專利名稱：一種提取與純化10-去乙酰基巴卡丁ⅲ(10-dabⅲ)的方法
技術領域：
本發明涉及一種從含有10-去乙酰基巴卡丁III(10-DABIII)的紅豆杉植物中提取與純化10-去乙酰基巴卡丁III的方法。
背景技術：
10-去乙酰基巴卡丁III(10-DABIII)是從紅豆杉中分離出的天然有機化合物，被用于半合成紫杉醇及紫杉醇類化合物。其分子式如下 從二十世紀60年代末美國化學家Wall和Wani從太平洋紅豆杉中分離得到了紫杉醇，并于70年代初確定了它的化學結構，但未引起學術界的重視。直到1979年，Albent Einstein醫學院的生化藥理教授Su.Horwity研究發現了紫杉醇(Taxol)具有獨特的能促進微管蛋白聚合以及抑制微管解聚的活性。換句話說它有一種獨特的抗癌作用機理后，才引起了業界的重視。1983年開始進入臨床研究，1991年經美國FDA批準進入市場成為國際上公認的抗癌藥物之一。我國對紅豆杉有效成分之一紫杉醇抗腫瘤作用研究始于1984年，1986年列入國家醫藥總局的“七五”攻關科研計劃，1995年2月經衛生部批準對國產紫杉醇進行臨床研究，同年9月得到許可證。紫杉醇被譽為90年代中國抗腫瘤藥的重大成果之一。但是目前從植物紅豆杉(包括其他同系物種)中提取紫杉醇的方法，可獲得紫杉醇的量相當少，遠遠不能滿足醫藥業的需求，為此有關的藥物研究人員致力于開拓紫杉醇的合成與半合成之路，以擴大紫杉醇的來源，并成功利用紫杉醇的前體10-去乙酰基巴卡丁III(簡稱10-DABIII，下同)為原料來半合成紫杉醇或紫杉醇的類似物如多西紫杉醇(Docetaxel)等，其抗癌活性及水溶性均優于紫杉醇，并有望很快進入工業化。但問題的關鍵是如何利用現有的資源能工業化地提取足夠多的半合成的原料，即獲得高純度10-DABIII精品。為此，醫藥界的有關人士期望生物工程方面的專家探索一條從植物紅豆杉中能高效地提取和純化10-DABIII地工業化之路，以推動和支持抗腫瘤醫藥工業的技術進步。
發明內容
本發明的目的在于推動和支持抗腫瘤醫藥工業的技術進步，提供了一種從紅豆杉類植物的莖葉和嫩枝中提取、純化10-去乙酰基巴卡丁III(10-DABIII)的方法，簡稱“一種提取與純化10-去乙酰基巴卡丁III(10-DABIII)的方法”，它不僅大大提高資源的利用率，而且以工業化地獲得高純度10-去乙酰基巴卡丁III(10-DABIII)精品，純度高達99.5％以上。本發明的構思如下首先要突破高效率的提取難關。眾所周知，目前從紅豆杉莖葉與嫩枝中提取紫杉醇與10-去乙酰基巴卡丁III(10-DABIII)等有效組分的方法，都是藉用傳統的中藥浸泡工藝，需要長時間(至少需要24小時以上)反復地浸泡(多達7～8次以上)，希望盡可能多地提取獲得所需的有效組分。但是這種方法本身實際的提取效果是粗放有限的。因為常識告訴我們，植物的細胞壁是相當厚的而且是比較致密的，想藉助滲透，到植物細胞中將細胞內的有效組分載帶出來，它對于大分子的紫杉醇化合物載帶出來的困難是可想而知的，可以說能載帶出來的量是很少的，也就是說植物細胞內的有效組分基本未得到利用，往往局限在獲取細胞外的有效組分。為此本發明構思用現代科學最新進展超細粉碎技術，將粗粉粉碎至0.5mm的紅豆杉莖葉與嫩枝的顆粒再進一步超細粉碎至植物細胞的粒徑之下，使植物細胞中的有效組分全部釋放出來，這樣不僅能達到最大限度的獲得有效組分，而且可快速地(5～30分鐘內)一次性地用溶劑將紅豆杉莖葉與嫩枝的超細粉中有效組分提取出來，經過濾除去濾渣得到提取液。
