專利名稱：抗牙周病特異性復合IgY制備方法及其組合制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗牙周病特異性復合IgY及其制備方法，特別是涉及用于預防和治療牙周病(牙齦炎、牙周炎等)特異性復合IgY及其制備方法和組合制劑。
背景技術：
牙周病是人類最普遍的口腔常見多發病之一，由于牙周病初期不會引起痛楚和大的功能障礙，患者往往容易忽視，直至牙齦出血、酸軟疼痛、腫脹發炎、化膿松動、槽骨病變，才就醫治療。因此牙周病發病率極高，據WHO調查統計，牙齦炎在兒童和青少年中患病率在70-90％，且隨年齡增高，老年人牙周病發病率達80-90％，香港一項資料稱成年人發病率高達95％。在病因學方面除少數因內分泌藥物遺傳、精神因素外，近50年來學者們公認各類牙周病均由牙菌斑引起的感染而致病，它比齲齒患病率更高。至今世界各國都尚無特效的藥物預防和治療，對人類健康危害極大。
目前世界各國對牙周病多用化學藥物治療或抑制菌斑細菌。100年來基本沒有大的變化，有大量的研究報告試驗了各種藥物，目前臨床最常應用的藥物有硝基味唑類，如甲硝唑、替硝唑和二胍己烷類如鹽酸洗必泰、醋酸洗必泰、葡萄糖酸洗必泰等，這些都是廣譜抗菌藥。存在最大的問題是長期使用廣譜抑菌藥會產生耐藥菌株和二重感染及其它副作用；近年上市了一些酶類制劑，如溶菌酶、葡萄糖氧化酶、葡聚糖酶、SOD.H2O2酶、RNA酶等雖能減少菌斑形成，但穩定性很差，極易降解和失活，是口腔用藥穩定性的難題。
目前使用的氟化物治療藥(含氟漱口水等)因人體“攝氟多源性”和“高氟區域性”及氟化水源等因素；再用氟化物治療會造成攝氟過多的危害，氟牙癥、氟骨癥甚至致癌；用硝咪唑類、甲硝唑、替硝唑治療牙周病，不僅味道極苦難耐，口中金屬味，久用易致肝功不全者積蓄中毒、鈉潴留，誘發白色念珠菌性口腔炎，周圍神經炎，白細胞減少，妊娠危險、雙硫侖反應、過敏等一系列副作用；洗必泰類是目前推薦的口腔用藥，對齲齒和牙周病有較好的療效，但仍逃不過廣譜化學藥物的弊端，重復使用引起粘膜牙齦過敏、干燥、紅腫、皸裂，在其合成中對氯苯胺的殘留，是潛在的致癌因素，對此美FDA和英國BP限制極嚴。在用該品沖洗、漱口治療中，手腳固定性藥疹、粘膜損傷經常出現。
因此，研制一種既可殺滅牙周病細菌，又沒有毒副作用的天然安全，且有長效作用的新藥，非常必要。抗人類牙周病多種病原微生物特異性復合卵黃抗體(Immunoglobulinof Yolk，IgY)屬IgG類免疫球蛋白，它是用致牙周病多種病原體來免疫健康產蛋禽類，使之產生大量相應免疫球蛋白，經提取分離純化，而制得特異性復合卵黃抗體。這些復合IgY對導致牙周病的多種病原體，有特異性結合抑制作用，即使在濃度極低的情況下，也能起到有效作用，并且只抑制致病菌，對口腔共生菌無作用。絕不會產生耐藥菌株和二重感染，更沒有化學藥品的毒副作用。
技術內容本發明的目的是提供一種直接抑制牙周病多種病原微生物的特異性復合IgY的制備方法及其制劑；本發明的目的還在于提供一種由可抑制牙周病病原微生物的特異性復合IgY制成的天然安全又具特效的預防和治療牙周病的制劑。
本發明的目的是通過以下技術方案實現的(1)篩選引致牙周病的病原微生物按照感染微生態學文獻和臨床口腔科流行病學資料，經分離篩查牙周病菌斑中31種病原菌，按照它們存在數量和出現機率，并根據這些最常見病原體的“抗原交叉性”進行分類組合，最后確定為如下8種主要致病菌牙齦卟啉單胞菌 (Porphyromonas gingiValis)具核梭桿菌 (Fusobacterium nucleatum)放線共生放線菌 (Actinobacillus actinomycetem comitans)粘性放線菌 (Actinomgces Viscosus)福賽類桿菌 (Bacteroides forsythus)齒垢密螺旋體 (Treponemas denticola)中間類桿菌 (Bacteroides intermedius)牙齦類桿菌 (Bacteroides gingivalis)(2)在篩選和分類組合這些病原體的基礎上分別制備單一或復合的牙周病病原體抗原按照這些病原微生物的培養特性和最適培養條件，分別選擇適宜的培養基，進行菌株大量繁殖和擴增，然后收獲培養物，進行提純、菌株計數、稀釋分裝；復合細菌抗原的制備將以上培養純化分裝好的單一抗原參照牙周病菌斑中所出現機率和所占比例，按如下百分比混合
