專利名稱：一種從冬凌草中提取冬凌草甲素的工藝方法
技術領域：
本發明涉及一種從冬凌草中提取冬凌草甲素的新的工藝方法。
背景技術：
藥物研究表明，冬凌草有良好的消炎、抗菌、鎮痛作用，可有效抑制甲型、乙型溶血型鏈球菌，金黃色葡球菌等。對體外培養的Hela細胞，人體食管癌109細胞及肝癌BEL-7402細胞有明顯的細胞毒作用，對多種移植物性動物腫瘤如ECA，S180，P388，L1210肝癌及AKS有明顯抗腫瘤作用，并且冬凌草甲素對食管上皮增生有輕度抑制作用。其中二萜類成分冬凌草甲素是抗腫瘤的有效成分，因而被譽為中藥里的“盤尼西林”和“天然抗菌素”。并且美國也正在研究將冬凌草用于愛滋病的防治。冬凌草的開發將成為本世紀的“朝陽產業”和“黃金產業”。
冬凌草提取工藝主要通過提取——脫色——層析等工藝，提取其中的重要有效成分冬凌草甲素并除去其中的植物色素、糖類和鞣質類。各種文獻報道的方法的區別體現在(1)提取溶劑的不同，如乙醚提取法，主要有中國的趙清治，王漢清等和日本的E.Fujita.T.Fujita，H，Katayama，M.Shibuya；乙醇提取法；(2)提取后對提取液處理方法不同，如有用過濾等方法去除水不溶物質，最常用的是沉降，然后活性炭脫色；還有是直接用活性炭脫色；(3)處理后的水提液一般采用有機溶劑萃取或層析或萃取+層析的工藝獲得冬凌草甲素。
除在工藝路線上有上述差別外，不同方法的具體區別表現在所選萃取劑及柱層析方法上有所不同。
這些提取工藝通常是采用溶液提取法，然后采用活性炭脫色，濃縮后然后直接進行柱層析分離，此工藝不能很好的除去其中的鞣質和多糖，也不能很好除去與冬凌草甲素分子量只相差2的冬凌草乙素，很難得到冬凌草甲素的純品。
冬凌草甲素的結構為 冬凌草甲素冬凌草乙素的結構為
冬凌草乙素為了得到純度較高的冬凌草甲素，很好地除去其中的植物色素、多糖、樹脂、鞣質類物質，因此有必要改進上述的傳統生產工藝。
發明內容
本專利發明的目的是克服現有技術的缺陷，開發出一種簡單、適于工業化生產，并且成本低的提取純化冬凌草中有效成分冬凌草甲素的新工藝，并可用于開發新型抗腫瘤新藥。
本發明的技術構思是這樣的本發明綜合運用幾種提取純化方法，將其進行有機組合，開發出了一套適合分離純化冬凌草甲素的新工藝。采用醇溶液提取法，然后進行水浮回流處理，水浮液過以苯乙烯和二乙烯苯為單體聚合的大孔吸附樹脂(如HZ-841大孔吸附樹脂)柱除去其中的糖分、植物色素等，采用硅膠與氧化鎂混合柱層析法分離洗脫，最后進行重結晶就可以得到純度較高的冬凌草甲素。
本發明是通過如下技術方案實現的1、將冬凌草用4-10倍的95％醇溶液，最好是6倍量的醇溶液，醇提2-6小時，最好4小時；再用2-6倍的95％醇溶液，最好是4倍量的醇溶液，醇提1-4小時，最好2小時，提取溫度為76攝氏度；2、合并兩次提取液，減壓濃縮，回收乙醇，得到綠褐色膏狀物；加入1-6倍量的水進行水浮，最好是3倍；溫度為60-90℃，最好是80℃；回流時間0.5-3h，最好1.5h；3、過濾，將濾液直接過以苯乙烯和二乙烯苯為單體聚合的大孔吸附樹脂(如HZ-841大孔吸附樹脂)柱，先用水洗去大部分植物色素，再用低濃度醇洗脫，一般為5％-30％，最好為10％，而后用50％-70％的醇洗脫，最好是60％的醇，效果較好；4、將過大孔吸附樹脂柱液減壓濃縮蒸干，硅膠與氧化鎂混合柱層析法分離洗脫，洗脫劑可采用氯仿-甲醇、氯仿-丙酮、石油醚-丙酮等，最好是氯仿-丙酮，洗脫劑比例為6∶1-9∶1，最好是85∶15；原料與吸附劑的比例為1∶5～1∶10，最佳為1∶7，吸附劑為硅膠與氧化鎂的混合吸附劑，一般為15∶1為宜；5、用甲醇-丙酮進行重結晶，過濾后用少量丙酮洗至白色，得到純度為99％的冬凌草甲素。
