專利名稱：不育轉基因魚的制備方法
技術領域：
本發明涉及轉基因魚研究領域，更具體涉及一種不育轉基因魚的制備方法。
背景技術：
1984年，中國科學院水生生物研究所在世界上率先開展了魚類基因工程定向育種研究，建立了完整的轉基因魚理論模型和完善的實驗技術體系(Zhu，et al，1985；朱作言等，1989)。在此基礎上，快速生長的轉“全魚”生長激素基因鯉魚研究取得重要進展，規模化養殖試驗顯示，轉基因鯉魚子代群體平均體重比對照魚增重快42％，餌料利用效率提高18.5％，池塘養殖綜合經濟效益提高125.7％(汪亞平等，2001；朱作言等，2001)。與此同時，歐、美等國在快速生長轉基因虹鱒、大西洋鮭和羅非魚等研究方面亦取得重要進展，規模化養殖試驗也在進行中，但迄今尚無轉基因魚商品化實例。
誠然，作為一種定向遺傳改良的生物體，轉基因魚的生物安全性受到了全社會的普遍關注。轉基因魚的生物安全性包括作為食物的消費安全、釋放的遺傳安全和生態安全。目前，轉基因魚研究均采用魚類來源甚至自身來源的基因元件，極大地消除了轉基因魚的食品安全隱患；而且轉“全魚”基因鯉魚的食品安全性檢測結果也表明，攝食轉基因魚對小鼠的生長、發育和生殖等均無顯著影響(張甫英等，2000)。高效養殖模式的建立和食品安全性研究結果的獲得，為轉基因魚的商品化奠定了基礎。因此，遺傳和生態安全及其控制技術已成為轉基因魚研究亟待解決的問題，也是轉基因魚實現產業化的必要前提。轉基因魚的遺傳和生態安全問題概括起來包括兩個方面其一，轉基因魚可能與野生種和近緣物種雜交，造成自然種質資源基因庫污染；其二，轉基因魚可能形成優勢種群，破壞水生態系統的群落結構，造成難以逆轉的影響。而通過制備不育的轉基因魚，一方面可以控制轉植基因通過有性交配的方式發生遺傳漂移，另一方面，可以防止逃逸到自然水體中的轉基因魚形成優勢種群，進而對水生態系統產生不利影響。基于此，轉基因魚的遺傳和生態安全可以通過對轉基因魚的生殖控制來解決。
目前不育轉基因魚的培育技術是采用三倍體策略，通過魚類倍間雜交的方法進行的，即將二倍體的轉基因魚與四倍體魚雜交，從而獲得不育的三倍體轉基因魚。但是，四倍體魚的獲得極其困難，我國學者自行制備的異源四倍體鯽鯉是目前世界上唯一一例能自身繁殖、遺傳性狀穩定且沒有經過化學或物理方法處理獲得的四倍體魚種群(劉筠，1993)。因此，采用三倍體策略制備不育轉基因魚的應用受到很大限制，只能是解決轉基因魚遺傳生態安全問題的一個特例，不具備普遍性。
發明內容
本發明的目的在于提供一種不育轉基因魚的制備方法，該方法簡便，操作方便，通過反義核酸技術阻遏鯉魚性腺發育及性成熟相關基因----鮭魚型促性腺激素釋放激素基因(sGnRH)的表達，阻抑轉基因魚的生殖功能，從而獲得不育的轉基因魚，為解決轉基因魚的遺傳和生態安全問題提供具有普遍適用性的技術平臺。
為了達到上述目的，本發明采用了以下技術措施根據反義核酸作用原理，構建反義RNA表達載體，遏制鯉魚鮭魚型促性腺激素釋放激素(sGnRH)基因的表達，制備獲得不育的轉基因魚。其步驟是A以鯉魚肌動蛋白(β-actin)基因的啟動子為啟動子，以反義的286bp鯉魚鮭魚型促性腺激素釋放激素基因(sGnRH)的cDNA片段為靶位基因[包括sGnRH十肽、促性腺激素釋放激素相關肽(GAP)編碼區和64bp 3′非編碼區序列]，以草魚生長激素基因的3′側翼順序為終止順序，構建反義RNA表達載體pCAsGnRHc-antisense。B經限制性內切酶(Hind III和EcoR I)消化，顯微注射法將重組基因CAsGnRHc-antisense導入鯉魚受精卵中。C采用PCR篩選轉重組基因的陽性魚，進而通過放射免疫檢測獲得不育轉基因魚。
本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果提供了一種制備不育轉基因魚的新的技術平臺，采用該技術，不用培育四倍體魚，可以直接獲得不育的轉基因魚，不育轉基因魚出現的頻率約32％。該方法易行，操作簡便，不受培育四倍體魚的限制，具有普適性，能廣泛應用于轉基因魚育種實踐，進而為從根本上解決轉基因魚的遺傳和生態安全的問題提供了具有普遍適用性的技術平臺。
圖1為鯉魚鮭魚型促性腺激素釋放激素基因(sGnRH)反義RNA表達載體(pCAsGnRHc-antisense)示意圖。
1鯉魚肌動蛋白(β-actin)基因的啟動子，長2.5kb；
2反向的鯉魚鮭魚型促性腺激素釋放激素基因(sGnRH)cDNA片段，長286bp，包括鮭魚型促性腺激素釋放激素基因(sGnRH)十肽、促性腺激素釋放激素相關肽(GAP)編碼區和64bp 3′非編碼區序列.