牙齦卟啉單胞菌 20-5％具核梭桿菌 20-5％放線共生放線菌 20-5％粘性放線菌 15-10％福賽類桿菌 10-20％齒垢密螺旋體 5-15％中間類桿菌 5-20％牙齦類桿菌 5-20％將各單一或復合的牙周病致病菌一定數量加入福氏佐劑，再放入高速勻漿機中以10000-30000r/min勻化，使成為均一W/O乳狀液，制得單一或復合的牙周病病原體抗原。
(3)制備免疫蛋選擇具有高免疫應答能力的產蛋SPF健康母禽，每只在胸部肌肉或皮下分別多點注射所制備的單一或復合牙周病病原體抗原，在第一次注射后，間隔7天，再以同樣劑量、方法注射第二次；第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第三次，第一次注射20天后，根據測得血清和卵黃中復合IgY的效價情況揀取高效價免疫蛋。并對應不同抗原對免疫蛋編號標記。
母禽可以是產蛋母雞或產蛋母鴨或產蛋母鵝或產蛋火雞或產蛋鴕鳥或產蛋野雞。
(4)抗牙周病致病菌特異性復合IgY粗品制備將不同抗原分別免疫的母禽所產禽蛋用消毒液浸泡或擦拭，用無菌純水沖洗晾干，再分別置打蛋機中，打碎蛋殼，用卵黃篩濾除蛋清，留取蛋黃，加入5-8倍蒸餾水稀釋混勻，用1mol NaOH或HCL液調節pH至5.5-6.0，4-6℃下靜置過夜，此稀釋液以1000-3000r/min離心20分鐘，取上清用截留分子量5-10萬Da超濾膜濃縮15-20倍，濃縮液用凍干法干燥，將單一抗原IgY凍干粉按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10比例混合即得抗牙周病特異性復合IgY粗品。
(5)抗牙周病致病菌特異性復合IgY純品制備采用本公司已公開的技術(專利申請號00101270.3，專利公開號1307061)分別過離子交換樹脂柱和凝膠交換柱，對按以上工藝制取的抗牙周病復合IgY粗品進行純化，即得純復合IgY。
應用SDS-PAGE電泳測定法對上述IgY粗品檢測，測得其中復合IgY含量為50％以上。
(6)采用酶聯免疫法(ELISA)測得復合IgY生物活性效價達128-512。
將0.02-80％這種特異性IgY配以99.98-20％的藥用輔料，可制成臨床口腔科可接受的口噴劑、漱口水、含片、棒狀治療劑或牙膏。
本發明上述劑型直接施于口腔牙周局部預防和治療牙周病療效好、見效快，解決了使用各種化學治療藥對口腔難耐、刺激性、耐藥性和副作用的弊端，且對口腔共生菌無影響。
實驗例1將致病菌20-35億其中牙齦卟啉單胞菌20％，具核梭桿菌20％，放線共生放線菌20％，粘性放線菌15％，福賽類桿菌10％，齒垢密螺旋體5％，中間類桿菌5％，牙齦類桿菌5％，制成0.5ml菌液，加入0.5ml福氏佐劑充分混勻即制成復合抗原，再用它免疫產蛋母禽，揀蛋制備它們的特異性復合IgY，然后分別用牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、放線共生放線菌、粘性放線菌、福賽類桿菌、齒垢密螺旋體、中間類桿菌、牙齦類桿菌為檢測抗原用“ELISA”方法檢測所制得的抗牙周病特異性復合IgY抗體結合效價，結果如下
從上述檢測結果顯示，采用本發明制備的復合抗原強化免疫母禽所制備的特異性復合IgY具有理想的廣譜性，對所免疫的細菌有很強的抑制作用(抗體效價1:128-512)。
實驗例2方法同實驗例1。注射用抗原比例改變為牙齦類桿菌20％，中間類桿菌20％，福賽類桿菌20％，齒垢密螺旋體15％，粘性放線菌10％，放線共生放線菌5％，具核梭桿菌5％，牙齦卟啉單胞菌5％時，檢測抗體結合效價結果如下
由上表可見抗原比例改變，強化免疫后所提取的特異性復合IgY抗體結合效價也發生相應變化，免疫應答性十分良好。
實驗例3采用實驗例1制作的復合抗原，分別免疫產蛋母雞、產蛋母鴨、產蛋母鵝、產蛋火雞以及產蛋鴕鳥。再分別采用本發明的方法制備得到(1)抗牙周病致病菌特異性雞IgY、(2)抗牙周病致病菌特異性鴨IgY、(3)抗牙周病致病菌特異性鵝IgY、(4)抗牙周病致病菌特異性火雞IgY、(5)抗牙周病致病菌特異性鴕鳥IgY。然后，采用“ELISA法”(酶聯免疫吸附試驗)分別以牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、放線共生放線菌、粘性放線菌、福賽類桿菌、齒垢密螺旋體、中間類桿菌、牙齦類桿菌為檢測用抗原，檢測這五種抗牙周病致病菌特異性IgY的抗體效價。結果如下表
