專利名稱：一種植物甾醇或/和植物甾烷醇－β－D－葡萄糖苷類化合物的合成方法
技術領域：
本發明涉及一種具有生理活性的植物甾醇或/和植物甾烷醇衍生物的合成方法，具體地說是一種植物甾醇或/和植物甾烷醇-β-D-葡萄糖苷類化合物的合成方法。
更值得關注的是，植物甾醇或/和植物甾烷醇-β-D-葡萄糖苷也同樣存在于許多中藥材中，如人參、刺五加、胡蘿卜子、薺尼等；其中藥理作用較為顯著的為β-谷甾醇-β-D-葡萄糖苷(β-sitosterol glucoside，簡稱BSSG)，又稱胡蘿卜甾醇，刺五加甙A。經動物實驗和人體實驗研究已經證實，β-谷甾醇(BSS)及其葡萄糖苷具有消炎、退熱、抗腫瘤和調節免疫等功效。
植物甾醇或/和植物甾烷醇-β-D-葡萄糖苷可從經提煉完豆油的大豆殘渣中分離，但除含量很低以外，往往與植物甾醇或/和植物甾烷醇混雜在一起。此外目前尚無合成制備方面的文獻報道，因此尋找一種可以工業化生產植物甾醇或/和植物甾烷醇-β-D-葡萄糖苷類化合物的方法。是個很有意義的科研項目。
本發明是提供一種植物甾醇或/和植物甾烷醇-β-D-葡萄糖苷類化合物的合成方法。是以植物甾醇或/和植物甾烷醇和糖基配體多取代基-D-葡萄糖三氯乙酰亞胺酯為原料，經過糖苷化反應和脫保護基反應制得植物甾醇或/和植物甾烷醇-β-D-葡萄糖苷類化合物的合成方法。該方法的反應條件溫和，操作簡便，收率高，純度高，成本低，是適宜于工業化生產的方法。
本發明合成方法中的原料植物甾醇及植物甾烷醇的結構式如下 (植物甾醇) (植物甾烷醇)在植物甾醇式中，R1＝ 時，其化學名依次為豆甾醇，β-谷甾醇，菜子甾醇，菜油甾醇。
在植物甾烷醇式中，R1＝ 時，其化學名依次為豆甾烷醇，β-谷甾烷醇，菜子甾烷醇，菜油甾烷醇。
由上述植物甾醇及植物甾烷醇結構式顯示，兩者具有很大的相似性。僅在C5和C6之間植物甾醇為C＝C，而植物甾烷醇為C-C，在自然界植物中兩者也是廣泛的同時存在，且很難分離，通常得到的都是二者的混合物。而且植物甾醇可以是菜子甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇中的一種或一種以上的混合物，植物甾烷醇可以是菜子甾烷醇、豆甾烷醇、菜油甾烷醇、β-谷甾烷醇中的一種或一種以上的混合物，并隨著大豆的來源不同而有所改變。又本發明合成方法的關鍵反應是在C3位置上的OH基起糖苷化反應，因此不論是單獨各別或者是混合物都能進行糖苷化反應。為了便于對下列反應式的表示，以植物甾醇為例列出，而其余的反應式也類似，不再累贅。
本發明合成方法可用如下反應式表示(以植物甾醇為例) 式中R1為 R2為氫、1-10個碳的酰基，苯甲酰基、鹵素(如F、Cl、Br、I)取代的苯甲酰基、芐基、鹵素(如F、Cl、Br、I)取代的芐基、烷基硅基等。
本發明合成方法是首先將植物甾醇或/和植物甾烷醇粗品通過重結晶純化為晶體，其收率可達95％；再由D-葡萄糖(I)經過三步反應(I→II→III→IV)合成糖基配體，即多取代-D-葡萄糖三氯乙酰亞胺酯(IV)收率為70％，以糖基配體IV和植物甾醇或/和植物甾烷醇晶體為原料，在路易斯酸催化劑的催化下進行糖苷化反應，生成多取代的植物甾醇或/和植物甾烷醇-β-D-葡萄糖苷類化合物(V)，收率80～95％；再在堿金屬的氫氧化物、碳酸鹽或甲醇鹽的作用下，生成植物甾醇或/和植物甾烷醇-β-D-葡萄糖苷類化合物(VI)，收率85～95％。