3草魚生長激素基因3′側翼順序，長0.8kb；4質粒載體pUC118，長3.2kb。
5限制性內切酶Hind III位點。
6限制性內切酶EcoR I位點。
具體實施例方式
其步驟是A，鮭魚型促性腺激素釋放激素反義RNA表達載體(pCAsGnRHc-antisense)的構建在鮭魚型促性腺激素釋放激素反義RNA表達載體(pCAsGnRHc-antisense)中，鯉魚肌動蛋白(β-actin)基因的啟動子2.5kb片段為啟動子，按3′--5′的方向，反向的286bp鯉魚鮭魚型促性腺激素釋放激素(sGnRH)基因的cDNA片段為靶位基因插入在啟動子的下游，隨后的草魚生長激素基因的3′側翼順序0.8kb為終止順序，反義載體骨架為pUC118。
B，轉基因魚的制備將鮭魚型促性腺激素釋放激素反義RNA表達載體(pCAsGnRHc-antisense)分別用限制性內切酶(EcoR I和Hind III)消化，得到線性重組DNA片段(CAsGnRHc-antisense)。回收的DNA溶于緩沖液ST(88mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH7.5)，調節其終濃度為50ng/μL，鯉魚受精卵用0.25％的胰蛋白酶消化去除卵膜，采用顯微注射的方法，在第一次卵裂前將DNA溶液導入受精卵動物極，DNA注射劑量約5×105拷貝/卵，完成顯微操作后的受精卵置于實驗室無菌環境中孵化。
C，不育轉基因魚的篩選剪取轉CAsGnRHc-antisense基因魚尾鰭少許，提取DNA，采用PCR技術檢測轉基因陽性魚；從轉基因陽性魚尾部血管取血少許，檢測轉基因陽性魚血清中11-酮基睪酮(11-ketotestosterone)的濃度，確定雄性鯉魚，同時采用雙抗體放射免疫法(Radioimmunoassay，RIA)測定血清的促性腺激素(Gonadotropin，GtH)含量，若其血清促性腺激素(GtH)含量低于同批轉基因陽性魚促性腺激素(GtH)含量的60％，則篩選獲得不育的轉基因魚。其中，正向檢測引物(5′-CCATGGCGTATCGATGTCGAC-3′)位于啟動子與反向靶向序列之間的接頭序列上，反向檢測引物(5′-CATGGCTTTGCCAGCATTGG-3′)位于靶向序列上，兩引物擴增的片段長度為328bp。
SEQUENCE LISTING<110>中國科學院水生生物研究所<120>不育轉基因魚的制備方法<130>不育轉基因魚的制備方法<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3645<212>DNA<213>魚artificial sequence<220>
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1.一種不育轉基因魚的制備方法，包括下列步驟A、鮭魚型促性腺激素釋放激素反義RNA表達載體的構建，在鮭魚型促性腺激素釋放激素反義RNA表達載體中，以鯉魚肌動蛋白基因的啟動子2.5kb片段為啟動子，按3′-5′的方向，286堿基對鯉魚鮭魚型促性腺激素釋放激素基因的cDNA片段為靶位基因插入在啟動子的下游，隨后以草魚生長激素基因的3′側翼順序0.8kb為終止順序，反義載體骨架為pUC118；B、轉基因魚的制備，將鮭魚型促性腺激素釋放激素反義RNA表達載體分別用限制性內切酶消化，得到線性重組DNA片段，回收的DNA溶于緩沖液，調節其終濃度為50ng/μL，鯉魚受精卵用0.25％的胰蛋白酶消化去除卵膜，采用顯微注射的方法，在第一次卵裂前將DNA溶液導入受精卵動物極，DNA注射劑量約5×105拷貝/卵，完成顯微操作后的受精卵置于實驗室無菌環境中孵化；C、不育轉基因魚的篩選，剪取轉基因魚尾鰭，提取DNA，采用PCR技術檢測轉基因陽性魚；從轉基因陽性魚尾部血管取血，檢測轉基因陽性魚血清中11-酮基睪酮的濃度，確定雄性鯉魚，同時采用雙抗體放射免疫法測定血清的促性腺激素含量，其血清促性腺激素含量低于同批轉基因陽性魚促性腺激素含量的60％，則篩選獲得不育的轉基因魚，正向檢測引物為5′-CCATGGCGTATCGATGTCGAC-3′位于啟動子與反向靶向序列之間的接頭序列上，反向檢測引物為5′-CATGGCTTTGCCAGCATTGG-3′位于靶向序列上，兩引物擴增的片段長度為328bp。
