專利名稱：與sars相關的冠狀病毒全基因組芯片及其用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及與SARS相關的冠狀病毒全基因組芯片及其構建策略、方法及用途。
背景技術：
病毒檢測基因芯片背景。基因芯片，簡單地說就是在一塊特殊處理過的玻璃片或其它固相支持物(如硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等)上，將基因探針以大規模陣列的形式排布，形成可與目的分子(如病毒基因組)相互作用的固相表面。分子雜交后的探針陣列因為探針上結合目的分子的不同而在激光的順序激發下分別呈現不同的熒光發射譜征，根據其波長及波幅特征收集信號，作出比較分析從而得到所要的信息。
基因芯片現今的應用主要有以下方面基因表達時空特征分析；基因差異表達檢測；新基因的發現；大規模DNA測序；基因型、基因突變和多態性分析；遺傳病相關基因的定位；腫瘤相關基因的檢測；單一或少量感染性疾病的診斷以及藥物研究等。
病毒檢測芯片具有以下特點1、高通量每平方厘米上可以結合5000～10000個核酸探針，也就是說可以同時平行地進行上萬個分子雜交反應。現今基因序列已知的上千種病毒僅通過一張芯片就可以完全容納。
2、高精確度、靈敏度通過分子雜交來檢測病毒的存在是當前應用的技術中精確性和特異性最高的，據報道中表明，應用基因芯片技術進行臨床診斷，準確度可達到98％-100％。
3、組合性現在開發出的可以檢測病毒的基因芯片產品均只能單一性檢測一種或少量幾種病毒，如此則不能發揮基因芯片最大的技術優勢。我們的病毒組合檢測芯片將幾乎全部已知病毒的檢測組合在一張芯片上，最大程度地利用芯片技術的潛力，提高時效性的同時降低成本。病毒的組合檢測對于環境監控和質量監督等方面則具有劃時代的意義。
4、周期短、低成本、低工作量通過常規方法對病毒進行分子檢測通常至少需要一周時間，且對于多種病毒則需要相同的工作重復進行。病毒組合檢測芯片可以在4～5小時的自動化過程中一次性檢測所有病毒，大大降低工作時耗、強度和試驗成本。
SARS冠狀病毒相關背景及SARS冠狀病毒全基因組芯片的
背景技術：
從2002年11月到現在，世界范圍內的急性呼吸窘迫綜合癥(severe acute respiratorysyndrome，SARS)的爆發和流行被證明與一種新型變異的冠狀病毒相關，目前國際上將這種病毒叫做SARS相關冠狀病毒(SARS related virus)或SARS病毒(SARS virus)，在本發明中我們稱之為“與SARS相關的冠狀病毒”。在中國將這種急性呼吸窘迫綜合癥也稱做非典型性肺炎。3月23日，亞特蘭大的美國疾病預防控制中心寄往UCSF Dr.Deresi教授的標本經過其對包含1000種病毒的芯片測試，首次證實造成這種大規模流行的病因是一種冠狀病毒。繼之，加拿大BCCA基因組科學中心4月13日首次發布了SARS冠狀病毒(Genbank序列號AY274119)全序列，4月15日Genbank加以注釋再次發布(Genbank序列號NC_004718)。4月16日給猴子單獨接種這種從臨床確診病人身上分離的SARS冠狀病毒，發現在猴子身上引起的癥狀與SARS病人極其相似。WHO的SARS多中心協作研究成員在WHO多國協作研究基礎上基本確定一種新型冠狀病毒是這種急性呼吸道癥狀SARS的病原，衣原體等其它可疑病原仍需進一步評估。
所報道的目前認為是SARS的發病原因的冠狀病毒，是一種變異程度非常大的冠狀病毒。它屬于冠狀病毒科(來自拉丁語corona，象皇冠的)，是一種RNA病毒，病毒體含有單鏈正鏈線性RNA分子，感染脊椎動物，尤其是溫血動物，包括一些哺乳類(比如人、牛、貓、豬和鼠)，以及幾種禽類(比如火雞和雞)。該科病毒基因組由RNA組成，具有29,000個到31,000個堿基。
香港大學最新發現，感染人類的“非典”病毒成員最少有6個。這項發現，可為近日部分患者藥物無效、病情反復之謎，提供破解的線索。然而，從衛生防疫角度看，“非典”病毒數目繁多，短期內逐一擊破，會非常困難。港大醫學院微生物學系將多個來自世界各地的“非典”病毒樣本作比較，竟發現當中6個病毒樣本，某一段基因出現不相同的組合，包括兩個來自香港本地、兩個來自廣州、一個來自加拿大和一個來自美國的，就是說6個病毒是家族中不同的成員。不過，目前尚不知哪個樣本的病毒是“母體”，研究人員傾向于來自香港的一個樣本與來自加拿大和美國的相似；而來自香港的另一個樣本，則與廣州的兩個樣本相似。暫時未知這些非典型肺炎病毒家族成員是本已存在，還是由其中一種非典型肺炎病毒變種衍生出來的。而各家族成員之間的關系，以至病征上的異同都尚未清楚。不過，這發現可能有助解答一系列患者感染后出現病情極大差異之謎。
香港大學的研究結果，證實一直以米不少人“非典”病毒不只一種的擔憂，是正確的。雖然未知這六個病毒成員之間的關系，但由于成員有六個之多，有關專家由此推斷，非典型肺炎的康復者有可能在康復后，再受另一種病毒成員侵襲，身體并沒有相應抗體下而受感染，造成重復感染的現象。另一方面，若病毒有6個成員，部分病患者體內可能同時有兩個以上不同病毒成員，令醫護人員更難制訂有效的治療方案。醫護人員必須知道病人身上的病毒是哪一個成員，才可以采取最有效的治療方案，而測試方法亦因此受到限制。這無疑對防治及康復等工作倍添困難。
