抑制sars病毒感染的小rna分子及其作用靶點的制作方法

專利名稱：抑制sars病毒感染的小rna分子及其作用靶點的制作方法
技術領域：
本發明涉及一組能夠特異抑制SARS病毒及與SARS病毒基因序列相似的其他RNA病毒感染的小核糖核酸(RNA)分子及其作用靶點。本發明還涉及這些小RNA分子及其作用靶點在醫藥領域中的應用。
RNA干擾(RNA interference RNAi)是生物中雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)誘導產生的特異性基因沉默(gene silencing)。RNAi研究被“Science”雜志評為2001年十大科技成就之一。自從1995年發現了RNAi現象后，已在多物種中觀察到RNAi現象，包括線蟲、果蠅、植物、真菌、哺乳動物等。作為一種新的“基因阻滯”技術，RNAi在基因功能的研究中已成為熱點。RNAi的高效、特異、可擴散、可調控特性，使其作為成熟的基因篩選技術大規模應用于后基因組的研究中，包括對具有相關功能的基因篩選，某一特異基因的功能鑒定等(Andrew F.et al.1998 Nature 391806-810；ZamorePD.et al.2000 Cell 101(1)25-33；.Hammond SM.et al.2000 Nature404(6775)293-296；Bernstein E.et al.2001 Nature 409(6818)363-366；ElbashirSM.et al.20001 Nature 411(6836)494-498)。
SARS冠狀病毒在種屬分類上屬于“ssRNA positive-strand viruses”家系的“Nidovirales”族中的“Coronaviridae”系。它是冠狀病毒家族中新出現的一個子類。全長29,736bp，已知有11個編碼序列(cds)，而其中的一個cds(putativeorflab polyprotein)與鼠類的肝炎病毒(murine hepatitis virus)結構類似，依據鼠類的肝炎病毒的結構模式，推斷出該段cds應該編碼了14個蛋白質。SARS冠狀病毒是一種高變異性的單鏈(+)RNA病毒。通過長期對冠狀病毒的研究發現于單鏈(+)RNA病毒在宿主細胞內的復制過程主要包括如下的步驟1)正鏈RNA利用宿主細胞的翻譯系統表達了RNA聚合酶；2)在RNA聚合酶作用下以正鏈RNA為模板合成了負鏈RNA；3)負鏈RNA又作為模板通過“嵌入式”的方式合成了大小不等的編碼不同病毒蛋白mRNA和正鏈RNA；4)病毒在細胞內組裝；由此可見SARS病毒其自身攜帶的正鏈RNA和在細胞內合成的負鏈RNA是病毒在細胞內復制的關鍵。如果破壞病毒的RNA，將直接干擾病毒的復制，而利用RNAi技術篩選獲得的小分子雙鏈干擾RNA(siRNA)即可以達到這樣效果。
這方面類似的抗病毒研究已有成功報道在2003年3月，PNAS雜志連續報道了RNAi在病毒治療方面的突破性進展。研究發現，在細胞模型上和在含有胚胎的雞蛋模型上，利用RNAi技術靶向沉默流感病毒的mRNA，可以直接降低病毒mRNA在宿主細胞內的轉錄，從而有效的降低病毒的復制(Ge Q，et al.2003 PNAS 100(5)2718-2723)。同時還有文獻表明，利用RNAi技術可以有效的保護小鼠爆發性肝炎的發生和發展，在爆發性肝炎感染的動物模型上，通過在尾靜脈注射siRNA對Fas基因沉默可以有效的降低動物的死亡率(Song E，et al.2003 Nature Med.9(3)347-351)。另外，在抗HIV感染方面也取得類似進展。由于SARS病毒和流感病毒都屬于冠狀病毒的家族，都是正鏈RNA病毒。二者在細胞內的復制應該十分相似，因此，我們認為利用RNAi技術來沉默SARS病毒RNA和其編碼蛋白mRNA，采用多靶點沉默的原則，將會阻止SARS病毒在宿主細胞內的復制，從而降低其對宿主的損傷作用。
本發明的上述序列可以通過體外直接化學合成或其他任何方法制備的，也可以通過體外轉錄得到的，還可以利用載體或其DNA模板在細胞內轉錄產生的。
為闡明本發明的小RNA分子的作用靶點，本發明的發明人通過計算機生物信息學分析獲得非常特異的針對SARS病毒復制的藥物基因靶點。
與本發明的上述序列完全一致的基因序列可以作為藥物靶點，這些基因序列如下aaGTCTAAACGAACATGAAAC，來源于SRAS病毒mRNA轉錄起始部位基因序列；aaGTATAAATTTGTCCGTATC，來源于SRAS蛋白中表達NSP2蛋白的部分基因序列；aaGTGAATTCAACACTAGAAC，來源于SRAS蛋白中表達NSP10蛋白的部分基因序列；aaGAACACTTGTGATGGTAAC，來源于SRAS蛋白中表達NSP5蛋白的部分基因序列；aaGTGCTGCTATGACCATGTC，來源于SRAS蛋白中表達NSP10蛋白的部分基因序列；