從以上試驗結果可以看出，采用本發明的方法制作抗原，用免疫激活方法免疫母雞、母鴨、母鵝、產蛋火雞或產蛋鴕鳥，再采用本發明的方法分別制得抗牙周病致病菌特異性雞IgY、抗牙周病致病菌特異性鴨IgY、抗牙周病致病菌特異性鵝IgY、抗牙周病致病菌特異性火雞IgY、抗牙周病致病菌特異性鴕鳥IgY五種不同的IgY，雖然免疫的禽類不同，但是所制得的特異性IgY對引致牙周病的幾種致病菌都有較強的抑制效果。雖然免疫產蛋鴕鳥和產蛋火雞所制得的IgY抗體效價從檢測數據看稍微低了一些，但是，由于鴕鳥和火雞蛋個體特別大，每個免疫蛋所能提取得到的IgY比雞免疫蛋和鴨免疫蛋以及鵝免疫蛋都多得多，這點對于工業化大規模生產，也是十分可取的。
實驗例4采用實驗例2制作的復合抗原，分別免疫產蛋母雞、產蛋母鴨、產蛋母鵝、產蛋火雞以及產蛋鴕鳥。再分別采用本發明的方法制備得到(1)抗牙周病致病菌特異性雞IgY、(2)抗牙周病致病菌特異性鴨IgY、(3)抗牙周病致病菌特異性鵝IgY、(4)抗牙周病致病菌特異性火雞IgY、(5)抗牙周病致病菌特異性鴕鳥IgY。然后，采用“ELISA法”(酶聯免疫吸附試驗)分別以牙齦類桿菌、中間類桿菌、福賽類桿菌、齒垢密螺旋體、粘性放線菌、放線共生放線菌、具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌為檢測用抗原，檢測這五種抗牙周病致病菌特異性IgY的抗體效價。結果如下表
由上表可見抗原比例改變，強化免疫后所提取的各種不同產蛋禽類的特異性復合IgY抗體結合效價也發生相應變化，免疫應答性十分良好。
實驗例5牙周病患者以本發明的抗牙周病特異性復合IgY為原料制備組合口腔噴劑和短棒劑，進行治療觀察。
(1)在牙周病患者中隨機選擇牙齦炎患者20名和牙周炎患者20名。
(2)牙齦炎患者用口腔噴劑每日于刷牙后飯后漱口后及中間時間、睡前，施噴劑于牙齦牙齒部位每次4-6噴，每日4-6次，對牙周炎患者(牙周袋0-2mm)先用施用口腔噴劑，再在牙周袋中嵌入短棒劑或IgY顆粒劑，每次飯后清潔口腔后嵌一顆，睡前嵌一粒，共4次。
(3)觀察牙齦、牙周袋、牙菌斑變化情況。
(4)用藥7-15天，20名牙齦炎患者癥狀基本消失齒齦由暗紅色轉為正常紅色，腫痛出血消失，灼燒感消失。
牙周炎患者15人用藥后1-5天內壓擠無膿液，疼痛消失，叩診轉陰，牙周袋閉合，另5人癥狀明顯減輕，牙菌斑明顯變淡，無新斑發展。
(5)連續用藥15天，牙齦炎20人癥狀消失，牙周炎(牙周袋形成0-2mm)20人，18人牙周袋閉合，齦腫出血消失，動度改善，菌斑消失或明顯變淡，1人只齦乳頭輕度腫脹，1人有輕度牙菌斑。
實施例1制備100g抗牙周病特異性IgY(1)選具高免疫應答能力的良種鴨用牙齦卟啉單胞菌制作抗原，分別免疫1000只母鴨，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再注射一次，共三次。于第一次注射后第7個月，將這些鴨所產的蛋標記后，按常規方法分別提取其IgY；以ELISA法(酶聯免疫吸附實驗)檢測所制得的IgY的效價；選出其中IgY效價≥256的鴨200只，再用這批鴨所產的蛋孵出優良鴨種，待其長大至2-3個月，作為優選的高免疫應答能力的特種母鴨；(2)牙周病病原體復合抗原的制備按照牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、放線共生放線菌、粘性放線菌、福賽類桿菌、齒垢密螺旋體、中間類桿菌、牙齦類桿菌的培養特性和最適培養條件，分別選擇適宜的培養基，進行菌株大量繁殖和擴增，然后收獲培養物，進行提純、菌株計數、稀釋分裝；
將以上培養純化分裝好的單一抗原參照牙周病菌斑中所出現機率和所占比例，按如下百分比混合牙齦卟啉單胞菌 20-5％具核梭桿菌 20-5％放線共生放線菌 20-5％粘性放線菌 15-10％福賽類桿菌 10-20％齒垢密螺旋體 5-15％中間類桿菌 5-20％牙齦類桿菌 5-20％然后向含20-35億菌數/0.5ml混合菌液中，按1∶1的比例加入福氏佐劑，再放入高速勻漿機中以10000-30000r/min勻化，使成為均一W/O乳狀液，制得牙周病致病菌復合抗原。
(3)分別對優選的特種母鴨進行強化免疫用所制得的牙周病致病菌復合抗原，采用皮下注射和翅靜脈注射相結合的免疫法，分別對優選的特種母鴨進行免疫，每只母鴨每次注射量達到1ml抗原，注射后第7天、第14天再同樣各注射一次進行強化。第一次免疫20天后，開始揀取免疫鴨蛋至第10個月終止并淘汰母鴨。