歷史上，標準病毒檢測技術依賴于病毒分離和體外病毒培養或者免疫檢測。當前SARS冠狀病毒的抗體和抗原標準還未建立，并且免疫檢測主要依賴于抗體的質量和可獲得性，SARS冠狀病毒單克隆抗體和ELISA的IgM抗體研究還正在進行。SARS標準化細胞株也未建立，SARS冠狀病毒體外培養較難，SARS冠狀病毒代謝模式和抗體動力學研究仍不清楚，已經開發出的SARS冠狀病毒診斷ELISA試劑盒的敏感性及特異性還有待進一步確認。甚至是目前最好的方法學的缺陷也變得明顯。我們研制的SARS冠狀病毒全基因組芯片除了在診斷上具有絕對優勢，對基因多樣性數據庫的建立；人群中SARS冠狀病毒全基因組序列變異的監控以及環境中SARS冠狀病毒污染的監控有特別重要的意義。目前針對冠狀病毒的實驗室檢測存在著局限性，因此SARS冠狀病毒全基因組芯片的應用是十分必須的。下面將就三個方面闡述SARS冠狀病毒全基因組芯片的重要意義(1)SARS冠狀病毒全基因組芯片對于“超級傳染源”的早期發現以及愈后病人對環境污染的監控有重要意義。PCR檢測具有很好的特異性，但是無法檢測出所有分泌冠狀病毒的病人。盡早并可靠地檢測出SARS冠狀病毒可以幫助醫生識別當病人出現發燒和其他可疑癥狀時是否感染了SARS，同時將其及時隔離并嚴格實施控制感染的措施。這將大大降低SARS病人將疾病繼續傳播的危險。
超級傳染源”一詞用以描述一名感染SARS的病人將疾病傳染給很多人。“超級傳染源”的現象出現在疾病暴發的早期，當時對這種現象沒有足夠的認識和了解。最初人們只知道SARS是一種新型疾病，認為很多患有非典型性肺炎的病人是由其他原因造成的，因此并沒有對感染者實施隔離和嚴格的控制措施。因此疾病暴發的早期沒有實行嚴格的感染控制措施。在缺乏保護措施的情況下，很多醫務工作者，病人親屬以及前往醫院的探視者都暴露于SARS冠狀病毒之下，隨后也都發展為SARS病患。有專家指出SARS病人出院后在一段時間內都有可能對環境造成潛在的SARS冠狀病毒威脅。
(2)SARS冠狀病毒全基因組芯片對于追蹤并確定SARS冠狀病毒的動物來源有重要意義。已有報道狗的主人中一人因感染“非典”后死亡，家中其他成員也根據防治“非典”的有關措施予以隔離。家人養的這只寵物狗，也在此期間死亡，有關部門還沒有確定其是否是因為感染“非典”而死。荷蘭Utrecht大學的Peter Rottier研究小組通過對傳染性貓腹腦炎病毒(Feline Infectious Peritonitis Virus，FIPV)導入小鼠冠狀病毒的一個基因片段，貓FIPV就可以感染小鼠細胞了，這項研究證明冠狀病毒能夠通過基因改組輕易的改變宿主，進而推斷SARS冠狀病毒可能是現有的動物及人類冠狀病毒突變成一種更致命的形式造成的。如果另外的證據支持這種動物性感染，通過對動物身上分離得到的SARS冠狀病毒進行全基因組芯片分析可以輕易分析證實這種種系間傳播的分子依據。
(3)SARS冠狀病毒全基因組芯片對于SARS冠狀病毒基因多樣化數據庫的建立有重要意義。有報道說從臺灣兩個人分離到SARS冠狀病毒其并不出現SARS相關臨床癥狀，對這種分離到的SARS冠狀病毒進行全基因組芯片分析有助于對SARS冠狀病毒遺傳抗性的認識。當然SARS冠狀病毒可能存在的天然遺傳抗性不是由單一因素決定的，但是僅僅依靠血清學以及PCR的方法不能確定SARS冠狀病毒相關具體基因的多樣性以及可能發生的微小改變，當RNA病毒(比如HIV病毒和流行性感冒病毒)在活細胞內迅速增殖(基因組復制和病毒體裝配)時，它們可以在短期內較容易地在不同組織中改變其遺傳結構。因此，專家認為研究SARS冠狀病毒的突變范圍對病毒感染的診斷和治療是非常必要的。SARS冠狀病毒全基因組芯片可以方便快捷地達到這一目的，對病毒毒株的變異以及分子流行病學調查有重要意義。
我們設計的SARS冠狀病毒全基因組芯片主要根據GenBank公布的SARS相關冠狀病毒全基因組序列(GenBank序列號NC_004718)以及迄今GenBank公布的所有SARS冠狀病毒全基因組序列(包括1、SARS冠狀病毒HKU-39849，GenBank序列號AY278491；2、SARS冠狀病毒Urbani，GenBank序列號AY278741；3、SARS冠狀病毒CUHK-W1，GenBank序列號AY278554；以及GenBank已公布了部分基因組序列的SARS冠狀病毒1、SARS冠狀病毒BJ04，GenBank序列號AY279354；2、SARS冠狀病毒BJ03，GenBank序列號AY278490；3、SARS冠狀病毒GZ01，GenBank序列號AY278489；4、SARS冠狀病毒BJ01，GenBank序列號AY278488；5、SARS冠狀病毒BJ02，GerBank序列號AY278487；6、SARS冠狀病毒Taiwan RNA-directed RNA多聚酶(pol)基因部分編碼區，GenBank序列號AY268049；7、SARS冠狀病毒Vietnam200300592多聚酶基因部分編碼區，GenBank序列號AY269391)。它與現在已有的冠狀病毒比較結果顯示，其核苷酸水平的相似性極差。其中我國測完SARS冠狀病毒全基因組序列的五株SARS相關冠狀病毒分別分離自廣州和北京地區的患者及死亡病例中。其中兩株分別來源于不同地區死亡病例的尸解肺組織標本；一株來源于北京尸解肝和淋巴結組織混合物；還有一株則來源于北京患者鼻咽拭子標本。
與加拿大與美國發布的冠狀病毒序列的比較顯示，該病毒的變異能力極強，在很短的幾代內有多處堿基突變。包括進這些不同來源的所有標本全基因組序列，將使我們的芯片覆蓋了所有已知的變異并將十分準確地確定標本是否被SARS冠狀病毒感染，并有助于了解病毒的突變機制，及時掌握病毒在各地區的分布情況，提高檢測的準確性。
我們的選擇策略是，從待選基因組序列的5’端開始，以40-80個堿基為探針標準長度，相鄰探針重疊5-30個堿基，選出的探針序列完全覆蓋了整個基因組序列。與存放小量的PCR擴增基因策略不同，這使我們能夠靶向基因的最大獨特性區域，得以在保留敏感性的同時消除交叉雜交的問題。而且它不需要昂貴的和費時的酶擴增以及證實上千條DNA模板的過程。這對冠狀病毒特別重要，因為其基因組A/T含量比較高，約60％，使用較長的合成的寡核苷酸解決了這一問題。
