專利名稱：一種家蠶體中提取多肽抗生素的制備方法
技術領域：
本發明涉及昆蟲免疫學、生物化學、微生物學等領域，更具體涉及一種從家蠶體中提取多肽抗生素的制備方法。
背景技術：
世界上第一個被發現的抗菌肽是1980年由瑞典科學家G.Boman等人經注射陰溝通桿菌及大腸桿菌(Escherichia coli K12D31)誘導惜古比天蠶蛹產生的具有抗菌活性的多肽，定名為Cecropins。此后數年間，人們相繼從細菌、真菌、兩棲類、昆蟲、高等植物、哺乳動物乃至人類中發現并分離獲得具有抗菌活性的多肽。由于最初人們發現這類活性多肽對細菌具有廣譜高效殺菌活性，因而命名為“antibactetial peptides(ABP)”，中文譯為抗菌肽，其原意為抗細菌肽。隨著人們研究工作的深入開展，發現某些抗細菌肽對部分真菌、原蟲、病毒及癌細胞等均具有強有力的殺傷作用，因而目前對這類活性多肽傾向于稱之為“peptideantibiotics”----多肽抗生素。
由于天然多肽抗生素具有對細菌、真菌、原蟲、病毒及癌細胞等均具有強有力的殺傷作用，愈來愈受到人們的關注。目前國內外學者已陸續從各種生物中分離提純了具有抗菌活性的多肽，具有代表性的是從哺乳動物組織中，大麥和小麥粒中分離出了含有29-34個氨基酸的defensins類多肽抗生素，并已被人工合成商品化，運用到植物病蟲害防制上；從蟾蜍和蛙的皮膚、哺乳動物(兔、牛、豬)的神經組織和腸組織中分離出了含有28-35個氨基酸的maganins類多肽抗生素；從天蠶蛹、家蠶、柞蠶、果蠅、麻蠅的血淋巴系統中分離出了含有37-39個氨基酸的cecropins類多肽抗生素，這些都充分的證明多肽抗生素在自然界中廣泛的存在。為了得到活性較高、產量較大的天然多肽抗生素，研究學者相繼研究得到了以下3種方法1、直接提取法一般是以注射大腸桿菌作為誘導源誘導昆蟲，將免疫血淋巴細胞進行熱處理，除去蛋白質后純化得到。這種方法雖然分離效果較好，但其誘導效果欠佳、昆蟲來源有限、操作麻煩、成本高，得率少、速度慢，且不適用于工業化提取純化。
2、化學合成法通過人工設計多肽的一級結構，加入特殊氨基酸，經化學合成而得到。但是昂貴的成本是限制該方法工業化應用的最大障礙。
3、基因工程合成法利用基因工程的方法生產多肽抗生素是降低生產成本的一條有效途徑。但是多肽抗生素對原核細胞(如微生物)的毒性可能造成宿主微生物自殺而不能獲得表達產物，在一定程度上限制了其在原核表達系統中的應用。而真核表達系統的較低表達效率也是其工業化生產的一個障礙。以融合蛋白的形式表達多肽抗生素基因，雖然可以克服這一缺點，但仍有表達產物少的問題。
發明內容
本發明的目的是在于提供一種家蠶體中提取多肽抗生素的制備方法，它具有工藝簡單，原料來源廣泛，成本低廉，抗菌譜廣，純度高。
為了達到上述目的本發明采用以下技術方案，本發明所涉及的多肽抗生素是利用蠶幼蟲、蛹、鮮繭繅絲后的蠶蛹為原料的進行提取純化的制備方法，其步驟是A、家蠶的誘導1、幼蟲的誘導在幼蟲提取的前五天，以2％～10％濃度的微生物培養液(主要是大腸桿菌或滅活核型多角體溶液)噴灑桑葉后飼喂4～5齡期的家蠶，每天1次，連續4天。同時，采用超聲波誘導，條件是10～20千赫處理2～5小時，間隔20～24小時重復誘導3次，誘導后的幼蠶幼蟲于0～12℃低溫下儲藏，在4-5齡期進行提取。
2、蠶蛹的誘導以2％～10％濃度的微生物培養液(主要是大腸桿菌或滅活核型多角體溶液)噴灑桑葉后飼喂4～5齡期的家蠶，每天1次，直至家蠶吐絲；待結繭后第3-5天，采用10～20千赫超聲波進行處理，每天1次，每次2～5小時，間隔20～24小時重復誘導3次。誘導后的蠶繭于0～12℃低溫下儲藏。蠶繭可先進行鮮繭繅絲，然后再提取多肽抗生素。
