專利名稱：一種兩步法毛細管電泳等電聚焦分離蛋白質的裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種兩步法毛細管電泳等電聚焦分離蛋白質的裝置。是用電滲泵驅動毛細管內的聚焦區帶，使其經過檢測窗口完成檢測。主要適用于蛋白質等兩性物質的等電聚焦分離。
背景技術：
等電聚焦作為毛細管電泳分離分析的一種模式，廣泛應用于具有不同等電點的蛋白質混合物樣品的分離。等電聚焦分為兩種形式一步法和兩步法。一步法也稱之為動態聚焦法，它是利用pH梯度和電滲的共同作用，使區帶在聚焦中遷移或在遷移中聚焦。兩步法是將等電聚焦分離中聚焦過程和遷移過程分別進行。兩步法較之一步法具有更高的檢測靈敏度、分離效率和更好的重現性，因此被更為廣泛地應用。為了遷移聚焦區帶，Hjertén等人提出了一系列方法，他們在聚焦完成之后通過改變陰極或陽極緩沖液的pH值而使聚焦區帶遷移，(Zhu M，Hjertén S.U.S.Patent 4,725,343，Feb.16，1988)包括將陰極的堿替換為酸或將陽極的酸替換為堿；在陽極(或陰極)電解液中加入鹽。(Hjertén S.U.S.Patent 4,911,808，Mar.27，1990)之后，Rodriguez等人用兩性離子代替鹽來遷移區帶。(Rodriguez R，Wehr T，Zhu M.U.S.Patent 5,110,434，May 05，1992)他們用pI3.22的兩性離子代替鹽，使酸性蛋白得到更好的分離效果，用pI6.9的兩性離子代替鹽，提高了中性和堿性蛋白的分離能力。(Zhu M，RodriguezR，Wehr T.J Chromatogr.，1991，559479-488)這種在陽極(或陰極)電解液中加入鹽或兩性離子，在直流電場作用下，使聚焦區帶向檢測窗口方向遷移的方法稱為化學遷移。然而，化學遷移，無論是用鹽或兩性離子，均不能提供線性pH梯度，不利于pI值的測定。1994年，Herrick等人發明了一種能夠控制電滲流(EOF)并且能遷移聚焦區帶的等電聚焦實驗裝置。(Herrick S S，Sternberg J C.U.S.Patent 5,282,942，Feb.01，1994)他們在毛細管外加上導電部件，通過控制外部電場實現聚焦時毛細管內EOF的調節及聚焦完成后區帶的遷移。但此方法并未得到廣泛地應用。壓差遷移是采用恒定的流體力學流動，真空或低壓推動，使聚焦區帶遷移。而壓差遷移(一般用N2)需輔助設備，實驗裝置較為復雜，連接到毛細管上也比較麻煩。(Liu X，Sosic Z，Krull I S.J Chromatogr.A，1996，735165-190)這在一定程度上阻礙了兩步法等電聚焦分離方法的發展和應用。因此，尋找一種裝置簡單且易于控制的遷移區帶方法，對毛細管電泳等電聚焦分離蛋白質具有一定的實用意義。
發明內容
本發明的目的在于提供一種兩步法毛細管電泳等電聚焦分離蛋白質的裝置，可以方便精確地通過控制電滲泵電壓調節輸出流量來調節遷移聚焦區帶的速度，裝置簡單，適用于毛細管電泳等電聚焦兩步法分離蛋白質等兩性物質。
為實現上述目的，本發明的工作原理是通過施加高壓電場，將待分離蛋白質樣品在分離毛細管內等電聚焦后，用電滲泵將聚焦區帶緩慢遷移經過檢測窗口完成檢測。
根據上述原理，本發明提供的兩步法毛細管電泳等電聚焦分離蛋白質的裝置，主要包括一微型四通，分別連接微流量電滲泵、等電聚焦分離毛細管、陽極緩沖溶液儲液管(即聚焦高壓電源正極)和進樣口。
其中等電聚焦分離毛細管較理想的是消除了電滲的有內涂層的石英毛細管，較理想的內徑為50-100μm。其一端插入至陰極緩沖溶液池中，另一端通過設置在微型四通內裝滿陽極緩沖溶液的儲液管而與陽極緩沖溶液池相連接。該毛細管在微型四通與陰極緩沖溶液池之間經過一柱上紫外-可見毛細管電泳檢測器的檢測窗口。
一高壓直流電源，為高穩定電源，較理想的電壓是5KV-30KV，其陰極連接至陰極緩沖溶液池，陽極連接至陽極緩沖溶液池，使等電聚焦分離毛細管的兩端形成高壓電場。
微型四通與微流量電滲泵之間通過一輸液導管連接，該微流量電滲泵較理想為內徑250-530μm的填充通道電滲泵，由100-1000V的低壓直流高穩定電源驅動，通過控制該電壓來調節流體的輸出壓強和流量。
待測樣品由微型四通的進樣口注入至等電聚焦分離毛細管中，在由高壓直流電源形成的高壓電場作用下完成等電聚焦分離，控制微流量電滲泵的電壓調節流體的輸出壓強和流量，對等電聚焦毛細管中已聚焦好的區帶進行遷移，使聚焦區帶經過檢測窗口，用柱上紫外-可見毛細管電泳檢測器實現檢測。
圖1為本發明的裝置示意圖。