aaGACTGCTCTTAAGAATGC，來源于SRAS蛋白中表達NSP1蛋白的部分基因序列；aaGCTGCAAGACGTTGTTAAC，來源于SRAS蛋白中表達spike蛋白的部分基因序列；aaGGAGCAGCTGCAACTACTC，來源于SRAS蛋白中表達MHV蛋白的部分基因序列；這些靶標可以用于與SARS病毒序列類似的其他RNA病毒感染的預防和治療。它們的模擬空間結構可以是通過計算機分析或其他分子生物學方法如各種生物文庫展示技術等方法獲得的。這些模擬空間結構可以作為研制針對SARS或與SARS病毒序列相似的其他RNA病毒感染的藥物靶標。
實驗證明，本發明的小RAN分子對SARS病毒感染具有很好的抑制作用，這些分子可以單獨或以任何比例、任何組合方式與其他任何治療SARS病毒感染的方法混合用于SARS病毒感染的預防和治療，對與SARS病毒序列類似的其他RNA病毒感染的預防和治療也具有重要的應用價值。
本發明獲得的序列及靶點對SARS病毒的診斷也有一定意義，并具有潛在的應用價值。
1.實驗方法1.1 siRNA DNA模板設計利用軟件和實驗經驗，根據GENEBANK報告的SARS病毒(病毒株SARS coronavirus CUHK-W1)的基因序列，已經設計并制備了16條siRNA，所靶向的基因幾乎涵蓋了整個病毒基因組包括MHV(777-2693) NSP1(2694-9959) NSP2(9960-10877) NSP5(11917-12590)rdrp(13347-16141)nsp10(16142-17944)Spikeprotein(21467-25234)以及SARS病毒蛋白轉錄起始序列，并設計合成能夠體外轉錄成siRNA的DNA模板引物序列，具體序列見表1，單鏈DNA模板由上海博潤生物技術公司合成。上述siRNA序列在目前已報道的所有SARS病毒基因序列中皆存在，且序列完全一致。因此實驗設計是針對所有SARS病毒株基因序列皆有效。
表1.siRNA DNA模板的引物序列




1.2 DNA模板退火將相互匹配的正義和反義單鏈DNA模板溶于20μl轉錄緩沖液中95℃加熱10分鐘，然后室溫放置15分鐘。
1.3體外轉錄制備單鏈RNA按下列轉錄體系進行體外轉錄5xbuffer 4μlrNTP(25mM each) 4μlDNA模板 1μlT7 polymerase2μlDEPC H2O9μl37℃，4h加入DNA酶消化 37℃ 1h1.4 siRNA制備將產生的正義鏈RNA和反義鏈RNA混合退火，95℃10分鐘，然后室溫放置15分鐘，將退火后樣品用超濾離心管(MW3000)，1,3000r/min離心1h，70％乙醇1,3000r/min離心1h，用無RNase H2O洗脫回收RNA，2％瓊脂糖電泳鑒定雙鏈RNA。
1.5 siRNA轉染Vero細胞并觀測對病毒感染的保護作用(在P3實驗室內操作)用不含抗生素的無血清DMEM培養基稀釋5pmol dsiRNA至25ml，另外用同樣培養基將0.25μl Lipofectamide 2000(Invitrogen)稀釋至25ml，5分鐘內將兩者輕輕混合，室溫孵育20分鐘；將培養至對數生長期的VeroE6(猴腎上皮細胞)細胞(培養條件為含10％胎牛血清的DMEM培養基)接種96孔板(Costa)，5×104細胞/孔/100μl，每孔加入50μl上述孵育后的siRNA樣品，24小時后更換新鮮正常完全培養基，然后各個細胞孔中加入100μl DMEM完全培養基稀釋的SARS病毒病毒(10-4)，繼續37℃，5％CO2培養72小時，觀察細胞存活狀態。
2.實驗結果2.1 siRNA的鑒定。從瓊脂糖電泳圖(附

圖1)可以看出，雙鏈siRNA著色深，位置靠前而單鏈RNA對照染色很淺，位置稍靠后，表明已成功制備出雙鏈siRNA。
2.2 不同siRNA轉染Vero細胞對SARS病毒感染的保護作用結果見表2。從表中可以看出，序列4，17能夠完全抑制SARS病毒對vero細胞的感染，序列5，9，11具有較強的抑制病毒感染作用，序列1，2，15具有較弱的抑制病毒感染作用。而序列3，6，7，8，10，12，13，14，16完全沒有抑制SARS病毒感染的作用，其結果與光加脂質體對照，或無血清對照，或針對GFP(綠色熒光蛋白)的siRNA及無關tRNA對照相似，細胞皆嚴重感染SARS病毒，導致細胞壞死。不加SARS病毒的正常細胞對照細胞生長良好。
表2.不同siRNA轉染Vero細胞對SARS病毒感染的保護作用

注“+”表示細胞受到病毒感染程度，數值越大表示感染程度越嚴重；“-”表示細胞未受到細胞感染，細胞生長狀態正常。
以上結果為病毒持續感染72小時結果。