(4)抗牙周病特異性IgY的制備首先將免疫蛋洗凈，酒精消毒晾干；用打蛋機將免疫蛋打碎，蛋黃篩篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻；加入4-6倍蒸餾水，混合均勻；用1.0N HCL溶液調整pH至6.0-6.5，進一步充分攪拌均勻，4-6℃下靜置過夜，將此稀釋液2000r/min離心20分鐘；取上清液用截留分子量7-10萬超濾膜濃縮至1/20；濃縮液加入0.1-0.3％海藻酸鈉充分混勻，4℃過夜，12000rpm離心20分鐘；取上清超濾；繼而用膜過濾技術除菌；冷凍干燥，即制得抗牙周病特異性IgY粗提物；過離子交換柱和凝膠交換柱，對抗牙周病特異性IgY粗提物進行純化，即得純IgY。
實施例2制備一種抗牙周病口腔噴劑按以下配方調配100升抗牙周病特異性IgY組合溶液抗牙周病特異性IgY 150g甘油 1500g
甘露醇1500g薄荷醇200g薄荷油300g桉葉油100g酒 精2000ml蒸餾水適量制 成100升制備工藝1、取總量80％的蒸餾水加入甘露醇攪拌溶解，再加入IgY溶解攪拌均勻，用1mol/LNaOH調節pH至6.5-7.5。
2、薄荷腦加薄荷油、桉葉油、乙醇攪拌溶解加入甘油充分混合均勻。
3、再攪拌將2項緩緩加于1項中，并充分攪拌均勻。
4、過濾，從濾器上補加蒸餾水至全量，檢驗澄明度，pH效價合格后供灌裝于常壓噴中，每支20ml，全檢合格后包裝即得。
實施例3一種牙周袋用顆粒劑的制備配方抗牙周病特異性復合IgY 100g羥丙基甲基纖維素(HPMC)400g羥丙基甲基纖維素磷苯二甲酸酯(HPMCP) 400g膠性微粉硅膠 20g聚乙二醇4000(PEG 4000)80g丙 酮適量全 量1000g制備工藝1、將特異性復合IgY，HPMC、HPMCP膠性SiO2和PHG4000混合均勻一同過30目篩預混兩次；2、加入丙酮適量制成適宜軟性材料；3、裝入九號針筒，擠出成型，室溫下揮去溶劑，再真空除去溶劑；4、將上述成型物切成細條狀使重量在1.5-2mg之間，密封包裝即得抗牙周病復合IgY條粒劑，用于嵌入牙周袋除牙菌斑消炎治療。
實施例4制備一種抗牙周病特異性復合IgY含片配方抗牙周病特異性復合IgY 3.8g山 梨 醇505.5g麥芽糊精225g阿斯巴甜0.9g薄 荷 醇1.5g薄 荷 油0.98ml桉 葉 油0.33ml2％羥丙甲基纖維素50％乙醇液 適量乙 醇 適量制 成 1000片制備工藝1、山梨醇、麥芽糊精、阿巴斯甜分別過80目篩，按配方比例混合均勻，過60目篩一次；2、以2％羥丙甲基纖維素50％乙醇液作粘合劑，加入上述混合粉中制成適宜軟材，16目尼龍篩制粒，60#通風干燥，顆粒水分3-5％收粒，過14目篩整粒，篩出適量細粉加入IgY粉混勻，并混入顆粒中拌勻；3、薄荷醇加薄荷油、桉葉油并加乙醇適量(約5ml)溶解，噴于上述顆粒中密閉4小時，加入硬脂酸鎂(按總量1％)混均壓片，每片重約0.75g。
權利要求
1.一種抗牙周病特異性IgY，其特征在于該抗牙周病特異性IgY的制備方法包括下列步驟分離和培養引致牙周病的主要病原體，制備單一或復合的牙周病病原體抗原；制備免疫蛋；制備抗牙周病特異性IgY粗提物；抗牙周病特異性IgY粗提物的純化；制備多種抗牙周病特異性IgY制劑。
2.如權利要求1所述的抗牙周病特異性IgY，其特征在于該抗牙周病特異性IgY的制備方法包括下列步驟在篩選和分類組合這些病原體的基礎上分別制備單一或復合的牙周病病原體抗原按照這些病原微生物的培養特性和最適培養條件，分別選擇適宜的培養基，進行菌株大量繁殖和擴增，然后收獲培養物，進行提純、菌株計數、稀釋分裝；將培養好的病原體單獨或按適當比例混合，再按1∶1比例或其他適當比例分別加入福氏佐劑，置入高速勻漿機中高速勻化，形成油包水溶液，即制成單一或復合的牙周病病原體抗原；制備免疫蛋選擇具有高免疫應答能力的產蛋SPF健康母禽，每只在胸部肌肉或皮下分別多點注射所制備的單一或復合牙周病病原體抗原，在第一次注射后，間隔7天，再以同樣劑量、方法注射第二次；第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第三次，第一次注射20天后，根據測得血清和卵黃中復合IgY的效價情況揀取高效價免疫蛋，并對應不同抗原對免疫蛋編號標記；制備抗牙周病致病菌特異性復合IgY粗品將不同抗原分別免疫的母禽所產禽蛋用消毒液浸泡或擦拭，用無菌純水沖洗晾干，再分別置打蛋機中，打碎蛋殼，用卵黃篩濾除蛋清，留取蛋黃，加入5-8倍蒸餾水稀釋混勻，用1mol NaOH或HCL液調節pH至5.5-6.0，4-6℃下靜置過夜，此稀釋液以1000-3000r/min離心20分鐘，取上清用截留分子量5-10萬Da超濾膜濃縮15-20倍，濃縮液用凍干法干燥，將各單一抗原的IgY凍干粉按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10比例混合，即得抗牙周病特異性復合IgY粗品；抗牙周病致病菌特異性IgY粗品的純化將以上工藝所制取的抗牙周病致病菌特異性IgY粗品分別先后過離子交換柱和凝膠層析柱，即得純IgY。
