專利名稱：Sars冠狀病毒核衣殼蛋白的抗原決定簇及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及SARS冠狀病毒核衣殼蛋白(N蛋白)的抗原決定簇及其應用。具體地本發明使用人工合成的源自SARS病毒N蛋白的抗原多肽以及該多肽免疫動物后產生的抗體(單抗、多抗)，結合酶聯免疫的方法檢測人血清樣品中的早期抗SARS抗體IgM或IgG，或直接檢測血清樣品中SARS病原體。該多肽可以直接作為治療藥物誘導保護性的CTL反應，保護病人免于急性病癥的折磨，并且進一步促進病人產生保護性的抗體，加速康復的進程；還可以作為重要組成部分，構建亞單位疫苗用于SARS的預防和控制。
背景技術：
非典型肺炎即嚴重急性呼吸綜合征(Severe Acute Respiratory SyndromeSARS)的病原體最近已經確認是一種冠狀病毒該病毒是一種正鏈RNA病毒基因組為單鏈RNA含有Poly(A)總長接近30kb病毒表面有約20nm左右的棒狀結構呈皇冠狀該病原體具有很強的感染性和傳染性病毒在患者體內經15過早期復制過程后在肺部引發大規模炎癥反應最終導致肺部組織損傷由于臨床缺少有效的治療藥物所以現階段將感染病人迅速隔離治療是最有效的防治手段。
發明人通過調研大量與冠狀病毒有關的科研文獻和參考新近涌現的非典型肺炎(SARS)病原體-SARS冠狀病毒的臨床及基礎醫學研究的成果，得出SARS冠狀病毒的核衣殼蛋白(N蛋白)是其重要的致病因子的結論N蛋白可以引起被感染細胞的細胞分裂失常，與細胞內重要的信號分子接合并干擾正常的細胞信號傳導和細胞的轉錄、翻譯等代謝過程，并且參與病毒的復制、蛋白質合成和包裝等。此外，N蛋白不但可以誘導宿主產生高效價的抗體，進一步促進宿主產生對S蛋白(冠狀病毒的另一重要毒力因子)的中和抗體；而且能誘導產生保護性的CTL(細胞毒性T淋巴細胞)，對消除宿主的急性感染具有決定性的作用。
截止2003年6月2日，全世界已經有8384人感染SARS冠狀病毒，并且已經有700多人死亡(http//www.who.int/csr/sars/country/2003 06 02/en/)。SARS已經成為全人類共同面臨的新的嚴重傳染病，如何預防、治療SARS病毒引起的急性傳染病和控制其蔓延是人類能否贏得這場戰爭的核心。
目前已經發展并使用的診斷方法包括RT-PCR、通過臨床癥狀綜合評價診斷、血清免疫檢查病毒抗體(熒光免疫法或ELISA)。這三種方法易產生較多的假陰性和假陽性而導致漏診或誤診，或者不能簡便快速準確的判斷與區分患者與疑似病例，常常會延誤對疾病進行有效的治療。而抗原檢測(ELISA)準確率高，操作簡便，適合臨床推廣，但目前缺少病原體的特異性抗體。
因此本領域迫切需要開發新的更加有效的早期診斷的方法和試劑盒以及治療、預防SARS的藥物和疫苗。
發明內容
本發明目的就是提供一種快速簡便準確率高的SARS檢測方法和試劑盒以及治療、預防SARS的藥物和疫苗。
在本發明的第一方面提供一種源自SARS病毒的多肽，其氨基酸序列為SEQID NO1-SEQ ID NO54所示的一條氨基酸序列的多肽，這些SARS特異性多肽可特異性地與抗SARS病毒的抗體結合。較佳的，該多肽為SEQ ID NO39所示的氨基酸序列的多肽。
在本發明的第三方面提供了一種抗體，所述抗體特異性地與本發明的SARS特異性多肽結合。
在一優選例中所述的抗體是單克隆抗體。
在本發明的第四方面提供了一種檢測試劑盒，它含有本發明的SARS特異性多肽、抗本發明多肽的抗體或其組合。
在本發明的第五方面提供了一種體外檢測樣品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗體的方法包括步驟(a)將樣品與選自下組的物質接觸本發明的SARS特異性多肽、抗本發明多肽的抗體或其組合；(b)檢測是否形成抗原-抗體復合物其中形成復合物就表示樣品中存在SARS病毒或抗SARS病毒抗體。
在一優選例中所述的樣品為血清樣品或痰液。
在另一優選例中所述的物質是氨基酸序列為SEQ ID NO1-SEQ ID NO54所示的一條氨基酸序列的多肽。
在另一優選例中所述的物質是單克隆抗體。
在另一優選例中步驟(b)的檢測方法是熒光檢測法。
在本發明的第六方面提供了本發明多肽在制備治療或預防非典型肺炎的藥物中的應用。
圖1MHC II型抗原表位(epitope)。
圖2MHC I型(HLA型)抗原表位。
圖3通過比較得出的SARS冠狀病毒的N蛋白的主要CTL誘導抗原表位，其中，MHV是鼠肝炎病毒，SARS-CoV是人的SARS冠狀病毒。
具體實施例方式
