專利名稱：納米金屬硫蛋白及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種生物制劑，具體指一種采用納米技術制備的、具有高生物敏感性、高生物親和性和高生物活性的納米金屬硫蛋白及其制備方法。
背景技術：
金屬硫蛋白(Metallothionein，簡稱MT)，是一種廣泛存在于動物、植物和微生物體內的生物基團，結構相當穩定，富含功能巰基，具有生物活性的蛋白質，能參與微量元素的代謝和調控，對有害的重金屬元素，如鉛、鎘、汞等具有解毒功能，是目前人們發現的清除自由基、抗衰老、抗輻射能力最強的生物制品，已被聯合國教科文組織列為21世紀生物制品的推薦項目。
金屬硫蛋白的制備方法一般為先對動物子皮下注射金屬誘導劑，如CdCl2誘導其在體內產生金屬硫蛋白，取其臟器或腎臟或腦組織切碎勻漿，用Tris-HCl—乙醇—氯仿混合液萃取后分離，冷凍干燥制得。其流程可概括為金屬誘導→切碎勻漿→離心分離→上柱分離→超濾脫鹽→冷凍干燥→金屬硫蛋白制劑。
但由于目前采用的生產技術只能制得粒徑在微米級的制品，從而限制了其性能的發揮。
發明內容
本發明的目的在于提出一種采用納米誘導劑誘導和采用納米技術處理的工藝方法制備金屬硫蛋白，使金屬硫蛋白產品的粒徑達到納米級(粒徑為0.1-100nm)的水平，即成為納米金屬硫蛋白(Nano-Metallothionein，簡稱N-MT)，以提高和擴展其性能。
本發明的一種納米金屬硫蛋白，由金屬硫蛋白經納米技術處理獲得，所述金屬硫蛋白是在對動物體進行誘導劑誘導后在其臟器中提取出的一種低分子量、富含半胱氨酸、且具有高度可誘導性的金屬與硫蛋白結合物，在每摩爾金屬硫蛋白中含有60-61個氨基酸結合，7-12個金屬離子，相對分子量為6000-7000u，含有18-20個巰基，其中半胱氨酸占23-33％，其特征在于金屬硫蛋白在誘導時采用由納米溶質與納米溶劑構成的納米誘導劑進行誘導，并對提取的金屬硫蛋白以超聲霧化納米化或/和甚低溫超聲粉碎納米化技術處理所獲得的納米級微粒。
本發明的一種納米金屬硫蛋白的制備方法，其流程為納米誘導、搗碎勻漿、分離、超濾脫鹽、超聲霧化納米化或/和甚低溫超聲粉碎納米化，所述工藝過程均在低溫狀態下進行。現分述如下●納米誘導—通過將納米金屬誘導劑注射入動物體，使動物體產生金屬與硫蛋白的結合物。如對動物進行5-8天分2-4次皮下注射，誘導動物的臟器產生金屬硫蛋白，在誘導結束后一天，摘取動物的臟器；納米金屬誘導劑是以經納技術制備的納米金屬鹽類作溶質，純水經電子或超聲納米化處理所獲得的納米溶劑配制而成。納米金屬誘導劑是以經納技術制備的納米金屬鹽類作溶質，純水經電子或超聲納米化處理所獲得的納米溶劑配制而成。
●搗碎勻漿—將動物臟器清洗、搗碎后、進行勻漿處理；●分離—勻漿后進行第一次離心分離，除去沉淀和雜蛋白，取上清液；再次分離，清除雜質，棄上清液；上色譜柱層析分離，收集洗脫液；●超濾脫鹽；●納米制備a)取上道工序的收集液，進行低溫超聲霧化納米化，收集產物即為納米金屬硫蛋白；b)或取上道工序的收集液，進行甚低溫超聲粉碎納米化，收集產物即為納米金屬硫蛋白；c)或取上道工序的收集液，進行低溫超聲霧化納米化和甚低溫超聲粉碎納米化，收集產物即為納米金屬硫蛋白。
綜上所述，其中搗碎勻漿、分離、超濾脫鹽基本上與現行生化工藝相似，而納米誘導和納米制備工藝則為本發明所特有。
本發明的優點在于，采用本發明的工藝所獲得的納米金屬硫蛋白，由于其微粒粒徑已達到納米級，從而其穿透性、擴張性、表面能、趨向性、附集性均產生質的飛躍，成為一種具有高生物敏感性、高生物親和性和高生物活性的新型生物制品，它具有零維、高表面能、高運動速度和生物靶向效應，能快速透過細胞，其活性和功能得以大大的提高和擴展。因此在臨床使用中用量顯著降低，注射次數可以減少。本發明采用超聲霧化納米化、甚低溫超聲粉碎納米化等技術手段，不僅效率高，產品得率高，而且可保證納米生物材料的活性和品質。
具體實施例方式
現結合一按本發明的技術制備納米金屬硫蛋白的實施例作進一步說明。
1.納米誘導—在活體兔子皮下注射納米金屬誘導劑，第1天30mg/只，第2天和第4天50mg/只，第7天60mg/只，誘導兔體產生金屬硫蛋白，第8天屠宰后取其肝臟。
納米誘導劑的溶質可采用納米級的鹽類如鎘鹽、鋅鹽等，本采用ZnCl2或ZnSO4，現已有商品化的納米氯化鋅和納米硫酸鋅出售。納米溶劑采用納米水，納米水是純水經過電子整水器拆開水分子團的締合鍵，因此水分子團的締合度甚低，完全在納米級的尺寸范圍內，納米水具有更高的通透性、溶解力和乳化性等活性。
