一種高效的聚乙二醇活化工藝及活化物的蛋白質(zhì)修飾應(yīng)用的制作方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：一種高效的聚乙二醇活化工藝及活化物的蛋白質(zhì)修飾應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及蛋白質(zhì)修飾劑及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
聚乙二醇(PEG)化學(xué)修飾蛋白質(zhì)作為一種提高蛋白質(zhì)在醫(yī)藥和生物技術(shù)領(lǐng)域應(yīng)用的方法，正引起人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾，蛋白質(zhì)的很多特征會(huì)發(fā)生變化，同時(shí)有效地保持其主要的生物功能，如酶活性或受體識(shí)別能力。通過(guò)PEG修飾可掩飾蛋白質(zhì)的表面并增加其分子體積，從而降低被腎小球過(guò)濾的幾率；還可防止抗體、抗原、酶等的靠近，減少被蛋白酶類(lèi)的降解。PEG還可將自身的理化性質(zhì)賦予蛋白質(zhì)，例如改變蛋白質(zhì)的生物體內(nèi)的分布及溶解性[i]，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)藥物的靶向給藥。
許多實(shí)驗(yàn)已證明，蛋白質(zhì)經(jīng)PEG修飾后免疫原性與抗原性大大降低。例如經(jīng)PEG修飾的牛血清蛋白(BSA)不與BSA抗血清發(fā)生沉淀，經(jīng)PEG修飾的BSA免疫血清既不與BSA反應(yīng)，也不與經(jīng)PEG修飾的BSA反應(yīng)，可見(jiàn)BSA喪失了免疫原性和抗原性[ii]。蛋白質(zhì)經(jīng)PEG修飾后其循環(huán)半衰期也有不同程度提高，如超氧化物歧化酶(SOD)經(jīng)PEG化后，在體內(nèi)的半衰期(T1/2)從0.667h延長(zhǎng)到5.09h[iii]。另外，經(jīng)PEG共價(jià)修飾后蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性也往往有不同程度的提高，許多不溶性藥物經(jīng)PEG修飾后給藥更為容易[iv]。
目前，至少有2種PEG修飾的蛋白藥物(PEG-L-天冬酰胺酶，PEG-腺苷脫氨酶)由FDA批準(zhǔn)上市，有5種以上處于臨床實(shí)驗(yàn)階段。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，有27種酶處于研究階段?？梢?jiàn)，PEG化學(xué)修飾技術(shù)是生化藥物研究開(kāi)發(fā)的重要手段，如果與基因重組技術(shù)相結(jié)合，將有更好的發(fā)展前景。
另外，由于PEG可改變蛋白質(zhì)的可溶性、生物相容性、藥代動(dòng)力學(xué)等性質(zhì)，在應(yīng)用生物技術(shù)領(lǐng)域也具有很大潛力。例如，在有機(jī)相中不可溶的酶經(jīng)PEG修飾后變?yōu)榭扇芮颐富钚缘玫奖Ａ?，這對(duì)生物催化及制藥技術(shù)的發(fā)展具有重大意義。
PEG簡(jiǎn)介PEG是一種線性的或分支的中性聚合物，溶于水及其他很多有機(jī)溶劑，其分子式為HO-(CH2CH2O)n-CHCH2OH；用于蛋白質(zhì)修飾的聚乙二醇多為單甲氧基聚乙二醇(mPEG)，分子式為HO-(CH2CH2O)n-CHCH2O-CH3。mPEG分子只有一個(gè)羥基用于偶聯(lián)反應(yīng)，另一端的羥基被甲基化，避免了偶聯(lián)反應(yīng)中蛋白質(zhì)分子的相互交聯(lián)。
PEG化學(xué)修飾蛋白質(zhì)在生物技術(shù)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域引起人們很大興趣有以下幾個(gè)原因(1)PEG沒(méi)有毒性，已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用于體內(nèi)服用[v，vi，vii]。
(2)靜脈注射到人體內(nèi)的游離PEG很容易通過(guò)腎排出[viii]。
(3)PEG的免疫原性很小。
(4)在蛋白質(zhì)適當(dāng)?shù)牟课还矁r(jià)偶聯(lián)上PEG后，活性不會(huì)完全喪失，某些蛋白質(zhì)還有活性升高的情況。并且能消除一些異體蛋白質(zhì)的免疫原性，能延長(zhǎng)蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)的半衰期[ix]。
(5)水溶液中PEG存在的條件下它能有效地排除其它聚合物，這一性質(zhì)已經(jīng)應(yīng)用到雙水相萃取的研究中。
PEG與蛋白質(zhì)偶聯(lián)后，PEG可以穩(wěn)定被修飾的蛋白質(zhì)分子；降低或消除蛋白質(zhì)的免疫原性及提高耐受性；降低蛋白質(zhì)被腎臟清除的速率；提高蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞膜的穿透力；改善藥物動(dòng)力學(xué)。
