專利名稱：馬鈴薯病毒rna的提取方法
技術領域：
本發明涉及一種馬鈴薯病毒RNA的提取方法。
植物RNA的提取技術主要有兩條路線。(1)異硫氰酸胍法。此方法適用于富含RNA酶的組織或核質不易分開的組織，但較為昂貴，不適合生產應用。(2)苯酚法。此方法的提取工藝雖較異硫氰酸胍法簡單、經濟，但操作流程仍然十分的繁瑣，即玻璃器皿需在180℃下至少烘烤8小時，不耐高溫的離心管、微量移液器吸頭、實驗用水均用DEPC處理。因此，RNA提取成本仍然較高，很難在生產上廣泛使用。以上原因使目前用RT-PCR方法檢測馬鈴薯病毒受到了限制。
本發明包括以下步驟1)將馬鈴薯莖或葉片組織放入冰預冷的滅菌勻漿器或研缽中，研磨成勻漿；2)向勻漿中加入提取緩沖液(Tris-HCl pH8.0 100mmol/L，NaCl 100mmol/L，EDTA10mmol/L)和β-巰基乙醇，在離心管中振蕩混勻；3)加入水飽和酚，氯仿/異戊醇(49∶1，體積比)，充分混勻，冰浴中放置10分鐘，其間混勻2～3次；4)以10000轉/分室溫離心15分鐘，吸取水相，加入0.1倍體積的NaAc(3mol/L，pH5.2)和等體積的異丙醇，混勻，在-20℃中沉淀3小時；5)以11000轉/分室溫離心20分鐘后，棄去上清，加冰預冷70％的乙醇洗滌沉淀2次，室溫風干，至乙醇揮發完全為止；
6)用無菌雙蒸水充分溶解提取的RNA，測OD值，計算RNA濃度。
本發明中使用的玻璃器皿不需要180℃高溫烘烤8小時，不耐高溫的器皿不需要用DEPC處理和實驗用水不需要DEPC處理，只需高壓滅菌。與傳統的RNA提取方法相比，本發明在準備工作中，省去了對器皿的高溫烘烤或DEPC處理，省去了對實驗用水的DEPC處理。并且以冰予冷的勻漿器或研缽代替在液氮中研磨，以普通高速離心機代替冰凍高速離心機。以上的改進，簡化了提取步驟，降低了成本，為生產上使用RT-PCR方法檢測馬鈴薯病毒奠定基礎。本發明提取的馬鈴薯病毒RNA純度較高，含糖和酚類等小分子雜質較少，可以為RT-PCR檢測提供有效的模板。
圖2馬鈴薯S病毒擴增產物電泳結果。
2、向勻漿中加入1ml RNA提取緩沖液(Tris-HCl pH8.0 100mmol/L，NaCl100mmol/L，EDTA 10mmol/L)和8μlβ-巰基乙醇，在離心管中振蕩混勻。
3、加入1ml水飽和酚，1ml氯仿/異戊醇(49∶1，v/v)，充分混勻，冰浴中放置10分鐘，其間混勻2～3次。
4、臺式高速離心機10000轉/分，室溫離心15分鐘。吸取水相，水相中加入0.1倍體積的NaAc(3mol/L，pH5.2)和等體積的異丙醇，混勻。在-20℃中沉淀3小時。
5、臺式高速離心機11000轉/分，室溫離心20分鐘后，棄去上清。加600μl冰預冷70％的乙醇洗滌沉淀2次，室溫風干，至乙醇揮發完全為止。
6、用50μl無菌雙蒸水充分溶解提取的RNA，測OD值，計算RNA濃度。
采用本發明(簡稱簡約法)提取馬鈴薯病毒RNA，用經典苯酚提取法提取馬鈴薯病毒RNA作為對照，用以上兩種方法提取的馬鈴薯病毒RNA為模板進行RT-PCR反應。同時用簡約法提取未染病組織的病毒RNA作為陰性對照，RT-PCR結果如
圖1圖1馬鈴薯Y病毒擴增產物電泳結果。圖中的四個泳道分別為1分子量標準；2經典苯酚提取法提取馬鈴薯Y病毒RNA，以它為模板進行RT-PCR反應，得到病毒特異擴增的目的片段；3簡約法提取馬鈴薯Y病毒RNA，以它為模板進行RT-PCR反應，得到病毒特異擴增的目的片段；