根據同樣的選擇策略，我們設計了針對豬傳染性胃腸炎病毒(Porcine transmissiblegastroenteritis virus，TGEV)以及禽傳染性氣管炎病毒(Avian infectious bronchitisvirus)的40-80堿基對長的病毒最保守序列的特異性寡核苷酸探針，這樣在快速排查SARS冠狀病毒的基礎上可以進一步排查是否還有其它動物類型冠狀病毒的感染。冠狀病毒在人以及家畜和實驗動物上引起的許多疾病都有重要經濟價值，經常導致動物嚴重的腸道或者呼吸道感染。豬傳染性胃腸炎是由冠狀病毒屬的豬傳染性胃腸炎病毒引起的一種急性、高度接觸性的傳染病。病豬和帶毒豬是本病的主要傳染來源。目前尚無特效的藥物可供治療，此病發病率很高，傳播快，一旦發病，采取隔離、消毒措施效果不大。禽傳染性支氣管炎，通常可根據發病情況，解剖所見作出診斷。目前尚無特效藥物。
本芯片還包含從煙草花葉病毒全基因組序列以及人基因組中10000個已知基因和7000多個EST片段選出的40-80個堿基對長的寡核苷酸的陰性探針，共計有數十個至一百個芯片掃描的陰性對照點。將雜交完畢的芯片置于激光共聚焦芯片掃描儀中進行圖像數據的轉換，以激光作為激發光源進行掃描，采集各個雜交點熒光信號的位置、熒光強度等信息，運用專業分析軟件例如AMAD(Analysis of Microarray Data的縮寫)對所采集的數據進行數據轉換，主要組成分析、各種簇的分析，進而確定樣品是否有SARS感染。本芯片將仔細選擇的病毒序列與隨機擴增步驟組合，克服了以往基于RT-PCR檢測策略的局限，使得檢測范圍更廣，檢測結果更為公正。
冠狀病毒在人以及家畜和實驗動物上引起的許多疾病都有重要經濟價值，經常導致動物嚴重的腸道或者呼吸道感染。
豬傳染性胃腸炎是由冠狀病毒屬的豬傳染性胃腸炎病毒引起的一種急性、高度接觸性的傳染病。病豬和帶毒豬是本病的主要傳染來源。目前尚無特效的藥物可供治療，此病發病率很高，傳播快，一旦發病，采取隔離、消毒措施效果不大。禽傳染性支氣管炎，通常可根據發病情況，解剖所見作出診斷。目前尚無特效藥物。
我們在國際互聯網上查獲，國際上只有Combimatrix公司宣布在SARS病毒全序列發布48小時之內研發出了診斷SARS相關冠狀病毒的芯片。本發明的與SARS相關的冠狀病毒全基因組芯片包括進剛剛測完序的全基因組序列信息，并立足于現有的芯片開發及病毒背景資源豐富的優勢，將不斷完成的其它SARS病毒變異序列有效地包括進去。下面是目前已知的所有冠狀病毒分離株+---Corona_S2 (130)+---Viruses(130)+---ssrna positive-strand viruses-no dna stage(130)+---nidovirales(130)+---coronaviridae (130)+---coronavirus transmissible (5)+---coronavirus enteric (2)+---coronavirus epidemic (4)+---coronavirus coronavirus (37)+---coronavirus sialodacryoadenitis (1)+---coronavirus gastroenteritis (5)+---coronavirus hepatitis (9)+---coronavirus infectious (61)+---coronavirushemagglutinating (1)+---coronavirus respiratory (5)下面是目前已經得到全基因組序列的冠狀病毒·Avian infectious bronchitis virus.Avian infectious bronchitis virus(strain 6/82).Avian infectious bronchitis virus(strain Beaudette CK).Avian infectious bronchitis virus(strain Beaudette M42).Avian infectious bronchitis virus(strain Beaudette US).Avian infectious bronchitis virus(strain Beaudette)
.Avian infectious bronchitis virus(strain D274).Avian infectious bronchitis virus(strain D3896).Avian infectious bronchitis virus(strain Gray).Avian infectious bronchitis virus(strain KB8523).Avian infectious bronchitis virus(strain M41).Avian infectious bronchitis virus(strain Portugal/322/82).Avian infectious bronchitis virus(strain UK/123/82).Avian infectious bronchitis virus(strain UK/142/86).Avian infectious bronchitis virus(strain UK/167/84).Avian infectious bronchitis virus(strain UK/183/66).Avian infectious bronchitis virus(strain UK/68/84)·Avian infectious laryngotracheitis virus·Enteric coronavirus·Equine coronavirus·Group 1 speciesCanine coronavirusFeline coronavirusHuman coronavirus(strain 229E)Porcine epidemic diarrhea virusTransmissible gastroenteritis virus·Group 2 speciesBovine coronavirusHuman coronavirus(strain OC43)Murine hepatitis virusPorcine hemagglutinating encephalomyelitis virusRat coronavirus·Group 3 speciesTurkey enteric coronavirus·Human enteric coronavirus 4408