本發明合成方法包括以下步驟1、植物甾醇或/和植物甾烷醇粗品的重結晶純化將植物甾醇或/和植物甾烷醇粗品通過溶劑重結晶純化。粗品在溶劑中加熱使之溶解，室溫放置0.5-72小時，即折出白色針狀晶體。溶劑可以選自脂肪醇(C1～C5)、脂肪烴(如石油醚、戊烷、己烷、環己烷)、芳香烴(如苯、甲苯、二甲苯)、脂肪酮(如丙酮、丁酮、環己酮)、醚類(如乙醚、四氫呋喃、正丁醚)、取代酰胺(如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、甲酰胺)、氯代烷烴(如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳)、酯類(如乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酰乙酸乙酯)等中的一種或一種以上的混合物。物料與溶劑之比為1克∶5-30毫升。
2、全取代葡萄糖(II)的合成葡萄糖(I)和取代物(其取代基為R2，例如苯甲酰氯)在溶劑中進行反應，再加入淬滅劑甲醇，定量生成化合物(II)。溶劑可以是吡啶，二氯甲烷或三氯甲烷等，化合物(I)和取代物以及淬滅劑的摩爾比是1∶3.0-7.0∶6.0-8.0，反應溫度是20-40℃，反應時間是8-24小時。反應結束后按常規方法處理。合成方法參照J.Amer.Chem.Soc；72；1950；2200-2204。
3、葡萄糖異頭碳(III)的合成化合物(II)在DMF中和冰醋酸以及水合肼反應，生成化合物(III)。化合物(II)∶冰醋酸∶水合肼＝1∶1-6∶1-5；反應溫度是-10-30℃，反應時間是1-6小時。反應體系采用乙酸乙酯稀釋，用食鹽水、稀鹽酸溶液、碳酸氫鈉溶液洗滌、干燥；過濾、濃縮、柱層析；反應收率為65-75％。合成方法參照Petersen，Lars et al.，J.org.chem；EN；66；19；2001；6268-62754、多取代-D-葡萄糖三氯乙酰亞胺酯(IV)的合成化合物(III)和三氯乙腈、催化劑在溶劑中于惰性氣體保護下反應生成化合物(IV)。催化劑是1，8-二氮雜二環[5.4.0]-7-十一烯(DBU)或無水碳酸鉀，化合物(III)和三氯乙腈、催化劑的摩爾比為1∶1.4-1.8∶0.03-0.08，惰性保護氣體是氮氣或氬氣，反應溫度是0-25℃，溶劑是無水二氯甲烷或無水三氯甲烷，反應時間是1.0-3.0小時。純化產物較好的方法是用短硅膠柱過濾，過濾用的吸附劑是硅膠，硅膠與產物的重量比為4-1∶1，硅膠的粒度是40-60μm，反應收率為88-96％。合成方法參照Du，Yuguo et al.，J.Chem.Soc.perkin Trans.I；EN；23；2001；3122-3127。
5、多取代的植物甾醇或/和植物甾烷醇-β-D-葡萄糖苷化合物(V)合成由植物甾醇或/和植物甾烷醇晶體，多取代-D-葡萄糖三氯乙烯亞胺酯(IV)，路易氏酸催化劑和脫水劑在惰氣體保護下，在溶劑中進行糖苷化反應生成多取代的植物甾烷或/和植物甾烷醇-β-D-葡萄糖苷化合物(V)，反應結束時，也可加入淬滅劑終止反應，在糖苷化反應中，反應溫度是-78-40℃，反應時間是0.5-24小時；化合物(V)，植物甾醇或/和植物甾烷醇，路易斯酸催化劑和淬滅劑的摩爾比為1∶0.8-2.5∶0.01-0.5∶0-0.5，反應溶劑用量是1摩爾化合物(IV)用10-40升溶劑。
反應溶劑為脂肪醇(C1～C5)、脂肪烴(如石油醚、戊烷、己烷、環己烷)、芳香烴(如苯、甲苯、二甲苯)、脂肪酮(如丙酮、丁酮、環己酮)、醚類(如乙醚、四氫呋喃、正丁醚)、取代酰胺(如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、甲酰胺)、氯代烷烴(如二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷)、酯類(如乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯)等中的一種或一種以上的混合物。