PEG活化技術(shù)單甲氧基聚乙二醇的一端羥基被甲基封閉，可以避免蛋白質(zhì)的交聯(lián)；另一端的羥基化學(xué)反應(yīng)活性較低，只能在較激烈的條件下直接與其它基團(tuán)反應(yīng)，而這樣的條件常為蛋白質(zhì)所不能耐受。因此需要用一定的方法改造PEG的末端羥基，即連接特定的活潑基團(tuán)之后才能在溫和的條件下，以較高的反應(yīng)速率與蛋白質(zhì)相偶聯(lián)。這便是PEG的活化技術(shù)(activation)。
PEG修飾的位點(diǎn)可以是蛋白質(zhì)表面的氨基，也可以是巰基或其它特殊基團(tuán)，但大多數(shù)是修飾氨基。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子表面的游離氨基，具有較高的親核反應(yīng)活性，使之成為蛋白質(zhì)化學(xué)修飾中最常用的被修飾基團(tuán)。
幾種用于偶聯(lián)蛋白質(zhì)分子的mPEG的常用的活化方法在文獻(xiàn)以及專(zhuān)利中都有報(bào)道。下圖列出了常用的PEG活化方法，即mPEG的活性中間體的制備。mPEG的活性中間體含有能和蛋白質(zhì)分子上的氨基或其它活性基團(tuán)相反應(yīng)的功能基團(tuán)，與蛋白質(zhì)分子的反應(yīng)條件必須足夠溫和，以維持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。同時(shí)，為達(dá)到此目的，應(yīng)使用以水為溶劑的緩沖液以及接近中性的pH值。
在DAVIS及其最初合作者的研究工作中，三聚尿氰(1、2)和PEG上的醇羥基反應(yīng)，以使三聚尿氰(或稱(chēng)三氯均嗪)環(huán)上的鹵原子只有一個(gè)被取代，其它的鹵原子可和蛋白質(zhì)分子上的氨基反應(yīng)(三氯均嗪，第一個(gè)Cl在4℃就可以反應(yīng)，第二個(gè)在25℃，第三個(gè)在80℃才反應(yīng))。這一方法已被很多研究者所采用及改進(jìn)，至今仍是最常用的方法之一。雖然這種活化只需一步即可完成，但因三鹵均嗪衍生物的毒性以及過(guò)強(qiáng)的反應(yīng)活性而使反應(yīng)速度難以控制，因而使其應(yīng)用受到限制。事實(shí)上，尿嗪鹵化物被認(rèn)為是蛋白質(zhì)修飾最不合適的試劑。用其修飾的蛋白質(zhì)常伴隨生物活性的較大損失。
用N-羥基琥珀酰亞胺與其它化學(xué)試劑(3～8)聯(lián)合對(duì)PEG活化的方法和修飾產(chǎn)物，實(shí)施可行性好、活性高，是近年來(lái)常被采用的方法和修飾劑，但這些修飾劑存在著容易水解、儲(chǔ)存性能不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，而且對(duì)某些蛋白質(zhì)反應(yīng)活性過(guò)高，不利于控制修飾度和修飾位點(diǎn)。
1986年That T.Ngo在US4,582,875中公開(kāi)了一種用2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸鹽(2-Fluoro-1-methylpyridinium toluene-4-sulfonate)活化固體載體聚合物羥基的方法，如多糖介質(zhì)等。該試劑也可以用于PEG或mPEG羥基的活化。用2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸鹽活化的PEG或mPEG與前述方法的活化產(chǎn)物相比具有抗水解能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，因此特別適合于在水性溶液中對(duì)多肽或者蛋白質(zhì)等生物活性分子進(jìn)行活化修飾。但是That T.Ngo提供的活化方法并不特別適合于PEG或mPEG的活化，主要因?yàn)?1)該專(zhuān)利所公開(kāi)的工藝是針對(duì)不溶于活化用溶劑的固體載體，而PEG或mPEG溶解于活化用溶劑，因此，包括原料處理、活化條件、產(chǎn)物分離、產(chǎn)物純化等工藝將不同；(2)用于生物活性分子化學(xué)修飾的活化PEG或mPEG都有很高的要求，例如活化產(chǎn)物的活化率要高(＞95％)，活化產(chǎn)物的純度要高(＞99％)等等。但是，很可惜用That T.Ngo提供的活化方法得到的活化PEG或mPEG并不能滿(mǎn)足這些要求，因?yàn)樗鼈兊幕罨容^低(＜30％)，產(chǎn)物的純度較低(＜75％)。用這樣的活化PEG或mPEG對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾顯然是不理想的，因?yàn)榛罨实蛣?shì)必要用很高濃度的修飾劑，而修飾劑濃度過(guò)高對(duì)蛋白質(zhì)的生物活性保護(hù)是不利的；修飾劑純度低的話其含有的一些雜質(zhì)也會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的生物活性造成傷害。
