專利名稱：重組α干擾素在防治呼吸系統感染制藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬生物制藥領域，主要涉及重組α干擾素(recombinant αInterferon)在制備用于防治由冠狀病毒、鼻病毒等引發的疾病中的應用二、背景技術干擾素具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤及免疫調節功能，其作用機理是通過誘生多種抗病毒蛋白，抑制病毒在細胞內復制，增強NK細胞活性及其他免疫調節作用，有效地遏制病毒侵襲和感染的發生，并有抑制腫瘤細胞生長、清除早期病變細胞等多方面的作用。由于干擾素具有上述重要作用，因此人們對它的研究也在不斷深入，并有新的干擾素分子被不斷發現，目前已知的干擾素分子主要有一下9種干擾素-α屬I型干擾素，約有23個變種，較詳細研究的有約13種亞型。分子量為19-26kDa，由156-166個氨基酸殘基組成，在115-151之間為保守序列；干擾素-β屬I型干擾素，主要由成纖維細胞所產生，由166個氨基酸殘基組成，其中Cys31/141之間的二硫鍵對其生物學活性的發揮是必需的。它在DNA水平上與干擾素α有30％的同源性；干擾素-γ屬II型干擾素，由T細胞和NK細胞刺激所產生。由143個氨基酸殘基組成，與干擾素α和β無明顯的同源性；干擾素-ω屬I型干擾素，是人白細胞干擾素的自然成分，與干擾素-α高度同源。干擾素ω結合于與干擾素-α和β同樣的細胞受體；干擾素-τ屬I型干擾素，由172個氨基酸殘基組成。它在反芻動物識別母體和建立孕體上起有重要作用；干擾素-δ屬I型干擾素，由149個氨基酸殘基組成；干擾素-λ(1-3)包括干擾素-λ-1、2和3，它們通過同一組受體系統進行信號傳遞；干擾素-κ屬I型干擾素，207個氨基酸，N端27個氨基酸是信號肽，與I型干擾素的其它成員有約30％的同源性；干擾素-ε屬I型干擾素，由189個氨基酸殘基組成，N端21個氨基酸為信號肽，有一個分子內二硫鍵和一個游離的半胱氨酸殘基。
在上述干擾素分子中，臨床應用最廣泛的為α家族干擾素，主要用于治療慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、慢性粒細胞白血病、慢性宮頸炎、毛細胞白血病等近40種疾病。除了早期開發成功的干擾素α1b、α2a、α2b之外，目前在臨床上使用的還有集成干擾素(IFN-con)。集成干擾素并不是自然界中存在的天然分子，它是通過比較十幾種α亞型的干擾素分子，并選取其中的保守序列人工組合而成的一種分子。我單位對集成干擾素進行了系列突變體的篩選，并已申報專利(新型α干擾素突變體及其制備方法，申請號02159950.5)。
盡管α干擾素已用于多種疾病的治療，但主要適應癥為病毒引發的慢性疾病，還沒有文獻報道可用于由病毒引發的急性疾病，例如SARS(severe acute respiratory syndrome)等。
SARS譯為嚴重性急性呼吸道綜合癥，在我國又稱為“非典型性肺炎”。2002年11月起在我國廣東省發現病例，在2003年2月底，在香港發生流行，并很快傳播到北美、歐洲和其它亞洲國家。經過全球科學家的共同努力，認為SARS疾病是由一種(+)鏈有膜的RNA病毒引起，經過形態鑒定和遺傳信息分析，認為該病毒屬新型冠狀病毒，接近第2組。
本發明的目的在于研究用α干擾素預防和治療包括SARS在內的由冠狀病毒和鼻病毒等引發的呼吸系統疾病。
發明內容
由于本發明使用的干擾素的純化方法在文獻上均有詳細描述，在此不予重復。另外，本發明使用的藥物制劑為干擾素與可作為藥物的載體、佐劑、稀釋劑、防腐劑和/或增溶劑一起組成的藥物制劑。其中稀釋劑包括各種具有一定的pH值和離子強度范圍的稀釋劑；載體為人血白蛋白等；增溶劑包括吐溫、聚乙二醇等；防腐劑包括硫汞撒、間甲苯酚、苯甲醇等。由于上述內容均為本領域技術人員所公知，在此亦不予詳述。
本發明重點研究了干擾素α1b、α2a、α2b和集成干擾素在細胞模型上對SARS冠狀病毒和鼻病毒的抑制作用。我們分別用病人體內分離得到的SARS病毒(新型冠狀病毒)、鼻病毒攻擊人宮頸癌細胞(HELA)系，同時給予不同濃度的上述干擾素，觀察細胞病變的抑制情況。實驗結果顯示，α1b、α2a、α2b在抑制由冠狀病毒、鼻病毒引起的細胞病變時，效果基本相同，但集成干擾素與三者相比，在產生相同抑制效果的情況下，用量明顯偏低。另外，集成干擾素對SARS病毒有較強的抑制作用，干擾素α1b對SARS病毒的抑制效果略高于干擾素α2a和α2b。