路易斯酸催化劑為三氟化硼乙醚、三氟甲磺酸、三氟甲磺三烷基硅酯或高氯酸等。
在反應中加入脫水劑，可使反應更為完全，脫水劑為無水的無機鹽或分子篩，如無水NaCl、無水MgCl2、無水CaCO3、無水MgSO4、3-5A分子篩等。化合物(IV)的摩爾和脫水劑的重量之比為1摩爾∶1-300克。淬滅劑是甲醇、水、三乙胺或氫氧化鈉等；惰性保護氣體是氮氣、氬氣或氦氣。反應粗產物經柱層析分離或重結晶純化。
6、植物甾醇或/和植物甾烷醇-β-D-葡萄糖苷類化合物(VI)合成化合物(V)和堿在極性溶劑中反應，脫保護基生成化合物(VI)。堿是堿金屬的氫氧化物，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鋰，碳酸鹽例如碳酸鈉、碳酸鉀或甲醇鹽例甲醇鈉、甲醇鉀等。化合物(V)與堿的摩爾比為1∶0.1-6，反應溫度是20-60℃，時間是1-10小時。極性溶劑是氯代烷烴(如二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷)、脂肪醇(C1-C5)、醚類(如乙醚、四氫呋喃、正丁醚)、乙腈、水等中的一種或一種以上的混合物。溶劑用量是1摩爾化合物(V)用10-30升溶劑。產物純化可以是重結晶或柱層析分離，較好的是重結晶純化。本發明優點本發明合成方法的反應條件比較溫和，操作比較簡便，收率較高，特別是關鍵的反應(糖苷化反應)的收率可以達到80-95％。且選擇性好，基本上是β型產物，經HPLC檢測顯示純度可達＞99％，原料易得，設備投資少，因此本發明方法是適宜于工業化大規模生產的方法。
具體實施例方式
實施例1 植物甾醇粗品的重結晶純化將植物甾醇粗品(20克，購于江蘇春之谷生物制品有限公司)溶于丙酮(200毫升)中，水浴50℃至全溶后，室溫放置4小時，抽濾，得白色針狀晶體19克，經GC-MS分析測試，其組成與植物甾醇標準品對比相符，各組分含量為菜子甾醇-3.52％；菜油甾醇-26.52％；豆甾醇-24.11％；β-谷甾醇-45.85％；收率95％。
實施例2 五-O-苯甲酰基-D-吡喃葡萄糖(II)的合成取D-葡萄糖(30克，167毫摩爾)加到吡啶(330毫升)中，冰水冷卻下滴加苯甲酰氯(107毫升，915毫摩爾)，室溫下攪拌反應過夜后，加入甲醇(13.5毫升，334毫摩爾)淬滅反應，將固液混合物倒入熱水中，有大量固體析出，過濾，水洗，固體晾干，得粗產物112克，為五-O-苯甲酰基-D-吡喃葡萄糖(II)，HPLC測試結果純度為97.21％，收率99％。
實施例3 2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-D-吡喃葡萄糖(III)的合成取五-O-苯甲酰基-D-吡喃葡萄糖(II)(617.3克，0.857摩爾)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(3000毫升)中，攪拌下加入冰醋酸(103毫升，1.8摩爾)，冰水浴，滴加水合肼(100.8克，1.8摩爾)。反應1.5小時后，用6000毫升乙酸乙酯稀釋，再用飽和食鹽水，4％鹽酸溶液，飽和碳酸氫鈉水溶液，飽和食鹽水各洗兩次，無水硫酸鈉干燥。過濾，濃縮，柱層析(濕法上柱，用4∶1的石油醚和乙酸乙酯淋洗，展開劑為PE∶EtOAc＝3∶1)，得固體393克，為2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-D-吡喃葡萄糖(III)，HPLC測試結果純度為95.89％，收率74％。