3.如權利要求1或2所述的抗牙周病特異性IgY，其特征在于該抗牙周病特異性IgY的制備方法中引致牙周病的病原體包括牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、放線共生放線菌、粘性放線菌、福賽類桿菌、齒垢密螺旋體、中間類桿菌、牙齦類桿菌。
4.如權利要求1或2所述的抗牙周病特異性IgY，其特征在于該抗牙周病特異性IgY的制備方法中制備免疫蛋所采用的產蛋禽類包括母雞、母鴨、母鵝、火雞、鴕鳥。
5.如權利要求2所述的抗牙周病特異性IgY，其特征在于該抗牙周病特異性IgY的制備方法中所述復合的牙周病病原體抗原的制備是這樣的將培養好并稀釋分裝的各病原體按1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10依此類推的比例均勻混合，加入福氏佐劑，再放入高速勻漿機中以10000-30000r/min勻化，使成為均一W/O乳狀液，制得復合的牙周病病原體抗原。
6.如權利要求5所述的抗牙周病特異性IgY，其特征在于所述復合的牙周病病原體抗原中各組分按如下百分比混合牙齦卟啉單胞菌20-5％具核梭桿菌20-5％放線共生放線菌20-5％粘性放線菌15-10％福賽類桿菌10-20％齒垢密螺旋體 5-15％中間類桿菌5-20％牙齦類桿菌5-20％
7.如權利要求1或2所述的抗牙周病特異性IgY，其特征在于將0.02-80％的特異性IgY配以99.98-20％的藥用輔料，可制成臨床口腔科可接受的口噴劑、漱口水、含片、棒狀治療劑或牙膏。
8.一種抗牙周病特異性雞IgY，其特征在于這種抗牙周病特異性雞IgY的制備方法包括下列步驟選具高免疫應答能力的良種母雞用牙齦卟啉單胞菌制作抗原，分別免疫1000只母雞，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再注射一次，共三次，于第一次注射后第7個月，將這些母雞所產的蛋標記后，按常規方法分別提取其IgY；以ELISA法(酶聯免疫吸附實驗)檢測所制得的IgY的效價；選出其中IgY效價≥256的母雞200只，再用這批母雞所產的蛋孵出優良雞種，待其長大至2-3個月，作為優選的高免疫應答能力的特種母雞；牙周病病原體復合抗原的制備按照牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、放線共生放線菌、粘性放線菌、福賽類桿菌、齒垢密螺旋體、中間類桿菌、牙齦類桿菌的培養特性和最適培養條件，分別選擇適宜的培養基，進行菌株大量繁殖和擴增，然后收獲培養物，進行提純、菌株計數、稀釋分裝；將以上培養純化分裝好的單一抗原參照牙周病菌斑中所出現機率和所占比例，按如下百分比混合牙齦卟啉單胞菌20-5％具核梭桿菌20-5％放線共生放線菌20-5％粘性放線菌15-10％福賽類桿菌10-20％齒垢密螺旋體 5-15％中間類桿菌5-20％牙齦類桿菌5-20％然后向含20-35億菌數/0.5ml混合菌液中，按1∶1的比例加入福氏佐劑，再放入高速勻漿機中以10000-30000r/min勻化，使成為均一W/O乳狀液，制得牙周病致病菌復合抗原；制備免疫蛋用所制得的牙周病致病菌復合抗原，采用皮下注射和翅靜脈注射相結合的免疫法，分別對優選的特種母雞進行免疫，每只母雞每次注射量達到1ml抗原，注射后第7天、第14天再同樣各注射一次進行強化，第一次免疫20天后，開始揀取免疫雞蛋至第10個月終止并淘汰母雞；抗牙周病特異性IgY的制備首先將免疫蛋洗凈，酒精消毒晾干；用打蛋機將免疫蛋打碎，蛋黃篩篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻；加入4-6倍蒸餾水，混合均勻；用1.0N HCL溶液調整pH至6.0-6.5，進一步充分攪拌均勻，4-6℃下靜置過夜，將此稀釋液2000r/min離心20分鐘；取上清液用截留分子量7-10萬超濾膜濃縮1/20；濃縮液加入0.1-0.3％海藻酸鈉充分混勻，4℃過夜，12000rpm離心20分鐘；取上清超濾；繼而用膜過濾技術除菌；冷凍干燥，即制得抗牙周病特異性IgY粗提物；過離子交換柱和凝膠交換柱，對抗牙周病特異性IgY粗提物進行純化，即得純IgY。