B、家蠶多肽抗生素粗提液的制備(1)將誘導好的幼蟲、鮮蛹或鮮繭繅絲后的蠶蛹，加2～3倍體積的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液，pH值為5-7，放入組織搗碎勻漿機中，勻漿10min。
(2)所得勻漿液于4℃，12000r/min離心15min，取上清液，于4℃下放置12小時。
(3)將抽提液于40～80℃水浴中處理25min，迅速置超低溫(-20--60℃)冰箱中冷卻10min后，4℃，12000r/min離心10min，取上清。
(4)上清液用25％、80％硫酸氨進行分級沉淀，在第二步沉淀的同時用碳酸鈉調pH9.5-10.5，靜置10min后，4℃，15000r/min離心15min，所得沉淀用2-6ml緩沖液進行溶解，再按照上述方法離心，得上清液。
(5)上清液透析除鹽24小時，透析袋每隔三小時換水一次。
C、家蠶多肽抗生素的分離純化(1)分子篩柱層析上清液經透析處理后，上葡聚糖G-75分子篩柱，平衡液為0.2mol/L磷酸鹽緩沖液，pH值為5-7，洗脫液為0.5～1.0mol/L磷酸鹽緩沖液梯度洗脫，pH5-7。收集活力峰；將收集的溶液進行-20--80℃真空干燥得家蠶多肽抗生素的活性干粉。
(2)上制備型高效液相色譜柱，10～50％的乙腈(0.1％三氟乙酸)洗脫，收集活性峰。
(3)活力峰凍干(將提取的抗菌肽進行冷凍干燥)，于零下20℃保存，得本發明所說的從蠶體中制備的多肽抗生素。
本發明利用其熱穩定性強、分子量小的特點，在抽提過后采用40-80℃水浴處理的方法，可以除去60％以上的雜蛋白，同時加熱后還可以使蠶血液中中的氧化酶失活，這樣進一步的分離純化工作就可以在常溫下進行。然后利用(NH4)2SO4進行分級沉淀和調節等電點的方法沉淀多肽抗生素，由此得到的多肽抗生素粗品，可以提高柱層析的分離效果。采用分子篩柱層析得到3個峰，峰2為活性成分，有強的抑菌作用。25ml多肽抗生素粗品液收獲了10mg干粉，收獲率較高。然后進行HPLC進一步純化，得到純品。本方法所制備得到的多肽抗生素具有如下性能(一)生化特性1、熱穩定性本多肽抗生素100℃下加熱30min仍能保持活性。
2、pH值穩定性本多肽抗生素在pH3～13范圍內活力穩定，最適pH值為5～7；3、等電點采用pH梯度電聚焦法(IPGIEF)測定蠶多肽抗生素pI值，pI值為9.8～10.7之間。
4、分子量采用Tricine-SDS-PAGE電泳法，測得本多肽抗生素的分子量為3～5KD；5、氨基酸組成本多肽抗生素含有氨基酸種類為色氨酸(Trp)；天冬氨酸(Asn)；脯氨酸(Pro)；苯丙氨酸(Phe)；賴氨酸(Lys)；亮氨酸(Leu)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；纈氨酸(Val)；谷氨酰胺(Gln)；異亮氨酸(Ile)；蛋氨酸(Met)；精氨酸(Arg)；蘇氨酸(Thr)；天冬酰胺(Asn)；絲氨酸(Ser)。(二)生理活性1、抑菌活力的測定采用改進的抑菌圈法取用本方法制備得到的多肽抗生素水溶液1ul用移液槍豎直的滴在涂菌液的培養皿上，24小時觀察結果，以抑菌圈大小來測定抑菌活力。用硫酸鏈霉素20(萬單位/ml)水溶液作對照。結果表明抗菌物質對枯草芽孢桿菌產生的細菌圈很大。而對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌次之(見表1)。