為此，本發(fā)明提供一種高效的聚乙二醇(PEG)末端羥基的活化工藝及其活化產(chǎn)物在蛋白質(zhì)修飾中的應(yīng)用。其特征是(1)利用水和甲苯在140℃共沸的性質(zhì)將PEG溶解在甲苯中，然后加熱到140℃共沸除去PEG中的水份(PEG水份含量＜50ppm)。(2)無(wú)水PEG和2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸鹽在無(wú)水的極性有機(jī)溶劑(水份含量＜50ppm)中進(jìn)行反應(yīng)，例如乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮等。(3)反應(yīng)過(guò)程中滴加叔胺或者吡啶等有機(jī)堿維持溶液pH在8～9之間。(4)利用乙醚沉淀的方法分離PEG活化產(chǎn)物；利用異丙醇重結(jié)晶的方法純化PEG活化產(chǎn)物。(5)純凈的PEG活化產(chǎn)物在緩沖水溶液中與蛋白質(zhì)等帶有親核基團(tuán)的生物活性分子反應(yīng)，得到PEG與該分子的偶聯(lián)物。本發(fā)明提供的PEG的活化方法與US4,582,875中公開(kāi)的方法相比具有以下的優(yōu)點(diǎn)產(chǎn)物活化率高(95％vs 30％)；產(chǎn)物純度高(99％vs 75％)。另外，還具有活化產(chǎn)物的化學(xué)穩(wěn)定性好；修飾反應(yīng)條件溫和；修飾速度可控性好；修飾產(chǎn)物的化學(xué)穩(wěn)定性好；修飾產(chǎn)物的生物活性保留值高等優(yōu)點(diǎn)。所以本發(fā)明的活化PEG能應(yīng)用于各種帶親核基團(tuán)的分子的修飾，尤其適用于各種帶氨基和巰基的生物活性分子，例如多肽和蛋白質(zhì)的修飾，以達(dá)到降低其免疫原性、降低其被體內(nèi)酶分解的速度、增加其分子量和溶解度、改善其在體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)等目的。
蛋白質(zhì)修飾技術(shù)本發(fā)明提供的高純度PEG修飾劑對(duì)三種蛋白質(zhì)藥物進(jìn)行了修飾，即血紅蛋白、重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rh G-CSF)以及重組人a-干擾素(rhIFN-a)。
血液最重要的生物學(xué)功能是通過(guò)血紅蛋白實(shí)現(xiàn)的。將從動(dòng)物血液或人體血液中提取的血紅蛋白再輸入人體，可以期望獲得血紅蛋白的攜氧功能。首次報(bào)告使用血紅蛋白作為紅細(xì)胞替代物是在1898年，Von Stark用血紅蛋白治療一個(gè)貧血病人。盡管做了許多嘗試，結(jié)果存在著(1)血紅蛋白很快從腎臟排泄出去，(2)腎毒性，(3)血壓升高等現(xiàn)象；經(jīng)人們研究發(fā)現(xiàn)快速?gòu)哪I臟排除是由于血紅蛋白分子太小，腎毒性是由于血紅蛋白進(jìn)入血液后分解成二聚體，二聚體具有腎毒性；血壓升高則是因?yàn)椤毖芑钚浴毙?yīng)。血紅蛋白由于有上述缺陷，因而不能直接用作血液替代品。一個(gè)解決的辦法就是對(duì)血紅蛋白用聚乙二醇或其它大分子進(jìn)行化學(xué)修飾。這方面的研究在60-70年代作出了幾個(gè)非常重要的發(fā)現(xiàn)。然而，真正努力開(kāi)發(fā)用于人體的修飾血紅蛋白是由于受到公眾對(duì)于捐獻(xiàn)血液中存在的HIV和丙肝及其它病毒的關(guān)注在80年代才開(kāi)始的。
人體內(nèi)粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)由單核巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞和骨髓間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，其功能是(1)作用于中性粒細(xì)胞的前體細(xì)胞，促進(jìn)多功能干細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，刺激其增殖和分化，加速粒細(xì)胞的生成；(2)感染時(shí)G-CSF的分泌增加，可促進(jìn)中性粒細(xì)胞向炎癥部位移動(dòng)，增強(qiáng)其對(duì)病原微生物的吞噬和殺傷力；(3)加強(qiáng)中性粒細(xì)胞依賴(lài)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，增強(qiáng)其抗腫瘤能力；(4)活化單核巨噬細(xì)胞功能；(5)誘導(dǎo)某些白血病細(xì)胞分化和成熟。自從1986年Seuza等報(bào)道人粒細(xì)胞集落刺激因子基因在大腸桿菌中重組成功，表達(dá)并制備出重組蛋白以來(lái)，世界上一些藥業(yè)公司相繼對(duì)這一產(chǎn)品進(jìn)行了開(kāi)發(fā)、報(bào)批和批量生產(chǎn)，為這一產(chǎn)品的臨床研究和應(yīng)用創(chuàng)造了條件。然而其在人體內(nèi)的循環(huán)半衰期卻很短，主要是由于注入人體后，免疫系統(tǒng)會(huì)識(shí)別G-CSF并發(fā)生免疫反應(yīng)將其清除，同時(shí)體內(nèi)的蛋白水解酶也會(huì)將其水解一部分，腎小球?qū)⑵渥鳛樾》肿游镔|(zhì)濾出。綜上原因可見(jiàn)，G-CSF實(shí)際在體內(nèi)的利用率是很低的，這無(wú)疑是一種極大的浪費(fèi)。通過(guò)將PEG等大分子與G-CSF偶聯(lián)的方法就可以達(dá)到以下的目的(1)降低G-CSF的免疫原性，使其不因體內(nèi)的免疫反應(yīng)而被清除；(2)增強(qiáng)其抗蛋白酶水解能力；(3)增大G-CSF的分子量，大大降低腎小球?qū)-CSF的過(guò)濾速度。同時(shí)G-CSF的熱穩(wěn)定性、抗酸堿能力及抗變性能力都會(huì)有所增強(qiáng)，最終目的就是要延長(zhǎng)G-CSF在體內(nèi)的循環(huán)半衰期，提高利用率。