然后要攻克獲得高純度10-DABIII的工業化提純難關1、將上述提取液置于旋轉蒸發器中濃縮，除去溶劑等物質(另外處理)，得到提取濃縮液，加入適量的水。激烈攪拌數分鐘分散成均一的乳化液，然后加入萃取劑，再激烈攪拌數分鐘，靜置分層0.5～1.5小時，從底部放出含有目標產物的萃取液(萃余液為水相另行處理)，在旋轉蒸發器中蒸發回收萃取劑后得到含5～10％(wt)10-DABIII粗品A；2、將粗品A先制備成硅膠混合物，再裝入玻璃硅膠柱的上部，在常溫常壓下，用洗脫劑進行柱層析洗脫分離，分段收集洗脫液，經分析測試，將合格的洗脫液進行濃縮得到濃度達25％(wt)以上的10-DABIII粗品B；3、將粗品B先制備硅膠混合物，再裝入大型制備色譜柱的上部，在室溫常壓或加壓下用混合溶劑進行層析洗脫分離，分段收集洗脫液，通過分析測試，將合格的洗脫液濃縮，獲得含量達80％(wt)的10-DABIII粗品C；
4、將粗品C先在常壓，溫度10～80℃，堿性條件下，用pH13-14氫氧化鈉水溶液水解處理數小時，使粗品C中的BaccatinIII(巴卡丁III的簡稱，下同)為代表的“雜質”轉化成10-DABIII；然后在旋轉蒸發儀中減壓蒸發至干，并用步驟(2)的同樣方法，制備成硅膠混合物，通過硅膠柱進行柱層析洗脫分離，分段收集洗脫液，將合格的洗脫液進行濃縮，最終得到濃度達99.5％以上的10-DABIII精品，即本發明的目標產物。
本發明按照上訴構思是這樣實現的1、本發明的10-DABIII的提取工藝主要包括如下二個步驟(1)首先將粒徑≤0.5mm的紅豆杉的莖葉和嫩枝在對撞式氣流超細粉碎機中粉碎至粒徑≤10μm(平均粒徑為5～6μm)，將紅豆杉植物細胞予以徹底粉碎(植物細胞平均直徑在15～25μm之間)，使細胞中的有效組分全部釋放出來，其中紫杉醇、10-DABIII等組分含量比現有技術所報導的公知含量要大2～4倍。
(2)然后用醇類溶劑進行一次性提取，過濾除渣后得到含有10-DABIII的提取液，所說的提取過程在室溫(或加溫40～60℃)、常壓、攪拌下進行，可在5～30分鐘內完成，攪拌轉速為60～240轉/分，料液比超細粉(wt)∶醇類溶劑(V)＝1∶1～2。過濾所得濾餅用少量的醇(為浸取液量的10％)洗脫，以回收夾帶在濾餅中的有效組分，洗脫液與提取液合并處理(為行文簡便，下面將包含洗脫液的提取液，簡稱提取液)。所說的醇類溶劑是甲醇、95％的工業酒精中的一種。
2、本發明的10-DABIII的純化過程主要包括如下四個步驟(1)提取液的處理與含量為5～10％(wt)10-DABIII粗品A的制取。
將上述的提取液置于旋轉蒸發器中濃縮(溶劑回收循環使用)，得到提取液濃縮，加入適量的水(為提取濃縮液的0.5～1.0倍的純水)進行激烈攪拌數分鐘(如3～8分鐘)，獲得均一的乳化液，再加入萃取劑。如加入與提取濃縮液等體積的乙酸丁酯，再進行激烈攪拌數分鐘(如3～8分鐘)，然后靜置分層0.5～1.5小時。從底部放出含有10-DABIII的萃取液，置于旋轉蒸發器中蒸發除去萃取劑(萃取劑回收后循環使用)，得到含5～10％(wt)的10-DABIII粗品A；萃余液集中后另行處理。
(2)5～10％(wt)10-DABIII粗品A的處理與25％(wt)以上濃度10-DABIII的制取。
首先將上述粗品A用95％酒精加熱溶解成均一的溶液，然后加入粒徑為10～50μm的硅膠(市售產品)攪拌均勻，置于旋轉蒸發儀中蒸發至于(酒精經回收循環使用)成硅膠與10-DABIII的均勻混合物(簡稱硅膠混合物，下同)，存放于干燥器中備用。可以反復多次制取，以備足樣品。以下為行文清晰起見，此處樣品簡稱“硅膠混合物①”。其中粗品A(w)與95％乙醇(V)比為1∶5，粗品A(w)與硅膠(w)之比為1∶1。