表1蠶多肽抗生素對細菌的抑菌活力測定(5次平均)菌種 抑菌圈直徑(mm)大腸桿菌Escherichia coli JM-109 21.3枯草芽孢桿菌Bacillus sublilis25.0金黃色葡萄球菌 Staphlococus aureus. 19.82、抗菌譜實驗方法同1。實驗結果表明，蠶多肽抗生素對大腸桿菌(Escherichia coliJM-109)、枯草芽孢桿菌(Bacillus sublilis)、金黃色葡萄球菌(Staphlococusaureus)均具有明顯的抑菌活性。
3、最低抑制濃度蠶多肽抗生素水溶液作2倍系列稀釋，分別觀察不同濃度多肽抗生素的抑菌圈。下表給出了多肽抗生素對幾種細菌的最低抑菌濃度。從本表中可以看出，本發明得到的多肽抗生素對大腸桿菌有強的溶菌活性。稀釋到25倍，仍表現出較強溶菌活性。但總的趨勢是隨著稀釋度的提高，抗菌活力下降(見表2)。
表2蠶多肽抗生素對細菌最低抑制濃度測定(5次平均) (ug/m1)菌種多肽抗生素大腸桿菌Escherichia coli JM-109 4.5枯草芽孢桿菌Bacillus sublilis 5金黃色葡萄球菌 Staphlococus aureus.3.44、抑菌時間檢測方法同1。滴加入多肽抗生素后，把培養皿暴露在空氣中進行檢測，取其5次平均值，實驗結果表明，在滴加了硫酸鏈霉素的抑菌圈上5h后長出了雜菌，而在滴加有多肽抗生素的抑菌圈上仍保持透明，直到72h后才長出雜菌。這點證明本發明得到的多肽抗生素具有長久抑制細菌生長的特性。
多肽抗生素制劑應用于抗細菌、病毒、具有對生物體無毒害、殺菌能力強、效果好的優點。而用本發明提取得到的多肽抗生素來源于蠶的體內，是一種小分子的肽類，為天然物質，且水溶性好，耐高溫。對細菌、真菌、原蟲、病毒具有高效的殺傷作用，如對枯草芽孢桿菌，其活性比硫酸鏈霉素的還高，可用于植物病蟲害的防治、動物細菌或病毒類疾病的治療、鮮花保鮮和動物飼料添加劑，也可在進一步加工修飾后，制備成用于人類病毒感染、細菌感染、真菌感染的診斷、預防、治療藥物。
發明的主要優點和積極效果是1、本發明采用飼喂低濃度大腸桿菌溶液與超聲波誘導相結合的方式，克服了以前用注射大腸桿菌方式誘導的局限，利于工業化規模提取。
2、利用多肽抗生素的耐高溫性質，將誘導后的蠶繭進行繅絲，再用來提取多肽抗生素，開辟了提高家蠶經濟價值的新途徑。
3、本發明中采用的多肽抗生素制備方法具有操作方便，儀器設備簡單，制備工藝簡便可行、高效快速。
4、用本方法從幼蠶或蠶蛹中提取多肽抗生素，原料來源廣泛，得到的多肽抗生素具有抗菌能力強，抗菌譜廣。
5、采用本發明進行提取，每1000克蠶體可收獲8mg多肽抗生素純品，得率較高。
6、本發明大大的提高了蠶蛹的利用效率，具有重要經濟效益、社會效益和生態環保效益。
具體實施例方式
實施例11、取4或5齡蠶幼蟲添食噴有2％或3％或5％或7％或8.5％或9.5％濃度的大腸桿菌溶液的桑葉，每天定時添食一次，連續四天。
2、在添食的同時，采用11或14或16或17或19千赫超聲波對幼蟲進行處理，每天誘導1次，每次4小時，間隔21或22或23小時重復誘導3次。誘導后的家蠶幼蟲于1℃或3℃或5℃或7℃或9℃或11℃低溫下儲藏備用。
3、將誘導好的幼蟲取出，加2～3倍體積的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6.2，放入組織搗碎勻漿機中，勻漿10min。所得勻漿液于離心15min，取上清液，于4℃下放置12小時。
4、將抽提液于40℃或45℃或50℃或55℃或60℃或65℃或75℃或80℃水浴中處理25min，迅速置超低溫冰箱中冷卻10min后，4℃，12000r/min離心10min，取上清。
5、上清液用25％、80％硫酸氨進行分級沉淀，在第二步沉淀的同時用碳酸鈉調pH到10，然后離心，所得沉淀用3ml緩沖液進行溶解，再離心一次，得上清液。