干擾素是一種細(xì)胞因子，它是機(jī)體感染病毒時(shí)，宿主細(xì)胞通過(guò)抗病毒應(yīng)答反應(yīng)而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類(lèi)似、功能相近的低分子糖蛋白。干擾素是1957年英國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的。干擾素有多種亞型，其中最大的一類(lèi)亞型是α-干擾素。α-干擾素具有三大功能(1)抗病毒作用這是干擾素最重要的也是應(yīng)用最廣的作用。干擾素通過(guò)抑制病毒復(fù)制和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，從而發(fā)揮抗病毒作用。(2)抗腫瘤作用α-干擾素是臨床上應(yīng)用最廣的治療腫瘤的細(xì)胞因子。它通過(guò)直接抗腫瘤細(xì)胞增殖和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能發(fā)揮抗腫瘤作用。(3)免疫調(diào)節(jié)作用α-干擾素通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，從而間接地發(fā)揮抗病毒作用和抗腫瘤作用。丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染呈全球分布，易慢性化，其中20％的慢性患者將發(fā)展為肝硬化等終末期肝病，而HCV感染引起的肝硬化又是肝細(xì)胞癌變的重要相關(guān)因素。迄今為止，干擾素是唯一相對(duì)有效的治療藥物，然而，僅30％左右的干擾素治療者可保持長(zhǎng)期的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶正常，即使在干擾素治療中合并使用病毒唑，其長(zhǎng)期效果也僅僅達(dá)到40％。干擾素單劑或干擾素聯(lián)合病毒唑治療丙型肝炎的低反應(yīng)率主要與病毒因素、宿主因素以及治療制劑因素三個(gè)方面有關(guān)。干擾素藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程對(duì)有效性的影響與HCV的復(fù)制特性有關(guān)。干擾素吸收后很快并分布到全身，腎臟清除率高，由于其這一特性，天然的干擾素或基因工程干擾素半衰期都很短，在血清中僅持續(xù)6h(4h～8h)。將聚乙二醇與干擾素偶聯(lián)通過(guò)以下幾個(gè)方面的機(jī)制來(lái)延長(zhǎng)蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)的半衰期，從而達(dá)到增強(qiáng)其生物學(xué)活性的作用(1)蛋白質(zhì)與聚乙二醇偶聯(lián)后，分子質(zhì)量增大，皮下注射后吸收緩慢；(2)聚乙二醇的甲基中含有大量的氫原子，其氫鍵可與水分子結(jié)合，因此，增加了聚乙二醇-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的水溶性；(3)聚乙二醇-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的分子質(zhì)量增大，減少了腎臟的排泄。一般分子質(zhì)量在68kD以下的蛋白質(zhì)常由腎小球?yàn)V過(guò)經(jīng)尿排出，聚乙二醇-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物質(zhì)量增大，同時(shí)流體半徑加大，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)減少。聚乙二醇鏈的復(fù)雜程度也會(huì)影響聚乙二醇-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物被腎臟的清除，所以，偶聯(lián)分支鏈PEG的蛋白質(zhì)比偶聯(lián)線性PEG的蛋白質(zhì)腎臟清除率更低，半衰期更長(zhǎng)。(4)PEG干擾了細(xì)胞清除機(jī)制，減少了蛋白質(zhì)的細(xì)胞清除；(5)聚乙二醇與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)物在血液循環(huán)中能抵抗被蛋白酶與肽酶的降解，這一特性可能與PEG包裹了蛋白質(zhì)，阻斷蛋白質(zhì)與蛋白酶的接觸有關(guān)。