然后將硅膠混合物①置于已充填入工業硅膠的玻璃層析柱的上部，用1∶1的乙酸乙酯和環己烷混合溶劑洗脫，分段收集餾分(洗脫液)，實驗證明前半部分的餾分僅含有少量10-DABIII組分(洗脫下的大部分為酯類雜質)，后半部分的餾分，分段收集后，取樣分析。合格部分蒸發濃縮，得到含量≥25％(wt)的10-DABIII粗品B；不合格的餾分，則經蒸發回收溶劑后，返回步驟(2)重復處理。前半部分的餾分則通過精餾，回收混合溶劑后，循環使用，殘留的雜質及少量10-DABIII則集中后另行處理。如可作為原料進入醇類溶劑浸取混合系統重新浸取。
(3) 以含量≥25％(wt)的10-DABIII粗品B為原料，通過大型制備色譜柱正相制取含量≥80％(wt)10-DABIII粗品C。
先將粗品B溶解于甲醇中，加入粒度為10～50μm工業硅膠攪拌混勻后，置于旋轉蒸發器中蒸干(溶劑甲醇回收后循環使用)，將此干樣置于干燥器中備用。下面為行文之簡明起見，將上述干樣簡稱為“硅膠混合物②”；然后將“硅膠混合物②”填充入大型制備色譜柱的上部，用1～4∶1的乙酸乙酯與環己烷組成的混合溶劑作洗脫劑，在常壓/加壓下進行洗脫，分段收集洗脫液，其中，前面占總量2/3的洗脫液經檢測僅含有少量10-DABIII組分，以投入的10-DABIII計，僅占5％左右；后面1/3的洗脫液經分段收集后，經檢測其中達標的餾分，經蒸發回收溶劑后，得含量≥80％(wt)10-DABIII粗品C，未達標的餾分則經回收除去混合溶劑后返回步驟(3)再行處理。前面收集的占總量2/3的洗脫液經精餾回收溶劑后循環使用，殘留的雜質中含有少量的10-DABIII可作為原料返回提取濃縮液工藝中再行處理。所說的加壓，其壓力為600～1000psi，壓力源為壓縮空氣或瓶裝氮氣。
(4)粗品C的水解處理與純度99.5％(wt)10-DABHI精品的制取。
先將粗品C溶解于甲醇中，構成一均一的溶液，加入堿性的pH13～14氫氧化鈉水溶液，在10～80℃下，水解數小時(3～8小時)，使得巴卡丁III(簡稱BaccatinIII)為代表的同系物或衍生物轉化為10-DABIII，從而進一步提高10-DABIII的產率，實踐證明其產率至少可增加15％(wt)以上。所得水解液可作進一步處理。
將上述水解液，置于一蒸發裝置中，經減壓蒸發，除去溶劑及水，獲得的濃縮物，經冷卻干燥后，按步驟(2)同樣的方法處理，獲得的合格餾分經蒸發濃縮回收溶劑后，得到純度大于99.5％(wt)10-DABIII精品-----即本發明的目標產物。不過在按步驟(2)的處理時，以甲醇作溶劑為好。
本發明所說的紅豆杉包括南方紅豆杉、云南紅豆杉、西藏紅豆杉、東北紅豆杉、中國紅豆杉、曼地亞紅豆杉、尖杉紅豆杉、加拿大紅豆杉。
下面結合附圖和實例進一步闡明本發明的內容，但實例并不限制本發明的保護范圍。
圖1為從粒徑＜10μm的超細紅豆杉莖葉與嫩枝粉中浸取有效組分的工藝流程示意圖。
由圖1可見本發明的浸取有效組分的工藝特別簡便、快速，其原因由于本發明采用超細粉碎技術，將紅豆杉粉碎至植物細胞粒徑(平均顆粒直徑15～25μm)之下，使細胞內的有效組分全部釋放出來，故超細粉中有效組分可以在短時間內一次性地用醇類溶劑提取出來。它不僅使資源得到充分的合理使用，而且大大減少了溶劑耗量，全面做到多塊好省。
圖2為制取含量達5～10％(wt)10-DABIII粗品A的工藝流程圖。
