條試驗的膜是硝酸纖維素膜，尼龍膜或類似物等。第一抗體可以是多克隆抗體，也可以是一或多種單克隆抗體，或者其組合。第二抗體也可以是多克隆抗體，或者一或多種單克隆抗體，或者其組合。第一抗體和第二抗體的配對使用情況可經配合實驗確定，這在下文中將會更具體描述。第一抗體可以附著在膠體金顆粒、磁性顆粒、微珠等上。優選地是膠體金顆粒，其大小可以是10-100nm，優選20-60nm，尤其是例如40nm。優選地，對檢測樣品進行進一步處理，使其抗原性提高。例如，對樣品進行裂解處理，以暴露其N蛋白抗原。裂解可采用例如0.001-0.2％SDS，優選地0.005-0.15％SDS、更優選0.01-0.1％SDS在室溫處理，或者煮5-10分鐘。在檢測SARS病毒時，還可以在檢測前對病毒進行Vero細胞擴增，然后檢測，這樣對樣品中的SARS冠狀病毒檢測下限能達到更低。通常，固定在膜上的抗體的選用量是，當生物樣品中含有足以能在雙抗體夾心試驗中產生陽性信號的多肽水平時，在上述檢測方式中也能產生可肉眼察覺的樣式。優選地，固定在膜上的抗體量為約25ng-1μg，更優選為約50ng-500ng。這類檢測可對很小量的生物樣品進行。這種快速的SARS免疫檢測試紙條方法具有靈敏、快速、特異、簡便(操作不需要特殊技術和設備)和早期診斷的優點，而且還可減少樣本檢測廢棄物(液)的產生，在疾病的隔離、防污染方面有其它檢測方法不具備的優點。
適用于本發明的抗體可以多種多樣，只要其具有足夠的反應活性、并且對重組N蛋白及天然SARS冠狀病毒裂解物的反應性相當(最好相等)即可。配對抗體的選擇可依常規方法進行，例如普通雙抗體夾心實驗。簡言之，將第一抗體固定在96孔微量滴定板的孔中，加入標準N蛋白抗原與之溫育足夠時間，以便充分結合。然后加入例如經辣根過氧化物酶標記的第二抗體，溫育。洗滌去除未結合的第二抗體之后，用相應標記的底物顯色。選擇出第二抗體能夠結合于其上的組合(即第一抗體和第二抗體之間不會發生拮抗作用)。在一個實施方案中，所述第一抗體和第二抗體都是多克隆抗體。在另一個實施方案中，所述第一抗體是一種單克隆抗體或者兩種以上單克隆抗體的混合物，而所述第二抗體是多克隆抗體。在又一個實施方案中，所述第一抗體和第二抗體是能夠相配合的單克隆抗體。
在本發明的上下文中，“能夠相配合的抗體”是指所述抗體針對的是N蛋白抗原中不同的表位、在與N蛋白抗原的結合中不發生相互干擾或拮抗的抗體組合。
本發明中的抗體配合測試可以例如按照下述方法進行用單株單克隆抗體或多株單克隆抗體的組合作為俘獲抗體(噴在膜上)，用其它的單株單克隆抗體或多株單克隆抗體的組合作為膠體金綴合抗體(gold conjugate)。也可以用多克隆抗體(羊抗SARS-N抗體)作為俘獲抗體(噴在膜上)，單株或多株單克隆抗體作為綴合抗體。用1mg/ml抗IgG噴膜作為對照線。作為標記抗體的用量決定于每一單種抗體本身的特性，以能夠在加入10％v/v的10％氯化鈉后膠體金顆粒不發生凝聚為標準，這可通過系列稀釋度確定。
標記好的抗體的用量可以決定試劑的敏感度，一般以已標記抗體的膠體金的OD(常用的40nm膠體金顆粒在520-530nm波長處的吸光度)和用在金膜(gold pad)上的量有關。生產中將膠體金綴合抗體施加到金膜上有兩種方法，即傳統的浸泡法和改進的噴膜法。前者一般用OD530在1-10之間的懸液通過OD濃度有限度的調節標記抗體的用量；后者一般用OD530＝50的懸液噴膜，但在無法將膠體金綴合抗體復合物濃縮到OD530＝50的懸液的情況下則可采用OD530＜50以下所能濃縮到的最高濃度。其用量是以噴到金膜上的體積來決定的。一般可工作范圍的體積在1-2.5ul/cm之間。在本發明的SARS N蛋白抗原檢測試劑研制中，所有標記抗體均在0.5-3.0ul/cm之間系統測試過，通常在1-2.5ul/cm可以達到相當的敏感度，在2.0-3.0之間達到最好的敏感度。作為俘獲抗體的用量也決定于不同單克隆抗體本身的特性，如抗體的親和力、抗體純度、抗體之間是否有相互累加或拮抗作用等等，多克隆抗體的用量決定于抗體的滴度、提純方法(是否經過親和層析拄提純或只是簡單的免疫學清的IgG級分)等因素。一般抗體用量在0.5mg/ml-5mg/ml之間，優選1mg/ml-3mg/m。最高敏感度要由抗體(俘獲抗體和膠體金綴合抗體)的組合及配合情況而定。
本發明人發現，利用抗SARS冠狀病毒N蛋白的抗體，可以試紙條的方式簡便地測定樣品中SARS病毒的存在情況，并且可達到與迄今已報導的RT-PCR檢測靈敏度(1000pfu/ml)。優選地，所述第一抗體被標記上膠體金。膠體金顆粒的大小可以是例如20-60nm，尤其是40nm。在本發明中，可以使用大小并不均一的膠體金顆粒。可通過常規方法用第一抗體與膠體金綴合。這樣的方法在現有技術中有眾多的科技文獻可供參考，也可見于諸多膠體金顆粒生產廠家例如Arista Biologicals Inc.的網頁。
標記環境的pH值對標記效率有直接的影響。多克隆抗體對膠體金的標記一般在pH7.2-7.5進行。對于單克隆抗體，標記環境pH值一般是比其pI(等電點)偏堿性約0.1-0.5。這可通過測定具體單克隆抗體的pI值來確定。或者，可通過設置pH值梯度，測定單克隆抗體在不同pH值下對膠體金的標記效率、選擇最佳者來確定。標記抗體的用量足夠標記之用即可，不宜過多，否則會增加成本，更為嚴重的是會干擾測定反應。直接的檢測方法是以能夠在加入1/10體積的10％NaCl溶液后室溫靜置10分鐘膠體金顆粒不發生凝聚為標準。選用能達到此程度的最低抗體濃度進行膠體金顆粒的標記。標記好的膠體金顆粒懸液(通常OD530nm的讀數在1.0-10之間)可以通過傳統的直接浸泡法施加到金膜(gold pad)上。或者，可對標記好的膠體金顆粒懸液濃縮，例如2400g-4400g、4℃離心30-60分鐘濃縮成OD530nm的讀數達到50或其最大值的懸液，然后通過改進的噴膜法以0.5-3.0μl/cm、優選1.0-3.0μl/cm、例如1-2.5、2.0-3.0μl/cm的用量噴到金膜上。
