重組人干細(xì)胞因子的原核表達(dá)載體、工程菌及制備方法

專利名稱：重組人干細(xì)胞因子的原核表達(dá)載體、工程菌及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種新的表達(dá)人干細(xì)胞因子的原核表達(dá)載體及工程菌，該工程菌高密度發(fā)酵方法以及從該工程菌中提取制備高活性重組人干細(xì)胞因子的方法。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)，又稱為肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子(MGF)，c-kit配體及Steel因子，為c-kit原癌基因編碼的受體的配體蛋白。SCF主要由基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，是一類刺激早期造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞增殖和定居的造血生長(zhǎng)因子，SCF在造血干細(xì)胞的發(fā)育、黑色素生成以及生殖細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。它參與機(jī)體發(fā)育過(guò)程中的多種細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控，是造血干細(xì)胞增殖分化的關(guān)鍵因子。SCF與其它細(xì)胞因子(如GM-CSF、IL-3)合用時(shí)，能刺激來(lái)源于骨髓、外周血、臍帶血中的造血干細(xì)胞的增殖。因此SCF在造血干細(xì)胞移植、腫瘤放療、化療導(dǎo)致的骨髓功能衰竭等的造血功能恢復(fù)治療、再生障礙性貧血及其它血液病的治療方面有著很廣闊的應(yīng)用前景。
編碼人SCF基因位于第12號(hào)染色體(12q22-24)，全長(zhǎng)50kb左右。人SCF基因含有8個(gè)外顯子，經(jīng)克隆后編碼人SCF的cDNA序列全長(zhǎng)為543kb。由于編碼基因剪切位點(diǎn)不同，可翻譯成兩種蛋白，表現(xiàn)為可溶性SCF(sSCF)和膜結(jié)合型SCF(mSCF)。這兩種SCF的形成與mRNA的不同拼接方式有關(guān)，前者包含外顯子6編碼的氨基酸殘基序列，編碼的蛋白質(zhì)有248個(gè)氨基酸，以SCF248表示，由于該分子含有跨膜區(qū)及由第6外顯子編碼的一個(gè)蛋白酶切割位點(diǎn)，酶切后的產(chǎn)物能以可溶性分子的形式可被分泌到細(xì)胞外。另一種編碼產(chǎn)物含220個(gè)氨基酸殘基，有跨膜區(qū)，但在由第6外顯子編碼的序列中缺乏相應(yīng)的蛋白切割位點(diǎn)，翻譯后的蛋白質(zhì)以膜蛋白形式存在于細(xì)胞膜表面發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)活性，因而這種SCF為膜結(jié)合型，以SCF220表示?？扇苄院湍そY(jié)合型的SCF都有生物學(xué)活性。
由于天然SCF來(lái)源有限，難以大規(guī)模生產(chǎn)，不能滿足日益增長(zhǎng)的臨床前研究及臨床研究的需要。通過(guò)將人SCF膜外活性部分的165個(gè)氨基酸的cDNA克隆入表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)出的SCF就有天然生物學(xué)活性，其分子量約為18kD，在溶液中通常以非共價(jià)鍵相連的二聚體形式存在。由于骨髓基質(zhì)細(xì)胞和胸腺組織富含SCF mRNA，可通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法擴(kuò)增出人SCF基因，但由于組織細(xì)胞中的SCF mRNA較少，可通過(guò)多次PCR從組織細(xì)胞中擴(kuò)增SCFmRNA；也可以直接從真核細(xì)胞基因文庫(kù)篩選出SCF基因。
可用于表達(dá)SCF的原核表達(dá)載體很多，但表達(dá)量一般占總蛋白的10％左右(Martin，F(xiàn)H，1990，Cell，63(2)203-211；Langley，KE，1992，Arch Biochem Biophy，295(1)21-28)，很少有高效表達(dá)SCF的載體。國(guó)內(nèi)有進(jìn)行密碼子突變來(lái)進(jìn)行高效表達(dá)，見(jiàn)中國(guó)公開專利號(hào)CN1314470A(申請(qǐng)?zhí)?1109409.5)。研究發(fā)現(xiàn)，外源基因上游的一個(gè)SD序列在很多情況下不足以提供高水平表達(dá)。
T7噬菌體的基因10(gene 10 of the phage T7)編碼噬菌體外殼蛋白，該蛋白是T7噬菌體感染大腸肝菌以后的主要表達(dá)產(chǎn)物。該基因上游由9個(gè)核苷酸組成的序列“TTAACTTTA”是一個(gè)非常高效的核糖體位點(diǎn)(RBS)，通過(guò)與核糖體結(jié)合而啟動(dòng)下游基因的翻譯，其效率超過(guò)一般的大腸桿菌RBS(即SD序列)數(shù)十倍，因而被稱為“翻譯增強(qiáng)子”。因此，在通常的原核表達(dá)質(zhì)粒中引入該序列可能提高外源基因表達(dá)(Lehmeier B et al，1992，J of Biotechnol，23(2)153-165；Olins PO et al，1988，Gene，73(1)227-235)。然而，當(dāng)在外源基因的上游僅有翻譯增強(qiáng)子時(shí)，有時(shí)其表達(dá)量仍難以令人滿意。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的高效表達(dá)干細(xì)胞因子的方法、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種高效表達(dá)人干細(xì)胞因子的方法、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于重組表達(dá)人干細(xì)胞因子的原核表達(dá)載體，所述的載體含有人干細(xì)胞因子表達(dá)盒以及與所述表達(dá)盒操作性相連的啟動(dòng)子，所述的表達(dá)盒從5’至3’依次具有序列為TTAACTTTA的增強(qiáng)子、長(zhǎng)度為14±2bp的上游間隔序列、和人干細(xì)胞因子的編碼序列、終止密碼子。