本發明通過對SARS病毒潛在抗原蛋白的序列分析找到了具有很強抗原性的氨基酸序列。通過合成多肽合成這些潛在抗原靶位，再由這些多肽免疫獲得的抗體，研制出一種通過檢測SARS病毒或抗SARS病毒抗體進行SARS臨床早期診斷的酶聯免疫方法和試劑盒。這些多肽可以用于構建SARS臨床檢驗試劑盒，也可以作為候選藥物直接使用或者經過改造而應用于臨床，誘導感染早期的病人產生保護性的CTL，消除急性病征；另外，促進機體產生對SARS病毒的S蛋白的中和抗體也有利于病人的康復。同時，本發明可顯著提高診斷效率并且簡便準確率高。
已有的研究表明，采用抗體檢測病原體可以在病人感染后最短時間內作出有效診斷。采用IgM檢測可以在感染后一個星期左右作出診斷，而檢測病人體內IgG則最不理想。為了獲得檢測SARS病毒所需的相關抗原與抗體，本發明人通過對SARS病毒基因組的分析與比對，結合最近與以往文獻資料，對SARS的潛在抗原蛋白進行分析。
通過與冠狀病毒的分析與比對，本發明人發現冠狀病毒通過與細胞表面受體結合，隨即與細胞膜發生融合，病毒粒子進入細胞。病毒的生活周期完全在細胞質中進行，不需細胞核參與。SARS病毒本身編碼兩大類蛋白質結構蛋白和非結構蛋白。與RNA結合構成螺旋狀核衣殼樣結構的N蛋白為SARS病毒的結構蛋白。
如本文所用，本發明多肽或SARS特異性多肽指氨基酸序列如圖1、圖2所示的抗原多肽。
本發明多肽可用常規方法人工合成也可用重組方法生產。
本發明多肽可以直接用于檢測抗SARS的抗體。
本發明的多肽可用于免疫兔、鼠等動物，從而獲得抗本發明多肽的抗體(本發明抗體)。本發明抗體包括特異性的多克隆抗體和單克隆抗體尤其是單克隆抗體。這里特異性是指抗體能結合于SARS病毒的基因產物或片段。較佳地，指那些能與非典型肺炎冠狀病毒的基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段(如Fab’或(Fab)2片段)、 抗體重鏈、抗體輕鏈、嵌合抗體人源化抗體等。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的本發明多肽可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。對于單克隆抗體，可利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。
本發明的多肽和抗體都可用于檢測樣品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗體，從而作為早期檢測SARS的有效指標之一。
除了用于檢測，本發明的SARS特異性多肽還可在體內與病毒競爭受體，阻止病毒與膜融合抑制病毒感染正常細胞。此外本發明的多肽或抗體還可用于制備治療性的藥物組合物或預防性的疫苗組合物。
因此，另一方面本發明還提供了一種組合物它含有(a)安全有效量的本發明多肽或其組合物以及(b)藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水緩沖液、葡萄糖水、甘油乙醇佐劑及其組合。本發明的組合物可通過常規方法進行制備，以本發明多肽計其用量。例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
本發明的主要優點在于(a)因為本發明的SARS特異性多肽與抗SARS病毒抗體的親和力高，本發明抗體與SARS病毒的親和力高，因此本發明的檢測方法靈敏簡便，準確率高；(b)本發明的SARS特異性多肽還可在體內與病毒競爭受體，阻止病毒與膜融合，抑制病毒感染正常細胞，所以本發明具有很高的臨床應用價值；(c)本發明的SARS特異性多肽也可以作為候選藥物直接使用或者經過改造而應用于臨床，CTL在2-3天內就可以產生，對于消除病人的急性病征具有關鍵作用。本發明中提供的MHCII型抗原表位多肽就可以直接作為藥物使用，誘導產生保護性的CTL反應并且促進抗S蛋白的中和抗體的產生。
下面結合具體實施例進一步闡述本發明。應理解這些實施例僅用于說明本發明，而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法。通常按照常規條件如Sambrook等人分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1多肽的人工合成按序列表SEQ ID NO3-SEQ ID NO54所示的氨基酸序列，在多肽合成儀上合成多肽，合成后經質譜法驗證證明合成的多肽與設計相符。
實施例2抗原多肽免疫動物制備抗體取實施例1制備的各條多肽片斷0.5毫克，分別溶解于1.5ml PBS中，加入等體積的CFA(完全弗氏佐劑)，充分混勻，將經過佐劑乳化處理的抗原免疫兔子和小鼠。
每只兔子注射抗原3ml左右，小鼠則注射0.8ml/只。分別皮下多點注射動物背部(每點0.2ml)，初次免疫三周后，取同樣劑量多肽、PBS，混合2ml IFA(不完全弗氏佐劑)，乳化后對動物進行加強免疫注射，劑量不變。三周后對動物取血收集抗血清，使用BSA包被的層析柱清除針對BSA的抗體。挑選抗體滴度較高的抗原多肽制備單克隆抗體。