作為“俘獲抗體”的第二抗體，其用量取決于抗體本身的性質和純度，以及與第一抗體的配合情況。例如與單克隆抗體的親和力、抗體純度、抗體之間是否有相互累加或拮抗效應等因素有關。作為多克隆抗體，其用量決定于例如抗體的滴度、提純方法等。一般在1mg/ml-5mg/ml之間。可以通過常規方法確定最佳的第一抗體&第二抗體組合和用量。例如，在按照前文所述方法確定了合適的第一抗體與第二抗體組合后，在96孔微量滴定板上用系列稀釋的第一抗體包被相應孔，再與適當濃度的SARS冠狀病毒N蛋白抗原溫育足夠時間。充分結合后，去除溫育液，加入系列稀釋的標記第二抗體溫育。之后顯色。選擇落入ELISA讀數器適合讀取的數值范圍的第一抗體&第二抗體配合用量。在以后的實驗室或臨床檢測中即可采用這樣確定的范圍。通過對系列濃度的標準N蛋白抗原或SARS病毒裂解液讀數，制成標準曲線，本發明的雙抗體夾心檢測法還可以用于對樣品中的N蛋白抗原或SARS病毒含量進行定量測定。
在本發明的方法中，第一抗體和第二抗體無需精制而通過簡單的硫酸銨沉淀和透析后即可使用。當然，毫無疑問，經過例如親和純化的抗體也可用于本發明中。
在本發明的試紙條測定方法中，除了膠體金顆粒之外，還可以使用經第一抗體標記的磁性顆粒、膠乳顆粒等來進行。其中相應顆粒的標記、用量、第二抗體的用量等均可常規地確定。
還可以采用例如毛細管等方法，經本發明公開的雙抗體夾心法檢測樣品中的SARS冠狀病毒或相應的N蛋白抗原。這樣的測定方式均是本領域中已知的，并且有眾多的文獻可供參考。
本發明的測定方法中檢測的是N蛋白抗原，即核衣殼蛋白。在完整的病毒顆粒中是包被在顆粒內部的。因此，若未經裂解，在完整SARS冠狀病毒中是檢測不到的。然而，研究結果表明，病毒感染細胞中含有較高的不參與病毒組裝的剩余N蛋白的表達，有可能在病毒株釋放的過程中，或在被感染細胞死亡過程中隨之釋放到細胞外，進入體液及血管，作為檢測病毒感染及復制的免疫學指標，從而通過本發明的方法直接、簡便、快速地進行檢測。
若是檢測完整病毒的N蛋白抗原，則可簡單地用0.001-0.2％、優選0.005-0.15％、更優選0.01-0.1％、例如0.05％SDS處理樣品，以便裂解病毒顆粒，釋放N蛋白抗原來進行檢測。
在試紙條實驗中，可以簡單地將試紙條浸入樣品或裂解液中來進行檢測。這大大簡化了樣品的處理，節約了時間，在臨床診斷上有重要的意義。
當然，存在大量適合于與本發明抗體一起使用的試驗方法。上述描述只是舉例說明。
在另一個實例中，SARS冠狀病毒N蛋白可作為監控SARS患者病情的標記使用。在這個實例中，上述就SARS診斷所述的測定可隨時間進行，并評估反應性多肽水平的改變情況。舉例而言，可在1個月至1年期間每24-48小時進行一次測定，以后按需要進行。通常，經抗體檢測，多肽水平持續增加，說明患者體內SARS一直在發展。相反，當反應多肽的水平隨時間降低時，SARS不再發展。
本發明的抗體和/或方法，可以用于對適當病人標本進行檢測，作為療效觀察的指標及是否具有傳染性和是否需要隔離的指標。其中一個實施方案是為治療性干預提供監測方案。優選的，在治療過程中周期性監測SARS冠狀病毒N蛋白水平，在治療開始前或治療結束后對SARS冠狀病毒N蛋白水平的周期性測定可能非常有益。
此處所述“患者”是指任何溫血動物，優選是人，患者可以是患病的，或不患有可察覺的疾病。
在本發明的上下文中，“樣品”可以是任何可能含有SARS病毒或其抗原的樣品，包括例如血清、全血、痰液、口腔/鼻咽分泌物或洗液、尿液、糞便、胸腹腔積液、腦脊液和組織標本。
本發明提供了一個對懷疑有SARS病毒污染的生理標本進行檢測的診斷試劑盒。該試劑盒包括(a)本發明的針對SARS冠狀病毒N蛋白的抗體，例如一種或多種單克隆抗體和/或多克隆抗體；(b)任選的樣品處理溶液，例如0.01-0.2％SDS；和(c)使用說明書。本發明的診斷試劑盒中還可含有適當的可檢測標記物(例如辣根過氧化物酶)和相應的標記和檢測試劑。在一個實施方案中，所述試劑盒中包含能夠配合使用的第一抗體和第二抗體。優選地，所述第一抗體與膠體金、磁性顆粒、膠乳等相綴合。
本發明進一步提供了一種檢測或測定樣品中SARS病毒的方法。該方法包括將任選地經過處理(例如利用0.01-0.2％SDS于室溫處理過)的樣品與本發明的抗SARS冠狀病毒N蛋白抗體混合，形成一種包括抗體和抗原的二價復合物，對形成的復合物進行定性檢測和定量測定。該復合體的存在或數量指示了SARS病毒的存在情況或者含量。本發明的抗體包括人或動物的單克隆抗體，多克隆抗體制劑，以及抗體片段或合成抗體。合成抗體包括重組抗體和嵌合抗體，其又包括人源化抗體，抗獨特型抗體及其衍生物。
通過以下實施例對本發明作進一步的說明。這些實施例都是示范性的，并不以任何方式限制本發明。
實施例1、N蛋白基因合成N蛋白核酸序列全長為1269bp，蛋白序列全長共有422個氨基酸。因為SARS病毒為經空氣傳播的嚴重威脅生命的傳染性疾病的病原體，從安全考慮以人工合成為安全和簡單。依據于2003年6月19日在GenBank發表的SARS冠狀病毒核衣殼蛋白(NP)基因完整編碼區核酸序列(LocusAY307165 Protein_id＝“AAP49024.1”合成整個編碼區序列，該序列示于SEQ ID NO1，其推斷的氨基酸序列示于SEQ ID No26。