圖中1-微流量電滲輸液泵；11-輸液導管；12-低壓直流電源；2-微型四通；21-進樣口；22-陽極緩沖溶液儲液管；3-等電聚焦分離毛細管；31-陰極緩沖溶液池；32-陽極緩沖溶液池；33-檢測窗口；4-柱上紫外-可見毛細管電泳檢測器；5-高壓直流電源；51-高壓直流電源接地端；52-高壓直流電源正極端。
具體實施例方式
本發明提供的兩步法毛細管電泳等電聚焦分離蛋白質裝置的結構參見圖1。一微型四通2，分別連接微流量電滲泵1、等電聚焦分離毛細管3、陽極緩沖溶液儲液管22和進樣口21。
其中等電聚焦分離毛細管3較理想的是消除了電滲的有內涂層的石英毛細管，該毛細管的一端插入至陰極緩沖溶液池31中，另一端通過設置在微型四通2內的陽極緩沖溶液儲液管22而與陽極緩沖溶液池32相連接，陽極緩沖溶液儲液管22內部裝滿了陽極緩沖溶液。該毛細管3在微型四通1與陰極緩沖溶液池31之間經過一柱上紫外-可見毛細管電泳檢測器4的檢測窗口33。
一高壓直流電源5，為高穩定電源，其陰極51連接至陰極緩沖溶液池31，陽極52連接至陽極緩沖溶液池32。等電聚焦分離毛細管3通過陽極緩沖溶液儲液管22中的陽極緩沖溶液與陽極緩沖溶液池32相連接。使等電聚焦分離毛細管3兩端形成高壓電場，而等電聚焦分離毛細管3中的樣品就處在高壓電場下完成等電聚焦分離。
微型四通2與微流量電滲泵1之間通過一輸液導管11連接。微流量電滲泵1通過控制低壓直流電源12的電壓來調節輸液導管11中流體的輸出壓強和流量。
等電聚焦分離毛細管3中的樣品在高壓電場的作用下完成等電聚焦分離后，開啟微流量電滲輸液泵1，通過輸液導管11將所輸送液體導出，從微型四通2的一端進入等電聚焦分離毛細管3中，通過控制微流量電滲輸液泵1的電壓12來調節流體的輸出壓強和流量，對等電聚焦分離毛細管3中已聚焦好的區帶進行遷移，使聚焦區帶按控制的速度經過檢測窗口33，利用柱上紫外-可見毛細管電泳檢測器4實現檢測。
利用上述裝置，下面列舉一分離溶菌酶和牛血清蛋白的實施例來幫助理解本發明。
在列舉實施例之前，需要說明的是，在前述發明內容部分列出的條件是實現本發明較理想的條件，而不是限制實現本發明的條件。這點很容易被本領域的技術人員理解并掌握。因此，為簡明扼要起見，只列舉一個具有代表性的實施例。但該實施例不能用來限定本發明的權利要求范圍。
本實施例所用的等電聚焦分離毛細管為二甲基聚硅氧烷涂層毛細管，膜厚0.06μm，內徑100μm，柱長50cm，有效長度42.5cm。陰極緩沖溶液為20mMNaOH的0.2％甲基纖維素(MC)溶液，陽極緩沖溶液為120mM H3PO4的0.2％MC溶液。聚焦電壓10kV；所用電滲泵的結構為兩根5cm×530μm柱并聯，內填5μm二氧化硅(SiO2)；輸送液體為甲醇/水＝30/70；泵驅動電壓為600V。柱上紫外-可見毛細管電泳檢測器的檢測波長為280nm。取得了很好的分離效果。
權利要求
1.一種兩步法毛細管電泳等電聚焦分離蛋白質的裝置，主要包括一微型四通，分別連接微流量電滲泵、等電聚焦分離毛細管、陽極緩沖溶液儲液管和進樣口；其中等電聚焦分離毛細管一端插入至陰極緩沖溶液池中，另一端通過設置在微型四通內的陽極緩沖溶液儲液管而與陽極緩沖溶液池相連接；在微型四通與陰極緩沖溶液池之間經過一柱上紫外-可見毛細管電泳檢測器的檢測窗口；一高壓直流電源，為5KV-30KV，其陰極連接至陰極緩沖溶液池，陽極連接至陽極緩沖溶液池，使等電聚焦分離毛細管的兩端形成高壓電場；微型四通與微流量電滲泵之間通過一輸液導管連接，該微流量電滲泵由100-1000V的低壓直流高穩定電源驅動，通過控制該電壓來調節流體的輸出壓強和流量；待測樣品由微型四通的進樣口注入至等電聚焦分離毛細管中，在由高壓直流電源形成的高壓電場作用下完成等電聚焦分離，控制微流量電滲泵的電壓調節流體的輸出壓強和流量，對等電聚焦毛細管中已聚焦好的區帶進行遷移，使聚焦區帶經過檢測窗口，用柱上紫外-可見毛細管電泳檢測器實現檢測。
2.由權利要求1所述的裝置，其特征在于，所述微流量電滲泵為內徑為250-530μm的填充通道電滲泵。
3.由權利要求1所述的裝置，其特征在于，所述等電聚焦分離毛細管是消除了電滲的有內涂層的石英毛細管，內徑為50-100μm。
4.由權利要求1所述的裝置，其特征在于，所述高壓和低壓直流電源為高穩定電源。
全文摘要
一種簡易的兩步法毛細管電泳等電聚焦分離蛋白質的裝置，主要包括微流量電滲泵、等電聚焦分離毛細管、微型四通、柱上紫外－可見(UV－Vis)電泳檢測器、高壓和低壓直流電源；裝置中采用一個微型四通，用來分另連接電滲泵、等電聚焦分離毛細管、陽極緩沖溶液(聚焦高壓電源正極)和進樣口。
文檔編號C07K1/26GK1590402SQ0315568
公開日2005年3月9日 申請日期2003年9月3日 優先權日2003年9月3日
發明者關亞風, 陳令新, 舒馨, 馬繼平, 王海龍 申請人:中國科學院大連化學物理研究所