實施例4 2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-D-葡萄糖三氯乙酰亞胺酯(IV)的合成取2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-D-吡喃葡萄糖(III)(378.5克，0.608摩爾)溶解在無水處理的二氯甲烷(1000毫升)中，氬氣保護下加入三氯乙腈(112毫升，90.2毫摩爾)。室溫攪拌下加入DBU(4.6毫升，0.03摩爾)。TLC監測反應進程，反應1.5小時后，短柱快速柱層析，用無水處理的二氯甲烷淋洗，得到2、3、4、6-四-O-苯甲酰基-D-葡萄糖三氯乙酰亞胺酯(IV)428.5克，收率95％。
實施例5 植物甾醇-β-D-2，3，4，6-四-O-苯甲酰基葡萄吡喃苷(V)的合成將2、3、4、6-四-O-苯甲酰基-D-葡萄糖三氯乙酰亞胺酯(IV)(428.5克，0.578摩爾)和植物甾醇晶體(200克)溶于無水二氯甲烷(2500毫升)中，加入4分子篩(40克)，氬氣保護；室溫攪拌半小時后冷卻至0～-20℃范圍內，攪拌1小時后加入TMSOTf(0.45毫升)，反應3小時，加入三乙胺(1毫升)淬滅反應，過濾，濾液濃縮后得粗品，經柱層析分離或重結晶純化(重結晶的方法見實施例6)后得495克白色固體(HPLC測試純度為92％)，為植物甾醇-β-D-2，3，4，6-四-O-苯甲酰基葡萄糖吡喃苷，收率95％。
實施例6 植物甾醇-β-D-2，3，4，6-四-O-苯甲酰基葡萄糖吡喃苷粗品的重結晶純化將植物甾醇-β-D-2，3，4，6-四-O-苯甲酰基葡萄糖吡喃苷粗品(100克)溶于乙酸乙酯(720毫升)，滴加甲醇(880毫升)，放置過夜，抽濾得白色固體95克(HPLC測試純度為92％)，為植物甾醇-β-D-2，3，4，6-四-O-苯甲酰基葡萄糖吡喃苷，收率95％。
實施例7 植物甾醇-β-D-葡萄糖苷化合物(VI)的合成將植物甾醇-β-D-2，3，4，6-四-O-苯甲酰基葡萄糖吡喃苷(87克)溶于二氯甲烷(1000毫升)中，加入甲醇(400毫升)/NaOH(5.1克)溶液，室溫攪拌2-4小時，濃縮大部分溶劑，加入去離子水(150毫升)，水浴50℃，攪拌1小時，放置過夜；抽濾，并用去離子水洗滌濾餅至濾液PH中性，得白色固體1.57克，收率90％。
產物鑒定首先經HPLC檢測顯示產物純度＞99％，方法如下色譜條件Sedex 75蒸發光散射檢測器(ELSD)，Zorbax SB-Phenyl色譜柱，5μ，4.6×250mm，流動相為甲醇，流速1mL/min，定量管體積20μL，進樣體積10μl。
將植物甾醇-β-D-葡萄糖苷樣品(1.16g，2mmol)樣品和10％鹽酸(20ml)加入到30ml甲苯和乙醇(1∶2)的溶液中，回流24hr。反應混合物濃干溶劑，加入去離子水(50ml)，40℃水浴20分鐘；抽濾，并先后用去離子水以及乙醇洗濾餅，濾餅烘干，經快速柱層析純化(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)得到白色固體(660mg)，經GC-MS分析測試，其組成與植物甾醇標準品對比相符。
植物甾醇GC-MS分析測試方法如下儀器5973 GC-MS儀色譜柱DB5ms 30m×0.25mm×0.25μm柱溫240℃停留4分鐘后升溫到290℃，升溫速率20℃/min載氣He，1.2mL/min氣化溫度280℃接口溫度280℃E1源70ev結果如下1、β-谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇通過GC-MS在NIST標準質譜圖庫中檢索到相應的標準質譜圖，匹配度＞95％。