由圖2可見本發明用乙酸丁酯從“提取濃縮液”中萃取10-DABIII的工藝亦是一種簡單易行的方法，可以一次性地獲得含量高達5～10％(wt)10-DABIII的粗品A，為后續的提取工藝打下了基礎。萃取劑乙酸丁酯可在系統內循環使用。提取液經旋轉蒸發器濃縮回收的醇類溶劑可返回圖1的浸取槽中循環使用。萃取液經旋轉蒸發回收除去萃取劑后即得粗品A；萃余液集中后另行處理，可采用適當得工藝提取和純化獲得紫杉醇精品。具體工藝將在另外得專利申請中公開，故本發明申請中敘述從略。
圖3為制取含量達25％(wt)以上的i0-DABIII粗品B的工藝流程。
由圖3可見溶劑(95％酒精)、洗脫劑(由1∶1乙酸乙酯和環己烷組成的混合溶劑作洗脫劑)以及粗品A在粗品B的制取工藝中均實行閉路循環，基本上做到物料無損耗，亦無污染排放。所說的粗品B即為含量≥25％(wt)的10-DABIII粗制品。
圖4為以粗品B為原料通過大型制備色譜柱制取含量≥80％(wt)的10-DABIII-----粗品C的工藝流程。
由圖4可見其中硅膠混合物②先加入大型制備色譜柱的上部，然后密閉進口，(由1～4∶1乙酸乙酯和環己烷組成的)混合溶劑在常壓/加壓下進入制備色譜柱進行洗脫。所說的加壓，其壓力為600～1000psi，壓力源為壓縮空氣或瓶裝氮氣。通過大型制備色譜柱的正相分離，以10-DABIII為基準時粗品C的得率為60％左右，純度達80％以上。
圖5為粗品C的水解處理與純度99.5％以上精品10-DABIII的制備工藝流程。
由圖5可見1、本發明獨到的水解處理工藝，使得BaccatinIII為代表的同系物高效地轉化成10-DABIII，從而進一步提高了10-DABIII的產率，實踐驗證其產率至少可增加15％(wt)以上。
2、按步驟(2)相同方法制得硅膠混合物③置于填充入工業硅膠得玻璃層析柱的上部，然后用1∶1乙酸乙酯和環己烷的混合溶劑在室溫常壓下洗脫，分段收集餾分(或稱洗脫液)，經分析測定凡10-DABIII含量大于99.5％(wt)的餾分為合格產品，統稱為餾分2，經旋轉蒸發器濃縮回收除去混合溶劑后，即得本發明得目標產物——純度大于99.5％(wt)以上得10-DABIII精品，收率達85％以上。
未達標得餾分(包括餾分1，餾分3)經集中收集蒸發回收混合溶劑后，所得粗品B”則返回至純化步驟(3)通過大型制備色譜柱再次正相制取含量大于80％(wt)的10-DABIII粗品C。
所說的粗品B”和B’、B一樣附合含量≥25％(wt)10-DABIII的原料，從本質上說沒有大的區別，僅僅因出現在不同的純化步驟中，予以適度區別而已。
總之，由圖1可見本發明完善地解決了從植物組織中(包括植物細胞中)有效組分的充放釋放問題，從而提高了有限資源的利用率，并使提取工藝變得十分簡便。
由圖2-5可見本發明比較完善地解決了10-DABIII的純化問題，可高效地獲得高純度的10-DABIII精品。
具體實施例方式
下面就是本發明的具體的提取和純化過程提供一些工業化的實施例，以進一步闡明本發明的內容。
實施例1用浸取法從紅豆杉枝葉的超細粉(粒徑＜10μm)中獲得含10-DABIII的提取液。
稱取30公斤粒徑10μm的曼地亞紅豆杉枝葉超細粉原料，置于聚乙烯容器中，加入濃度為95％工業酒精50升，攪拌浸取20分鐘，過濾后得到提取液45升，濾渣(或濾餅)至少再用5升95％的酒精洗脫一次，以回收濾渣中夾帶的有效組分，所得洗脫液(5升)與提取液合并后等待進一步處理。用高壓液相色譜儀測定原料中的10-DABIII及其衍生物(或同系物)含量達0.21％(wt)，與現有的公知數據相比，由于超細技術的引入使原料中有效組分提高了三倍，而且用本發明的方法，不僅可以快速地提取有效組分，而且其提取率可達98％左右，提取液中有效組分含量達到1.24g/L。