9.一種抗牙周病特異性鴨IgY，其特征在于這種抗牙周病特異性鴨IgY的制備方法包括下列步驟選具高免疫應答能力的良種鴨用牙齦卟啉單胞菌制作抗原，分別免疫1000只母鴨，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再注射一次，共三次，于第一次注射后第7個月，將這些鴨所產的蛋標記后，按常規方法分別提取其IgY；以ELISA法(酶聯免疫吸附實驗)檢測所制得的IgY的效價；選出其中IgY效價≥256的鴨200只，再用這批鴨所產的蛋孵出優良鴨種，待其長大至2-3個月，作為優選的高免疫應答能力的特種母鴨；牙周病病原體復合抗原的制備按照牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、放線共生放線菌、粘性放線菌、福賽類桿菌、齒垢密螺旋體、中間類桿菌、牙齦類桿菌的培養特性和最適培養條件，分別選擇適宜的培養基，進行菌株大量繁殖和擴增，然后收獲培養物，進行提純、菌株計數、稀釋分裝；將以上培養純化分裝好的單一抗原參照牙周病菌斑中所出現機率和所占比例，按如下百分比混合牙齦卟啉單胞菌 20-5％具核梭桿菌 20-5％放線共生放線菌 20-5％粘性放線菌 15-10％福賽類桿菌 10-20％齒垢密螺旋體 5-15％中間類桿菌 5-20％牙齦類桿菌 5-20％然后向含20-35億菌數/0.5ml混合菌液中，按1∶1的比例加入福氏佐劑，再放入高速勻漿機中以10000-30000r/min勻化，使成為均一W/O乳狀液，制得牙周病致病菌復合抗原；制備免疫蛋用所制得的牙周病致病菌復合抗原，采用皮下注射和翅靜脈注射相結合的免疫法，分別對優選的特種母鴨進行免疫，每只母鴨每次注射量達到1-2ml抗原，注射后第7天、第14天再同樣各注射一次進行強化，第一次免疫20天后，開始揀取免疫鴨蛋至第10個月終止并淘汰母鴨；抗牙周病特異性IgY的制備首先將免疫蛋洗凈，酒精消毒晾干；用打蛋機將免疫蛋打碎，蛋黃篩篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻；加入4-6倍蒸餾水，混合均勻；用1.0N HCL溶液調整pH至6.0-6.5，進一步充分攪拌均勻，4-6℃下靜置過夜，將此稀釋液2000r/min離心20分鐘；取上清液用截留分子量7-10萬超濾膜濃縮至1/20；濃縮液加入0.1-0.3％海藻酸鈉充分混勻，4℃過夜，12000rpm離心20分鐘；取上清超濾；繼而用膜過濾技術除菌；冷凍干燥，即制得抗牙周病特異性IgY粗提物；過離子交換柱和凝膠交換柱，對抗牙周病特異性IgY粗提物進行純化，即得純IgY。
10.一種抗牙周病特異性鵝IgY，其特征在于這種抗牙周病特異性鵝IgY的制備方法包括下列步驟選具高免疫應答能力的良種母鵝用牙齦卟啉單胞菌制作抗原，分別免疫1000只母鵝，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再注射一次，共三次，于第一次注射后第7個月，將這些母鵝所產的蛋標記后，按常規方法分別提取其IgY；以ELISA法(酶聯免疫吸附實驗)檢測所制得的IgY的效價；選出其中IgY效價≥256的母鵝200只，再用這批母鵝所產的蛋孵出優良鵝種，待其長大至2-3個月，作為優選的高免疫應答能力的特種母鵝；牙周病病原體復合抗原的制備按照牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、放線共生放線菌、粘性放線菌、福賽類桿菌、齒垢密螺旋體、中間類桿菌、牙齦類桿菌的培養特性和最適培養條件，分別選擇適宜的培養基，進行菌株大量繁殖和擴增，然后收獲培養物，進行提純、菌株計數、稀釋分裝；將以上培養純化分裝好的單一抗原參照牙周病菌斑中所出現機率和所占比例，按如下百分比混合牙齦卟啉單胞菌20-5％具核梭桿菌20-5％放線共生放線菌20-5％粘性放線菌15-10％福賽類桿菌10-20％齒垢密螺旋體 5-15％中間類桿菌5-20％牙齦類桿菌5-20％然后向含20-35億菌數/0.5ml混合菌液中，按1∶1的比例加入福氏佐劑，再放入高速勻漿機中以10000-30000r/min勻化，使成為均一W/O乳狀液，制得牙周病致病菌復合抗原；分別對優選的特種母鵝進行免疫用所制得的牙周病致病菌復合抗原，采用皮下注射和翅靜脈注射相結合的免疫法，分別對優選的特種母鵝進行免疫，每只母鵝每次注射量達到2-10ml抗原，注射后第7天、第14天再同樣各注射一次進行強化，第一次免疫20天后，開始揀取免疫鵝蛋至第10個月終止并淘汰母鵝；抗牙周病特異性IgY的制備首先將免疫蛋洗凈，酒精消毒晾干；用打蛋機將免疫蛋打碎，蛋黃篩篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻；加入4-6倍蒸餾水，混合均勻；用1.0NHCL溶液調整pH至6.0-6.5，進一步充分攪拌均勻，4-6℃下靜置過夜，將此稀釋液2000r/min離心20分鐘；取上清液用截留分子量7-10萬超濾膜濃縮至1/20；濃縮液加入0.1-0.3％海藻酸鈉充分混勻，4℃過夜，12000rpm離心20分鐘；取上清超濾；繼而用膜過濾技術除菌；冷凍干燥，即制得抗牙周病特異性IgY粗提物；過離子交換柱和凝膠交換柱，對抗牙周病特異性IgY粗提物進行純化，即得純IgY。