發明內容
本發明中，我們的芯片設計的策略是以SARS冠狀病毒TOR2株全基因組序列(NC_004718)為檢測對象，設計相應的探針和芯片。我們以SARS冠狀病毒全基因組中的每40-80個堿基序列作為一個探針序列，相鄰探針序列重復5-30個堿基，特別是以70個堿基序列作為一個探針序列，相鄰探針序列重復25個堿基作為首選的選擇模式，從而覆蓋整個SARS冠狀病毒的基因組。合成好的探針利用基因芯片點樣儀點制于固相載體表面，固相載體可以包括玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等材料制成的片基。
利用逆轉錄及聚合酶鏈反應技術，我們將來自人體的血液及分泌物等臨床樣品以及相關病毒的標準樣品等中提取的總體RNA進行逆轉錄和擴增，在擴增的過程中摻入熒光標記。擴增標記產物與芯片進行雜交反應后，熒光信號通過基因芯片掃描儀掃描分析處理，最終得到全基因組探針的陰陽性結果。經過與標準毒株雜交結果的對比可以得到檢測樣品的帶毒情況。
本發明的技術路線是探針設計、探針合成、芯片點制、樣本處理與標記、芯片雜交、結果分析。
本發明描述了一種基因芯片，其特征是固定在基片上的探針矩陣覆蓋了SARS冠狀病毒的全基因組序列，所描述的SARS冠狀病毒的全基因組序列是指GenBank已公布的SARS冠狀病毒毒株或亞型的全基因組序列，所描述的SARS冠狀病毒毒株或亞型包括SARScoronavirus TOR2(GenBank序列號NC 004718/AY274119)，SARS coronavirus HKU-39849(GenBank序列號AY278491)，SARS coronavirus CUHK-W1(GenBank序列號AY278554)，SARS coronavirus Urbani(GenBank序列號AY278741)，SARS coronavirns BJ01(GenBank序列號AY278488)，SARS coronavirns BJ02(GenBank序列號AY278487)，SARS coronavirusBJ03(GenBank序列號AY278490)，SARS coronavirus BJ04(GenBank序列號AY279354)，SARS coronavirus GZ01(GenBank序列號AY278489)。
本發明所描述的基因芯片上的探針特征是從SARS冠狀病毒全基因組中的每40-80個堿基序列作為一個探針序列，相鄰探針序列重復5-30個堿基，所描述的基因芯片上的探針特征特別是指以70個堿基序列作為一個探針序列，相鄰探針序列重復25個堿基的模式。
根據同樣的選擇策略，我們還設計了針對豬傳染性胃腸炎病毒(Porcine transmissiblegastroenteritis virus，TGEV)以及禽傳染性氣管炎病毒(Avian infectious bronchitisvirus)的40-100堿基對長的病毒特異性寡核苷酸探針。這樣的設計策略的目的是，在快速排查SARS冠狀病毒的基礎上可以進一步排查是否還有其它動物類型冠狀病毒的感染。
本發明所描述的基因芯片的用途之一是用于檢測SARS冠狀病毒，所描述的檢測對象可以包括來自人體的血液及分泌物等臨床樣品、動植物樣品、食品水源樣品以及水環境和大氣環境樣品等等，所描述的基因芯片的用途之二是用于監測SARS冠狀病毒的變異和亞型，所描述的監測對象可以包括來自人體的血液及分泌物等臨床樣品、動植物樣品、食品水源樣品以及水環境和大氣環境樣品等等。
本發明所描述的基因芯片的用途之三是用于鑒別SARS冠狀病毒和其它冠狀病毒，所描述的鑒別對象可以包括來自人體的血液及分泌物等臨床樣品、動植物樣品、食品水源樣品以及水環境和大氣環境樣品等等。
說明書附圖中圖1所示為與SARS相關的冠狀病毒全基因組芯片點樣示意圖，點制規則為每條探針重復三個點，分為5個矩陣，每個矩陣136條探針，每個矩陣包括38個陽性坐標點，形成25列×14行的點陣。每組三聯點為一條探針。圖中的A所示的灰色點為陽性坐標點，B所示的黑色三聯點為檢測探針。
具體實施例方式
以下實施例對本發明的與SARS相關的冠狀病毒全基因組芯片的制備和用途作了詳細說明，但并不意味著限制本發明的內容。實施例1 芯片的制備探針的選取我們選取SARS冠狀病毒TOR2株全基因組序列(NC_004718)為檢測對象，設計相應的探針和芯片。TOR2株全基因組序列(NC_004718)基因組全長29736堿基，從5’端開始，以70個堿基為探針標準長度，相鄰探針重疊25個堿基。如探針1的首尾位置為基因組序列中第1-70個堿基，探針2的首尾位置為基因組序列中第46-115個堿基，探針3的首尾位置為基因組序列中第91-160個堿基，探針4的首尾位置為基因組序列中第136-205個堿基，以此類推，共得到660個探針，如表1所示，這660個探針覆蓋了該基因組的全部序列。每條探針的5’端進行氨基修飾。