實施例2用萃取法從濃縮提取液中制取含量5～10％(wt)10-DABIII粗品。
將實施例1制得50升提取液，置于旋轉蒸發器中濃縮至3升(回收的酒精循環使用)，移入帶攪拌的萃取器中，加入2升純凈水激烈攪拌3分鐘，使濃縮液與水分散成均一的乳液，然后再加入3升乙酸丁酯萃取劑，再激烈攪拌3分鐘，靜置1小時或待分層清晰后，打開底部閥門，放出下層的乙酸丁酯萃取液，置于旋轉蒸發器中，蒸發回收乙酸丁酯后，得到1029克含6％(wt)10-DABIII粗品(簡稱粗品A)，重復實施例1、2的操作步驟，制得5公斤以上的粗品A，供下一步使用；萃余液(水相)集中合并后，另外處理，可提取其他有效組分。
實施例3以粗品A為原料，經多步制取純度達99.5％(wt)以上的精品10-DABIII。
1、稱取200克粗品A，置于一帶外加熱和攪拌器的溶解槽中，先加入1升95％的工業酒精，待粗品A在加熱(40～50℃)下完全溶解后，然后加入200克粒徑為10～50μm的硅膠，攪拌均勻后，再移至旋轉蒸發器中蒸發至干，制成硅膠與粗品A的混合物400克，簡稱硅膠混合物①，存放于干燥器中待用。蒸發回收的工業酒精可循環使用。按照上述方法，可以重復地制備，至少備足2公斤硅膠混合物①。
在一直徑(內徑)為15cm，有效長度為1.5m的玻璃柱中(按照層析柱的要求加工)，底部先墊上一層醫用脫脂棉花，然后密實地裝入18公斤工業硅膠，組成一玻璃層析柱，在工業硅膠的上部再添加2公斤要求處理的硅膠混合物①，填充密實后，在上面再加一層醫用脫脂棉花，上端蓋上蓋子后，通入“由1∶1乙酸乙酯和環己烷”組成的混合溶劑作層析柱的洗脫液(簡稱洗脫液)，總量為60升，分段收集餾分，分析檢測證明前面30升的餾分中僅含有少量的10-DABIII，總量僅占投入量的3％左右，通過精餾回收混合溶劑(混合溶劑循環使用)后，殘余物料(包括雜質)返回浸取過程重復處理。
餾分1為第30至40升的洗脫液；餾分2為第40至50升的洗脫液；餾分3為第50升至60升的洗脫液。
分別進行旋轉蒸發濃縮得到三個干樣。用高壓液相色譜分析三個干樣的組成，結果如下餾分177.8克含量為14％(wt)的10-DABIII；餾分2145.8克含量為31％(wt)的10-DABIII，收率為75.3％；餾分383.4克含量為3％(wt)的10-DABIII。
其中餾分2為10-DABIII含量大于25％的合格中間產品，簡稱粗品B，收率＞75％。
餾分1、餾分3均為不合格的中間產品，生產時兩者可以合并進行蒸發濃縮(回收混合溶劑)后，得到粗品A’，它與粗品A類同，因此可作粗品A原料，進入系統再行處理。
按照上述方法多次制備，至少制得2公斤以上的粗品B待用。
2、稱取上述粗品B(含量為31％(wt)10-DABIII粗品)2公斤，置于帶攪拌的溶解混合槽中，加入10升甲醇，溶解成均一的溶液，然后再加入2公斤粒徑為10～50μm的工業硅膠，攪拌混勻后，轉入旋轉蒸發器中，旋轉蒸發至干，所得樣品簡稱硅膠混合物②，再移入干燥器中干燥備用。旋轉蒸發回收的甲醇循環使用。