11.一種抗牙周病特異性火雞IgY，其特征在于這種抗牙周病特異性火雞IgY的制備方法包括下列步驟選具高免疫應答能力的良種產蛋火雞用牙齦卟啉單胞菌制作抗原，分別免疫1000只產蛋火雞，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再注射一次，共三次，于第一次注射后第7個月，將這些產蛋火雞所產的蛋標記后，按常規方法分別提取其IgY；以ELISA法(酶聯免疫吸附實驗)檢測所制得的IgY的效價；選出其中IgY效價≥256的產蛋火雞200只，再用這批產蛋火雞所產的蛋孵出優良火雞種，待其長大至2-3個月，作為優選的高免疫應答能力的特種產蛋火雞；牙周病病原體復合抗原的制備按照牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、放線共生放線菌、粘性放線菌、福賽類桿菌、齒垢密螺旋體、中間類桿菌、牙齦類桿菌的培養特性和最適培養條件，分別選擇適宜的培養基，進行菌株大量繁殖和擴增，然后收獲培養物，進行提純、菌株計數、稀釋分裝；將以上培養純化分裝好的單一抗原參照牙周病菌斑中所出現機率和所占比例，按如下百分比混合牙齦卟啉單胞菌20-5％具核梭桿菌20-5％放線共生放線菌20-5％粘性放線菌15-10％福賽類桿菌10-20％齒垢密螺旋體 5-15％中間類桿菌5-20％牙齦類桿菌5-20％然后向含20-35億菌數/0.5ml混合菌液中，按1∶1的比例加入福氏佐劑，再放入高速勻漿機中以10000-30000r/min勻化，使成為均一W/O乳狀液，制得牙周病致病菌復合抗原；分別對優選的特種產蛋火雞進行免疫用所制得的牙周病致病菌復合抗原，采用皮下注射和翅靜脈注射相結合的免疫法，分別對優選的特種產蛋火雞進行免疫，每只產蛋火雞每次注射量達到3-15ml抗原，注射后第7天、第14天再同樣各注射一次進行強化，第一次免疫20天后，開始揀取免疫火雞蛋至第10個月終止并淘汰產蛋火雞；抗牙周病特異性IgY的制備首先將免疫蛋洗凈，酒精消毒晾干；用打蛋機將免疫蛋打碎，蛋黃篩篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻；加入4-6倍蒸餾水，混合均勻；用1.0N HCL溶液調整pH至6.0-6.5，進一步充分攪拌均勻，4-6℃下靜置過夜，將此稀釋液2000r/min離心20分鐘；取上清液用截留分子量7-10萬超濾膜濃縮至1/20；濃縮液加入0.1-0.3％海藻酸鈉充分混勻，4℃過夜，12000rpm離心20分鐘；取上清超濾；繼而用膜過濾技術除菌；冷凍干燥，即制得抗牙周病特異性IgY粗提物；過離子交換柱和凝膠交換柱，對抗牙周病特異性IgY粗提物進行純化，即得純IgY。
12.一種抗牙周病特異性鴕鳥IgY，其特征在于這種抗牙周病特異性鴕鳥IgY的制備方法包括下列步驟選具高免疫應答能力的良種產蛋鴕鳥用牙齦卟啉單胞菌制作抗原，分別免疫1000只產蛋鴕鳥，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再注射一次，共三次，于第一次注射后第7個月，將這些產蛋鴕鳥所產的蛋標記后，按常規方法分別提取其IgY；以ELISA法(酶聯免疫吸附實驗)檢測所制得的IgY的效價；選出其中IgY效價≥256的產蛋鴕鳥200只，再用這批產蛋鴕鳥所產的蛋孵出優良鴕鳥種，待其長大至2-3個月，作為優選的高免疫應答能力的特種產蛋鴕鳥；牙周病病原體復合抗原的制備按照牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、放線共生放線菌、粘性放線菌、福賽類桿菌、齒垢密螺旋體、中間類桿菌、牙齦類桿菌的培養特性和最適培養條件，分別選擇適宜的培養基，進行菌株大量繁殖和擴增，然后收獲培養物，進行提純、菌株計數、稀釋分裝；將以上培養純化分裝好的單一抗原參照牙周病菌斑中所出現機率和所占比例，按如下百分比混合牙齦卟啉單胞菌20-5％具核梭桿菌20-5％放線共生放線菌20-5％粘性放線菌15-10％福賽類桿菌10-20％齒垢密螺旋體 