在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體為pBV220，且所述的上游間隔序列為SEQID NO7中第10-23位，即TAAAGGAGGAATTC。
在另一優(yōu)選例中，所述的人干細(xì)胞因子的編碼序列編碼人干細(xì)胞因子第1-165位的氨基酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種大腸桿菌，它含有本發(fā)明上述的原核表達(dá)載體。
在另一優(yōu)選例中，所述的大腸桿菌為大腸桿菌DH5α菌株。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種制備重組人干細(xì)胞因子的方法，包括步驟(a)培養(yǎng)本發(fā)明上述的大腸桿菌，至OD600值為30-45；(b)誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟(a)的大腸桿菌，從而表達(dá)重組人干細(xì)胞因子；(c)分離出表達(dá)的重組人干細(xì)胞因子。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中使用的初始培養(yǎng)基含有0.1-1mM濃度的微量元素、1-5％的葡萄糖、1-5％甘油和1-5％酵母浸出物，并且在培養(yǎng)過(guò)程中補(bǔ)充的養(yǎng)料為10-40％濃度的葡萄糖，5-10％酵母浸出物和5-10％蛋白胨。
在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟(d)對(duì)包涵體變性、復(fù)性、酸沉淀、陽(yáng)離子交換、和反相柱層析，從而得到純化的重組人干細(xì)胞因子。
在另一優(yōu)選例中，所述的復(fù)性的復(fù)性時(shí)間為24-60小時(shí)，最佳復(fù)性時(shí)間為48±2小時(shí)，復(fù)性的蛋白濃度為200-500ug/ml，最佳的蛋白濃度為300±10ug/ml。
在另一優(yōu)選例中，所述的酸沉淀?xiàng)l件是蛋白的濃度為0.5-2mg/ml，最佳的蛋白濃度為1.2±0.1mg/ml，所用的酸為10％的冰醋酸(V/V)，沉淀時(shí)的pH為4.0-5.0，以4.5為最佳。
在另一優(yōu)選例中，所述的陽(yáng)離子交換層析條件是pH為4.0-4.5，最佳為4.5，所采用的陽(yáng)離子交換劑固定在載體底物上的磺基，優(yōu)選的凝膠介質(zhì)為Source30S(Amersham Phamarcia公司)。
在另一優(yōu)選例中，反相柱層析的條件是填料為Source15RPC(AmershamPhamarcia)，洗脫劑為12.5mM HCl的80％乙醇溶液。


圖1顯示了不同培養(yǎng)基對(duì)DH5α/pBV220-rhSCF原核表達(dá)工程菌SCF表達(dá)量的影響。
其中，泳道1標(biāo)準(zhǔn)分子量；泳道22YT；泳道3M9；泳道4M9plus+2YT；泳道5LB；泳道6SOB；泳道7SOC。結(jié)果表明，在2YT和M9plus+2YT中，分子量約18kD的rhSCF蛋白表達(dá)明顯高于其它培養(yǎng)基。
圖2顯示了原核表達(dá)工程菌DH5α/pBV220-rhSCF發(fā)酵生長(zhǎng)曲線。
經(jīng)優(yōu)化的SCF發(fā)酵方法，工程菌在發(fā)酵8-18小時(shí)內(nèi)，基本以穩(wěn)定的速率(約0.15OD600/小時(shí))增長(zhǎng)，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)細(xì)菌OD600可達(dá)約40。
圖3顯示了不同復(fù)性時(shí)間后SDS-PAGE分析rhSCF的復(fù)性效果。
其中，泳道1標(biāo)準(zhǔn)分子量；泳道2復(fù)性5小時(shí)后還原型電泳；泳道3復(fù)性5小時(shí)后氧化型電泳；泳道4未復(fù)性樣品還原型電泳；泳道5未復(fù)性樣品氧化型電泳；泳道6復(fù)性48小時(shí)后還原型電泳；泳道7復(fù)性48小時(shí)后氧化型電泳。在48小時(shí)后氧化型電泳速度明顯比還原型快，形成的二聚體明顯少，顯示復(fù)性已基本完成。
圖4顯示了不同pH值樣品的陽(yáng)離子交換層析分離效果。
圖ApH3.5的50mM枸櫞酸鈉緩沖液；圖BpH＝4.0的50mM乙酸鈉緩沖液；圖CpH＝4.5的50mM乙酸鈉緩沖液；圖DpH＝5.0的50mM乙酸鈉緩沖液。洗脫后第1峰內(nèi)含rhSCF組分，第2峰為NaOH洗脫峰，主要為雜質(zhì)成分、含少量SCF多聚體，rhSCF得率最高的是pH為4.5的陽(yáng)離子交換層析圖。
圖5顯示了Source15RPC分離去除二聚體色譜圖。rhSCF的單體在40％-50％之間的乙醇處洗脫，而二聚體則在60％乙醇以后洗脫，顯示Source15RPC去除二聚體效果佳。
圖6顯示了反相柱層析純度分析。經(jīng)色譜層析純化的rhSCF終樣品用WatersC4(25×390mm，300A，15μm)柱分析其純度。單峰面積占95％以上。
圖7顯示了基于該工程菌表達(dá)的SCF的純化過(guò)程。
泳道1標(biāo)準(zhǔn)分子量；泳道2全菌裂解液；泳道3溶解的包涵體；泳道4復(fù)性上清(還原型)；泳道5復(fù)性上清超濾濃縮后；泳道6酸沉淀上清；泳道7Resource 30S柱分離后(還原型)；泳道8Resource 30S柱分離后(氧化型)；泳道9Resource 15RPC分離后；泳道10經(jīng)Resource 30Q柱轉(zhuǎn)換緩沖液后。顯示經(jīng)以上各步分離后，最終得高純度的rhSCF。