4健康馬鈴薯葉片組織RT-PCR擴增產物。未見擴增的目的片段。
將本發明得到的病毒特異擴增目的片段進行測序鑒定。測序結果證明，擴增出的目的片段確實來自馬鈴薯Y病毒RNA，從而證明了本發明提取馬鈴薯病毒RNA的可靠性。從電泳結果可以看出，用上述兩種方法提取的馬鈴薯病毒RNA制備的模板，均可用于RT-PCR檢測。由于簡約法具有快速、簡便、可靠、成本低等優勢，因此，可廣泛應用于實際生產中馬鈴薯病毒的檢測。
實施例2以天津市蔬菜所提供的帶有馬鈴薯S病毒的馬鈴薯葉片為材料，采用實施例1的操作步驟簡約法提取馬鈴薯病毒RNA，用經典苯酚提取法提取馬鈴薯病毒RNA作為對照，用以上兩種方法提取的馬鈴薯病毒RNA為模板進行RT-PCR反應。同時用簡約法提取未染病組織的病毒RNA作為陰性對照，RT-PCR結果如下(圖2)圖2馬鈴薯S病毒擴增產物電泳結果。圖中的四個泳道分別為1分子量標準；2經典苯酚提取法提取馬鈴薯S病毒RNA，以它為模板進行RT-PCR反應，得到病毒特異擴增的目的片段；3新方法提取馬鈴薯S病毒RNA，以它為模板進行RT-PCR反應，得到病毒特異擴增的目的片段；4健康馬鈴薯葉片組織RT-PCR擴增產物。未見特異擴增的目的片段；將本發明得到的病毒特異擴增目的片段進行測序鑒定。測序結果證明，擴增出的目的片段確實來自馬鈴薯S病毒RNA，從而證明了本發明提取馬鈴薯病毒RNA的可靠性。從電泳結果可以看出，用上述兩種方法提取的馬鈴薯病毒RNA制備的模板，均可用于RT-PCR檢測。
權利要求
1.一種馬鈴薯病毒RNA的提取方法，其特征在于它包括以下步驟1)將馬鈴薯莖或葉片組織放入冰預冷的滅菌勻漿器或研缽中，研磨成勻漿；2)向勻漿中加入提取緩沖液Tris-HCl pH8.0 100mmol/L、NaCl 100mmol/L、EDTA10mmol/L和β-巰基乙醇，在離心管中振蕩混勻；3)加入水飽和酚，氯仿/異戊醇(體積比，49∶1)，充分混勻，冰浴中放置10分鐘，其間混勻2～3次；4)以10000轉/分，室溫離心15分鐘，吸取水相，水相中加入0.1倍體積的NaAc，3mol/L，pH5.2，和等體積的異丙醇，混勻，在-20℃中沉淀3小時；5)以11000轉/分，室溫離心20分鐘后，棄去上清，加冰預冷70％的乙醇洗滌沉淀2次，室溫風干，至乙醇揮發完全為止；6)用無菌雙蒸水充分溶解提取的RNA，測OD值，計算RNA濃度。
全文摘要
本發明涉及一種馬鈴薯病毒RNA的提取方法。它包括將馬鈴薯莖或葉片組織放入冰預冷的滅菌勻漿器或研缽中研磨成勻漿，加入提取緩沖液(Tris－HCl pH8.0100mmol/L，NaCl 100mmol/L，EDTA 10mmol/L)和β－巰基乙醇，混勻，加入水飽和酚，氯仿/異戊醇，室溫離心，水相中加入NaAc(3mol/L，pH5.2)和等體積的異丙醇，－20℃中沉淀3小時；70％的乙醇洗滌沉淀，用無菌雙蒸水充分溶解等步驟。本發明省去了對器皿的高溫烘烤或DEPC處理，實驗用蒸餾水亦不需DEPC處理。材料的粉碎只需在冰預冷的器皿中進行。全部提取過程均可在常溫下進行。所得到的RNA經RT－PCR檢測及序列分析，序列完整，沒有降解。該技術可用于生產上大規模的馬鈴薯病毒RT－PCR檢測。
文檔編號C07H21/00GK1473839SQ03130540
公開日2004年2月11日 申請日期2003年8月8日 優先權日2003年8月8日
發明者杜榮騫, 李德森, 羅智敏, 俞鍵, 祁驥 申請人:南開大學, 天津科潤農業科技股份有限公司蔬菜研究所, 天津市農業生物技術研究中心