2、保留時間在13.91min的峰，未在標準質譜圖庫中匹配到相應的物質。但由質譜圖碎片可判斷它也是甾體同系物，其分子離子峰與菜油甾醇相同，據此，初步判斷此峰為菜子甾醇。
3、含量分別是菜子甾醇-3.52％；菜油甾醇-26.52％；豆甾醇-24.11％；β-谷甾醇-45.85％。
權利要求
1.一種植物甾醇或/和植物甾烷醇-β-D-葡萄糖苷類化合物的合成方法，其特征是包括如下步驟1).植物甾醇或/和植物甾烷醇粗品的重結晶純化得晶體；2).由植物甾醇或/和植物甾烷醇晶體，多取代-D-葡萄糖三氯乙烯亞胺酯(化合物(IV))，路易氏酸催化劑和脫水劑在惰性氣體保護下，在溶劑中進行糖苷化反應生成多取代的植物甾醇或/和植物甾烷醇-β-D-葡萄糖苷類化合物(化合物(V))，反應結束時，也可加入淬滅劑終止反應，化合物V中R1為 多取代的取代基R2為氫、1-10個碳的酰基，苯甲酰基、鹵素F、Cl、Br、I取代的苯甲酰基、芐基、鹵素F、Cl、Br、I取代的芐基、烷基硅基；在糖苷化反應中，反應溫度是-78-40℃，反應時間是0.5-24小時；化合物(IV)，植物甾醇或/和植物甾烷醇，路易斯酸催化劑和淬滅劑的摩爾比為1∶0.8-2.5∶0.01-0.5∶0-0.5，化合物(IV)的摩爾和脫水劑的重量比為1摩爾∶1-300克，反應溶劑用量是1摩爾化合物(IV)用10-40升溶劑；3).化合物(V)和堿在極性溶劑中，進行脫保護基反應生成植物甾醇或/和植物甾烷醇-β-D-葡萄糖苷化合物(VI)，在脫保護基反應中，化合物(V)與堿的摩爾比為1∶0.1-6，反應溫度是20-60℃，反應時間是1-10小時，極性溶劑用量是1摩爾化合物(V)用10-30升溶劑。
2.如權利要求1所述的合成方法，其特征在于對所述植物甾醇或/和植物甾烷醇粗品進行重結晶純化時所用的溶劑可以選自C1-C5的脂肪醇、脂肪烴、芳香烴、脂肪酮、醚類、取代酰胺、氯代烷烴、酯類中的一種或一種以上的混合物。
3.如權利要求2所述的合成方法，其特征在于對所述植物甾醇或/和植物甾烷醇粗品進行重結晶純化時所用的溶劑是脂肪酮。
4.如權利要求1所述的合成方法，其特征在于在所述糖苷化反應中，所用的路易斯酸催化劑是三氟化硼乙醚、三氟甲磺酸、三氟甲磺酸三烷基硅酯或高氯酸。
5.如權利要求1所述的合成方法，其特征在于在所述糖苷化反應中的溶劑為C1-C5的脂肪醇、脂肪烴、芳香烴、脂肪酮、醚類、取代酰胺、氯代烷烴、酯類中的一種或一種以上的混合物。
6.如權利要求1所述的合成方法，其特征在于在所述糖苷化反應中的脫水劑為無水的無機鹽或分子篩。
7.如權利要求1所述的合成方法，其特征在于在所述糖苷化反應中的淬滅劑是甲醇、水、三乙胺或氫氧化鈉。
8.如權利要求1所述的合成方法，其特征在于在所述糖苷化反應中的惰性保護氣體是氮氣、氬氣或氦氣。
9.如權利要求1所述的合成方法，其特征在于在所述脫保護基反應中所用的堿是堿金屬的氫氧化物，碳酸鹽或甲醇鹽。
10.如權利要求1所述的合成方法，其特征在于在所述脫保護基反應中所用的極性溶劑是氯代烷烴、C1-C5的脂肪醇、醚類、乙腈、水中的一種或一種以上的混合物。
全文摘要
一種植物甾醇或/和植物甾烷醇－β－D－葡萄糖苷類化合物的合成方法。首先是將植物甾醇或/和植物甾烷醇粗品進行重結晶純化得到晶體；再將該晶體與多取代－D－葡萄糖三氯乙烯亞胺酯在路易氏酸催化劑存在下進行糖苷化反應，再脫去保護基生成植物甾醇或/和植物甾烷醇－β－D－葡萄糖苷類化合物。該方法具有反應條件溫和、操作簡便、合成路線經濟、立體選擇性高等優點，是一個適宜于工業化生產的方法。
文檔編號C07J9/00GK1443771SQ0311648
公開日2003年9月24日 申請日期2003年4月18日 優先權日2003年4月18日
發明者惠永正, 劉俊耀, 何亞楠 申請人:上海中藥創新研究中心