圖8顯示了pBV220-rhSCF165質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明經(jīng)過(guò)深入而廣泛的研究發(fā)現(xiàn)，在SCF編碼序列的上游的特定位置處(在ATG上游約12-16bp處)添加翻譯增強(qiáng)子，可實(shí)現(xiàn)SCF的高效表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明構(gòu)建獲得了高效表達(dá)SCF的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞，并且優(yōu)化了發(fā)酵、復(fù)性和純化等過(guò)程，從而全面優(yōu)化了SCF的生產(chǎn)工藝，實(shí)現(xiàn)了SCF的高效大規(guī)模生產(chǎn)。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)”指天然存在的或人工合成的這樣一種蛋白質(zhì)，它具有已知成熟的(無(wú)信號(hào)肽)可溶型人SCF相同的氨基酸序列(Martin，F(xiàn)H，1990，Cell，63(2)203-211)，其與天然人SCF具相同生物學(xué)活性。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“上游間隔序列”指位于增強(qiáng)子和SCF的起始密碼子ATG之間的序列。在本發(fā)明中，上游間隔序列的長(zhǎng)度通常10-18bp，較佳地為12-16bp。一種優(yōu)選的上游間隔序列是SEQ ID NO7中第10-23位，即TAAAGGAGGAATTC。
在本發(fā)明中，可供使用的重組人干細(xì)胞因子的編碼DNA序列可以是通過(guò)常用的RT-PCR方法克隆的cDNA序列，或是本領(lǐng)域研究人員運(yùn)用人工合成的但編碼與成熟可溶型人干細(xì)胞因子相當(dāng)氨基酸序列的DNA片段。
本發(fā)明的一個(gè)方面，是通過(guò)已知的分子生物學(xué)方法，從胎肝細(xì)胞中抽提mRNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR克隆編碼可溶型SCF的cDNA序列，通過(guò)優(yōu)選翻譯增強(qiáng)子，將cDNA序列插入原核表達(dá)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞大腸桿菌，篩選出穩(wěn)定高表達(dá)SCF的原核工程菌。
許多表達(dá)載體可應(yīng)用于SCF的原核表達(dá)，本發(fā)明通過(guò)比較研究發(fā)現(xiàn)，pBV220是一種特別優(yōu)選的載體。pBV220是一種常用的原核表達(dá)載體，但外源性蛋白編碼基因在該載體控制下的表達(dá)受到多種因素的制約。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，外源基因的翻譯效率并未達(dá)到最佳優(yōu)化水平，外源基因上游的一個(gè)SD序列在很多情況下不足以提供高水平表達(dá)。本發(fā)明通過(guò)在誘導(dǎo)型原核質(zhì)粒pBV220的SD序列上游的不同位置引入T7噬菌體翻譯增強(qiáng)子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ATG上游約10-18bp(較佳地12-16bp)處引入翻譯增強(qiáng)子，特別適合SCF的高效表達(dá)。用PCR方法插入目標(biāo)序列，并用DNA測(cè)序證實(shí)，其增強(qiáng)功能在rhSCF的表達(dá)中得到了證實(shí)。
可用于本發(fā)明的的宿主細(xì)胞沒(méi)有特別限制，代表性例子包括DH5α、MM294、TOP10和ER2566等多種大腸桿菌菌株。優(yōu)選的宿主細(xì)胞為DH5α。
簡(jiǎn)而言之，本發(fā)明的表達(dá)載體是這樣構(gòu)建的采用中國(guó)人胎肝細(xì)胞作為人干細(xì)胞因子的來(lái)源，采用反轉(zhuǎn)錄PCR方法獲得編碼可溶性干細(xì)胞因子N端165個(gè)氨基酸的編碼cDNA；將該cDNA序列克隆到經(jīng)酶切處理的含翻譯增強(qiáng)子的原核表達(dá)載體pBV220中，從而構(gòu)建成重組表達(dá)載體pBV220-rhSCF165。采用大腸桿菌DH5α作為宿主細(xì)胞，用重組表達(dá)載體pBV220-rhSCF165轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，經(jīng)過(guò)反復(fù)篩選和表達(dá)量檢測(cè)分析，獲得穩(wěn)定高表達(dá)rhSCF的工程菌株DH5α/pBV220-rhSCF165。
對(duì)于本發(fā)明的工程菌，可用常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)，然后從培養(yǎng)物中分離出所需的人干細(xì)胞因子。
在本發(fā)明的另一方面，還針對(duì)已篩選出原核高表達(dá)工程菌，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基的優(yōu)化、發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化、補(bǔ)料方案的選擇，建立一套完整合適的高密度發(fā)酵工藝。
將構(gòu)建好的熱誘導(dǎo)pBV220-rhSCF表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH-5α大腸桿菌中，表達(dá)工程菌DH-5α/pBV220-rhSCF是一株非分泌型表達(dá)工程菌，其rhSCF表達(dá)是在熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制下，在32℃時(shí)不表達(dá)，但在升溫到42℃時(shí)表達(dá)rhSCF。表達(dá)蛋白是以包涵體形式存在。理想的培養(yǎng)基即能讓細(xì)菌快速生長(zhǎng)，又有高的表達(dá)量。本發(fā)明觀察了不同培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)和rhSCF表達(dá)量的影響，發(fā)現(xiàn)工程菌在LB、M9及2YT中生長(zhǎng)迅速，但只有在2YT和M9plus+2YT中表達(dá)量最高?？紤]到M9具有緩沖能力，有利于細(xì)菌發(fā)酵時(shí)pH值的穩(wěn)定控制，故本實(shí)驗(yàn)以M9為基本培養(yǎng)基。通過(guò)優(yōu)選試驗(yàn)，在M9培養(yǎng)基中添加不同的組份，包括不同濃度的葡萄糖、酵母浸出粉、酪蛋白水解物及不同的微量元素配方，以此培養(yǎng)基作為擴(kuò)增培養(yǎng)基，在32℃進(jìn)行培養(yǎng)，然后補(bǔ)充各種養(yǎng)料維持細(xì)菌以一定的速度生長(zhǎng)，最后用2YT作為熱誘導(dǎo)培養(yǎng)基，使最終發(fā)酵的工程菌中rhSCF表達(dá)量可占總蛋白的30％以上。