N蛋白編碼基因合成策略如下1 357911131517195’----- - - - -3’3’----- - - - -5’2 46810 1214161820為完成完整核酸序列的合成，首先合成如下寡核苷酸1)5’atgtctgataatggaccccaatcaaaccaacgtagtgccccccgcattacatttggtggacccacagatt 3’(SEQ ID NO2，對應于SEQ ID NO1中第1-70位核苷酸所示序列)；2)5’ctgttttggccttgccccattgcgtcctccattctggttattgtcagttgaatctgtgggtccaccaaat 3’(SEQ ID NO3，對應于SEQ ID NO1中第51-140位核苷酸所示序列的互補序列)；3)5’ccgaccccaaggtttacccaataatattgcgtcttggttcacagctctcactcagcatggcaaggaggaacttagatt 3’(SEQ ID NO4，對應于SEQ ID NO1中第123-200位核苷酸所示序列)；4)5’tagccaatttggtcatctggaccactattggtgttgattggaacgccctggcctcgagggaatctaagttcctccttgcc 3’(SEQ ID NO5，對應于SEQ ID NO1中第181-260位核苷酸所示序列的互補序列)；
5)5’ccagatgaccaaattggctactaccgaagagctacccgacgagttcgtggtggtgacggcaaaatgaaagagctcagccccag 3’(SEQ ID NO6，對應于SEQ IDNO1中第241-323位核苷酸所示序列)；6)5’ttgttagcgccgtagggaagtgaagcttctgggccagttcctaggtaatagaagtaccatctggggctgagctctttca 3’(SEQ ID NO7，對應于SEQ ID NO1中第305-383位核苷酸所示序列的互補序列)；7)5’ttccctacggcgctaacaaagaaggcatcgtatgggttgcaactgagggagccttgaatacacccaaagaccacattggcac 3’(SEQ ID NO8，對應于SEQ ID NO1中第365-446位核苷酸所示序列)；8)5’tttggcaatgttgttccttgaggaagttgtagcacggtggcagcattgttattaggattgcgggtgccaatgtggtctttgg 3’(SEQ ID NO9，對應于SEQ ID NO1中第428-509位核苷酸所示序列的互補序列)；9)5’tcaaggaacaacattgccaaaaggcttctacgcagagggaagcagaggcggcagtcaa gcctcttctcgctc ctcatcacgtagtcgcg 3’(SEQ ID NO10，對應于SEQID NO1中第488-577位核苷酸所示序列)；10)5’tcgagcaggagaatttcccctactgctgccaggagttgaatttcttgaattaccgcgactacgtgatgagg 3’(SEQ ID NO11，對應于SEQ ID NO1中第560-630位核苷酸所示序列的互補序列)；11)5’ggaaattctcctgctcgaatggctagcggaggtggtgaaactgccctcgcgctattgctgctagacagatt gaaccagcttg 3’(SEQ ID NO12，對應于SEQ IDNO1中第613-694位核苷酸所示序列)；12)5’gatgcctcagcagcagatttcttagtgacagtttggccttgttgttgttggcctttaccagaaactttgctctcaagctggttcaatctgtc 3’(SEQ ID NO13，對應于SEQ ID NO1中第676-767位核苷酸所示序列的互補序列)；13)5’aatctgctgctgaggcatctaaaaagcctcgccaaaaacgtactgccacaaaacagtacaacgtcactcaag catttgggagacgtg 3’(SEQ ID NO14，對應于SEQID NO1中第749-835位核苷酸所示序列)；
14)5’atcagttccttgtctgattaggtcttggtccccgaaatttccttgggtttgttctggaccacgtctcccaaatgcttg 3’(SEQ ID NO15，對應于SEQ ID NO1中第817-894位核苷酸所示序列的互補序列)；15)5’ctaatcagacaaggaactgattacaaacattggccgcaaattgcacaatttgctccaagtgcctctgcattc tttggaatgtca 3’(SEQ ID NO16，對應于SEQ IDNO1中第874-957位核苷酸所示序列)；16)5’taatggctccatgataagtcagccatgttcccgaaggtgtgacttccatgccaatgcgtgacattccaaagaatgcaga 3’(SEQ ID NO17，對應于SEQ ID NO1中第937-1015位核苷酸所示序列的互補序列)；17)5’gacttatcatggagccattaaattggatgacaaagatccacaattcaaagacaacgtcatactgctgaacaa gcacatt 3’(SEQ ID NO18，對應于SEQ ID NO1中第996-1074位核苷酸所示序列)；18)5’gctctgttggtgggaatgttttgtatgcgtcaatgtgcttgttcagcagtat 3’(SEQID NO19，對應于SEQ ID NO1中第1054-1105位核苷酸所示序列的互補序列)；19)5’acattcccaccaacagagcctaaaaaggacaaaaagaaaaagactgatgaagctcagcctttgccgcagagacaaaagaagcagcccactgtgactcttcttcctgcggctg 3’(SEQ IDNO20，對應于SEQ ID NO1中第1087-1198位核苷酸所示序列)；20)5’ttatgcctgagttgaatcagcagaagctccactcatggaattttgaagttgtctggagaaatcatccatgtcagccgcaggaagaagag 3’(SEQ ID NO21，對應于SEQ IDNO1中第1181-1269位核苷酸所示序列的互補序列)。