6、上清液透析除鹽24小時，透析袋每隔三小時換水一次。
7、上清液經透析處理后，上葡聚糖(Sephadex)G-75分子篩柱，平衡液為0.2mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6.2，洗脫液為0.5～1.0mol/L磷酸鹽緩沖液梯度洗脫，pH6.2，收集活性峰。
8、將活力部分凍干或真空濃縮后，上制備型高效液相色譜柱，10～50％的乙腈(0.1％三氟乙酸)洗脫，收集活性峰。
9、活力峰凍干，于零下20℃保存，得從蠶中制備的多肽抗生素。產率5.2mg/kg蠶幼蟲。
實施例21、在家蠶的5齡期添食涂噴有3％或4.5％或5.5％或7.5％或8％或9％濃度的核型多角體滅活溶液的桑葉，每天定時添食一次，直至蠶吐絲。
2、待蠶幼蟲結成繭后，用10或10.5或13或15或17.5或18千赫的超聲波處理4小時，每天誘導1次，間隔20～24小時重復誘導3次。誘導后的蠶蛹于2℃或4℃或6℃或8℃或10℃或12℃低溫下儲藏備用。
3、提取方法與實施例1相同。
產率8mg/kg蠶蛹。
權利要求
1.一種家蠶體中提取多肽抗生素的制備方法，它包括下列步驟A、家蠶的誘導，首先是幼蟲的誘導在幼蟲提取的前五天，以2％～10％濃度的微生物培養液噴灑桑葉后飼喂4～5齡期的家蠶，每天1次，連續4天，同時，采用超聲波誘導，條件是10～20千赫處理2～5小時，間隔20～24小時重復誘導3次，誘導后的幼蠶幼蟲于0～12℃低溫下儲藏；其次是蠶蛹的誘導，以2％～10％濃度的微生物培養液噴灑桑葉后飼喂4～5齡期的家蠶，每天1次，直至家蠶吐絲；待結繭后第3-5天，采用10～20千赫超聲波進行處理，每天1次，每次2～5小時，間隔20～24小時重復誘導3次，誘導后的蠶繭于0～12℃下儲藏；B、家蠶多肽抗生素粗提液的制備，首先是將誘導好的幼蟲、鮮蛹或鮮繭繅絲后的蠶蛹，加2～3倍體積的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液，pH5-7，放入組織搗碎勻漿機中，勻漿10min；其次是將所得勻漿液于4℃，12000r/min離心15min，取上清液，于4℃下放置12小時；第三是將抽提液于40～80℃水浴中處理25min，置超低溫冰箱中冷卻10min后，4℃，12000r/min離心10min，取上清；第四是將上清液用25％，80％硫酸氨進行分級沉淀，在沉淀的同時用碳酸鈉調pH9.5-10.5，靜置10min后，4℃，15000r/min離心15min，所得沉淀用緩沖液進行溶解，再按照上述方法離心，得上清液；第五是將上清液透析除鹽24小時，透析袋每隔三小時換水一次；C、家蠶多肽抗生素的分離純化，首先是分子篩柱層析，上清液經透析處理后，上葡聚糖G-75分子篩柱，平衡液為0.2mol/L磷酸鹽緩沖液，pH5-7，洗脫液為0.5～1.0mol/L磷酸鹽緩沖液梯度洗脫，pH5-7；其次是收集活力峰，將收集的溶液進行-20℃--80℃真空干燥得家蠶多肽抗生素的活性干粉；第三是上制備型高效液相色譜柱，10～50％的乙腈洗脫，收集活性峰；第四是活力峰凍干，于零下20℃保存，得到多肽抗生素。
全文摘要
本發明公開了一種利用家蠶提取多肽抗生素的制備方法，其步驟為家蠶幼蠶和蠶蛹多肽抗生素的誘導，家蠶多肽抗生素粗提液的制備，家蠶多肽抗生素的分離純化。本發明工藝簡單，原料來源廣泛，成本低廉，抗菌譜廣，純度高，具有一定的社會、經濟和生態環保效益。
文檔編號C07K14/435GK1456574SQ03128069
公開日2003年11月19日 申請日期2003年5月30日 優先權日2003年5月30日
發明者張莉, 郭聰, 朱家裕 申請人:成都天創生物科技有限責任公司