此外，血液循環(huán)中的胰蛋白酶的作用位點(diǎn)位于賴(lài)氨酸與精氨酸之間，而聚乙二醇與蛋白質(zhì)分子偶聯(lián)的主要位點(diǎn)也是賴(lài)氨酸，該位點(diǎn)與聚乙二醇的偶聯(lián)妨礙了蛋白酶進(jìn)入活性位點(diǎn)；(6)結(jié)合于組氨酸的PEG結(jié)合位點(diǎn)往往位于蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)核心，保證了聚乙二醇化的穩(wěn)定性，(7)PEG本身并不具備抗原性，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與聚乙二醇偶聯(lián)后，PEG遮蓋了蛋白的抗原決定族，從而降低了蛋白的抗原性。
i Francesco M.Veronese.Review Peptide and protein PEGylationa review of problems andsolutions.Biomaterials.2001，22405-417ii Abuchowshi A，Davis FF.Alteration of immunoiogical proporties of bovine serum albumin bycovalent attachment of polyethylene glycol.J Biol Chem，1997，2523568-358liii 楊保珍，張?zhí)烀瘢鯓?shù)歧。聚乙二醇修飾超氧化物歧化酶的研究，藥物生物技術(shù)。1998，5(1)12-16iv Herman S，Hooftman G，Schacht E.Poly(ethylene glycol)with reactive endgroupsI.Modification of proteins.J Bioactive Compatible Polym.1995，10145-87vD.A.Herold，K.Keil，and D.E.Bruns，Biochem.pharmacol，38，73(1989)viH，F(xiàn)，Smyth，Jr，C，P.Carpenter，andC.S.Weil，J，Am，pharm，Assoc。39，349(1950)viiA，J.Johnson，M.H.darpatkin，andJ，Newman，Br.J.Hematol.21，21(1971)viiiC.B.Shaffer and F.H.Critchfield，J.Am.Pharm.Assol，36，152(1947)ixA.Abuchowski，J.R.Mccoy，N.C.Palczuk，Vanes，and F.F.Davis，J.Biol.Chem.，252，3582(1997)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種高效的聚乙二醇(PEG)末端羥基的活化工藝及其活化產(chǎn)物與蛋白質(zhì)等帶親核基團(tuán)的生物活性分子的修飾反應(yīng)方法和反應(yīng)產(chǎn)物。其特征是(1)利用水和甲苯在140℃共沸的性質(zhì)將PEG溶解在甲苯中，然后加熱到140℃共沸除去PEG中的水份(PEG水份含量＜50ppm)。(2)無(wú)水PEG和2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸鹽在無(wú)水的極性有機(jī)溶劑(水份含量＜50ppm)中進(jìn)行反應(yīng)，例如乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮等。(3)反應(yīng)過(guò)程中滴加叔胺或者吡啶等有機(jī)堿維持溶液pH在8～9之間。(4)利用乙醚沉淀的方法分離PEG活化產(chǎn)物；利用異丙醇重結(jié)晶的方法純化PEG活化產(chǎn)物。(5)純凈的PEG活化產(chǎn)物在緩沖水溶液中與蛋白質(zhì)等帶有親核基團(tuán)的生物活性分子反應(yīng)，得到PEG與該分子的偶聯(lián)物。本發(fā)明提供的PEG的活化方法具有以下的優(yōu)點(diǎn)產(chǎn)物活化率高；產(chǎn)物純度高。另外，還具有活化產(chǎn)物的化學(xué)穩(wěn)定性好；修飾反應(yīng)條件溫和；修飾速度可控性好；修飾產(chǎn)物的化學(xué)穩(wěn)定性好；修飾產(chǎn)物的生物活性保留值高等優(yōu)點(diǎn)。所以本發(fā)明的活化PEG能應(yīng)用于各種帶親核基團(tuán)的分子的修飾，尤其適用于各種帶氨基和巰基的生物活性分子，例如多肽和蛋白質(zhì)的修飾，以達(dá)到降低其免疫原性，降低其被體內(nèi)酶分解的速度，增加其分子量和溶解度，改善其在體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)等目的。
本發(fā)明提供的高效活化工藝、高純度活化產(chǎn)物及其與帶親核配基的分子的偶聯(lián)方法和偶聯(lián)產(chǎn)物可以帶來(lái)以下效應(yīng)1.本發(fā)明提供的高效活化工藝及其與帶親核基團(tuán)的分子的偶聯(lián)方法可用于帶羥基的分子的活化，微球、藥物載體、膜等表面的活化及其與帶親核基團(tuán)的分子的連接。