5-15％中間類桿菌5-20％牙齦類桿菌5-20％然后向含20-35億菌數/0.5ml混合菌液中，按1∶1的比例加入福氏佐劑，再放入高速勻漿機中以10000-30000r/min勻化，使成為均一W/O乳狀液，制得牙周病致病菌復合抗原；分別對優選的特種產蛋鴕鳥進行免疫用所制得的牙周病致病菌復合抗原，采用皮下注射和翅靜脈注射相結合的免疫法，分別對優選的特種產蛋鴕鳥進行免疫，每只產蛋鴕鳥每次注射量達到3-15ml抗原，注射后第7天、第14天再同樣各注射一次進行強化，第一次免疫20天后，開始揀取免疫鴕鳥蛋至第10個月終止并淘汰產蛋鴕鳥；抗牙周病特異性IgY的制備首先將免疫蛋洗凈，酒精消毒晾干；用打蛋機將免疫蛋打碎，蛋黃篩篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻；加入4-6倍蒸餾水，混合均勻；用1.0N HCL溶液調整pH至6.0-6.5，進一步充分攪拌均勻，4-6℃下靜置過夜，將此稀釋液2000r/min離心20分鐘；取上清液用截留分子量7-10萬超濾膜濃縮至1/20；濃縮液加入0.1-0.3％海藻酸鈉充分混勻，4℃過夜，12000rpm離心20分鐘；取上清超濾；繼而用膜過濾技術除菌；冷凍干燥，即制得抗牙周病特異性IgY粗提物；過離子交換柱和凝膠交換柱，對抗牙周病特異性IgY粗提物進行純化，即得純IgY。
13.一種抗牙周病口腔噴劑的制備方法，其特征在于該方法為按以下配方調配100000體積份抗牙周病特異性IgY組合溶液抗牙周病特異性IgY 150重量份甘 油 1500重量份甘露醇 1500重量份薄荷醇 200重量份薄荷油 300重量份桉葉油 100重量份乙 醇 2000體積份蒸餾水 適量制 成 100000體積份制備工藝取總量80％的蒸餾水加入甘露醇攪拌溶解，再加入IgY溶解攪拌均勻，用1mol/L NaOH調節pH至6.5-7.5；薄荷醇加薄荷油、桉葉油、乙醇攪拌溶解加入甘油充分混合均勻；在攪拌下將后項緩緩加于前項中，并充分攪拌均勻；過濾，從濾器上補加蒸餾水至全量，檢驗澄明度，pH效價合格后供灌裝于常壓噴瓶中，每支20ml，全檢合格后包裝即得。
14.一種牙周袋用顆粒劑的制備方法，其特征在于該方法為配方抗牙周病特異性復合IgY 100重量份羥丙基甲基纖維素(HPMC) 400重量份羥丙基甲基纖維素磷苯二甲酸酯(HPMCP)400重量份膠性微粉硅膠 20重量份聚乙二醇4000(PEG 4000) 80重量份丙 酮 適量全 量 1000重量份制備工藝將特異性復合IgY，HPMC、HPMCP膠性SiO2和PHG4000混合均勻一同過30目篩預混兩次；加入丙酮適量制成適宜軟性材料；裝入九號針筒，擠出成型，室溫下揮去溶劑，再真空除去溶劑；將上述成型物切成細條狀使重量在1.5-2mg之間，密封包裝即得抗牙周病復合IgY顆粒劑。
15.一種抗牙周病特異性復合IgY含片的制備方法，其特征在于該方法為配方抗牙周病特異性復合IgY 3.8重量份山 梨 醇505.5重量份麥芽糊精225重量份阿斯巴甜0.9重量份薄 荷 醇1.5重量份薄 荷 油0.98體積份桉 葉 油0.33體積份2％羥丙甲基纖維素50％乙醇液 適量乙 醇 適量制 成 1000片制備工藝山梨醇、麥芽糊精、阿巴斯甜分別過80目篩，按配方比例混合均勻，過60目篩一次；以2％羥丙甲基纖維素50％乙醇液作粘合劑，加入上述混合粉中制成適宜軟材，16目尼龍篩制粒，60℃通風干燥，顆粒水分3-5％收粒，過14目篩整粒，篩出適量細粉加入IgY粉混勻，并混入顆粒中拌勻；薄荷醇加薄荷油、桉葉油并加乙醇適量(約5體積份)溶解，噴于上述顆粒中密閉4小時，加入硬脂酸鎂(按總量1％)混均壓片，每片重約0.75重量份。
16.一種抗牙周病牙膏的制備方法，其特征在于該方法為將適量抗牙周病特異性復合IgY加入牙膏中，混勻即得。
全文摘要
本發明公開了一種抗牙周病特異性IgY及其制備方法和制劑。本發明制備方法包括下列步驟篩選出引致牙周病的主要病原體，在篩選和分類組合各種病原體的基礎上，分別制備單一或復合的病原體抗原，制備免疫蛋，制備抗牙周病各種病原體特異性IgY粗提物，抗牙周病各種病原體特異性IgY粗提物的純化，本發明抗牙周病特異性IgY多種制劑用于牙周病的預防和治療具有長效、安全、使用方便的特點。
文檔編號C07K16/02GK1482141SQ03153298
公開日2004年3月17日 申請日期2003年8月15日 優先權日2003年8月15日
發明者包晟, 楊榮鑑, 李同森, 晟 包 申請人:雅臣藥業集團(遠東)有限公司