上述結果提示，α干擾素可用于治療由SARS病毒(冠狀病毒)和鼻病毒引起的疾病，其中集成干擾素和干擾素α1b對SARS病毒有更好的抑制作用。這說明，α干擾素可用于防治由冠狀病毒、鼻病毒引起的呼吸系統疾病，尤其是SARS病，而相同觀點未見文獻報道。
四
具體實施例方式
在HELA細胞培養內，采用細胞病變抑制法(CPE)法，觀察不同濃度的重組干擾素對冠狀病毒和鼻病毒的抑制作用。
1.材料1)藥物重組人干擾素α1b、重組集成干擾素α及突變體(為申請號為02159950.5中的多個分子)、干擾素α2a和α2b。
2)陽性對照藥物注射用更昔洛韋。
3)細胞人宮頸癌細胞(HELA)。
4)病毒冠狀病毒9號(SARS病人咽拭子分離株)和鼻病毒(普通感冒病人咽拭子分離株)。
2.實驗方法1)干擾素對HELA細胞的毒性測定方法HELA細胞以40萬/ml濃度接種96孔培養板，37℃、5％CO2培養24小時，加入干擾素，干擾素倍比稀釋為25mg/ml～1.0ug/ml，更昔洛韋為6000ug/ml～11.7ug/ml。每濃度接種3孔，每孔100ul，同時設正常細胞對照，37℃、5％CO2培養6天，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化(CPE)，以25％以下形態變化為“+”，26％～50％形態變化為“++”，51％～75％形態變化為“+++”，76％～100％形態變化為“++++”，用Reed-Muench法，計算藥物半數中毒濃度(TD50)和最大無毒濃度(TD0)。
2)在HELA細胞培養內對冠狀病毒或鼻病毒的毒力測定方法(病毒CPE法)HELA細胞以每毫升40萬濃度接種96孔板，37℃、5％CO2培養24小時，加入病毒液，病毒稀釋10-1～10-8，8個濃度，每濃度3孔，每孔100ul，設正常細胞對照，37℃、5％CO2培養5～7天，每24小時在倒置顯微鏡下觀察記錄細胞形態變化(CPE)以25％以下形態變化為“+”，26％～50％形態變化為“++”，51％～75％形態變化為“+++”，76％～100％形態變化為“++++”，用Reed-Muench法，計算病毒半數感染濃度TCID50。
3)干擾素在HELA細胞培養內對冠狀病毒和鼻病毒的抑制實驗觀察不同濃度的重組干擾素在HELA細胞培養內對冠狀病毒和鼻病毒的預防作用，試驗采用細胞病變抑制法，計算藥物的半數有效濃度(IC50)和最小有效濃度(MIC)及治療指數(TI)，判斷藥效。
HELA細胞以40萬/毫升濃度接種96孔板，37℃、5％CO2培養24小時，細胞培養至單層，棄掉培養液，加入不同濃度的重組干擾素，藥物選用對細胞最大無毒濃度(TD0)，2倍稀釋10個濃度，陽更昔洛韋為2倍稀釋10個濃度即375ug/ml～0.73ug/ml；每濃度3孔，置37℃、5％CO2吸附2.5小時，加入100TCID50的冠狀病毒或鼻病毒，同時設正常細胞對照和病毒對照，置37℃、5％CO2培養5～7天，逐日在倒置顯微鏡下觀察病毒CPE，以病毒對照出現+++～++++時結束試驗，用Reed-Muench法，計算藥物的半數有效濃度(IC50)和最小有效濃度(MIC)及治療指數(TI)，判斷療效，試驗重復三次。
3.試驗結果用最小有效濃度(MIC)來評價不同干擾素對病毒的防治效果，結果見下表不同α干擾素抑制細胞病變的作用結果
由上表可以看出，α干擾素可用于防治由冠狀病毒、鼻病毒引起的相關疾病，其中集成干擾素及其突變體和干擾素α1b有更好的抑制作用。
權利要求
1.重組人α干擾素在制藥中的應用，其特征在于應用于防治冠狀病毒和鼻病毒等引起的呼吸系統感染性疾病。
2.如權利要求1所述，其特征在于重組α干擾素為重組人干擾素αlb。
3.如權利要求1所述，其特征在于重組α干擾素為重組集成干擾素(IFN-con)及其突變體。
4.如權利要求1所述，其特征在于病原體為冠狀病毒、鼻病毒。
5.如權利要求1所述，其特征在于所指的疾病為SARS病(severeacute respiratory syndrome嚴重的急性呼吸道綜合癥)和普通感冒。
全文摘要
α干擾素現主要用于慢性病毒性感染。本發明利用冠狀病毒或鼻病毒感染的人宮頸癌細胞(HELA)作為評價模型，觀察不同α干擾素對引起呼吸系統感染的常見病毒的抑制效果，表明α干擾素可用于防治由冠狀病毒和鼻病毒引起的疾病，包括嚴重的急性呼吸道綜合癥(SARS)，其中集成干擾素及其突變體和干擾素α1b對新型SARS病毒有更好的抑制作用。
文檔編號C07K14/56GK1548149SQ0312873
公開日2004年11月24日 申請日期2003年5月7日 優先權日2003年5月7日
發明者劉金毅, 劉永全, 孫儉波, 程永慶 申請人:北京三元基因工程有限公司, 北京畢艾歐科技發展有限責任公司