2.各種帶氨基或巰基的蛋白質(zhì)、多肽、核酸的修飾，以達(dá)到降低蛋白質(zhì)等的免疫原性，提高蛋白質(zhì)和多肽的分子量，避免蛋白質(zhì)被酶分解，提高蛋白質(zhì)、多肽、核酸等藥物在體內(nèi)的半衰期，改變蛋白質(zhì)、多肽、核酸等分子在各種溶劑中的溶解度等目的。
3.各種帶親核基團(tuán)的低分子化合物的修飾，以達(dá)到提高低分子化合物的分子量，提高低分子藥物在體內(nèi)的半衰期，改變低分子化合物在各種溶劑中的溶解度等目的。
4.帶羥基的各種低分子化合物的活化，以達(dá)到在低分子化合物上連接其它分子的目的。


圖1聚乙二醇的活化及其與帶親核基團(tuán)分子的偶聯(lián)反應(yīng)示意圖。
圖2(A)和(B)是FMP-mPEG分別在0.5NHCl和0.5NNaOH溶液中的紫外-可見(jiàn)光吸收光譜。
圖3(A)和(b)分別為m-PEG和FMP-mPEG的紅外光譜。
圖4FMP-mPEG修飾蛋白質(zhì)(血紅蛋白、G-CSF、α-干擾素)的SDS-PAGE電泳圖。
具體實(shí)施方案本發(fā)明包括一種高效的聚乙二醇(PEG)末端羥基的活化方法及其高純度活化產(chǎn)物與蛋白質(zhì)等帶親核基團(tuán)的生物活性分子的偶聯(lián)方法和偶聯(lián)產(chǎn)物。PEG的活化流程以及活化產(chǎn)物與帶親核基團(tuán)的分子的偶聯(lián)反應(yīng)流程如圖1所示，其中TEA表示三乙胺，P-AH2和P-SH表示帶有親核基團(tuán)的分子。
具體方法和步驟說(shuō)明如下1)聚乙二醇(PEG)的預(yù)處理利用水和甲苯在140℃共沸的性質(zhì)將PEG溶解在甲苯中，然后加熱到140℃共沸除去PEG中的水份。然后用PEG的非溶劑，例如乙醚將PEG從甲苯溶液中沉淀出來(lái)，并在真空干燥器中將乙醚完全除去得到干燥的PEG固體(PEG水份含量＜50ppm)。
2)聚乙二醇(PEG)的活化將預(yù)處理后的聚乙二醇溶解在無(wú)水的極性有機(jī)溶劑中，然后加入2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸鹽(FMP)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中滴加叔胺或者吡啶等有機(jī)堿維持溶液pH在8～9之間。
上述反應(yīng)所使用的極性溶劑包括乙氰、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮以及四氫呋喃等。叔胺包括三乙胺或三丁胺等。反應(yīng)條件為常溫常壓，反應(yīng)時(shí)間為15分鐘左右。聚乙二醇的分子量范圍為1000-30000d。
3)聚乙二醇活化產(chǎn)物(FMP-PEG)的分離提純用PEG的非溶劑，例如乙醚、乙酸乙酯等，將FMP-PEG從極性有機(jī)溶劑中沉淀出來(lái)，然后過(guò)濾除去溶劑。再將沉淀物溶于異丙醇中，并加熱到55℃使固體完全溶解，然后在攪拌的條件下自然降溫直到固體重新完全沉淀出來(lái)。再過(guò)濾除去異丙醇。最后用真空干燥器進(jìn)一步除去溶劑得到干燥的FMP-PEG白色固體。
4)聚乙二醇活化產(chǎn)物(FMP-PEG)與帶親核基團(tuán)的生物活性分子的偶聯(lián)(修飾)將FMP-PEG與帶親核基團(tuán)的分子在水性緩沖液(pH7-10)或極性有機(jī)溶劑中混合，使兩者反應(yīng)得到結(jié)構(gòu)為RO-(CH2CH2O)nCH2CH2-AH2-P或RO-(CH2CH2O)nCH2CH2-B-P(A、B為親核基團(tuán))的偶聯(lián)產(chǎn)物。
偶聯(lián)反應(yīng)的可以在不同的溫度和pH條件下，在水溶液或極性有機(jī)溶劑中進(jìn)行。反應(yīng)條件根據(jù)反應(yīng)試劑的敏感性和實(shí)際操作難易程度來(lái)確定。
帶親核基團(tuán)的分子包括帶伯氨、仲胺或巰基等基團(tuán)的分子。任何可以取代PEG上1-甲基-2-吡啶基的基團(tuán)都可以用作被修飾的分子。因此，被修飾分子可以包含任何的脂肪基、芳香基、雜環(huán)基或芳香雜環(huán)基或者任何包含前述基團(tuán)組合的分子，只要該分子含有可以被偶聯(lián)的功能基團(tuán)。尤其是具有生物活性的分子，如包括酶、抗原或抗體在內(nèi)的蛋白質(zhì)分子；氨基酸；聚氨基酸；多肽；硫醇化合物；輔因子；核苷；多聚核苷酸；半抗原等。
實(shí)施例1用2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸鹽(FMP)活化單甲氧基聚乙二醇5000(mPEG5000)將250ml甲苯和50g mPEG5000加到1000ml的圓底燒瓶中，在圓底燒瓶上依次接上分水器、回流冷凝管和干燥塔，然后加熱甲苯溶液到140℃。保持回流狀態(tài)兩個(gè)小時(shí)。然后將回流裝置改為減壓蒸餾裝置，蒸出200ml甲苯。再向圓底燒瓶中加入500ml乙醚，在攪拌的條件下自然降溫，直到固體完全沉淀出來(lái)。然后過(guò)濾除去乙醚，并將沉淀物放到真空干燥器中把殘余的乙醚除去。得到干燥的無(wú)水mPEG5000。然后用卡氏水分測(cè)定儀測(cè)定干燥后無(wú)水mPEG5000中的水分含量，要求水分含量低于50ppm。