表1 SARS冠狀病毒TOR2株全基因組探針序列序號 序列 起始位點sars001 CTACCCAGGAAAAGCCAACCAACCTCGATCTCTTGTAGATCTGTTCTCTAAACGAACTTTAAAATCTGTG1sars002 CTCTAAACGAACTTTAAAATCTGTGTAGCTGTCGCTCGGCTGCATGCCTAGTGCACCTACGCAGTATAAA46sars003 GCCTAGTGCACCTACGCAGTATAAACAATAATAAATTTTACTGTCGTTGACAAGAAACGAGTAACTCGTC91sars004 GTTGACAAGAAACGAGTAACTCGTCCCTCTTCTGCAGACTGCTTACGGTTTCGTCCGTGTTGCAGTCGAT136sars005 CGGTTTCGTCCGTGTTGCAGTCGATCATCAGCATACCTAGGTTTCGTCCGGGTGTGACCGAAAGGTAAGA181sars006 GTCCGGGTGTGACCGAAAGGTAAGATGGAGAGCCTTGTTCTTGGTGTCAACGAGAAAACACACGTCCAAC226sars007 GTCAACGAGAAAACACACGTCCAACTCAGTTTGCCTGTCCTTCAGGTTAGAGACGTGCTAGTGCGTGGCT271sars008 GTTAGAGACGTGCTAGTGCGTGGCTTCGGGGACTCTGTGGAAGAGGCCCTATCGGAGGCACGTGAACACC316sars009 GCCCTATCGGAGGCACGTGAACACCTCAAAAATGGCACTTGTGGTCTAGTAGAGCTGGAAAAAGGCGTAC361sars010 CTAGTAGAGCTGGAAAAAGGCGTACTGCCCCAGCTTGAACAGCCCTATGTGTTCATTAAACGTTCTGATG406sars011 TATGTGTTCATTAAACGTTCTGATGCCTTAAGCACCAATCACGGCCACAAGGTCGTTGAGCTGGTTGCAG451sars012 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CTTAAACAACTCCTGGAACAATGGAACCTAGTAATAGGTTTCCTATTCCTAGCCTGGATTATGTTACTAC26416sars589 TTCCTAGCCTGGATTATGTTACTACAATTTGCCTATTCTAATCGGAACAGGTTTTTGTACATAATAAAGC26461sars590 AACAGGTTTTTGTACATAATAAAGCTTGTTTTCCTCTGGCTCTTGTGGCCAGTAACACTTGCTTGTTTTG26506sars591 TGGCCAGTAACACTTGCTTGTTTTGTGCTTGCTGCTGTCTACAGAATTAATTGGGTGACTGGCGGGATTG26551sars592 ATTAATTGGGTGACTGGCGGGATTGCGATTGCAATGGCTTGTATTGTAGGCTTGATGTGGCTTAGCTACT26596sars593 GTAGGCTTGATGTGGCTTAGCTACTTCGTTGCTTCCTTCAGGCTGTTTGCTCGTACCCGCTCAATGTGGT26641sars594 TTTGCTCGTACCCGCTCAATGTGGTCATTCAACCCAGAAACAAACATTCTTCTCAATGTGCCTCTCCGGG26686sars595 ATTCTTCTCAATGTGCCTCTCCGGGGGACAATTGTGACCAGACCGCTCATGGAAAGTGAACTTGTCATTG26731sars596 CTCATGGAAAGTGAACTTGTCATTGGTGCTGTGATCATTCGTGGTCACTTGCGAATGGCCGGACACTCCC26776sars597 CACTTGCGAATGGCCGGACACTCCCTAGGGCGCTGTGACATTAAGGACCTGCCAAAAGAGATCACTGTGG26821sars598 GACCTGCCAAAAGAGATCACTGTGGCTACATCACGAACGCTTTCTTATTACAAATTAGGAGCGTCGCAGC26866sars599 TATTACAAATTAGGAGCGTCGCAGCGTGTAGGCACTGATTCAGGTTTTGCTGCATACAACCGCTACCGTA26911sars600 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GATCAGTTTCACCAAAACTTTTCATCAGACAAGAGGAGGTTCAACAAGAGCTCTACTCGCCACTTTTTCT27496sars613 AAGAGCTCTACTCGCCACTTTTTCTCATTGTTGCTGCTCTAGTATTTTTAATACTTTGCTTCACCATTAA27541sars614 TTTTAATACTTTGCTTCACCATTAAGAGAAAGACAGAATGAATGAGCTCACTTTAATTGACTTCTATTTG27586sars615 GCTCACTTTAATTGACTTCTATTTGTGCTTTTTAGCCTTTCTGCTATTCCTTGTTTTAATAATGCTTATT27631sars616 ATTCCTTGTTTTAATAATGCTTATTATATTTTGGTTTTCACTCGAAATCCAGGATCTAGAAGAACCTTGT27676sars617 AATCCAGGATCTAGAAGAACCTTGTACCAAAGTCTAAACGAACATGAAACTTCTCATTGTTTTGACTTGT27721sars618 GAAACTTCTCATTGTTTTGACTTGTATTTCTCTATGCAGTTGCATATGCACTGTAGTACAGCGCTGTGCA27766sars619 ATGCACTGTAGTACAGCGCTGTGCATCTAATAAACCTCATGTGCTTGAAGATCCTTGTAAGGTACAACAC27811sars620 TGAAGATCCTTGTAAGGTACAACACTAGGGGTAATACTTATAGCACTGCTTGGCTTTGTGCTCTAGGAAA27856sars621 CTGCTTGGCTTTGTGCTCTAGGAAAGGTTTTACCTTTTCATAGATGGCACACTATGGTTCAAACATGCAC27901sars622 GGCACACTATGGTTCAAACATGCACACCTAATGTTACTATCAACTGTCAAGATCCAGCTGGTGGTGCGCT27946sars623 