實施例3抗原多肽檢測病人血清樣品使用經過處理的實施例1制備的抗原多肽包被，與病人血清混合反應，結果本發明的抗原肽段可以識別病人血清中早期針對SARS的特異性抗體，并與之結合，洗滌后加入HRP酶連二抗反應；最后加入顯色底物進行檢測。
結果表明本發明的多肽可特異性地與抗SARS病毒的抗體結合。
實施例4抗體(單抗與多抗)檢測病原體對于實施例2獲得的抗體(多抗和單抗)，用ELISA法與病人血清反應，檢測病人組織液血液中的病毒結合，對病原體進行檢測。
結果表明本發明的多抗和單抗可特異性地與SARS病毒結合。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
SEQUENCE LISTING<110>非典病毒(SARS virus)<120>中國科學院上海生命科學研究院<130>SARS冠狀病毒核衣殼蛋白的抗原決定簇及其應用<160>54<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>420<212>PRT<213>非典病毒(SARS virus)MHC II型抗原表位<400>1Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile1 5 10 15Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly20 25 30Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn35 40 45Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Glu50 55 60Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Gly65 70 75 80Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Val Arg85 90 95Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr
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權利要求
1.一種多肽，其特征在于其氨基酸序列為SEQ ID NO3-SEQ ID NO54所示的一條氨基酸序列的多肽。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于其氨基酸序列為SEQ ID NO39所示氨基酸序列的多肽。
3.一種抗體，其特征在于所述的抗體特異性地與權利要求1或2所述的多肽結合。
4.如權利要求3所述的抗體，其特征在于所述的抗體是單克隆抗體。
5.一種檢測試劑盒，其特征在于它含有權利要求1或2所述的多肽，權利要求3所述的抗體或其組合。
6.一種體外檢測樣品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗體的方法，其特征在于包括步驟(a)將樣品與選自下組的物質接觸權利要求1或2所述的多肽、權利要求3所述的抗體或其組合；(b)檢測是否形成抗原-抗體復合物其中形成復合物就表示樣品中存在SARS病毒或抗SARS病毒抗體。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述的物質是氨基酸序列為SEQNO1-SEQ NO54所示的一條氨基酸序列的多肽。
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于步驟(b)的檢測方法是熒光檢測法。
9.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述的物質是權利要求3所述的抗體，且所述抗體是單克隆抗體。
10.如權利要求1或2所述的多肽在制備治療或預防非典型肺炎的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及SARS冠狀病毒核衣殼蛋白(N蛋白)的抗原決定簇及其應用。具體地本發明使用人工合成的源自SARS病毒N蛋白的抗原多肽以及該多肽免疫動物后產生的抗體(單抗或多抗)，結合酶聯免疫的方法檢測人血清樣品中的早期抗SARS抗體IgM或IgG，或直接檢測血清樣品中SARS病原體。該多肽還可用于制備治療SARS疾病的藥物或預防SARS疾病的疫苗。
文檔編號C07K16/08GK1566143SQ03145229
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月25日 優先權日2003年6月25日
發明者秦磊, 李亦學, 石鐵流, 金由辛, 何偉忠 申請人:中國科學院上海生命科學研究院, 上海生物信息技術研究中心