用量筒稱(chēng)量干燥25ml乙腈倒入500ml的圓底燒瓶中，將567mg FMP溶解于乙腈中。然后向燒瓶中加入10g分子量為5000的單甲氧基聚乙二醇(mPEG)。攪拌溶液的同時(shí)緩慢地向燒瓶中滴加三乙胺以維持溶液pH值在8～9之間。在常溫常壓的條件下反應(yīng)15分鐘。反應(yīng)結(jié)束后向乙腈溶液中加入足量的乙醚，直到?jīng)]有白色固體生成為止。用漏斗過(guò)濾乙醚和乙腈的混合溶液，并用300ml乙醚洗滌沉淀物。然后，將白色的固體重新溶于250ml異丙醇中，并加熱到55℃完全溶解固體。在攪拌的條件下自然降溫，直到固體完全沉淀出來(lái)。然后過(guò)濾除去異丙醇，并將沉淀物放到真空干燥器中干燥3個(gè)小時(shí)把殘余的異丙醇除去。得到蓬松的白色固體。
使用紫外-可見(jiàn)光吸收光譜和紅外光譜兩種方法鑒定mPEG的活化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。將mPEG的活化產(chǎn)物(FMP-mPEG5000)分別溶于0.5N HCl溶液和0.5NNaOH溶液，對(duì)這兩種溶液分別進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光的全波長(zhǎng)掃描檢測(cè)。圖2是FMP-mPEG5000分別在這兩種溶液中的特征吸收?qǐng)D譜。對(duì)比圖2(A)和(B)可知，F(xiàn)MP-PEG的活性末端在酸性溶液中穩(wěn)定，而在堿性溶液中發(fā)生水解，末端從PEG上脫落下來(lái)，吸光峰2從280nm移到297nm。另用傅利葉變換紅外光譜鑒定活化產(chǎn)物的基團(tuán)，圖3(a)和(b)分別是mPEG-5000及其活化產(chǎn)物FMP-mPEG5000的紅外光譜圖。比較(a)和(b)可知，PEG經(jīng)活化后，在3500cm-1附近的O-H特征峰基本消失，而在1600cm-1附近出現(xiàn)吡啶環(huán)的特征峰。將不同濃度的FMP溶于氨水中水解，然后用在229nm下測(cè)定的吸光值作標(biāo)準(zhǔn)曲線。同樣，將活化的FMP-PEG溶于氨水并測(cè)定其在229nm下的吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算出產(chǎn)物的活化率(95％)。根據(jù)活化率可以進(jìn)一步計(jì)算得到產(chǎn)物的純度(99％)。
實(shí)施例2用FMP-mPEG5000偶聯(lián)重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)將G-CSF溶于0.1M硼酸-硼砂緩沖液，pH值為8.6，濃度為2.3mg/ml。取40ml溶液倒入200ml的錐形瓶并放到25℃的恒溫振蕩器中振蕩。然后向錐形瓶中加入0.98克FMP-mPEG5000。反應(yīng)持續(xù)30分鐘后將反應(yīng)體系的pH值調(diào)到4.0以終止偶聯(lián)反應(yīng)。然后用凝膠過(guò)濾色譜除去未反應(yīng)的FMP-mPEG，將收集到的偶聯(lián)產(chǎn)物用SDS-PAGE分析其分子量變化情況，結(jié)果如圖4所示，用FMP-mPEG修飾后的產(chǎn)物分子量增大，表明FMP-mPEG與G-CSF生了偶聯(lián)反應(yīng)，得到了偶聯(lián)產(chǎn)物。
實(shí)施例3用FMP-mPEG5000偶聯(lián)重組人α-干擾素(rhα-Interferon)將α-干擾素溶于0.1M硼酸-硼砂緩沖液，pH值為7.6，濃度為3.5mg/ml。取40ml溶液倒入200ml的錐形瓶并放到25℃的恒溫振蕩器中輕輕振蕩。然后向錐形瓶中加入3.1克FMP-mPEG5000。反應(yīng)持續(xù)30分鐘后將反應(yīng)體系的pH值調(diào)到4.0以終止偶聯(lián)反應(yīng)。然后用凝膠過(guò)濾色譜除去未反應(yīng)的FMP-mPEG，將收集到的偶聯(lián)產(chǎn)物用SDS-PAGE分析其分子量變化情況。結(jié)果如圖4所示，用FMP-mPEG修飾后的產(chǎn)物分子量增大，表明FMP-mPEG與α-干擾素生了偶聯(lián)反應(yīng)，得到了偶聯(lián)產(chǎn)物。
實(shí)施例4用FMP-mPEG5000修飾牛血紅蛋白(BHb)將血紅蛋白(Hemoglobin)溶于0.1M的磷酸鹽緩沖液，pH值為7.6，濃度為2.5mg/ml。取40ml溶液倒入200ml的錐形瓶并放到4℃的恒溫振蕩器中輕輕振蕩。然后向錐形瓶中加入3.1克FMP-mPEG5000。反應(yīng)持續(xù)30分鐘后將反應(yīng)體系的pH值調(diào)到4.0以終止偶聯(lián)反應(yīng)。然后用凝膠過(guò)濾色譜除去未反應(yīng)的FMP-mPEG，將收集到的偶聯(lián)產(chǎn)物用SDS-PAGE分析其分子量變化情況。結(jié)果如圖4所示，用FMP-mPEG修飾后的產(chǎn)物分子量增大，表明FMP-mPEG與血紅蛋白發(fā)生了偶聯(lián)反應(yīng)，得到了偶聯(lián)產(chǎn)物。