GTCAAGATCCAGCTGGTGGTGCGCTTATAGCTAGGTGTTGGTACCTTCATGAAGGTCACCAAACTGCTGC27991sars624 TTCATGAAGGTCACCAAACTGCTGCATTTAGAGACGTACTTGTTGTTTTAAATAAACGAACAAATTAAAA28036sars625 TTTTAAATAAACGAACAAATTAAAATGTCTGATAATGGACCCCAATCAAACCAACGTAGTGCCCCCCGCA28081sars626 TCAAACCAACGTAGTGCCCCCCGCATTACATTTGGTGGACCCACAGATTCAACTGACAATAACCAGAATG28126sars627 GATTCAACTGACAATAACCAGAATGGAGGACGCAATGGGGCAAGGCCAAAACAGCGCCGACCCCAAGGTT28171sars628 CCAAAACAGCGCCGACCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACAGCTCTCACTCAGCATG28216sars629 TGGTTCACAGCTCTCACTCAGCATGGCAAGGAGGAACTTAGATTCCCTCGAGGCCAGGGCGTTCCAATCA28261sars630 CCTCGAGGCCAGGGCGTTCCAATCAACACCAATAGTGGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAG28306sars631 GACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCCGACGAGTTCGTGGTGGTGACGGCAAAATGAAAGAGCTCA28351sars632 GGTGACGGCAAAATGAAAGAGCTCAGCCCCAGATGGTACTTCTATTACCTAGGAACTGGCCCAGAAGCTT28396sars633 TACCTAGGAACTGGCCCAGAAGCTTCACTTCCCTACGGCGCTAACAAAGAAGGCATCGTATGGGTTGCAA28441sars634 AAAGAAGGCATCGTATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCCAAAGACCACATTGGCACCCGCA28486sars635 CCCAAAGACCACATTGGCACCCGCAATCCTAATAACAATGCTGCCACCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAA28531sars636 ACCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAGGGAAGCAGAGGCGGCA28576sars637 TACGCAGAGGGAAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGCTCCTCATCACGTAGTCGCGGTAATTCAA28621sars638 TCATCACGTAGTCGCGGTAATTCAAGAAATTCAACTCCTGGCAGCAGTAGGGGAAATTCTCCTGCTCGAA28666sars639 AGTAGGGGAAATTCTCCTGCTCGAATGGCTAGCGGAGGTGGTGAAACTGCCCTCGCGCTATTGCTGCTAG28711sars640 ACTGCCCTCGCGCTATTGCTGCTAGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAGTTTCTGGTAAAGGCCAAC28756sars641 AGCAAAGTTTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCAT28801sars642 ACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCATCTAAAAAGCCTCGCCAAAAACGTACTGCCACAAAACAGTACAACG28846sars643 CGTACTGCCACAAAACAGTACAACGTCACTCAAGCATTTGGGAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAA28891sars644 CGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTCGGGGACCAAGACCTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAAC28936sars645 ATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCTCCAAGTGCCTCTGCATTCT28981sars646 TTTGCTCCAAGTGCCTCTGCATTCTTTGGAATGTCACGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACAT29026sars647 ATGGAAGTCACACCTTCGGGAACATGGCTGACTTATCATGGAGCCATTAAATTGGATGACAAAGATCCAC29071sars648 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AATTAATTTTAGTAGTGCTATCCCCATGTGATTTTAATAGCTTCTTAGGAGAATGACAAAAAAAAAAAAA29656另外，選取四條煙草花葉病毒特異性探針作為陰性對照探針，序列來源于煙草花葉病毒基因組(GenBank序列號NC_001367)。