原核表達(dá)系統(tǒng)因?yàn)槿狈Φ鞍踪|(zhì)折疊所需的環(huán)境，表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與天然蛋白明顯不同，高表達(dá)的蛋白質(zhì)常以不溶性包涵體形式存在，并絕大多數(shù)無(wú)生物學(xué)活性。原核表達(dá)產(chǎn)物制備過(guò)程中，一般均涉及目的蛋白的變性和復(fù)性。復(fù)性過(guò)程直接影響蛋白質(zhì)的得率及終產(chǎn)品的比活性。對(duì)復(fù)性條件的優(yōu)化是重組表達(dá)目的蛋白生產(chǎn)工藝中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。蛋白的純化則影響蛋白的純度、得率和比活性，色譜分離技術(shù)是蛋白質(zhì)純化最重要的手段，對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化有非常重要意義。本發(fā)明同時(shí)包括基于上述高效表達(dá)工程菌表達(dá)的SCF的包涵體的溶解、復(fù)性和純化的工藝研究。
本發(fā)明還提供了一種從含rhSCF的包涵體中通過(guò)變性及復(fù)性方法，制備具有生物學(xué)活性的簡(jiǎn)便方法。本發(fā)明中發(fā)酵終產(chǎn)物中rhSCF以包涵體形式存在，要制備含有生物學(xué)活性的rhSCF，必須對(duì)包涵體進(jìn)行變性及復(fù)性。
首先必須選擇適當(dāng)?shù)娜芤喝芙獍w，常用的方法是在緩沖液中加入合適的變性劑，如高濃度的尿素、鹽酸胍、SDS等。通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，選擇了含5-8M尿素的緩沖液溶解rhSCF包涵體。
通過(guò)稀釋后復(fù)性，經(jīng)超濾濃縮及緩沖液轉(zhuǎn)換后，制備具有生物學(xué)活性的rhSCF粗制品。優(yōu)選的復(fù)性條件為50mM Tris/HCl，pH＝8.0，2M尿素+1mMGSH/0.2mM GSSG，最佳的復(fù)性時(shí)間為40-60小時(shí)，更佳地為48小時(shí)。重組rhSCF在PH＞7的緩沖液中，在體外很容易復(fù)性，但在復(fù)性時(shí)必須掌握好rhSCF的蛋白濃度，太高或太低的rhSCF濃度皆影響復(fù)性，而且明顯影響比活性和復(fù)性得率，將rhSCF濃度控制在200-500μg/ml合適，以300ug/ml左右為最佳。
本發(fā)明還提供了一種簡(jiǎn)便快速的純化干細(xì)胞因子的方法，該方法包括依次采用酸沉淀、Source30S陽(yáng)離子柱層析、Source15RPC反相柱層析及Source30Q柱層析獲得高純度的重組人干細(xì)胞因子。酸沉淀時(shí)的蛋白濃度和酸沉淀時(shí)的pH值對(duì)rhSCF的得率和活性有明顯的影響，其中蛋白濃度以0.5-2mg/ml為佳，尤以1.2mg/ml為最佳。酸沉淀時(shí)pH值，以pH4.0-5.0為合適，又以pH4.5為最佳。
在一優(yōu)選例中，純化方法包括首先將復(fù)性后SCF組分，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH值為4.5，離心15000rpm×15min去除沉淀。然后將上清上樣到預(yù)先用50mM乙酸鈉，pH＝4.5緩沖液平衡的Source30S，以50mM乙酸鈉，PH＝4.5，1N NaCl線性梯度洗脫，將收集的組份用12.5mMHCl酸化后，上樣到Source15RPC，以含12.5mMHCl的80％乙醇線性梯度洗脫，收集SCF，最后用Source30Q轉(zhuǎn)換緩沖液。
采用本發(fā)明優(yōu)化的發(fā)酵、純化工藝，可以在4天時(shí)間內(nèi)，制備rhSCF表達(dá)量可占總蛋白的30％以上的培養(yǎng)物，經(jīng)純化后可得到純度達(dá)95％以上的rhSCF(產(chǎn)率為0.13g/l)。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(a)本發(fā)明中構(gòu)建的重組表達(dá)人干細(xì)胞因子的工程菌具有表達(dá)量高，表達(dá)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。
(b)通過(guò)本發(fā)明方法制備重組人干細(xì)胞因子得率高、活性好，可用于腫瘤放療、化療后的造血功能重建，造血干細(xì)胞的體外培養(yǎng)等。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1原核高表達(dá)工程菌DH5α/pBV220-rhSCF的構(gòu)建與篩選人SCF的完整編碼序列從人胎肝組織通過(guò)RT-PCR方法獲得?？寺∵@一序列的引物由上海生工生物技術(shù)公司合成，序列如下上游引物5’TATATGAAGAAGACA CAAACTTGG(SEQ ID NO1，下劃線標(biāo)示處為起始碼)，下游引物5’CG CACTTCTTGAA ACTCTCTCTC(SEQ ID NO2，下劃線標(biāo)示處為終止碼，雙下劃線為引入的酶切位點(diǎn)BamH I)。
人SCF最長(zhǎng)的成熟蛋白包含248個(gè)氨基酸，前端信號(hào)肽長(zhǎng)25個(gè)氨基酸，包含終止碼的核苷酸序列全長(zhǎng)為822bp。PCR產(chǎn)物大小接近822bp，與理論值相符。對(duì)該片段可以進(jìn)行初步的酶切鑒定。在人SCF序列中有一EcoRI位點(diǎn)，可以將片段切成420bp和400bp的兩個(gè)片段。PCR擴(kuò)增的人SCF基因片段克隆入T載體(Promega公司)后測(cè)序鑒定。T載體上帶有通用測(cè)序引物序列，由于插入片段長(zhǎng)于800bp，所以雙向測(cè)序。測(cè)序采用末端終止法，試劑為BigDye測(cè)序試劑(Perkin-Elmer)，數(shù)據(jù)采集及分析使用ABI377型全自動(dòng)測(cè)序儀。測(cè)序的結(jié)果示氨基酸序列與報(bào)道的序列完全一致。