序列表<110>中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所<120>抑制SARS病毒感染的小RNA分子及其作用靶點<130><160>42<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>RNA<213><400>1ggagcagcug caacuacuca u 21<210>2<211>21<212>RNA<213><400>2gaguaguugc agcugcuccu u 21<210>3<211>21<212>RNA<213><400>3gacugcucuu aagaaaugca a 21<210>4<211>21<212>RNA<213><400>4gcauuucuua agagcagucu u 21<210>5<211>21<212>RNA<213><400>5gaacacuugu gaugguaaca c 21<210>6<211>21<212>RNA<213><400>6guuaccauca caaguguucu u 21<210>7<211>21<212>RNA<213><400>7guauaaauuu guccguaucc a 21<210>8<211>21<212>RNA<213><400>8gauacggaca aauuuauacu u 21<210>9<211>21<212>RNA<213><400>9gugcugcuau gaccauguca u 21<210>10<211>21<212>RNA<213><400>10gacaugguca uagcagcacu u 21<210>11<211>21<212>RNA<213><400>11guuucauguu cguuuagacu u 21<210>12<211>21<212>RNA<213><400>12gucuaaacga acaugaaacu u 21<210>13<211>21<212>RNA<213><400>13gcugcaagac guuguuaacc a21<210>14<211>21<212>RNA<213><400>14guuaacaacg ucuugcagcu u 21<210>15<211>21<212>RNA<213><400>15gugaauucaa cacuagaaca g 21<210>16<211>21<212>RNA<213><400>16guucuagugu ugaauucacu u21<210>17<211>19<212>DNA<213><400>17gtctaaacga acatgaaac19<210>18<211>19<212>DNA<213><400>18gtataaattt gtccgtatc19<210>19<211>19<212>DNA<213><400>19gtgaattcaa cactagaac19<210>20<211>19<212>DNA<213><400>20gaacacttgt gatggtaac19<210>21<211>19<212>DNA<213><400>21gtgctgctat gaccatgtc 19<210>22<211>19<212>DNA<213><400>22gactgctctt aagaaatgc 19<210>23<211>19<212>DNA<213><400>23gctgcaagac gttgttaac 19<210>24<211>19<212>DNA<213><400>24ggagcagctg caactactc 19<210>25<211>21<212>RNA<213><400>25gugcugcuau gaccauguca u21<210>26<211>21<212>RNA<213><400>26gacaugguca uagcagcacu u21<210>27<211>21<212>RNA<213><400>27guugaauguu ggugauuacu u 21<210>28<211>21<212>RNA<213><400>28guaaucacca acauucaacu u 21<210>29<211>21<212>RNA<213><400>29guuucauguu cguuuagacu u 21<210>30<211>21<212>RNA<213><400>30gucuaaacga acaugaaacu u 21<210>31<211>21<212>RNA<213><400>31ggagaaguca gcucaaugcu u 21<210>32<211>21<212>RNA<213><400>32gcauugagcu gacuucuccu u21<210>33<211>21<212>RNA<213><400>33ggauggacau guugaaaccu u21<210>34<211>21<212>RNA<213><400>34gguuucaaca uguccauccu u21<210>35<211>21<212>RNA<213><400>35guugccucuu gguauuaaca u21<210>36<211>21<212>RNA<213><400>36guuaauacca agaggcaacu u21<210>37<211>21<212>RNA<213><400>37gcugcaagac guuguuaacc a21<210>38<211>21<212>RNA<213><400>38guuaacaacg ucuugcagcu u 21<210>39<211>21<212>RNA<213><400>39gccuucaaac cuauguaaca c 21<210>40<211>21<212>RNA<213><400>40guuacauagg uuugaaggcu u 21<210>41<211>21<212>RNA<213><400>41gugaauucaa cacuagaaca g 21<210>42<211>21<212>RNA<213><400>42guucuagugu ugaauucacu u 2權利要求