以本發明的方法從冬凌草中提取有效成分冬凌草甲素，技術上具有以下顯著優點和進步(1)本工藝增加在用乙醇溶液提取后，采用水浮回流技術除去一部分雜質，可初步提高產品的純度。
(2)采用過以苯乙烯和二乙烯苯為單體聚合的大孔吸附樹脂(如HZ-841大孔吸附樹脂)柱技術，并采用硅膠+氧化鎂的混合柱分離冬凌草甲素，可很大程度提高產品純度。
(3)經過水浮與過大孔樹脂柱處理，在過層析柱時因上樣的樣品純度相對較高，因而同樣量的吸附劑載樣量就較大，這樣就節省了吸附劑用量。
(4)僅用一套洗脫系統，大大節省了溶劑用量與洗脫時間。
(5)可以得到含量較高的冬凌草甲素(99.85％)
圖1是柱層析洗脫不同餾分的薄層色譜圖、圖2冬凌草甲素對照品與樣品薄層色譜圖比較、圖3是HPLC測試結果，圖4冬凌草甲素樣品與對照品HPLC圖比較、圖5是HENMR譜、圖6是IR譜、圖7是MS譜。
下面結合具體實施方式
和附圖對本發明進行進一步說明。
實施例1提取原料1kg加6倍量95％乙醇提取4小時，倒出溶液，再加入4倍量95％乙醇回流2小時，減壓濃縮，回收乙醇，得綠褐色膏狀物，加入3倍量水回流1.5小時，過濾，將此濾液過以苯乙烯和二乙烯苯為單體聚合的大孔吸附樹脂(如HZ-841大孔吸附樹脂)柱，先用約6倍量水洗至近無色，然后用約4倍量60％的乙醇液洗脫，將此洗脫液減壓濃縮，得到土黃色粉末約12g。
柱層析分離 將上步中所得土黃色粉末與適量硅膠拌勻，將相當于粉末5倍量的硅膠、氧化鎂(15∶1)裝柱，加樣后上層覆蓋少量硅膠，再加少量脫脂棉。用9∶1的氯仿-丙酮洗脫，以5ml/min的流速進行洗脫，按每份100ml進行收集，進行薄層板分析，證明第6份以后為純的甲素(見附圖1)。減壓濃縮，用甲醇-丙酮進行重結晶，減壓過濾后，用少量丙酮洗至白色，干燥后稱重，共1.5g。薄層層析分析將冬凌草甲素對照品和樣品用甲醇溶解后，在同一硅膠薄層板上點樣，以9∶1的氯仿-甲醇展開，取出晾干，在紫外燈下照射，樣品和對照品具有相同的Rf值(見附圖2)，并呈現同樣的亮黃綠色斑點，樣品中無雜質斑。HPLC分析 將冬凌草甲素對照品和樣品用甲醇溶解后，在同一條件下進樣，得到相同的色譜圖，保留時間相同，峰形也相同。冬凌草甲素HPLC圖及對照圖。見附圖3、4。
NMR和IR的測定 經紅外光譜與核磁共振光譜測定，表明所提樣品與對照品結構相同，為同一化合物。見附圖5、6。
MS檢測經分析為冬凌草甲素。見附圖7。
HPLC、HENMR、IR、MS分析IR、HENMR、MS檢測分析為冬凌草甲素，與文獻報道一致，將產物進行HPLC檢測，結果見附圖3。
權利要求