2.搗碎勻漿—將兔子肝臟清洗后，加等體積的Tris-HCl+無水乙醇+氯仿混合溶液在搗碎機上搗碎勻漿。
Tris-HCl+無水乙醇+氯仿混合溶液的配制方法是，取0.01mol的Tris(緩血酸銨)重量，用納米純水稀釋成1L溶液，再用HCl調節溶液的PH值至PH＝8.6，定容為1L，即成Tris-HCl緩沖液，再按Tris-HClP/無水乙醇/氯仿＝1.00/1.30/0.08的比例配制成Tris-HCl+無水乙醇+氯仿混合溶液。
3.一次分離—在勻漿料中加入2-4倍體積的上述Tris-HCl+無水乙醇+氯仿混合溶液，充分攪拌后，在離心機上高速分離后取上清液，加入2-4倍料液的-20℃無水乙醇，靜置12小時以上，以除去沉淀物和雜蛋白。
4.二次分離—取上道工序的上清液，高速離心分離后，棄上清液，取沉淀部分加入0.01mol/L的Tris-HCl緩沖液后，再次高速分離后，取上清液，進一步除去雜質。
5.層析分離—取上道工序的上清液，上Sephadex G-50色譜柱，再上DEAE-Sepharase Fast Flow層析柱進行離子交換層析分離，并以Tris緩沖液進行洗脫，收集洗脫液。
6.超濾脫鹽—取上道工序收集液，上經碳酸銨平衡的Sephadex G-25色譜柱，同樣以Tris緩沖液洗脫，脫鹽過程中嚴格控制流速，經超濾脫鹽后收集洗脫液。
7.納米制備—取上道工序收集液進低溫超聲霧化納米化裝置進行超聲霧化獲得納米金屬硫蛋白產品，或將上道工序收集液進行甚低溫超聲粉碎納米化裝置進行超聲粉碎，即得納米金屬硫蛋白產品。
所述超聲霧化納米化裝置是利用超聲諧振，使MT微粒間相互撞擊，分散成更細的微粒，MT微粒中的微量水份，又進一步促進超聲“空化”效果，激化MT微粒，使成更細的納米化微粒，所述甚低溫超聲粉碎納米化裝置是利用物質材料在甚低溫狀態下，變為極易破碎的“玻璃體”的原理，對MT材料進行超聲粉碎，使成納米級微粒。
權利要求
1.一種納米金屬硫蛋白，由金屬硫蛋白經納米技術處理獲得，所述金屬硫蛋白是在對動物體進行誘導劑誘導后在其臟器中提取出的一種低分子量、富含半胱氨酸、且具有高度可誘導性的金屬與硫蛋白結合物，在每摩爾金屬硫蛋白中含有60-61個氨基酸結合，7-12個金屬離子，相對分子量為6000-7000u，含有18-20個巰基，其中半胱氨酸占23-33％，其特征在于金屬硫蛋白在誘導時采用由納米溶質與納米溶劑構成的納米誘導劑進行誘導，并對提取的金屬硫蛋白以超聲霧化納米化或/和甚低溫超聲粉碎納米化技術處理所獲得的納米級微粒。
2.一種納米金屬硫蛋白的制備方法，其特征在于其制備流程為納米誘導、搗碎勻漿、分離、超濾脫鹽、超聲霧化納米化或/和甚低溫超聲粉碎納米化，所述工藝過程均在低溫狀態下進行。
3.根據權利要求2所述的納米金屬硫蛋白的制備方法，其特征在于所述納米誘導是通過將納米金屬誘導劑注射入動物體，使動物體產生金屬與硫蛋白的結合物。
4.根據權利要求2或3所述的納米金屬硫蛋白的制備方法，其特征在于所述納米誘導是通過將納米金屬誘導劑注射入動物子體內，對動物子進行5-8天分2-4次皮下注射，誘導動物臟器產生金屬硫蛋白，在誘導結束后一天，摘取動物的臟器。
5.根據權利要求4所述的納米金屬硫蛋白的制備方法，其特征在于所述納米金屬誘導劑是以經納技術制備的納米金屬鹽類作溶質，純水經電子或超聲納米化處理所獲得的納米溶劑配制而成。
6.根據權利要求5所述的納米金屬硫蛋白的制備方法，其特征在于所述納米金屬誘導劑的溶質采用納米級的鋅鹽，如ZnCl2或ZnSO4。
全文摘要
一種納米金屬硫蛋白，系經納米誘導劑誘導、納米技術處理獲得的納米級的金屬硫蛋白。其制備方法為納米誘導、搗碎勻漿、分離、超濾脫鹽、超聲霧化納米化或/和甚低溫超聲粉碎納米化，所述工藝過程均在低溫狀態下進行。納米誘導是通過將納米金屬誘導劑注射入動物體，使動物體產生金屬與硫蛋白的結合物。所述超聲霧化納米化是利用超聲霧化納米化裝置使金屬硫蛋白的微粒納米化，所述甚低溫超聲粉碎納米化是利用甚低溫超聲粉碎納米化裝置使金屬硫蛋白的微粒納米化。采用本發明的工藝所獲得的納米金屬硫蛋白，其活性和功能得以大大的提高和擴展，具有高生物敏感性、高生物親和性和高生物活性。
文檔編號C07K14/825GK1524881SQ03115579
公開日2004年9月1日 申請日期2003年2月28日 優先權日2003年2月28日
發明者陶芒, 崔濟忠, 陶 芒 申請人:上海清沁生物科技有限公司