1.具有下述序列結構的任意一個雙鏈RNA分子，即序列表中的序列1和25’GGAGCAGCUGCAACUACUCAU 3’5’GAGUAGUUGCAGCUGCUCCUU 3’序列3和45’GACUGCUCUUAAGAAAUGCAA 3’5’GCAUUUCUUAAGAGCAGUCUU 3’序列5和65’GAACACUUGUGAUGGUAACAC 3’5’GUUACCAUCACAAGUGUUCUU 3’序列7和85’GUAUAAAUUUGUCCGUAUCCA 3’5’GAUACGGACAAAUUUAUACUU 3’序列9和105’GUGCUGCUAUGACCAUGUCAU 3’5’GACAUGGUCAUAGCAGCACUU 3’序列11和125’GUUUCAUGUUCGUUUAGACUU 3’5’GUCUAAACGAACAUGAAACUU 3’序列13和145’GCUGCAAGACGUUGUUAACCA 3’5’GUUAACAACGUCUUGCAGCUU 3’，或序列15和165’GUGAAUUCAACACUAGAACAG 3’5’GUUCUAGUGUUGAAUUCACUU 3’。
2.與權利要求1所述序列有90％以上同源性的任何雙鏈RNA分子。
3.具有下述序列結構的任何一條單鏈RNA分子，包括正義鏈和反義鏈，即序列表中的序列1至16中的任一序列序列15’GGAGCAGCUGCAACUACUCAU 3’序列25’GAGUAGUUGCAGCUGCUCCUU 3’序列35’GACUGCUCUUAAGAAAUGCAA 3’序列45’GCAUUUCUUAAGAGCAGUCUU 3’序列55’GAACACUUGUGAUGGUAACAC 3’序列65’GUUACCAUCACAAGUGUUCUU 3’序列75’GUAUAAAUUUGUCCGUAUCCA 3’序列85’GAUACGGACAAAUUUAUACUU 3’序列95’GUGCUGCUAUGACCAUGUCAU 3’序列105’GACAUGGUCAUAGCAGCACUU 3’序列115’GUUUCAUGUUCGUUUAGACUU 3’序列125’GUCUAAACGAACAUGAAACUU 3’序列135’GCUGCAAGACGUUGUUAACCA 3’序列145’GUUAACAACGUCUUGCAGCUU 3’序列155’GUGAAUUCAACACUAGAACAG 3’，或序列165’GUUCUAGUGUUGAAUUCACUU 3’。
4.與權利要求3所述序列有90％以上同源性的任何單鏈RNA分子，包括正義鏈和反義鏈。
5.抑制SRAS病毒感染的藥物靶點，其特征為SRAS病毒中表達MHV蛋白、NSP蛋白或spike蛋白的部分基因序列。
6.抑制SRAS病毒感染的藥物靶點，其特征為SRAS病毒中表達各種蛋白的mRNA起始序列UCUAAAC。
7.權利要求5的藥物靶點，具有序列表中的序列17至24中的任一序列序列17aaGTCTAAACGAACATGAAAC序列18aaGTATAAATTTGTCCGTATC序列19aaGTGAATTCAACACTAGAAC序列20aaGAACACTTGTGATGGTAAC序列21aaGTGCTGCTATGACCATGTC序列22aaGACTGCTCTTAAGAAATGC序列23aaGCTGCAAGACGTTGTTAAC，或序列24aaGGAGCAGCTGCAACTACTC。
8.權利要求1或2的雙鏈RNA分子在制備SARS病毒或與SARS病毒基因序列相似的其他RNA病毒感染的防治藥物中的應用。
9.權利要求3或4的單鏈RNA分子在制備SARS病毒或與SARS病毒基因序列相似的其他RNA病毒感染的防治藥物中的應用。
10.權利要求5、6或7的藥物靶點在篩選SARS病毒或與SARS病毒基因序列相似的其他RNA病毒感染的防治藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一組抑制SARS病毒感染的小RNA分子及其作用靶標。這些小RNA分子為單鏈或雙鏈RNA分子。本發明的RNA分子能夠特異抑制SARS病毒及與SARS病毒基因序列相似的其他RNA病毒感染。本發明作藥物用靶點可用于篩選SARS病毒感染防治藥物。
文檔編號C07H21/02GK1443770SQ0312517
公開日2003年9月24日 申請日期2003年5月27日 優先權日2003年5月27日
發明者邵寧生, 楊光, 李潔, 曹國軍, 劉雪梅, 范明, 柳川, 沈倍奮 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所