前面所述幾個(gè)實(shí)施方案的目的是為了更好地說(shuō)明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。但是很明顯，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)講對(duì)本方法和材料的任何改進(jìn)或改變都不超出本發(fā)明的范圍和精神。例如，使用其他分子量的mPEG或者其他的生物大分子。
權(quán)利要求
1.一種聚乙二醇(PEG)末端羥基的高效活化工藝，其特征在于(1)利用水和甲苯在140℃共沸的性質(zhì)將PEG溶解在甲苯中，然后加熱到140℃共沸除去PEG中的水份(PEG水份含量＜50ppm)；(2)無(wú)水PEG和2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸鹽在無(wú)水的極性有機(jī)溶劑(水份含量＜50ppm)中進(jìn)行反應(yīng)；(3)反應(yīng)過(guò)程中滴加叔胺或者吡啶等有機(jī)堿維持溶液的pH在8～9之間；(4)利用乙醚沉淀的方法分離PEG活化產(chǎn)物；利用異丙醇重結(jié)晶的方法純化PEG活化產(chǎn)物。
2.一種如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇(PEG)末端羥基的高效活化工藝，其特征在于，活化產(chǎn)物的活化率達(dá)95％；產(chǎn)物純度達(dá)99％；產(chǎn)物化學(xué)穩(wěn)定性好，在中性和酸性條件條件下能穩(wěn)定保存6個(gè)月以上。
3.一種如權(quán)利要求1所述的工藝制備的PEG的純凈活化產(chǎn)物，其特征是PEG末端的羥基被1-甲基-2-吡啶基取代，結(jié)構(gòu)式如下圖所示。 CH2CH2(OCH2CH2)n-OR (R為H或烴基)
4.一種如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇(PEG)末端羥基的高效活化工藝，其特征在于聚乙二醇的分子量為1,000～30,000，優(yōu)選為2,000～20,000。
5.一種如權(quán)利要求2所述的聚乙二醇(PEG)純凈活化產(chǎn)物對(duì)帶親核基團(tuán)的生物活性分子的修飾(偶聯(lián))工藝，其特征在于PEG活化產(chǎn)物與帶親核基團(tuán)的被修飾分子在pH7～10的緩沖液中直接反應(yīng)。
6.一種如權(quán)力要求5所述的修飾工藝制備的PEG活化產(chǎn)物與帶親核基團(tuán)的生物活性分子的偶聯(lián)(偶聯(lián))產(chǎn)物，其特征在于PEG末端的C原子與親核基團(tuán)直接以共價(jià)鍵結(jié)合，其結(jié)構(gòu)式為RO-(CH2CH2O)nCH2CH2-AH-P或RO-(CH2CH2O)nCH2CH2-B-P(A、B為親核基團(tuán)，P為帶親核基團(tuán)的分子)
7.一種如權(quán)利要求5所述的聚乙二醇(PEG)純凈活化產(chǎn)物對(duì)帶親核基團(tuán)的生物活性分子的修飾(偶聯(lián))工藝，其特征在于帶親核基團(tuán)的生物活性分子為血紅蛋白。
8.一種如權(quán)利要求5所述的聚乙二醇(PEG)純凈活化產(chǎn)物對(duì)帶親核基團(tuán)的生物活性分子的修飾(偶聯(lián))工藝，其特征在于帶親核基團(tuán)的生物活性分子為人體內(nèi)粒細(xì)胞集落刺激因子。
9.一種如權(quán)利要求5所述的聚乙二醇(PEG)純凈活化產(chǎn)物對(duì)帶親核基團(tuán)的生物活性分子的修飾(偶聯(lián))工藝，其特征在于帶親核基團(tuán)的生物活性分子為干擾素。
全文摘要
本發(fā)明提供一種高效的聚乙二醇(PEG)末端羥基的活化工藝及其活化產(chǎn)物與蛋白質(zhì)等帶親核基團(tuán)的生物活性分子的修飾反應(yīng)方法和反應(yīng)產(chǎn)物。其特征是(1)將PEG和甲苯加熱到140℃共沸除去PEG中的水份。(2)無(wú)水PEG和2－氟－1－甲基吡啶鎓甲苯－4－磺酸鹽在無(wú)水極性有機(jī)溶劑中進(jìn)行反應(yīng)。(3)反應(yīng)過(guò)程中滴加有機(jī)堿維持pH在8－9。(4)用乙醚沉淀PEG活化產(chǎn)物，用異丙醇重結(jié)晶法純化活化產(chǎn)物。(5)PEG活化產(chǎn)物在緩沖水溶液中與蛋白質(zhì)等帶有親核基團(tuán)的生物活性分子反應(yīng)，得到PEG與該分子的偶聯(lián)物。本發(fā)明提供的PEG的活化工藝具有產(chǎn)物活化率高(95％)，產(chǎn)物純度高 (99％)，修飾速度可控性好，修飾產(chǎn)物的化學(xué)穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。本發(fā)明的活化PEG尤其適用于多肽和蛋白質(zhì)的修飾。
文檔編號(hào)C07K17/02GK1580082SQ0315328
公開(kāi)日2005年2月16日 申請(qǐng)日期2003年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月13日
發(fā)明者蘇志國(guó), 馬光輝, 贠強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所