2.根據權利要求1所述的一種不育轉基因魚的制備方法，其特征在于鮭魚型促性腺激素釋放激素反義RNA表達載體的重組基因是aagcttttag accttcttac ttttggggat tatataagta ttttctcaat aaatatctca 60tatcttactg tggtttaact gctgaatcta aaattttaat acaaaagtag ttatatttgt120tgtacattgt aaactataac ttaacttcag tttcagagaa actcatgtgc tcaaaatgta180aaaaaagttt cctgttaaat attttgtaaa tgtattgaag acaaaataag aaaaaaaaaa240tataagccac taaatcacac tgtccttggt atcagcaaga gattctgaca taatcagctg300tttttgttta ttactgccat tgaaggccat gtgcattagt cccaagttac acattaaaaa360gtcacatgta gcttaccaac atcagtgctg ttcaagcaca gcctcatcta ctattcaaac420tgtggcacca tctaaaatat gccagaattt ttttatttaa tgaatttgac cctgaaatat 480gtattaatat cactcctgtg atttttttgt aatcagctta caattacagg aatgcaagcc 540tgattcatta caagtttcac tacactttct ctgacaacat cacctactga actcagacca 600gctagttgct ccttaagtat acaatcatgt cactaatcct catttcaatg aaaaataccc 660ctattgtact tggtacttgg tagataacca cagagcagta ttatgccatt attgtgaata 720caataagagg taaatgacct acagagctgc tgctgctgtt gtgttagatt gtaaacacag 780cacaggatca aggaggtgtc catcactatg accaatacta gcactttgca caggctcttt 840gaaaggctga aaagagcctt attggcgtta tcacaacaaa atacgcaaat acggaaaaca 900acgtattgaa cttcgcaaac aaaaaacagc gattttgatg aaaatcgctt agggatcccc 960ccttgctctt caaacaatcc agcttctcct tctttcactc tcaagttgca agaagcaagt1020gtagcaatgt gcacgcgaca gccgggtgtg tgacgctgga ccaatcagag cgcagagctc1080cgaaagttta ccttttatgg ctagagccgg gcatctgccg tcatataaaa gagcgcgccc1140agcgtctcag cctcactttg agctcctcca cacgcagcta gtgcggaata tcatctgcct1200gtaacccatt ctctaaagtc gacaaacccc cccaaaccta aggtgagttg atctttaagc1260tagcttttta cattttcagc tcgcatatat caattcgaac gtttaattag aatgtttaaa1320taaagccaga ttaaatgatt aggctcagtt accggtcttt tttttctcat ttacgtgcga1380actctgctta aactctagtt attctttatt aatatgtggt tatttttata tatgtatgtg1440ttatcataac tgtactggct atgtcaggtg gtaatgactg taacgttacg ttactcgttg1500taggcacgac attgaatggg ccggtgttga aataagtctt caaccccttt taacctcaaa1560atgtgctctg gttaacaagg attttaacag ctatcagtat gactgtgcgg ttttaaagcc1620gttagtgagg cacgttgcac acttgatgga tggccggaat gggaagttct ttatgcaggc1680agtgctgcag cagggtgtga cctactttag ctaacgttag ccggctaacc agcattcatc1740tgccggtaac ttgagtctaa tattctctca tgtgatatcg aagtgatcaa agacacgtct1800gttagctcac tttaaccaac tgtagtgaaa aatagcgcag tgtgcagccc ttcagtcttt1860catttaggct gattattcaa tcattttatt aactattaac gcgttactaa acgtaaggta1920acgtagtcag tttttaataa ctggtgaaaa gtactggttg ggtttaaatg gtgacttata1980attgtgttgg agggggaaac ctttttgata aaggctatat aatctcaaat gaatgggctg2040aggatggtgt tcacaggtgc tttagtgaag tccgctcgtg aagagtcgct gaagtgactg2100cagatctgtg