利用DNA自動合成儀合成上述寡核苷酸，并進行凝膠純化，以20pmol/μl溶于dH2O中。
2)退火，將寡核苷酸1-20各種各2μl(20pmol/μl)溫和混合。在干燥加熱器內加熱到90℃10分鐘，冷卻至室溫大約1小時。
3)延伸按常規PCR向寡核苷酸混合物中加入PCR緩沖液、MgCl2、dNTP和Taq聚合酶，于56℃延伸5分鐘，然后冷卻至4℃。此步驟將填平所有的缺口。
4)連接向經過退火的寡核苷酸混合物中加入足量的T4連接酶(New England Biolabs)、連接酶緩沖液和dH2O，使體積加倍。于16℃連接過夜。
5).PCR使用如下引物，以步驟4)中獲得的連接產物為模板，PCR擴增全長和部分截短的SARS冠狀病毒N蛋白編碼序列引物15’caccatgtctgataatggacccca 3’(SEQ ID NO22)，其中斜體為5’末端添加的核苷酸，其余核苷酸對應于SEQ ID NO1中第1-20位殘基；引物25’tgcctgagttgaatcagcag 3’(SEQ ID NO23)，對應于SEQID NO1中第1247-1266位殘基的互補序列；引物35’gccgtcaccaccacgaact 3’(SEQ ID NO24)，對應于SEQID NO1中第282-300位殘基的互補序列；引物45’caccatggaagtcacaccttcgggaa 3’(SEQ ID NO25)，其中斜體為5’末端添加的核苷酸，其余核苷酸對應于SEQ ID NO1的第970-988位殘基。
將引物1與引物2，引物1與引物3和引物4與引物2組合使用時獲得的產物分別克隆到pET101/D-TOPO載體(1nvitrogen公司)內，克隆操作按照Invitrogen ChampionTMpET定向TOPO表達試劑盒進行。得到三種重組表達質粒pET-1、pET-2和pET-3。其中pET-1表達全長N蛋白序列(422個氨基酸)加上C-末端的6×His標簽；pET-2表達N末端的截短N蛋白(大約100個氨基酸)加上C-末端6×His標簽；pET-3表達C-末端的截短N蛋白(約99個氨基酸)加上C-末端6×His標簽。
6)測序使用試劑盒內提供的通用測序引物對三種克隆測序，選擇出序列完全正確的克隆。
7)表達按照試劑盒說明書進行。
8)純化遵循用于融合了6×His標簽的重組蛋白的標準方案進行。
實施例2.利用山羊抗SARS冠狀病毒N蛋白多克隆抗體進行雙抗體夾心分析(1)多克隆抗體的制備按照常規方法，用實施例1中制備的全長SARS病毒N蛋白免疫接種山羊，并加強免疫。由免疫山羊血清分離多克隆抗體，并經硫酸銨純化，對PBS透析。沉淀。
(2)將多克隆抗體與膠體金顆粒綴合利用Arista Biologicals Inc.的膠體金標記試劑盒，將山羊抗SARS病毒N蛋白的多克隆抗體綴合40nm膠體金顆粒備用。
(3)以常規方法制備試紙條，其中與膠體金綴合的山羊抗SARS冠狀病毒N蛋白多克隆抗體為第一抗體，單純的山羊抗SARS病毒N蛋白多克隆抗體作為“俘獲抗體”-第二抗體，兔抗山羊IgG為陽性對照。將試紙條浸入含SARS病毒裂解液(102、103、104、105pfu/ml)的樣品中。取出后靜置5分鐘，在103pfu/ml以上數量級的樣品中可明顯觀察到陽性的顯色條帶。
實施例3鼠抗SARS-N蛋白單克隆抗體的制備I.抗原的準備將實施例1中制備的全長SARS-N重組蛋白質抗原溶解于1×PBS中，制備成0.5mg/ml的工作液。
II.小鼠Balb/c雌性小鼠，5-6周齡。8-9周齡時開始免疫。
III.雜交瘤的制備1).將1.5ml濃度為1.0mg/ml的全長SARS-N蛋白與等體積完全性弗氏佐劑混合。
2).初次免疫小鼠每只小鼠注射0.5ml，共免疫6只。
3).加強免疫從初次免疫后第14天開始加強免疫，然后每14天加強免疫一次。加強免疫采用抗原與不完全弗氏佐劑的混合物進行，共加強免疫3次。在第3次加強免疫后的第10天，采集尾靜脈血。用1×PBS分別將免疫小鼠血清及未免疫小鼠血清稀釋成不同的濃度，ELISA方法檢測抗體滴度。
檢測程序用2μg/ml濃度的N蛋白抗原包被酶標板。每孔加入5μl血清和45μl樣本稀釋液(1×PBST)。每個稀釋度均做雙孔。37℃保溫1小時。洗板五次。加入1∶8000的羊抗鼠IgG-HRP，37℃保溫1小時。洗板五次。TMB顯色37℃10分鐘。0.2N硫酸終止反應。450nm波長下讀數。結果見表1。
表1 ELISA方法檢測抗體滴度結果。
3).最終免疫于初次免疫后第56天，分別將0.2μ過濾的100μl抗原不加佐劑進行靜脈注射和同側足掌內注射。。
4).免疫小鼠淋巴細胞制備于初次免疫后第60天，處死小鼠。分離腹股溝淋巴結，置于10ml已預熱至37℃的無血清培養基中，分離淋巴細胞。400g離心5分鐘，重懸于5ml無血清培養基中。