將上述的硅膠混合物②4Kg置于一大型的制備色譜柱的上部，密閉后用2∶1的乙酸乙酯和環己烷組成的混合溶劑進行常壓/加壓洗脫層析分離，洗脫劑(即混合溶劑)的用量為180升，(如加壓，壓力為800psi，壓力源為凈化的壓縮空氣或瓶裝的氮氣)。分段收集餾分，其中前面120升的餾分(占總洗脫劑耗量的2/3)，因僅含少量的10-DABIII，故通過精餾回收混合溶劑(回收的混合溶劑循環使用)后，殘余物(其中含有少量的10-DABIII，約占投料中的10-DABIII量的3％左右)返至提取濃縮液處理工藝中再行處理。
餾分1為第120至150升段的餾分；餾分2為第150升至170升段的餾分；餾分3為第170至180升段的餾分。
將上述三個餾分，分別用旋轉蒸發器蒸發至干(回收的混合溶劑循環使用)，得到三個干樣，經高壓液相色譜儀檢測結果如下餾分1375.6克含量為36％(wt)的10-DABIII粗品；餾分2457.7克含量為82％(wt)的10-DABIII粗品；餾分3523.6克含量為18％(wt)的10-DABIII粗品；其中餾分2符合本工序規定的合格的中間產品，簡稱粗品C，收率大于60％；餾分1、餾分3均為不合格的中間產品，生產中可以將兩者合并，然后一起進行蒸發濃縮回收混合溶劑(循環使用)后，獲得濃縮物，簡稱粗品B’，可以和粗品B一起作為原料，進入溶解混合槽中，予以循環使用。
3、以粗品C為原料進行水解，并進一步精制純化制取純度大于99.5％(wt)的精品10-DABIII。
稱取粗品C(純度82％的10-DABIII)30克，置于以水解反應器中，先加入200毫升甲醇，溶解成均一的溶液，然后加入100毫升pH13～14的氫氧化鈉水溶液，在堿性、常壓、10～80℃下，水解4小時，使以BaccatinIII為代表的10-DABIII類衍生物轉化成10-DABIII組分，從而有效提高10-DABIII的產率，一般至少可使10-DABIII的產率增加15％以上。
將水解后的溶液，移至旋轉蒸發器中，減壓蒸發至于，簡稱水解減壓蒸發至干的物料，然后移至干燥器中干燥待用。減壓蒸發出來的甲醇和水，集中收集達一定量后，再通過精餾，回收甲醇循環使用。
水解減壓蒸發至干的物料，先按照2所述的類同方法制得“硅膠混合物③”60克，然后將“硅膠混合物③”置于玻璃層析柱的上部，用“由1∶1乙酸乙酯和環己烷，”組成的洗脫劑進行洗脫層析，洗脫劑的用量為50升，分段收集餾分，餾分1(25升)、餾分2(15升)、餾分3(10升)，將三個餾分分別通過旋轉蒸發器蒸發至干，得到三個樣品，經高壓液相色譜儀檢測結果如下
餾分18克含量為63％(wt)的10-DABHI粗品；餾分221克含量為99.62％(wt)的10-DABIII精品；餾分35克含量為48％(wt)的10-DABIII粗品。
本實例中10-DABHI的得率達115.3％(可由物料衡算得到)，其中增加的得率為其他“雜質”轉化成10-DABIII的結果。
此外順便指出，餾分2即為本發明的目標產物，含量達99.62％(wt)10-DABIII精品，在本實例中(指實施例3的實例)其收率達85％，餾分1、餾分3，未達到精品質量的要求，它們可以合并后，用旋轉蒸發器蒸發濃縮得到粗品B”，它可以和B，B’一起返至溶解混合槽中作為制取粗品C的原料。
由上可見，本發明的方法具有構思新穎，方法簡便、工藝合理，易于工業化的特點，能有效地推動防治腫瘤醫藥工業的發展與技術進步。
權利要求
1.一種提取與純化10-去乙酰基巴卡丁III(10-DABIII)的方法，其特征在于所說的提取方法主要包括如下兩個步驟(1)首先將紅豆杉植物的莖葉和嫩枝進行超細粉碎得到超細粉，其粒徑在10μm以下，小于植物細胞的平均直徑15～25μm，從而使植物細胞中有效組分全部釋放出來；(2)然后用醇類溶劑從上述超細粉中將包括10-DABIII及其衍生物在內的全部有效組分一次性地提取出來，過濾除去濾渣后，得到提取液，提取時的工藝條件為料液比超細粉(w)∶醇類溶劑(V)＝1∶1～2；提取溫度室溫或加溫(40～60℃)；提取時間5～30分鐘；攪拌轉速60～240轉/分。