如表2所示表2 煙草花葉病毒特異性探針序列序號 序列 起始位點tmv1 ATATTCTTAAGTATGTGTGCAAAACTTACTTCCCGGCCTCTAATAGAGAGGTTTACATGAAGGAGTTTTT 895tmv2 TCTGCTGCGGTGTCGAATCTCGTCAAGATCCTCAAAGATACAGCTGCTATTGACCTTGAAACCCGTCAAA 2220tmv3 CTTCTTAAAGGAGTTAAGCTTATTGATAGTGGATACGTCTGTTTAGCCGGTTTGGTCGTCACGGGCGAGT 5065tmv4 TGACAATTGCAGAGGAGGTGTGAGCGTGTGTCTGGTGGACAAAAGGATGGAAAGAGCCGACGAGGCCACT 5145我們還選取了豬傳染性胃腸炎病毒以及禽傳染性氣管炎病毒特異性探針序列共12條探針，序列見表3表3 豬傳染性胃腸炎病毒以及禽傳染性氣管炎病毒特異性探針序列TGEV1CTCTTATGGTGGTGCTTCAGTTTGTATTTATTGCAGATGCCATGTTGAACATCCTGCTATTGATGGATTATGEV1_rc TAATCCATCAATAGCAGGATGTTCAACATGGCATCTGCAATAAATACAAACTGAAGCACCACCATAAGAGTGEV2AGGTGTTATAACACTTGACAACCAAGATCTTAATGGCAATTTCTACGATTTCGGCGATTTCGTGAAGACTTGEV2_rc AGTCTTCACGAAATCGCCGAAATCGTAGAAATTGCCATTAAGATCTTGGTTGTCAAGTGTTATAACACCTTGEV3GATAATGGTTGTTTGATGGGATGGGACTATCCTAAGTGTGACCGTGCTTTACCTAATATGATTAGAATGGTGEV3_rc CCATTCTAATCATATTAGGTAAAGCACGGTCACACTTAGGATAGTCCCATCCCATCAAACAACCATTATCAIBV1AACACTAGAAATGCTTCTGTAGTTATTGGAACAACCAAGTTTTATGGCGGTTGGGACAACATGTTGAGAAAIBV1_rc TTCTCAACATGTTGTCCCAACCGCCATAAAACTTGGTTGTTCCAATAACTACAGAAGCATTTCTAGTGTTAIBV2TTATGGGTTGGGATTATCCTAAGTGTGATAGAGCAATGCCTAATTTGTTGCGTATAGCAGCATCCTTAGTAIBV2_rc ACTAAGGATGCTGCTATACGCAACAAATTAGGCATTGCTCTATCACACTTAGGATAATCCCAACCCATAAAIBV3TATTTATGTTAAACCTGGTGGCACTAGCAGTGGTGATGCTACTACTGCTTATGCAAACAGTGTTTTTAACAIBV3_rc GTTAAAAACACTGTTTGCATAAGCAGTAGTAGCATCACCACTGCTAGTGCCACCAGGTTTAACATAAATA我們還設計了針對香港公布的CUHK-W1-S的SARS全序列的特異性探針序列共3條探針，序列見表4表4 CUHK-W1-S的SARS的特異性探針序列CUHK-W1-S-210 TACTATTAATCATACGTTTGGCAACCCTGTCATACCTTTTAAGGATGGTATTTATTTTGCTGCCACAGAGCUHK-W1-S-710 CCTTTTCACCTGCTCAAGACATTTGGGGCACGTCAGCTGCAGCCTATTTTGTTGGCTATTTAAAGCCAACCUHK-W1-S-1710 ATTAGACATTTCACCTTGCTCTTTTGGGGGTGTAAGTGTAATTACACCTGGAACAAATGCTTCATCTGAA當然不局限于CUHK-W1-S的SARS還包括了根據其它最新公布的SARS序列所設計的特異性探針。
同時選取來自人基因組序列的40-100條寡核苷酸單個或者成組分布排列作為芯片掃描的對照。
SARS冠狀病毒TOR2株660個探針，煙草花葉病毒4個探針，豬傳染性胃腸炎病毒以及禽傳染性氣管炎病毒12條探針，CUHK-W1-S的SARS全序列探針序列共3條探針，最后，上述總共679個探針。
實施例2 芯片點制將上述679個探針約計為680個探針進行矩陣設計。按679條探針進行合成，合成產物溶于點樣緩沖液(3×SSC)，終濃度為800ng/ul。通過基因芯片點樣儀將探針溶液點于醛基修飾的玻璃片基上，隨后在濕度為60％的環境中進行水合30min，以使探針的氨基與片基的醛基發生連接反應，從而使探針固定于片基之上。
點制規則為每條探針重復三個點，分為5個矩陣，每個矩陣136條探針，每個矩陣包括38個陽性坐標點，形成25列×14行的點陣。如說明書附圖中圖1所示，圖1為SARS冠狀病毒全基因組芯片點樣示意圖，每組三聯點為一條探針。圖中的A所示的灰色點為陽性坐標點，B所示的黑色三聯點為檢測探針。實施例3 樣本處理與標記對于可能含有SARS冠狀病毒的待測樣本，通過Trizol試劑應用常規方法提取總體RNA，用5’端帶有特異性末端的九堿基隨機引物(GTTTCCCAGTCACGATCNNNNNNNNN)進行隨機反轉錄，然后利用特異性末端(GTTTCCCAGTCACGATC)進行特異性擴增，在擴增的過程中摻入Cy3或Cy5標記的dCTP以使擴增產物帶有熒光信號。
操作流程如下RT(20ul體系)，1ul隨機引物(GTTTCCCAGTCACGATCNNNNNNNNN，100pmol/ul)2ulRNA模板(1-2ug總體RNA)1ul dNTP(10mM)8ul DEPC-ddH2O混勻，70℃5min，迅速冰浴，快速離心加入4ul5*第一鏈合成Buffer2ul0.1M DTT1ul RNA酶抑制劑(40U/ul)25℃5min，加入1ul反轉錄酶，混勻，25℃10min，42℃1h，70℃ 15min終止。