5).骨髓瘤細胞Ag8.8(可從ATCC獲得)的準備于融合前6天將細胞株從液氮復蘇。融合前一天，用含10％血清的新鮮培養基將細胞分離為5×105細胞/ml。融合的當天早晨，在10ml過夜培養瓶中加入等體積的含20％胎牛血清的培養基。400g離心5分鐘，重懸于5ml無血清培養基中。
6).細胞融合將制備好的5ml淋巴細胞和5ml骨髓瘤細胞合并，400g離心5分鐘，小心移去上清。緩慢加入0.2ml預溫為37℃的30％PEG溶液使細胞融合。將融合后的細胞轉移至100ml含20％胎牛血清、1×OPI、1×AH的培養基中，種入10個96孔培養板，每孔100微升，置于于二氧化碳培養箱中37℃培養。10天后，可觀察到每板均有數十個克隆。
7).雜交瘤的篩選融合后第10天，用ELISA方法篩選陽性克隆。用2μg/ml全長N抗原、N端和C端的N蛋白分別包被酶標板。每孔加入20μl培養基上清及30μl樣本稀釋液(1X PBS，2％BSA，0.05％NP-40，0.01％NaN3)37℃溫育60分鐘。洗板五次。加入1∶8000的羊抗鼠IgG-HRP。37℃溫育60分鐘。洗板五次。TMB顯色10分鐘。0.2N硫酸終止反應。450nm讀數。選擇所有對全長N蛋白及N端片段均為陽性的雜交瘤和所有對全長N蛋白及C端片段均為陽性的雜交瘤。根據ELISA結果及顯微鏡下觀察，隨機挑選出40個孔的細胞，培養于24孔板。4天后，用ELISA方法篩選。具體方法同上。共選出30株雜交瘤。
8).用細胞培養基的上清再進一步作Western印跡。用全長N蛋白，N端片段和C端片段進行SDS-PAGE，轉移到硝酸纖維素膜上，用5％脫脂奶粉封閉，洗滌，加入不同細胞株的培養基上清，洗滌，加入羊抗鼠IgG-HRP，最后加入顯色劑顯色。選擇ELISA和WesternBlot均反映較強的、N端片段與全長蛋白或者C端片段與全長蛋白都反應的細胞株保存，并通過有限稀釋進一步亞克隆，獲得14株單克隆。將它們分別編號為#1-#14，其中#1-#6對N端片段與全長蛋白都反應，#7-#14對C端片段與全長蛋白都反應。
9).單克隆雜交瘤的培養和儲存穩定的雜交瘤在含2％滅活胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素-鏈霉素、1mM丙酮酸鈉、5.5×10-5M 2-巰基乙醇的HB101培養基中進行體外傳代培養。細胞濃度為2-2.5×105/ml，保存于37℃含8％二氧化碳的溫箱中。細胞換液后，懸于含20％FCS和10％DMSO的基本培養基中，5×106個/ml/管，緩慢凍存于液氮中。
10).單克隆抗體的純化收集單克隆細胞培養基上清，用50％飽和硫酸銨沉淀，隨即于PBS(pH7.2)中透析，離心吸取上清，加入0.02％的疊氮化鈉，儲存于-70℃。
11).單克隆抗體的鑒定 Western Blot抗原樣品電泳制備抗原樣品，濃度為10μg/ml，并電泳分離。電轉移到硝酸纖維素膜上后用5ml封閉液(0.05％脫脂奶粉)封閉。然后換入用封閉液按1∶1000稀釋過的第一抗體，在室溫下持續搖動30～60分鐘。取出膜用TTBS洗膜四次，每次10-15分鐘。再加入用封閉液按1∶2000稀釋過的HRP-羊抗鼠IgG抗體綴合物。按常規方法使膜顯色，條帶應在10-30分鐘內出現。
直接ELISA法在酶標板中包被N蛋白抗原，包被濃度為2ug/ml。封閉后加入系列稀釋的抗N蛋白單克隆抗體，37℃溫育30分鐘，洗板后再加入HRP標記的羊抗鼠IgG，37度溫育30分鐘，TMB顯色。
上述實驗證實所獲得的#1-#14雜交瘤都分泌與N蛋白抗原特異性反應的單克隆抗體。
實施例4抗N蛋白抗體與病毒抗原的免疫反應性的檢測為確定抗N蛋白抗體與重組N蛋白抗原和SARS病毒天然N蛋白抗原之間的免疫反應性是否存在差異，需確保使用等同量的重組抗原和天然抗原。為此，對重組全長N蛋白抗原500ng和SARS病毒裂解產物系列滴度液進行SDS-PAGE電泳，通過N蛋白條帶的亮度確定與重組蛋白用量相當的SARS病毒滴度。用等同量的重組全長N蛋白抗原和經SDS處理的SARS病毒裂解液分別包被板，用HRP標記的#1-#10雜交瘤單克隆抗體與其反應，選擇二者之間反應強度相等或相近的抗體作為最終使用的抗體。結果得到除#2和#7外的其余12株雜交瘤單克隆抗體均可強度相當地與重組N蛋白抗原和SARS病毒裂解產物反應。
實施例5抗SARS病毒N蛋白多克隆抗體與單克隆抗體組合使用以檢測重組N蛋白隨機挑選實施例4中選出的抗N蛋白單克隆抗體#1，#3，#5，#8，#9和#12作為第一抗體，按照常規方法與膠體金綴合，抗SARS病毒N蛋白多克隆抗體4mg/ml作為“俘獲抗體”-第二抗體組合使用，以測試對重組N蛋白各稀釋度(5pg/ml，10pg/ml，20pg/ml，50pg/ml，100pg/ml，200pg/ml，500pg/ml)的反應性。結果發現這些抗體均可達到肉眼觀察檢測到20pg/ml重組N抗原的敏感度。
實施例6分別抗N蛋白N端片段和C端片段的兩種單克隆抗體配合使用以檢測重組N蛋白抗原和SARS冠狀病毒裂解液包被抗體和酶聯抗體的配對實驗將選出的抗N蛋白單克隆抗體(#1，#3-#6和#8-#14)均用PierceHRP標記試劑盒(Pierce Biotechnology，Inc.，Customer ServiceDepartment，P.O.Box 117，Rockford，IL.61105 U.S.A，cat.no.31490)標記。