1.一種從冬凌草中提取冬凌草甲素的工藝方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將冬凌草用4-10倍的95％醇溶液，提取2-6小時；再用2-6倍的95％醇溶液，提取1-4小時，提取溫度為76攝氏度；(2)合并兩次提取液，減壓濃縮，回收乙醇，得到綠褐色膏狀物；加入1-6倍量的水進行水浮，溫度60-90℃，回流0.5-3h，形成冬靈草甲素懸浮液；(3)將冬靈草甲素懸浮液過濾后，把濾液直接過以苯乙烯和二乙烯苯為單體聚合的大孔吸附樹脂柱，如HZ-841大孔吸附樹脂柱，先用水洗去大部分植物色素，再用5％-30％低濃度醇洗脫，而后用50％-70％的醇洗脫；(4)將過以苯乙烯和二乙烯苯為單體聚合的大孔吸附樹脂(如HZ-841大孔吸附樹脂)柱液減壓濃縮蒸干，用硅膠與氧化鎂混合柱層析法分離洗脫，洗脫劑可采用氯仿-甲醇、氯仿-丙酮、石油醚-丙酮，洗脫劑比例為6∶1-9∶1，原料與吸附劑的比例為1∶5-1∶10，吸附劑為硅膠與氧化鎂的混合吸附劑，一般為15∶1(5)用甲醇-丙酮進行重結晶，過濾后用少量丙酮洗至白色，得到純度為99％的冬凌草甲素。
2.如權利要求1所述的從冬凌草中提取冬凌草甲素的工藝方法，其特征在于，用95％醇溶液提取時，第一次用6倍量的醇溶液，第二次用4倍量的醇溶液。
3.如權利要求2所述的從冬凌草中提取冬凌草甲素的工藝方法，其特征在于，第一次醇提時間為4小時，第二次提取為2小時。
4.如權利要求3所述的從冬凌草中提取冬凌草甲素的工藝方法，其特征在于，提取溫度為76攝氏度。
5.如權利要求1所述的從冬凌草中提取冬凌草甲素的工藝方法，其特征在于，進行水浮回流時，水浮量為3倍。
6.如權利要求5所述的從冬凌草中提取冬凌草甲素的工藝方法，其特征在于，回流溫度為80℃。
7.如權利要求6所述的從冬凌草中提取冬凌草甲素的工藝方法，其特征在于，回流時間為1.5h。
8.如權利要求1所述的從冬凌草中提取冬凌草甲素的工藝方法，其特征在于，過以苯乙烯和二乙烯苯為單體聚合的大孔吸附樹脂柱，如HZ-841大孔吸附樹脂柱時，先用10％的醇洗脫，再用60％的醇洗脫收集。
9.如權利要求8所述的從冬凌草中提取冬凌草甲素的工藝方法，其特征在于，過硅膠與氧化鎂混合柱，洗脫液為氯仿-丙酮，比例為85∶15。
10.如權利要求9所述的從冬凌草中提取冬凌草甲素的工藝方法，其特征在于，過硅膠與氧化鎂混合柱，硅膠與氧化鎂的比例為15∶1。
11.如權利要求10所述的從冬凌草中提取冬凌草甲素的工藝方法，其特征在于，過硅膠與氧化鎂混合柱，原料與吸附劑的比例為1∶7。
12.如權利要求1所述的從冬凌草中提取冬凌草甲素的工藝方法，其特征在于，重結晶時采用甲醇與丙酮混合液。
全文摘要
本發明提出了一套適合分離純化冬凌草甲素的新工藝。即采用醇溶液提取法，然后進行水浮回流處理，水浮液直接過以苯乙烯和二乙烯苯為單體聚合的大孔吸附樹脂(如HZ－841大孔吸附樹脂)柱工藝除去其中的糖分、植物色素等，采用硅膠與氧化鎂混合柱層析法分離洗脫，最后進行重結晶得到純度較高冬凌草甲素。本發明的新工藝方法，安全，成本低廉，適于工業化生產，能夠提取純度較高的冬凌草甲素。
文檔編號C07D311/00GK1528757SQ0315147
公開日2004年9月15日 申請日期2003年9月29日 優先權日2003年9月29日
發明者張立國, 倪力軍, 謝國祥 申請人:華東理工大學