將插入有人SCF基因的質(zhì)粒將作為擴(kuò)增人SCF表達(dá)基因片段的模板。人SCF在天然狀態(tài)下存在由165個(gè)氨基酸殘基組成的分泌型單體，即人SCF膜結(jié)合型上胞外段的一部分，這一分泌型蛋白的長(zhǎng)度符合原核表達(dá)的最佳長(zhǎng)度范圍，并且沒(méi)有跨膜區(qū)，從理論上來(lái)說(shuō)適宜于原核表達(dá)，并且這一表達(dá)產(chǎn)物可以與人SCF的受體結(jié)合，具有人SCF的生物學(xué)活性。因而構(gòu)建了表達(dá)這一分泌型單體的原核表達(dá)載體。
許多表達(dá)載體可應(yīng)用于SCF的原核表達(dá)，包括pBV220，pLCM182，pGEM等，本發(fā)明選用熱誘導(dǎo)型的表達(dá)載體pBV220(見(jiàn)中國(guó)專利申請(qǐng)CN98105441.2，申請(qǐng)日1998年3月6日，申請(qǐng)人上海華晨生物技術(shù)研究所)。pBV220的質(zhì)粒包含質(zhì)粒復(fù)制起始子ori，氨芐青霉素抗性基因AmpR，來(lái)源于λ噬菌體的原核轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子PRPL，強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止序列rrnBT1T2，多克隆酶切位點(diǎn)MCS，和λ噬菌體來(lái)源的溫敏突變的阻抑蛋白cIts857，該蛋白在30℃時(shí)可強(qiáng)烈阻抑基因轉(zhuǎn)錄，當(dāng)溫度升至42℃時(shí)，該蛋白失活，要表達(dá)的目的蛋白序列被置于PRPL啟動(dòng)子的下游，當(dāng)熱誘導(dǎo)時(shí)該P(yáng)RPL啟動(dòng)子可使位于其下游的蛋白質(zhì)編碼序列翻譯及表達(dá)。
研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)(質(zhì)粒)中，外源基因的翻譯效率并未達(dá)到最佳優(yōu)化水平，外源基因上游的一個(gè)SD序列在很多情況下不足以提供高水平表達(dá)。為了提高表達(dá)，本發(fā)明人在pBV220載體基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)即用PCR方法加入噬菌體來(lái)源的翻譯增強(qiáng)子TTAACTTTA，所用的合成引物如下上游引物5’-GGCGGGAATTCCTCCTTTATAAAGTTAAAT TTTTAACCAATGCTTCGTTTCGTATC-3’，(SEQ ID NO3)下游引物5’-CCGAATTCCCGGGGATCCGTCGACCTGCAG CCAAGCTT-3’(SEQ IDNO4)，下劃線處為EcoRI酶切位點(diǎn)。
以EcoRI線性化的pBV220為模板擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接即得到改構(gòu)的pBV220載體。
rhSCF165的擴(kuò)增則以下列引物從T載體中直接克隆，引物序列如下上游引物5’TA GAAGGGATCTGCAGGAA(SEQ ID NO5，下劃線處為原核表達(dá)時(shí)加入的起始碼蛋氨酸，雙下劃線為EcoRI酶切位點(diǎn))，下游引物5’CGGGATCCTTAGGCTGCAACAGG GGGT(SEQ ID NO6，下劃線處為引入的BamH I酶切位點(diǎn))。
將擴(kuò)增的hSCF165以EcoRI和BamHI雙酶切，并插入用EcoRI和BamHI酶切的改構(gòu)pBV220載體，構(gòu)建成pBV220-rhSCF165質(zhì)粒，最后經(jīng)測(cè)序證實(shí)其序列正確性。pBV220-rhSCF165質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖譜見(jiàn)圖8。
得到序列正確的表達(dá)質(zhì)粒克隆后，將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到其它大腸桿菌中。在本實(shí)施例中將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化了DH5α，MM294，TOP10和ER2566等。作小量的誘導(dǎo)表達(dá)觀察不同宿主菌對(duì)表達(dá)SCF的影響，結(jié)果表明，相比較而言，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α所獲得的工程菌DH5α/pBV220-rhSCF的表達(dá)最高。
實(shí)施例2高表達(dá)原核工程菌DH5α/pBV220-rhSCF的大規(guī)模培養(yǎng)發(fā)酵工藝研究的目的是建立一套完整合適的發(fā)酵工藝，基本思想是在終產(chǎn)物產(chǎn)率、操作的簡(jiǎn)便性和投入的經(jīng)濟(jì)性之間尋求最適的方案，其中終產(chǎn)物的產(chǎn)率是考慮的首要因素。本實(shí)施例研究了批式發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)注射用rhSCF的基本培養(yǎng)基和發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基補(bǔ)充等問(wèn)題。大腸桿菌培養(yǎng)基包括四類營(yíng)養(yǎng)成分氮源物質(zhì)，主要是氨基酸和蛋白質(zhì)類；碳水化合物，主要是糖類和甘油等；無(wú)機(jī)鹽類，包括各種所需鹽類和微量元素；維生素類。
通過(guò)搖床發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明人觀察了不同的培養(yǎng)基包括LB，2YT，SOB，SOC，M9和M9plus+2YT培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)和rhSCF表達(dá)量的影響。