用上述單克隆抗體包被酶標板。抗體以1ug/ml溶于BBS。用溶于含0.02％NaN3(疊氮化鈉)的PBS中的3％BSA封閉板，加N蛋白抗原100pg/ml。每一個包被用的抗N端單克隆抗體首先和HRP標記的抗C端的單克隆抗體作配合試驗，然后再分別和其它所有標記的抗N-HRP抗體配合，選擇有最強信號的單克隆抗體作為配對抗體。反之用抗C端的單克隆抗體作為包被抗體是，首先用HRP標記的抗N端的單克隆抗體配合，然后再與其它所有標記的抗體配合。選擇反應信號最強的#1和#10、#3和#9作為配合抗體。
參照常規方法將#1和#9分別與膠體金顆粒綴合，濃縮后以OD530nm＝50噴膜，用量為2.5ul/cm。將#3和#10抗體以2.0mg/ml固定在相應試紙條上作為俘獲抗體，并以羊抗鼠IgG作為陽性對照。將試紙條浸入系列稀釋的重組N蛋白和經0.05％SDS滅活的SARS病毒裂解液樣品中進行檢測。結果發現兩種組合均可檢測到10pg/ml重組N抗原和1000pfu/ml SARS病毒的敏感度。
本發明人還測試了用山羊抗SARS-N蛋白多克隆抗體(4mg/ml)作為俘獲抗體、分別抗C端和N端的單克隆抗體(#1和#10)作為膠體金綴合抗體的配合。每種單克隆抗體的膠體金綴合物終濃度均為OD530nm＝50，噴射體積為2.5ul/cm。檢測結果見圖1。其中上部條帶為山羊抗鼠IgG陽性對照，下部條帶為俘獲抗體-山羊抗SARS-N蛋白多克隆抗體。在此條件下可以達到肉眼觀察檢測到10pg/ml(及低于10pg/ml)重組N抗原的敏感度和對滅活SARS病毒檢測達到1000PFU(及低于1000PFU)的稀釋度。此敏感度是目前RT-PCR方法對SARS病毒檢測的靈敏度水平。
結論本發明的方法檢測時間在10分鐘，檢測敏感度可達到10pg/ml重組N蛋白，檢測滅活SARS-CoV可達到1000PFU/ml或更高的稀釋度。
本發明的方法具有簡單、快速、使用方便、不需特殊技能或設備及易于保存(一般可于室溫保存18-24個月)，在用于SARS診斷中，本方法還有適用于在非醫療單位(如機場、車站、家庭等)由非義務人員操作及減少檢測本身產生的污染物(如ELISA方法中的洗液)的產生。能夠用于早期診斷的具有高靈敏度和特異性性SARS膠體金試劑/方法具有其它任何方法都無法比擬的優點。由上述結果可看出，本發明方法的敏感性可以達到ELISA方法的水平，并且可以通過與標準曲線比較而進行定量檢測，從而對SARS治療的療效即是否具有傳染性進行觀察和判斷。
上面以例示的方式對本發明進行了舉例說明，但本發明絕不限于此。本領域普通技術人員在閱讀了整篇說明書之后，完全清楚可對本發明作各種改動，而仍不偏離本發明的精神和范圍。
序列表<110>Ma，Jie<120>SARS冠狀病毒或其相關抗原的檢測<130>idc030083-ccpit<160>26<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1269<212>DNA<213>
<400>1atgtctgata atggacccca atcaaaccaa cgtagtgccc cccgcattac atttggtgga60cccacagatt caactgacaa taaccagaat ggaggacgca atggggcaag gccaaaacag120cgccgacccc aaggtttacc caataatatt gcgtcttggt tcacagctct cactcagcat180ggcaaggagg aacttagatt ccctcgaggc cagggcgttc caatcaacac caatagtggt240ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctacccgac gagttcgtgg tggtgacggc300aaaatgaaag agctcagccc cagatggtac ttctattacc taggaactgg cccagaagct360tcacttccct acggcgctaa caaagaaggc atcgtatggg ttgcaactga gggagccttg420aatacaccca aagaccacat tggcacccgc aatcctaata acaatgctgc caccgtgcta480caacttcctc aaggaacaac attgccaaaa ggcttctacg cagagggaag cagaggcggc540agtcaagcct cttctcgctc ctcatcacgt agtcgcggta attcaagaaa ttcaactcct600ggcagcagta ggggaaattc tcctgctcga atggctagcg gaggtggtga aactgccctc660gcgctattgc tgctagacag attgaaccag cttgagagca aagtttctgg taaaggccaa720caacaacaag gccaaactgt cactaagaaa tctgctgctg aggcatctaa aaagcctcgc780caaaaacgta ctgccacaaa acagtacaac gtcactcaag catttgggag acgtggtcca840gaacaaaccc aaggaaattt cggggaccaa gacctaatca gacaaggaac tgattacaaa900cattggccgc aaattgcaca atttgctcca agtgcctctg cattctttgg aatgtcacgc960attggcatgg aagtcacacc ttcgggaaca tggctgactt atcatggagc cattaaattg1020gatgacaaag atccacaatt caaagacaac gtcatactgc tgaacaagca cattgacgca1080tacaaaacat tcccaccaac agagcctaaa aaggacaaaa agaaaaagac tgatgaagct1140