acgcagtcgt tttgggcaga cggccgttga aattcggttg agtaattgat2160accaggtgag gctagaggat gtagaaattc atttgtgtag aatttaggga gtggccctgg2220cgtgatgaat gtcgaaatcc gttccttttt actgaaccct atgtctctgg ctgagtgcca2280caccgccggc agccgcaaag cgtctcaaac cattgccttt tatggtaata atgagaatgc2340agagggactt cctttgtctg gcacatctga ggcgcgcatt gtcacactag cacccactag2400cggtcagact gcagattgca gcacgaaaca ggaagctgac tccacatggt cacatgctca2460ctgaagtgtt gacttccctg acagctgtgc actttctaaa ccggttttct cattcattta2520cagttacagc catggcgtat cgatgtcgac tttttttttt ttttttacat ggaataaaat2580tttaatttat tctcgttggc tacaggggtt tatcttcatc ctttatgctt ttacactctt2640cctcgtcttt tgggaaatct cagttctttc agaggcaaac cttcagcatc cacttcattc2700actatgtgta tcggtgaaag ttgttccatt ggagagtctg caggaatgga tagtactgca2760tcaccagcat ccatcatcct aaatgttgcc tccacttcac caacgcttct ctttccacca2820ggaagccaac catatgacca atgctggcaa agccatgggg gagagcagcc tcagagagag2880ctttcgtctt ctggcttgct tcaagaagga catgcacaag gtggaaactt acctgagggt2940tgcgaattgc aggagatccc tggattcaaa ctgcaccctg tagatggcgc caatgtattg3000ctagccaaag cctgtgacac actttgctgc aaatctaaaa ccagtttaag tcctcaaaat3060ctcctaatat aattattatc tggtcttata tatgcaggaa atgtcaacca ggcatggcta3120ggtctgttct ctagttccct cccatatcta aacccaacac tattgtattt attcttctca3180ttggggagtg ctcgtaaatt aaagacatta agatctgatt taacatttca cagtggtgct3240aagcaatata tggcaatata ttttcaaatg tgcccaaatc gctttgactc tagtatttta3300tggctccaaa aatggctaaa gatgcctttt gtcgaaactg tcatttggat ggatgggttc3360actcccaacc aagtgtatga atgtaaacat ttgtctgtct gatagattat gtccatatta3420ttagctcatg ctgttctctt gaagctgtgt gtctttatcc attaaatttc taaactgcat3480ccaatgtgtc tgctgtatga cctgtgtggt ttattttttt ctacccgtct caacattaca3540cgtaccttac attttcactg ctcggatatt catcaaaatc agtcctatca tccgtccaca3600atgaacgagt tcaaaatgga ccgaaaaaaa tgaccagcgg aattc364全文摘要
本發明公開了一種不育轉基因魚的制備方法，以鯉魚肌動蛋白基因啟動子作為啟動子，以反義的286bp鯉魚鮭魚型促性腺激素釋放激素基因互補脫氧核糖核酸片段[包括sGnRH十肽、促性腺激素釋放激素相關肽編碼區和64bp的3′非編碼區序列]為靶位基因，草魚生長激素基因3′側翼序列為終止順序，構建鮭魚型促性腺激素釋放激素反義RNA表達載體，采用顯微注射法將重組DNA片段導入鯉魚受精卵，聚合鏈式酶反應及放射免疫檢測篩選獲得不育轉基因魚。本發明方法易行，操作方便，為解決轉基因魚的遺傳和生態安全問題提供了具有普遍適用性的技術平臺。
文檔編號C07K14/435GK1528131SQ0312545
公開日2004年9月15日 申請日期2003年9月26日 優先權日2003年9月26日
發明者胡煒, 朱作言, 汪亞平, 黎雙飛, 煒 胡 申請人:中國科學院水生生物研究所