結(jié)果表明，工程菌在LB、M9和2YT中生長(zhǎng)迅速，但只有在2YT和M9plus+2YT中表達(dá)量最高(圖1)。考慮到M9具有緩沖能力，有利于細(xì)菌發(fā)酵時(shí)pH值穩(wěn)定，故本實(shí)驗(yàn)以M9為基本培養(yǎng)基。在此基礎(chǔ)上，在M9培養(yǎng)基中添加不同的組份，包括適當(dāng)濃度(1-5％)的葡萄糖，1-5％酵母浸出粉，和1-5％酪蛋白水解物及不同的微量元素配方，推薦的培養(yǎng)基配方如下。
NH4Cl 20mMK2SO416.1mMKH2PO47.8mMNa2HPO412.2mMMgSO4.7H2O 3mM檸檬酸3鈉.2H2O 1.5mMMnSO4.4H2O 30μMZnSO4.7H2O 30μMCuSO4.5H2O 3μML-色氨酸70mg/lFeSO47H2O72μM硫胺20mg/l葡萄糖 40g/l酵母浸出粉 10g/L酪蛋白水解物10g/L以此培養(yǎng)基作為擴(kuò)增培養(yǎng)基，在32℃進(jìn)行培養(yǎng)。待OD600為10時(shí)，開始補(bǔ)充各種養(yǎng)料，主要是葡萄糖，蛋白胨和酵母浸出份，補(bǔ)料速度以維持細(xì)菌OD600值以每小時(shí)0.2速度生長(zhǎng)為佳，至OD值為40時(shí)，開始升溫至42℃誘導(dǎo)表達(dá)，細(xì)菌發(fā)酵生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2。
按生長(zhǎng)菌種必須經(jīng)過(guò)擴(kuò)增，由于種子液的擴(kuò)增無(wú)需工程菌表達(dá)rhSCF，因此要盡可能地增加細(xì)菌的擴(kuò)增量。將種子液分別以2％、5％和10％的比例接種入2YT培養(yǎng)基中，在搖床中發(fā)酵2hr后，升溫至42℃誘導(dǎo)表達(dá)6hr，細(xì)菌得率隨接種比例增加而增加，但rhSCF得率在2％組與5％、10％組相比無(wú)明顯差異，考慮到實(shí)際操作過(guò)程中，種子制備體積過(guò)大會(huì)增加操作時(shí)間，使種子發(fā)生雜菌污染的機(jī)率增大，因此最終發(fā)酵工藝中的接種量為2％。
pH值的波動(dòng)對(duì)rhSCF的表達(dá)產(chǎn)生明顯的影響，當(dāng)pH值在6.5-7.4之間時(shí)rhSCF表達(dá)基本不受影響，但當(dāng)?shù)陀?.5時(shí)rhSCF的表達(dá)明顯受到抑制。由于M9培養(yǎng)基中含有緩沖對(duì)，在搖床發(fā)酵下可控制在6.5以上。但當(dāng)在發(fā)酵罐中發(fā)酵時(shí)，由于細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中不斷產(chǎn)生酸性物質(zhì)，因此必須不斷補(bǔ)充堿性物質(zhì)如氨水、氫氧化鉀溶液等。
溶氧是一個(gè)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)影響極大的參數(shù)。在發(fā)酵罐培養(yǎng)中溶氧主要受到三個(gè)因素的控制，即轉(zhuǎn)速、通氣量和罐壓，加大任何一項(xiàng)都可使溶氧值增加。一般大腸桿菌的培養(yǎng)，溶氧值通常設(shè)定在30-80％之間。本發(fā)明觀察到DH-5α/pBV220-rhSCF在30-60％溶氧值之間其rhSCF表達(dá)并無(wú)明顯差別。溶氧值大于60％，由于必須通過(guò)增加轉(zhuǎn)速或通氣量來(lái)維持設(shè)定的溶氧值，因而加大了對(duì)細(xì)菌的剪切，細(xì)菌的結(jié)構(gòu)受到破壞，此時(shí)rhSCF的表達(dá)量反而減少；而溶氧值小于30％時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)周期將延長(zhǎng)，故將轉(zhuǎn)速、通氣量與溶氧控制級(jí)聯(lián)(最高轉(zhuǎn)速不得大于800rpm)，而通氣量最少定為2L/min，罐壓定為6PSI，以保證溶氧控制在30％以上。在發(fā)酵過(guò)程中，工程菌DH-5α/pBV220-rhSCF細(xì)菌在32℃培養(yǎng)后，升溫至42℃進(jìn)行熱誘導(dǎo)。
在誘導(dǎo)的開始階段，表達(dá)產(chǎn)物隨著誘導(dǎo)的時(shí)間延長(zhǎng)而不斷增加，但隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量不再增加，有時(shí)反而因?yàn)橥庠葱灾亟M蛋白在細(xì)菌內(nèi)的酶解作用而下降。因此在工藝研究過(guò)程中，觀察熱誘導(dǎo)后1h，2h，3h，4h，5h，6h和7h rhSCF表達(dá)量的變化。
結(jié)果表明，細(xì)菌在誘導(dǎo)后2h后rhSCF即有明顯的表達(dá)，6h達(dá)最高峰，在優(yōu)化的表達(dá)條件下rhSCF的表達(dá)量可達(dá)細(xì)菌菌體蛋白的31.8％。因此，最后選6h作為發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間。
實(shí)施例3重組人干細(xì)胞因子的包涵體的溶解與復(fù)性包涵體的分離與溶解是原核重組表達(dá)蛋白制備中的一個(gè)重要步驟。原核表達(dá)系統(tǒng)因?yàn)槿狈Φ鞍踪|(zhì)折疊所需的環(huán)境，表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與天然蛋白明顯不同，許多蛋白質(zhì)常以不溶性包涵體形式存在，并絕大多數(shù)無(wú)生物學(xué)活性。包涵體作為原核表達(dá)產(chǎn)物的一種主要存在形式，為目的蛋白的富集及后續(xù)的分離純化提供了十分便利的條件。本發(fā)明中高表達(dá)rhSCF是以不溶的包涵體形式存在，經(jīng)高壓破菌(1000psi)后細(xì)菌，離心收集沉淀即為包涵體。
用含低濃度去垢劑如尿素或鹽酸胍的緩沖液洗滌，洗滌目的是在保證靶蛋白基本不損失的情況下，去除部分菌體蛋白和雜質(zhì)，簡(jiǎn)化后面的純化步驟，由于鹽酸胍影響離子交換層析，因此首先采用1M和2M尿素洗滌包涵體，2M尿素洗滌效果較1M稍佳，但是目的蛋白損失也較多，因此最后選用1M尿素洗滌。由于包涵體是變性的rhSCF的聚合體，因此必須采用變性劑如高濃度的尿素或鹽酸胍溶解，本發(fā)明采用含8M尿素的Tris緩沖液(pH＝8.0)溶解包涵體。