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<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>6ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctacccgac gagttcgtgg tggtgacggc60aaaatgaaag agctcagccc cag83<210>7<211>79<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>7ttgttagcgc cgtagggaag tgaagcttct gggccagttc ctaggtaata gaagtaccat60ctggggctga gctctttca 79<210>8<211>82<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>8ttccctacgg cgctaacaaa gaaggcatcg tatgggttgc aactgaggga gccttgaata60cacccaaaga ccacattggc ac 82<210>9<211>82<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>9tttggcaatg ttgttccttg aggaagttgt agcacggtgg cagcattgtt attaggattg60cgggtgccaa tgtggtcttt gg 82<210>10<211>89<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>10tcaaggaaca acattgccaa aaggcttcta cgcagaggga agcagaggcg gcagtcaagc60ctcttctcgc tcctcatcac gtagtcgcg 89<210>11
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<210>16<211>84<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>16ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat tggccgcaaa ttgcacaatt tgctccaagt60gcctctgcat tctttggaat gtca 84<210>17<211>79<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>17agacgtaaga aaccttacag tgcgtaaccg taccttcagt gtggaagccc ttgtaccgac60tgaatagtac ctcggtaat 79<210>18<211>79<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>18taatggctcc atgataagtc agccatgttc ccgaaggtgt gacttccatg ccaatgcgtg60acattccaaa gaatgcaga 79<210>19<211>52<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>19gctctgttgg tgggaatgtt ttgtatgcgt caatgtgctt gttcagcagt at52<210>20<211>112<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>20acattcccac caacagagcc taaaaaggac aaaaagaaaa agactgatga agctcagcct60ttgccgcaga gacaaaagaa gcagcccact gtgactcttc ttcctgcggc tg112
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<400>26Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile
1 5 10 15Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly20 25 30Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn35 40 45Asn Ile Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Glu50 55 60Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Gly65 70 75 80Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Val Arg85 90 95Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr100 105 110Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys115 120 125Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys130 135 140Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu145 150 155 160Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly165 170 175Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg180 185 190Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro195 200 205Ala Arg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu210 215 220
Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly Gln225 230 235 240Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser245 250 255Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Gln Tyr Asn Val Thr260 265 270Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly275 280 285Asp Gln Asp Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln290 295 300Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg305 310 315 320Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr His Gly325 330 335Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Gln Phe Lys Asp Asn Val Ile340 345 350Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu355 360 365Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gln Pro Leu Pro370 375 380Gln Arg Gln Lys Lys Gln Pro Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp385 390 395 400Met Asp Asp Phe Ser Arg Gln Leu Gln Asn Ser Met Ser Gly Ala Ser405 410 415Ala Asp Ser Thr Gln Ala420
權利要求
1.一種針對SARS冠狀病毒N蛋白抗原的抗體。
2.權利要求1的抗體，它是單克隆的。
3.權利要求1的抗體，它是多克隆的。
4.權利要求1的抗體，它是嵌合抗體。
5.一種檢測樣品中SARS冠狀病毒或者其相應抗原的存在情況的方法，包括如下步驟(1)將樣品與權利要求1-4中任一項的抗體在合適的條件下溫育；(2)檢測上述步驟中結合復合體的存在。
6.權利要求5的方法，其中所述樣品是患者的血清、全血、痰液、口腔/鼻咽分泌物或洗液、尿液、糞便、胸腹腔積液、腦脊液和組織標本等。
7.權利要求5的方法，其中在溫育前用0.01-0.2％SDS對所述樣品進行處理。
8.權利要求5的方法，其中所述抗體固定在支持物，例如膜如硝酸纖維素、膠乳顆粒、磁性顆粒、膠體金、珠子或盤諸如玻璃、纖維玻璃或塑料材料如聚苯乙烯或聚氯乙烯、或纖維光學傳感器等上。
9.患者中SARS病的診斷方法，包括將來自患者的樣品與權利要求1-4中任一項的抗體溫育和檢測所述抗體的特異性結合的情況。
10.一種檢測試劑盒，其中包含針對SARS冠狀病毒N蛋白的第一抗體和第二抗體，所述第一抗體任選地進行了適當標記，例如辣根過氧化物酶或膠體金等標記。
11.權利要求10的試劑盒，其中所述第一抗體和第二抗體都是多克隆抗體。
12.權利要求10的試劑盒，其中所述第一抗體是多克隆抗體或者一或多種單克隆抗體或者它們的混合物，所述第二抗體是能夠配合使用的多克隆抗體或者一或多種單克隆抗體或者它們的混合物。
13.一種試紙條產品，其中包含針對SARS冠狀病毒N蛋白的第一抗體和第二抗體，所述第一抗體任選地進行了適當標記，例如辣根過氧化物酶或膠體金等標記，所述第二抗體作為俘獲抗體。
14.權利要求13的試紙條產品，其中所述第一抗體和第二抗體都是多克隆抗體。
15.權利要求13的試紙條產品，其中所述第一抗體是多克隆抗體或者一或多種單克隆抗體或者它們的混合物，所述第二抗體是能夠配合使用的多克隆抗體或者一或多種單克隆抗體或者它們的混合物。
16.權利要求13的試紙條產品，其中還含有抗第一抗體的陽性對照抗體。
全文摘要
本發明涉及針對SARS冠狀病毒核衣殼蛋白－N蛋白(nucleocapsidprotein)的抗體，利用該抗體檢測樣品中SARS冠狀病毒或者其抗原的存在情況的方法。本發明還涉及用于這些方法的試劑盒以及相應的產品。
文檔編號C07K16/08GK1590409SQ0315636
公開日2005年3月9日 申請日期2003年9月5日 優先權日2003年9月5日
發明者馬杰 申請人:馬杰