2.如權利要求書1所述的方法，其特征在于提取方法步驟(1)中所說的紅豆杉植物包括南方紅豆杉、云南紅豆杉、西藏紅豆杉、東北紅豆杉、中國紅豆杉、曼地亞紅豆杉、尖杉紅豆杉、加拿大紅豆杉。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于提取方法步驟(2)中所說的醇類溶劑是甲醇、95％工業酒精中的一種。
4.一種提取與純化10-去乙酰基巴卡丁III(10-DABIII)的方法，其特征在于所說的純化方法主要包括如下四個步驟(1)首先將所得提取液置于旋轉蒸發器中，蒸發濃縮除去醇類溶劑，得到濃縮提取液，用少量水稀釋后，再用乙酸丁酯萃取劑進行萃取分離，萃取時的工藝條件為相比濃縮提取液(V)∶萃取劑(V)＝1∶1；溫度室溫；萃取時間在劇烈攪拌下3～8分鐘；靜止分層0.5～1.5小時；分離得到乙酸丁酯萃取液，經蒸發除去萃取劑后得到含量為5～10％(wt)10-DABIII粗品原料，簡稱粗品A；(2)以粗品A為原料，用95％酒精加熱溶解成均一溶液，然后加入粒徑為10～50μm的工業硅膠，攪拌均勻，再蒸發除去95％酒精制成“硅膠混合物①”，然后將此“硅膠混合物①”置于填充硅膠的玻璃層析柱的上部，用1∶1的乙酸乙酯和環己烷組成的混合溶劑洗脫層析，分段收集餾分，取樣分析，將合格的餾分蒸發除去混合溶劑后得到含量≥25％(wt)的10-DABIII“粗品B”；(3)以粗品B為原料，溶解于甲醇中，加入粒徑為10～50μm的工業硅膠攪拌混勻后置于旋轉蒸發器中蒸干，得到“硅膠混合物②”填充入大型制備色譜柱的上部，用1～4∶1的乙酸乙酯與環己烷組成的混合溶劑作洗脫劑，在常壓或加壓下進行洗脫，分段收集餾分，經高壓液相色譜儀檢測達標的餾分，進行蒸發除去混合溶劑，得到含量≥80％(wt)10-DABIII粗品C；(4)以粗品C為原料，溶解于甲醇中，構成均一的溶液，加入pH13-14的氫氧化鈉水溶液，在10～80℃下，水解3～8小時，用氯化銨飽和溶液終止反應，使得以BaccatinIII為代表的10-DABIII類衍生物轉化為10-DABIII，所得水溶液移入蒸發裝置中，經減壓蒸發器除去甲醇和水，獲得濃縮物再按步驟(2)同樣的方法制得“硅膠混合物③”，進一步進行玻璃柱層析，分段收集餾分，經檢測合格的餾分進行蒸發除去溶劑后，得到純度大于99.5％(wt)以上的10-DABIII精品，即本發明的目標產物。
全文摘要
本發明公開了一種提取與純化10－去乙酰基巴卡丁III(10－DABIII)的方法，該法主要包括二大部分，其一先用醇類溶劑從紅豆杉枝葉的超細粉(粒徑≤10μm)中快速提取含10－DABIII及其衍生物類等有效成分，然后用萃取法獲得含5～10％(wt)10－DABIII原料；其二以5～10％(wt)10－DABIII原料，經硅膠柱層析，常壓色譜柱層析以及水解等提純、轉化、精制步驟，工業化獲得純度大于99.5％(wt)以上的10－DABIII精品。
文檔編號C07D305/00GK1473821SQ0312963
公開日2004年2月11日 申請日期2003年7月3日 優先權日2003年7月3日
發明者林復興, 陳建民, 詹華杏, 林炯明, 張偉中, 陳建軍, 楊繼東, 呂琦 申請人:上海金和生物技術有限公司