用8M尿素變性的包涵體要復(fù)性為有功能活性的靶蛋白，必須降低或去除高濃度尿素，目前較常用的去除方法有稀釋和透析兩種，后者因不易控制內(nèi)毒素等的污染，且在大規(guī)模制備中不易操作，而前者相對(duì)簡(jiǎn)單，因此本實(shí)驗(yàn)用稀釋法降低尿素濃度，最后優(yōu)選的復(fù)性液為pH＝8.0 50mMTris緩沖液(含2M尿素+1mmGSH/0.2mMGSSG)。
重組rhSCF在PH＞7的緩沖液中，在體外很容易復(fù)性，但在復(fù)性時(shí)必須掌握好rhSCF的蛋白濃度，當(dāng)?shù)鞍诐舛冗^(guò)高時(shí)，很容易出現(xiàn)大量的二聚體，從而影響重組制品的質(zhì)量和得率。rhSCF濃度測(cè)定方法是先測(cè)定溶液中總蛋白的濃度，然后行SDS-PAGE電泳，用圖像分析儀計(jì)算rhSCF的相對(duì)含量，估算rhSCF的含量。復(fù)性過(guò)程中可用SDS-PAGE電泳監(jiān)測(cè)rhSCF的復(fù)性程度，復(fù)性正確的rhSCF其氧化型電泳速率比還原型快，太高或太低的rhSCF濃度皆影響復(fù)性，而且明顯影響比活性和復(fù)性得率(表1)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)將rhSCF濃度控制在200-500μg/ml范圍比較合適，尤以300ug/ml左右最佳。復(fù)性的時(shí)間對(duì)正確復(fù)性也有明顯的影響，太短時(shí)間復(fù)性不完全，復(fù)性后的蛋白不穩(wěn)定，最后選擇復(fù)性時(shí)間控制在40-60小時(shí)合適，以48小時(shí)左右為最佳(圖3)。
表1不同rhSCF蛋白濃度復(fù)性后rhSCF的得率和比活性rhSCF蛋白濃度復(fù)性得率 比活性(mg/ml)1.00 36.5％ 5.2×105U/mg0.60 48.2％ 5.9×105U/mg0.30 60.4％ 7.5×105U/mg0.15 50.3％ 7.5×105U/mg實(shí)施例4采用酸沉淀從復(fù)性液中濃縮分離rhSCF復(fù)性后的蛋白溶液中含有許多雜蛋白，對(duì)pH的變化非常敏感，酸沉淀既要考慮盡可能去除雜蛋白，又要保證靶蛋白活性和得率損失最少，在pH降低至6以下時(shí)，有大量白色霧狀沉淀出現(xiàn)，降至4.0-5.0時(shí)，沉淀繼續(xù)增多，尤以pH為4.5時(shí)，沉淀達(dá)最多，且SDS-PAGE電泳示沉淀中大部分為雜蛋白，少量rhSCF單體和非共價(jià)鍵形成的rhSCF二聚體。
比較酸沉淀和將復(fù)性后樣品直接用陰離子交換柱分離的效果，發(fā)現(xiàn)用陰離子交換柱雖然可得到更多的rhSCF，但是其中含有許多復(fù)性不正確的rhSCF，在隨后的陽(yáng)離子交換色譜純化過(guò)程中，復(fù)性不正確的rhSCF去除后，其得率反比直接用酸沉淀低。因此最后選用將樣品直接用酸沉淀去除大部分雜質(zhì)。酸沉淀時(shí)rhSCF濃度對(duì)酸沉淀得率有明顯的影響，蛋白濃度過(guò)高大于2mg/ml時(shí)，酸沉淀得率反而低，蛋白濃度過(guò)低，則酸沉淀后樣品體積太大，影響了后續(xù)的柱層析純化過(guò)程，因此最后將rhSCF蛋白濃度控制在0.6-2mg/ml為合適，最適為1.2mg/ml(表2)。
表2不同rhSCF蛋白濃度對(duì)酸沉淀得率影響rhSCF蛋白濃度(mg/ml) 酸沉淀后得率5.00 8.5％2.40 21.2％1.20 30.4％0.60 35.3％
實(shí)施例5層析法分離rhSCF由于rhSCF等電點(diǎn)為5.2，用酸沉淀去除大部分雜蛋白后的樣品用陽(yáng)離子交換色譜可進(jìn)一步得到純化，通過(guò)對(duì)不同陽(yáng)離子交換填料的實(shí)驗(yàn)比較，選用的填料是Pharmacia Source 30S陽(yáng)離子交換填料。該填料屬BioProcess填料，可滿足于中試生產(chǎn)放大需要，便于在位清洗及消毒。而且具有很好的剛性，適合應(yīng)用于對(duì)大體積樣品進(jìn)行高流速的快速純化過(guò)程。
首先對(duì)不同pH值緩沖液對(duì)陽(yáng)離子交換柱分離效果進(jìn)行了比較研究。在1ml的小體積柱上，研究了pH為3.5、4.0、4.5和5.0的條件下采用Souce30S填料對(duì)酸沉淀后的樣品進(jìn)行層析分離的效果(圖4)。經(jīng)過(guò)觀察，發(fā)現(xiàn)選用不同pH值緩沖液進(jìn)行陽(yáng)離子交換時(shí)，會(huì)對(duì)rhSCF的最終得率產(chǎn)生較大的影響。pH值過(guò)低，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)在填料上吸附過(guò)強(qiáng)，使得率降低。pH值過(guò)高，可能會(huì)使目的蛋白離子交換填料上吸附力減弱，一方面使填料的上樣量減少(部分目的蛋白出現(xiàn)在上樣時(shí)的流穿峰中)，從而使rhSCF的回收率下降。通過(guò)比較，本發(fā)明人最終選用的最適層析條件為緩沖液A為pH4.5的50mM乙酸鈉緩沖液，B則為緩沖液A+1M NaCl。
將陽(yáng)離子交換分離的rhSCF組份用反相柱層析進(jìn)一步分離。反相柱填料為Pharmacia公司的Source15RPC。樣品用12.5mM HCl酸化后，非共價(jià)鍵形成的二聚體易于解離，而共價(jià)鍵形成的二聚體則不易解離，用反相的方法可區(qū)分開，常用的反相洗脫劑有乙腈和乙醇，由于乙腈很容易使SCF生物活性物質(zhì)丟失、對(duì)人體毒性較大，且成本相對(duì)乙醇高，因此選用乙醇。最后優(yōu)化的洗脫方案為用12.5mM HCl酸化的乙醇洗脫，可將rhSCF中共價(jià)鍵形成的二聚體和單體分離(圖5)。分離的rhSCF單體用Source30Q轉(zhuǎn)換緩沖液至PBS溶液中。經(jīng)過(guò)以上各步分離后的rhSCF樣品，經(jīng)用反相層析分析柱鑒定示其純度在95％以上(圖6)。各步純化過(guò)程和雜質(zhì)去除效果總結(jié)于圖7。
實(shí)施例6制備的rhSCF的生物活性測(cè)定rhSCF對(duì)祖系造血干細(xì)胞有促生長(zhǎng)分化的作用，因此本實(shí)驗(yàn)選擇了用UT-7(巨核細(xì)胞系造血干細(xì)胞)/MTT法測(cè)定rhSCF生物學(xué)活性。