PCRA(20ul體系)RT產物1ul10*PCR Buffer 2ul隨機引物1ul(GTTTCCCAGTCACGATCNNNNNNNNN，100pmol/ul)dNTP(10mM)0.6ulddH2O 14.4ulTaq(5U/ul)1ul95 5min-94 1min-30 5min-72 3min-5cycles-72 5minB(50ul體系)PCR-A產物5ul10*PCR Buffer 5ul特異引物2ul(GTTTCCCAGTCACGATC，100pmol/ul)dNTP(10mM)1ulCy3/5-dCTP(1mM)1ulddH2O 34ulTaq(5U/ul)2ul95 5min-94 50s-40 1min-50 1min-72 1min-30cycles-72 5min實施例4 芯片雜交將芯片進行預處理，即分別用0.5％SDS和去離子水漂洗芯片，晾干備用。
將標記好的50ul待測樣品擴增產物進行冷凍真空干燥，用1×雜交緩沖液20ul重新溶解，95℃變性5min，迅速冰浴，取20ul雜交液滴加于芯片表面，并以蓋玻片覆蓋，37℃溫浴1小時后，分別用0.5％SDS和去離子水漂洗芯片5min，晾干后通過基因芯片掃描儀掃描芯片，并利用分析軟件計算各條探針的信號值與分析陰陽性結果。實施例5 結果分析經過采集SARS冠狀病毒的標準毒株(臨床病人的血清及呼吸道分泌物樣品)以及其他與SARS冠狀病毒具有同源性的冠狀病毒，包括感染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus)、牛冠狀病毒(Bovine coronavirus)等(病毒標準品)，采用正常人血清及呼吸道分泌物樣品作為陰性實驗對象，根據以上技術路線進行多次實驗，得到實驗結果為1、雜交結果中陰性對照探針均呈現陰性信號；2、標準毒株雜交結果中SARS冠狀病毒檢測探針中陽性率為83％-92％；3、其他與SARS冠狀病毒相關的冠狀病毒雜交結果中SARS冠狀病毒檢測探針中陽性率為37％-58％；4、陰性實驗對象雜交結果中SARS冠狀病毒檢測探針中陽性率為1％-16％。
通過以上實驗得到雜交實驗結果判定標準，即在陰性探針反應呈陰性的前提下，80％以上檢測探針為陽性結果時可判定待測樣品帶有SARS病毒；30％-80％檢測探針為陽性結果時可判定待測樣品帶有與SARS病毒相關的病毒；30％以下檢測探針為陽性結果時可判定待測樣品不帶有與SARS病毒相關的病毒。
權利要求
1.本發明描述了一種基因芯片，其特征是固定在基片上的探針矩陣覆蓋了SARS冠狀病毒的全基因組序列。
2.權利要求1所述的SARS冠狀病毒的全基因組序列是指GenBank已公布的SARS冠狀病毒毒株或亞型的全基因組序列。
3.權利要求2中所述的SARS冠狀病毒毒株或亞型包括SARS coronavirus TOR2(GenBank序列號NC 004718/AY274119)，SARS coronavirus HKU-39849(GenBank序列號AY278491)，SARS coronavirus CUHK-WI(GenBank序列號AY278554)，SARScoronavirus Urbani(GenBank序列號AY278741)，SARS coronavirus BJ01(GenBank序列號AY278488)，SARS coronavirus BJ02(GenBank序列號AY278487)，SARScoronavirus BJ03(GenBank序列號AY278490)，SARS coronavirus BJ04(GenBank序列號AY279354)，SARS coronavirus GZ01(GenBank序列號AY278489)。
4.權利要求1所述的基因芯片上的探針特征是從SARS冠狀病毒全基因組中的每40-80個堿基序列作為一個探針序列，相鄰探針序列重復5-30個堿基。
5.權利要求1所述的基因芯片上的探針特征特別是指以70個堿基序列作為一個探針序列，相鄰探針序列重復25個堿基的模式。
6.權利要求1所述的基因芯片的用途之一是用于檢測SARS冠狀病毒。
7.權利要求6所述的檢測對象可以包括來自人體的血液及分泌物等臨床樣品、動植物樣品、食品水源樣品以及水環境和大氣環境樣品等等。
8.權利要求1所述的基因芯片的用途之二是用于監測SARS冠狀病毒的變異和亞型。
9.權利要求8所述的監測對象可以包括來自人體的血液及分泌物等臨床樣品、動植物樣品、食品水源樣品以及水環境和大氣環境樣品等等。
10.權利要求1所述的基因芯片的用途之三是用于鑒別SARS冠狀病毒和其它冠狀病毒。
11.權利要求10所述的鑒別對象可以包括來自人體的血液及分泌物等臨床樣品、動植物樣品、食品水源樣品以及水環境和大氣環境樣品等等。
全文摘要
本發明涉及用于急性傳染性疾病SARS相關冠狀病毒診斷的全基因組基因芯片，并提供了用于診斷其它有經濟價值的動物冠狀病毒基因芯片的高檢出率的新引物。該全基因組基因芯片包括檢測監控系統(A)和疾病診斷系統(B)兩個系統，可準確、快速檢測SARS相關冠狀病毒，并設有檢測監控系統，診斷時間更短，且大大提高診斷準確性。本發明的SARS冠狀病毒全基因組芯片尤其適用于檢疫局的生物體檢測、醫院臨床樣本，生物環境病毒污染監控、病人出院后疾病的傳播及人群中SARS冠狀病毒基因組水平的微小變化規律及基因多樣性數據庫的建立，特別對追蹤SARS冠狀病毒的動物來源都將具有十分深遠的重要意義。本發明特別應用于診斷領域。
文檔編號C07H21/04GK1450173SQ0312295
公開日2003年10月22日 申請日期2003年4月25日 優先權日2003年4月25日
發明者吳小岳, 馬鑫, 任魯風, 董小巖 申請人:本元正陽基因技術股份有限公司