取適量96孔細(xì)胞培養(yǎng)板做相應(yīng)標(biāo)記，將實(shí)驗(yàn)所用的溶液預(yù)溫到37℃。取足量UT-7細(xì)胞培養(yǎng)物，1200rpm離心5min后，棄上清，重懸于10ml PBS緩沖液中，37℃條件下放置5min后離心。重復(fù)三次后，用含10％血清的1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105/ml，置37℃?zhèn)溆谩?br> 取rhSCF標(biāo)準(zhǔn)品用含10％血清的1640培養(yǎng)基稀釋至500IU/ml。將待測(cè)樣品稀釋到1μg/ml濃度。將待測(cè)樣品進(jìn)行倍比稀釋，并設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照。每孔加入細(xì)胞懸液培養(yǎng)50μl細(xì)胞懸液，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)40小時(shí)。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
用以上方法測(cè)定本發(fā)明中純化的rhSCF的活性非常穩(wěn)定，比活性為6-7×105IU/mg。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>第二軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)研究所<120>重組人干細(xì)胞因子的原核表達(dá)載體、工程菌及制備方法<130>033706<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<222>(1)..(27)<223>含增強(qiáng)子的ATG上游序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(9)<223>增強(qiáng)子序列<400>7ttaactttat aaaggaggaa ttc 2權(quán)利要求
1.一種用于重組表達(dá)人干細(xì)胞因子的原核表達(dá)載體，其特征在于，所述的載體含有人干細(xì)胞因子表達(dá)盒以及與所述表達(dá)盒操作性相連的啟動(dòng)子，所述的表達(dá)盒從5’至3’依次具有序列為TTAACTTTA的增強(qiáng)子、長(zhǎng)度為14±2bp的上游間隔序列、和人干細(xì)胞因子的編碼序列、終止密碼子。
2.如權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，表達(dá)載體為pBV220，且所述的上游間隔序列為SEQ ID NO7中第10-23位。
3.一種大腸桿菌，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)載體。
4.如權(quán)利要求3所述的大腸桿菌，其特征在于，所述的大腸桿菌為大腸桿菌DH5α菌株。
5.一種制備重組人干細(xì)胞因子的方法，其特征在于，包括步驟(a)培養(yǎng)權(quán)利要求3所述的大腸桿菌，至OD600值為30-45；(b)誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟(a)的大腸桿菌，從而表達(dá)重組人干細(xì)胞因子；(c)分離出表達(dá)的重組人干細(xì)胞因子。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中使用的初始培養(yǎng)基含有0.1-1mM濃度的微量元素、1-5％的葡萄糖、1-5％甘油和1-5％酵母浸出物，并且在培養(yǎng)過(guò)程中補(bǔ)充的養(yǎng)料為10-40％濃度的葡萄糖，5-10％酵母浸出物和5-10％蛋白胨。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，還包括步驟(d)對(duì)包涵體變性、復(fù)性、酸沉淀、陽(yáng)離子交換、和反相柱層析，從而得到純化的重組人干細(xì)胞因子。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的復(fù)性的復(fù)性時(shí)間為24-60小時(shí)，復(fù)性的蛋白濃度為200-500ug/ml。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的酸沉淀?xiàng)l件是蛋白的濃度為0.5-2mg/ml，沉淀時(shí)的pH為4.0-5.0。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的陽(yáng)離子交換層析條件是pH為4.0-4.5，所采用的陽(yáng)離子交換劑固定在載體底物上的磺基；反相柱層析時(shí)的洗脫劑為12.5mM HCl的80％乙醇溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及高效表達(dá)重組人干細(xì)胞因子(rhSCF)的表達(dá)載體、工程菌及制備方法。本發(fā)明還提供了通過(guò)優(yōu)選的培養(yǎng)基成分及優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)，建立了工程菌高密度發(fā)酵方法。還提供了通過(guò)包涵體變性、蛋白復(fù)性、色譜分離制備高純度重組人干細(xì)胞因子的方法。本發(fā)明中構(gòu)建的重組人干細(xì)胞因子表達(dá)工程菌具有表達(dá)量高，表達(dá)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，所采取的純化工藝穩(wěn)定可靠，得率高，利于大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/36GK1570119SQ0314157
公開日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2003年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月14日
發(fā)明者陳國(guó)友, 蔣應(yīng)明, 黃欣, 張意, 盧琳, 施群英, 曹雪濤 申請(qǐng)人:第二軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)研究所